JPS62248492A - 乳頭腫ウイルスプロ−ブ及び乳頭腫ウイルス感染のインビトロ診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、乳頭腫ウィルスのＤＮＡ特に該ウィルス由来
のプローブ、及びこれらを使用した該ウィルス感染症の
ｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断方法に係る。

「乳頭腫ウィルス」なる用語は、比較的良性の皮膚又は
粘膜のイボから上皮内ｐ瘍形成及び皮膚癌及び粘膜の癌
に変質し悪化易い過形成にわたる種々の形態のウィルス
感染症の原因であることを共通点とする多数のウィルス
を包含する。乳頭腫ウィルス感染症のうちにはイボ状表
皮異形成も含まれており、本文中では以後ｒＥＶＪとｔ
３指称する。

乳頭腫ウィルスのいくつかのウィルス型はすでに文献に
記載されている。例えば、１９８５年１１月２９日付欧
州特許出願８５．４０２３６２．９−２１０５　（１９
８６年９月１０日、第０１９２００１　＠とじて公開）
では、罹患したうものかなりの割合の患茜で皮膚癌を増
殖させるイボ、斑点状病変、皮膚の前癌性病変、口腔の
過形成病変及び子宮頚癌から単離されたいくつかの新型
乳頭腫ウィルス及び該ウィルスの新しい亜型を記載して
いる。種々の型のヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）がｍ瘍
形成が発生するときに主としてどのような役割を果すか
も認識された。該ウィルスの病原性はまた、種々の遺伝
因子、特に免疫的及び／又は外因的因子の影響を受ける
。例えば乳頭腫ウィルス感染症の発病には化学（活性）
光線が影響を与える。

この先願には、いくつかの新型乳頭腫ウィルス及び該ウ
ィルスの新しい亜型が同定されている。

また、これらの新しい乳頭腫ウィルスのＤＮＡを単離状
態又は、互いに結合した状態及び／又ハ従来公知のＨＰ
ＶのＤＮＡと結合した状態でより精密な＋ｎ　ｖｉｔｒ
ｏ診断技術で使用することも記載されている。

該欧州特許出願に記載の乳頭腫ウィルスは概して、互い
に極めて異なってはいるが７０００〜８０００塩基対の
オーダの寸法をもつ。更に、所濤ストリンジェント（緊
縮）でない条件即ら緩やかな条件及びストリンジェント
な条件即ち厳密な条件下でのハイブリダイゼーションテ
ストの双方において乳頭腫ウィルスの種々の型及び亜型
の互いの相同のバーセンナージを測定すると、該ウィル
スのゲノムは成る程度の相同を有する。

厳密な条件下で５０％未満の割合の相同を有する乳頭腫
ウィルスは異なる型に属する。厳密な条件下で５０％以
上の割合の相同をもつウィルスは同じ型に属する。これ
ら同型「フィルス内部に異なる亜型が形成され得る。

緩やかな条件下のハイブリダイゼーションテストは、Ｃ
０＾、　ＨＥＩＬＨＡＮ等、１９８０年、Ｊ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、、３６゜３９５−４０７及びＣＲＯＩＳＳＡＮＴ
等、１９８２年、Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ。

Ｓｃ、　Ｐａｒｉｓ、　２９４．５８１−５８６によっ
テ記載された条件下で２種類のウィルス単離株由来のＤ
ＮＡを互いに接触させることによって行なわれる（ヘテ
ロデュプレックス分子）。

厳密な条件下のハイブリダイゼーションテストは、Ｃ，
Ａ、　ＨＥＩＬＨＡＭ等（１９８０年）並びにり。

ＫＲＥＨ３ＤＯＲＦ等（１９８２年、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ
、　４３；　４３Ｇ−４４７及び１９８３年、Ｊ、　Ｖ
ｉｒｏｌ、　４８；　３４０−３５１）及びＲ，Ｗ。

ＤＡＶＩＳ等、１９７１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、、　２１．４１３−４１８によって記載された
条件下で２種類のウィルス単離株由来のＤＮＡを互いに
接触させることによって行なわれる（ヘテロデュプレッ
クス分子）６以上を考察すると、先願は複数の新規なウ
ィルスを記載しており、また、これ等ウィルスのゲノム
（１−ＩＰＶ−ｔ）ＮＡと指称される）の全部又は一部
を含む遺伝子組換え体を記載している。従って、先願の
発明は、７，０００〜ａ、ｏｏｏ塩基対の範囲のサイズ
をもち、本出願でも再現された図面に示す制限地図をも
つことを特徴とするＤＮＡ集団のうちから選択されたＨ
ＰＶ−ＤＮＡの各々に係り、特に、乳頭腫ウィルスから
得られ、）ｌＰＶ２ｄ、１−ＩＰＶｌｏｂ　、　ＨＰＶ
１４ａ　、　ＨＰＶ１４ｂ　、　ＨＰＶ１５．　Ｉ−Ｉ
ＰＶ１７ａ　、　ＨＰＶ１７ｂ　、　ＨＰＶ１９．　Ｈ
ＰＶ２０．　ＨＰＶ２１．ＨＰＶ２２．ＨＰＶ２３．Ｈ
ＰＶ２４．ＨＰＶ２８、ＨＰＶ２９．ＨＰＶ３１．ＨＰ
Ｖ３２．ＨＰＶ−ＩＰ５及びＨＰＶ−ＩＰ４と指称され
るものに対応しているＨＰＶ−ＤＮＡに係る。

先願の発明はまた、その出願時点で公知であった乳頭腫
ウィルス又は新規な乳頭腫ウィルスから中離されたＨＰ
Ｖ−ＤＮＡの混合物に係る。また、これ等混合物を金石
しており種々の感染症の診断に使用でき所定の乳頭腫ウ
ィルスが検出された患者の危険の程度の診断にも極めて
有効に使用できるハイブリダイゼーションプローブに係
る。先願に記載の乳頭腫ウィルスを含むプローブに、そ
れまでにすでに単離されていた乳頭腫ウィルスのゲノム
ＤＮＡから構成されたプローブを付加し、雨音を同時に
含む所定混合物を調製することによって、種々の乳頭腫
ウィルスを原因とするか又はこれら種々の型の乳頭腫ウ
ィルスの作用で進展し得る種々の感染症の種類を大まか
に識別し、同一種類に属する感染症について、これらの
感染症がもっと恐ろしい病気に変化する危険の程度をよ
り十分に診断するための精密診断を行なうことが可能で
ある。特に、先願の発明は、イボ状表皮異形成が生じる
感染症において、これが皮膚癌に移行する危険の程度を
より精密に診断し得る。

従って先願の発明は特に診断組成物に係る。好ましい組
成物のグループを以下に示す。

（１）　　少ｔｘ＜トもＨＰ　Ｖ　２ｄ（７）　Ｄ　Ｎ
　Ａ　１（２）　　ＨＰ　Ｖ　１０ｂ、２ａ、２４９の
ＤＮＡの少なくとも１つ、 （３）　　ＨＰ　Ｖ　１７．２４のＤＮＡの少なくとも
１つ、（４）　　ＨＰＶ１４，１５，１７，１９，２０
，２１，２２．２３及びＩＰ４のＤＮＡの少なくとも１
つ、 （５）　　ＨＰＶ１５及ヒ１７（７）ＤＮＡ（７）少な
（とも１つ、（６）　　　ＨＰＶ２４のＤＮＡ１ （７）　　ＨＰ　Ｖ　１４，３２及（ＦＩＰ４のＤＮＡ
（８）　　　ＨＰＶ３１（７）ＤＮＡ。

（９）　　　ＨＰ　Ｖ　３２のＤＮＡ。

（１０）　　ＨＰ　Ｖ　１６．１８及びＩＰ５のＤＮＡ
の少なくとも１つ、 これら１０グループの各グループのＤＮＡは、いかなる
場合にも互いに異なるＤＮＡであるように選択されてい
る。

グループ（１０）のうちＨＰＶ−Ｉ　Ｐ２　（７）ＤＮ
ＡはＨＰＶ１６３１ｔＨＰＶ１８（７）ＤＮＡとＩＩみ
合わせるのが好ましい。

第１図から第９図は、関連するＨＰＶ−ＤＮＡの物理的
制限地図を示す。

物理的制限地図は、種々の制限エンドヌクレアーゼによ
る切断部位の位置を示す。地図の原点は一般に独特な（
唯一の）切断部位から成る。原点からの距離はゲノムの
長さのパーセンテージで示される。

本発明は、新しく単離された乳頭腫ウィルス、該ウィル
スから抽出され得るゲノムＤＮＡ又はこれらゲノムＤＮ
Ａの断片、及び、これらＨＰＶ−ＤＮＡ又はＨＰＶ−Ｄ
ＮＡ断片から形成され得る新規なハイブリダイゼーショ
ンプローブに係る。

本発明ハマタ、ＨＰＶ−Ｉ　Ｐ５　及びＨＰＶ−１Ｐ６
のうちから選択されたウィルスのＤＮＡの全部又は一部
と適当なベクターとの組換によって宿主中でのクローニ
ング部位に該ＤＮＡを組込んだ組換ＤＮ△が得られるよ
うにベクターを予め変性し、このベクターを適当な宿主
中で特に細菌中でクローニングし、組換ＤＮＡり［１−
ンを回収して精製することを特徴とするＨＰＶ−ＤＮＡ
プローブの製造方法に係る。大腸菌の如き原核微生物中
で複製できるプラスミド又はファージをベクターとして
使用するのが有利である。

また、使用し易いようにこのＨＰＶ−ＤＮＡプローブを
ラベル（標識）するのが有利である。放射性ラベル、免
疫蛍光ラベル、酵素ラベル等の任意のラベル物質を使用
し得る。

本発明はまた、前記の如きプローブを含む新規な混合プ
ローブに係り、また、先願の混合プローブに本発明のＨ
ＰＶ−ＤＮＡの１つを付加した混合プローブに係り、そ
の結果として、更に改良された診断用パッケージ即ちキ
ットを提供する。

本発明のＨＰＶ−ＤＮＡの特性は、第１０図及び第１１
図に示すＨＰＶ−ＩＰ５及ｆｆＨＰＶ−Ｉ　Ｐ６の夫々
のＤＮＡの制限地図によって決定される。

ＨＰＶ−ＩＰ５のゲノム又はＨＰＶ−ＩＰ６のゲノムか
ら作成されたハイブリダイゼーションプローブは、生殖
器官腫瘍形成特に子宮頚癌の増殖の危険をもたらす乳頭
腫ウィルスのウィルス型のｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断及び／
又は早期発見のために特に有効である。このときの診所
条件については先願にも記載されており、また本文でも
後述する。

これらハイブリダイゼーションプローブでは、後述する
如き同じ型の病気の診断用混合物に混入されるのが有利
である。

本発明はまた、前記ＨＰＶ−ＤＮＡ断片、又は特に厳密
な条件下で該ＨＰＶ−ＤＮＡとハイブリダイズし得る断
片に係る。本発明はまた、前記ＨＰＶ−ＤＮＡの各々の
全部又は一部を含む組換ＤＮＡ、特に、遺伝子Ｅ１、Ｅ
２、Ｅ６−Ｅ７、Ｌｌ、Ｌ２及び遺伝子間領域（ｒｅｇ
＋ｏｎ　ｔｎｔｅｒｇ６ｎｔｑｕｅ）ＮＧの夫々に対応
する断片を含む組換ＤＮＡ又は前記ＨＰＶ−ＤＮＡの遺
伝子間領域に対応する配列の断片を含む組換ＤＮＡに係
る。最後に本発明は、これらトＩＰＶ−ＤＮＡの各々か
ら作成されるか又は対応する断片から作成されるプロー
ブと、これらプローブを使用したｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断
方法に係る。

実施例１及び２で後述する技術を使用してウィルスＤＮ
Ａ１ｌＩＪ物（試料）を抽出した。

ウィルスの単離条件及び該ウィルスからＨＰＶ−ＤＮＡ
を得るための条件を以下に詳細に説明する。

−“　　　七　　び　　！　　゛の　　ＨＰＶのＨＰＶ
６又はＨＰＶｌＧ（７）特異的放射性ＤＮＡ、７０−プ
と共に緩やかな条件下でのレプリカに対する分子パイプ
リダイゼーションによって上皮内断形成（陰茎の過形成
丘疹）の生検抽出ＤＮＡ中で新型ＨＰＶを検出した。い
くつかの制限エンドヌクレアーゼに対するこのＨＰＶの
ＤＮＡの感染性を検査した結果、ＥＣ０ＲＩ酵素がウィ
ルスＤＮＡを１回切断することが判明した。病巣から抽
出したＤＮＡをＥＣ０ＲＩ酵素で消化し、８ｋｂのＤＮ
Ａ分子を含む画分をショ糖濃度勾配中の遠心によって精
製した。８ｋｂのＤＮＡ分子をＥＣｏＲｌ部位によって
バクテリオファージλｇｔ　ＷＥＳλＢのＤＮＡに挿入
した。組換ＤＮＡをカプシド封入（ｅｎｃａｐｓｉｄａ
ｔｉｏｎ）　Ｌ／て大腸菌Ｋ　１２　（Ｌ　Ａ　１０１
株）に感染させた後、ＨＰＶのＤＮＡを組込んだ組換バ
クテリオファージを溶菌プレートハイブリダイピージョ
ン法（ＢｅｎｔＯｎ及びＤａｖｉｓ）によって選別した
。これは、ＨＰＶ６のＤＮＡ特異的放射性ＤＮＡプロー
ブを使用し、緩やかな条件下で行なった。

全ウィルス配列を含む複数の組換バクテリオファージを
単離した。挿入酵素ＥＣ０ＲＩによって組換バクテリオ
ファージのＤＮＡを切断すると、緩やかな条件下で＋−
１ｒ’　Ｖ　６のＤＮＡとハイブリダイズする３ｋｂの
断片が生成する。組換バクテリオファ−ジのＤＮＡ及び
病巣から抽出されたＤＮＡＴ１４＠物のＤＮＡをエンド
ヌクレアーゼＥＣ０ＲＩとｐｓｔ■との混合物によって
切断すると、ＨＰＶゲノムの分子Ｍ（８ｋｂ）に対応す
る総分子伍をもつ等しい７つの断片が生成する。

新しいＨＰＶのＤＮＡをファージＤＮＡの配列から切除
し、プラスミドｐｓｐｅｓ中で再クローニングした。１
６種類の制限エンドヌクレアーげに対するこのＯＮへの
感受性を検査してウィルスＤＮＡの制限地図を作成した
。これにより２２個の切断部位を決定した（第１０図）
。新規な１−ＩＰＶの制限地図は、これまでに同定され
た全ての１−ＩＰＶの制限地図とは異なる。新規なＨＰ
ＶのＤＮＡと同定済のＨＰＶのＤＮＡとの相同度をレプ
リカハイブリダイゼーションテストによって分析する。

これは新規なＨＰＶの精製ＤＮＡから調製された放射性
プローブを使用し厳密条件下で行なう。ＨＰＶ１８のＤ
ＮＡに対する部分的相同が検出され、ＨＰＶ２６のＤＮ
Ａに対してはより程度の低い相同が検出され、ＨＰＶ２
．６．１０．１３．２９．３１とＨＰＶ−ＩＰ２に対し
ては僅かな相同が検出された。新規ＤＮＡ−ＤＮＡ再結
合実験を行ない、続いてハイブリッドをヌクレアーゼ＄
１で処理した。これら２ｇ！類のＤＮＡ間で２％のハイ
ブリダイゼーション率が検出された。従って、陰茎の退
形成丘疹から特性決定された新しいＤＮＡは新型ＨＰＶ
であり、仮にＨＰＶ−ＩＰ５と相称する。

種々（７）条件下ｒＨＰＶ−Ｉ　Ｐ５　（７）ＤＮＡと
ＨＰＶ−１６のＤＮＡとの間に形成されたヘテロデュプ
レックス分子を電子顕微鏡分析すると、これ等２種類の
ゲノムの物理的地図を位置合せし、）ＩＰＶ−ＩＰ５の
ＤＮＡの地図の原点に対する該ＤＮＡの種々の遺伝子の
理論位置を決定し得る。これらの位置は原点（第１０図
の制限地図の点０）からのゲノムの長さのパーセンテー
ジで示される。

ＩＰ５ Ｅ　６−　Ｅ　７　　　　　　１８−２８Ｅ　１　　　
　　　　　　２Ｂ−５３ Ｅ　２　　　　　　　　５１．５−６６１２　　　　　
　　　６９．５−８９ Ｎ　Ｇ　　　　　　　　　　７．５−１８精製ＨＰＶ−
ＩＰ５のＤＮＡから調製された放射性プローブを使用す
ると、該ウィルスの発病能を測定し得る。子宮頚の上皮
に対するＨＰＶの感染の頻度を測定するために１５２２
個の子宮頚−腟細胞サンプルを検査し、ＨＰＶを含む１
１０個のサンプル中の５個のサンプルでＨＰＶ−ＩＰ５
を検出した。また、子宮頚の初期癌の９３個の生検サン
プルを分析し、３個のサンプルでＨＰＶ−ＩＰ５を検出
した。この３つのサンプルでは、細胞ＤＮＡにＨＰＶ−
ＩＰ５のＤＮＡの全配列が組込まれていた。

従って、ＨＰＶ−ＩＰ５は発癌能をもつ生殖器１−Ｉ　
Ｐ　Ｖの１つの型である。そのため、生殖器腫瘍形成特
に子宮頚癌の増殖の原因になり得るＨＰＶの種々のウィ
ルス型を診断又は早期発見するために、分子プローブの
ＩＩＩに用いられるＨＰＶのＤＮＡの全ての混合物にＨ
ＰＶ−ＩＰ５を混入するのが望ましい。

別の新型ＨＰＶは、僅少細ｊＦ！Ｊｉ　型性’　（ａｔ
ｙＤｉｅｓｃｅｌｌｕｌａｉｒｅｓ　ｍｉｎｉｍｅｓ）
を示す乳頭腫として記載された女性外陰部病変から抽出
されたＤＮＡとＨＰＶ−３１の特異的放射性ＤＮＡプロ
ーブとを厳昼な条件下でハイブリダイズすることによっ
て、前者のＤＮＡから検出された。複数の制限酵素に対
するこのＨＰＶのＤＮＡの感受性を検査すると、３ａｍ
ＨＩ酵素がウィルスＤＮＡを１回切断することが判明し
た。病変から抽出したＤＮＡを３ａｍＨ１酵素で消化し
、８ｋｂのＤＮＡ分子をショ糖濃度勾配中の遠心によっ
て精製し、バクテリオファージλ１４７．１のＤＮＡに
Ｂａ１ｌｌ−１１部位によッテ挿入した。組換ＤＮＡを
カプシド封入し、大ＩＩ菌に１２（ＬＡｌｏｌ　株）　
ニ感染さｔｔｒから、新ＨＰＶ（７）ＤＮＡを組込んだ
組換バクテリオファージを溶菌ブレートハイプリダイゼ
ータジン法（ａｅｎｔｏｎ及び口ａｖｉｓ　）によって
選別した。これは、ＨＰＶ３１の社社専特異的放射性Ｄ
ＮＡプローブを使用し、厳密な条件下で行なった。全ウ
ィルス配列を含む複数の組換バクテリオファージを単離
した。エンドヌクレアーゼＢａ１ｌｌＨＩによって組換
バクテリオファージのＤＮＡを切断すると、厳密な条件
下でＨＰＶ３１のＤＮＡとハイブリダイズする８ｋｂの
断片が生成する。組換バクテリオファージのＤＮＡ及び
病変から抽出されたＤＮＡＷ４製物のＤＮＡをエンドヌ
クレアーゼＢａ１ａＨＩとＰ　ｓｔ　Ｉとの混合物によ
って切断すると、乳頭腫ウィルスのゲノムの分子間に対
応する総分子量をもつ等しい７つの断片が生成する。

新しいＨＰＶのＤＮＡをファージＤＮＡの配列から切除
し、プラスミドＤＳＰ６４中で再クローニングした。２
０種類の制限エンドヌクレアーぜに対するこのＤＮＡの
感受性を検査して新しいＨＰＶのＤＮＡの制限地図を作
成した。これにより２６個の切断部位を決定した（第１
１図）。この制限地図は、これまでに単離された全ての
ＨＰＶの制限地図とは異なる。新ＨＰ　ＶのＤＮＡと同
定済のＨＰＶのＤＮＡとの相同度をレプリカハイブリダ
イピージョンテストによって分析する。これは新ＨＰ■
の特異的放射性ＤＮＡプローブを使用し厳密条件下で行
なう。ＨＰＶ３１のＤＮＡとの間に部分ハイブリダイゼ
ーションが観察され、ＨＰＶ６．１３のＤＮＡ及びＨＰ
Ｖ−ＩＰ２のＤＮＡに対しては僅かな交差ハイブリダイ
ぜ−ジョンが観察された。

新ＨＰＶのＤＮＡとＨＰＶ３１のＤＮＡとの間の相同を
より正確に決定するために、液体媒質中でＤＮＡを再結
合させ、引続いてヌクレアーゼＳ１でハイブリッドを処
理した。これらの２つのＤＮＡの間で２０％のハイブリ
ダイゼーションが検出された。従って外陰部退形成乳頭
腫から単離されたウィルスは、新型ＨＰＶであり、仮に
ＨＰＶ−Ｉ　Ｐ６と相称する。

種々ノ条件下ｒＨＰＶ−Ｉ　Ｐ６　（７）ＤＮＡ、！：
ＨＰＶ３１のＤＮＡとの間に形成されたヘテロデュプレ
ックス分子を電子顕微鏡分析すると、これ等２種類のゲ
ノムの物理的地図を位置合せし、ＨＰＶ−ＩＰ６のＤＮ
Ａの地図の原点に対する該ＤＮＡの種々の遺伝子の理論
位置を決定し得る。これらの位置は原点（第１１図の制
限地図の点０）からのゲノムの長さのパーセンテージで
示される。

（１丈下祭臼少 ＨＰＶ−ＩＰ５の主な遺伝子及び遺伝子間領域（ＮＧ）
の推定位置 ＩＰ６ Ｅ　６−　Ｅ　７　　　　　１１．５−２１．５Ｅ　１
　　　　　　　　２１．５−４６．５Ｅ　２　　　　　
　　　　４５−５９．５１２　　　　　　　　　６３−
８２．５１１　　　　　　　　８０．５−１５ Ｎ　Ｇ　　　　　　　　　　１．５−１１．５精製ＨＰ
Ｖ−ＩＰ５のＤＮＡから調製された放射性プローブを使
用すると、該ウィルスの発病能を測定し得る。１６３名
の患者から得た外部生殖器官、肛門周囲領域及び子宮頚
の良性増殖性病変（コンジローム、乳頭腫）又は上皮内
腫瘍形成のサンプルを分析したところ、良性の病変（コ
ンジＯ−ム、乳頭ＩＩＩ＞を呈する患者１０名でＨＰＶ
−１Ｐ６のＤＮＡが検出された。子宮頚の上皮に対する
ＨＰＶの感染の頻度を測定するために１５２２個の子宮
頚−腟細胞サンプルを検査し、ＨＰＶのＤＮＡを含む１
１０個のサンプル中の正常もしくは炎症性細胞学または
軽度の異形成に対応する９個のサンプルでＨＰＶ−ＩＰ
５を検出した。

従って、ＨＰＶ−ＩＰ５は弱い発゛癌能しかもたない比
較的多い生殖器ＨＰＶの１つの追加型である。そのため
、生殖器腫瘍形成特に子宮頚癌の増殖の主原因にはなら
ない、性行為で伝播するＨＰＶの種々のウィルス型（良
性の生殖器腫瘍の拳固である）を診断又は早期発見する
ために、分子プローブの調製に用いられるＨＰＶのＤＮ
Ａの全ての混合物にＨＰＶ−ＩＰ５を混入するのが望ま
しい。

種々の形態のイボ又はその他の皮膚もしくは粘膜の病変
から単離され得るＨＰＶは極めて多様であるが、次表に
示す如（各病気を診断するためには、同種類の病気の増
殖に関与することが認識されている１種類又は２種類以
上のＨＰＶ−ＤＮＡを含む混合物を使用するのが好まし
い。感染症の種類及びその進行の診断は、使用プローブ
の数が多い程有効に行なわれる。更に、種々のプローブ
混合物を用いてハイブリダイゼーションテストを行なう
と、患者が罹っている疾患の種類をより確実に示す鑑別
診断が可能である。

従って本発明は更に、種々の形態の乳頭腫ウィルス感染
症の総合的診断、任意に感染症の進行の可能性の診断の
ために組合せて使用されることが可能な種々のＨＰＶ−
ＤＮＡの混合物〈又はこれらＨＰＶ−ＤＮＡを含むか又
はその配列を含むプローブ）に係る。

本発明の混合物の好ましい例を次表に示す。

前記の表はまた、表の左側部分に記載の混合物を使用す
ると特に診断し易い病気の種類を示している。この表で
指定された本発明以外のＨＰＶ−ＤＮＡの制限地図は第
１図から第９図に示されている。

注目スヘキハ、ＨＰＶ−ＩＰ５　及びＨＰＶ−ＩＰ２は
子宮頚癌の増殖の危険を検出するために有効な代表的プ
ローブとなり得、ＩＰ５は良性乳頭−腫の感染を検出す
るために使用できる代表的プローブとなり得ることであ
る。

ＨＰＶ−ＩＰ５のＤＮＡはＨＰＶ−６および／またはＨ
ＰＶｌｌのＤＮＡと組み合わせることができる。

最慢に本発明は全てのプローブの混合物にも係る。

さらに本発明は、より特定的には、生殖器癌に特異的な
ＨＰＶのＤＮＡを含むプローブのカクテＰＶ１１、ＨＰ
Ｖ１６、ＨＰ　Ｖ　１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３５を含
む。

ＩＰ５は良性乳頭腫ウィルスの感染を検出するのに使用
可能なプローブの代表例であり、ＩＰ５のＤＮＡ＆ｔＨ
Ｐ６　およｔＦ／ま７：はＨＰＶｌｌのＤＮＡと組み合
わせることができる。

従って本発明は特に、前出の表の「混合物の名称」の欄
に１〜１１０番号で示された１１個のグループを少なく
とも含む診断用パッケージ即ち［キット１に係る。

前記の記載では、主としてクローン化したＨＰＶ−ＤＮ
Ａ全体がプローブとして使用されている。

しかし乍らこれらクローン化ＨＰＶ−ＤＮＡ全部の代り
に、種々のＤＮＡのクローン化断片、特に遺伝子Ｅ１又
はＬｌ及び遺伝子Ｅ６−Ｅ７を使用してもよい。

ＨＰＶ−ＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出の基本原ｕでは
、当然厳密な条件又はやや緩和した条件下で処理するハ
イブリダイゼーションを使用する。例えば以下の如く処
理する。但し、本発明のプローブ又は混合プローブの使
用条件は記載の診断テストに限定されないことは言う迄
もない。

クローニングされたＨＰＶのＤＮＡの混合物から調製さ
れたプローブは、病変から掻爬された細胞の生検サンプ
ル、又は例えばｃａｒｎｏｙ混合物（エタノール、クロ
ロホルム、酢１ｍ−６：３：１）で固定しパラフィンに
封入した生検サンプル切片中のＨＰＶを検出しＨＰＶの
型を同定するための検査で使用される。この検査では、
公知の方法でサンプルからＤＮＡを予め抽出し、分子ハ
イブリダイゼーション実験で該ＤＮＡを分析する必要が
ある。このハイブリダイゼーション実験は、ＨＰＶ−Ｄ
ＮＡ混合物から調製され（３２Ｐ又は３ゞＳでラベルさ
れ）だ放射性プローブを用い厳密な条件又はやや緩和さ
れた条件下で行なわれる。各検査には通常、複数の混合
プローブが必要である。

いくつかのハイブリダイゼーション法の使用が可能であ
る。例えば、プロットハイブリダイゼーションを使用し
得る。この方法は、ＤＮＡの変性後に所定量のＤＮＡの
部分サンプルを膜（二ｌ−［１セルロース又はＧｅｎｅ
ｓｃｒｅｅｎｐｌｕｓ）に付着させ、常用条件下で６膜
と混合プローブとをハイブリダイズさせ、ラジオグラフ
フィルムと接触した膜を露光して放射性ハイブリッドを
検出する。また、レプリカハイブリダイゼーションを使
用してもよい。

この方法は、υ１限酵素によるＤＮＡの処理後に得られ
た［＞ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、こ
れら断片をアルカリ変性後に膜にトロセルロース、Ｇｅ
ｎｅｓｃｒｅｅｎｐｌｕｓ）に移植し、種々の混合プロ
ーブと共に常用条件下でハイブリダイズさせ、ラジオグ
ラフフィルムと接触した膜を露光して放射性ハイブリッ
ドの形成を検出する。

また、例えばｃａｒｎｏｙ混合物で固定しパラフィンに
封入された組織切片を用いたｉｎ　５ｉｔｕハイブリダ
イゼーシヨンを行なってもよい。

放射性プローブは、［ニック−トランスレーション」の
方法でラベルされたＨＰＶのＤＮＡから構成されてもよ
く、例えばｐｓＰ６のタイプのベクターに挿入されたウ
ィルスＤＮＡの転写によって調製されたＲＮＡから構成
されてもよい。放射性プ【コープの使用は感受性が高い
という利点を与えるが、非放射性プローブの使用も勿論
可能である。

非放射性プローブの例としては、ラベルされた抗体又は
酵素ラベル、蛍光ラベル等のラベルを含む抗体によって
認識され得るビオチニル化プローブがある。

従って本発明は更に、前記プローブを複数種含むキット
を提供する。本発明キットは、−夫々単離されたＨＰＶ
−ＩＰ５及びＨＰＶ−ＩＰ５と、 −従来のプローブと別のプローブ、特に前記プローブと
の混合物とを含む。

本発明のキットは、患者から得られたウィルスａ製物と
種々のプローブ又は混合プＯ−プとのハイブリダイゼー
ションによってｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断検査に使用される
。

本発明が記載の実施態様に限定されないこと、逆にその
全ての変形を包含することは前記の記載より勿論明らか
であろう。特に、特許請求の範囲において所与の符号で
特定され図面において対応する制限地図が示された）Ｉ
ＰＶ−ＤＮＡ１．：Ｉｌｌては、該ＨＰＶ−ＤＮＡが、
本文中の定義によれば該ＨＰＶ−ＤＮＡと同じ型に分類
できまた同じ亜型に属すると判断できる全てのＨＰＶ−
ＤＮＡを意味すると理解されたい。

以下の組換ＤＮＡは１９８６年１月２１日に以下の受託
番号ｒｃ、１４．ｃ、Ｈ，（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎ
ａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　
Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　ｄｅ　Ｉ’ｌＮ５
ＴＩＴＵＩ　Ｐ＾Ｓ■［υＲｄＯＰａｒｉｓ）に寄託さ
れた。

ｐｓＰ６５＃Ｐ５　　（犬馬菌中のプラスミド’）　：
ｌ−５０７ｐＳＰ６４／ＩＰ６　　（大腸菌中のプラス
ミド）　：ｌ−５０８え一藍一旦−１ （１）　　Ｄｉｉｒｓｔ、　１４．　ｅｔ　ａｌ、、　
１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、８０：　３８１
２−３８１５゜（ｌｂｉｓ）　Ｂｏｓｐａｒｔ　Ｈ，ｅ
ｔ　ａｔ、、　１９８４．　Ｅｍｂｏ　Ｊ、　３−（２
）　　Ｃｏ（ｌｏｉｎ、　Ｊ、Ｒ，、Ｊｒ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　１９７９．　ｃａｎｃｅｒＲｅｓ、　、　３９
　：　５４５−５４６（３）　　Ｇｉｓｓｍａｎｎ、　
Ｌ、　ｅｔ　ａｔ、、　１９８２．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ
、４４：３９３−４００、 （４）　　　Ｇｒｅｅｎ、Ｈ，ａｔ　ａｌ、、１９８２
．　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　　ｔｌ、ｓ、Ａ、　　７９：４４３７−４４
４１゜（５）　　　　ｌｌｅｉｌｍａｎ、Ｃ，八、　　
ｅｔ　　ａｌ、、１９８Ｇ、　　Ｖｉｒｏｌ、３６：３
９５（６）　　Ｊａｂｌｏｎｓｋａ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、
、１９７２．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

３２：５８３−５８９゜ （７）　　　ＪａｂｌＯｎＳｋａ、　　Ｓ、　　ｅｔ　
　ａｌ、、　　１９８２．　５ｌ）ｒｉｎ（ＩｅｒＳＯ
ｌｌｉｎ、　　ｌｌ１ｌｌＬＩｎＯＤａｔｈＯ１，５：
３３−６２゜（８）　　　にｒｅｍｓｄｏｒｆ、　　Ｄ
、　　ｅｔ　ａｔ、、　　１９８２．　　Ｊ、　　Ｖｉ
ｒｏｌ。

４３：４３６−４４７゜ （９）　　にｒｅｇｔｓｄｏｒｆ、Ｄ、ｅｔ　　ａｌ、
、１９８３．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

４８：３４Ｇ−３５１゜ （１Ｇ）　　Ｌｕｔｚｎｃｒ、Ｈ，＾、ｅｔ　　ａｌ、
、１９７８．Ｂｕｌｌ、Ｃａｎｃｅｒ。

６５：１６９−１８２、 （１１）　　Ｌｕｔｚｎｅｒ、Ｈ，Ａ、ｅｔ　　ａｌ、
、１９８３．Ｌａｎｃｅｔ　　１１：４２２−４２４゜ （１２）　　Ｈｉａｏｚｚｉ、Ｈ，ｅｔ　　ａｌ、、１
９６５．Ｂｕｌｌ、Ｓｏｃ。

Ｆｒａｎｃ、　　Ｇｅｒｍ、　　５ＶＤｈ、７２ニア４
７−７４８゜（１３）　　０ｒｔｈ、Ｇ、　　ｅｔ　ａ
ｌ、、１９８０．Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｏ　Ｈａｒｂｏ
ｒＣａｎｔ、　　Ｃｅ１ｌ　　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ
ｏｎ、　　７　：２５９−２８２゜（１４）　　０ｒｔ
ｈ、　　Ｇ、　ａｔ　ａｌ、、　　１９８１．　　Ｊ、
　　Ｉｎｖｅｓｔ。

Ｄｅｒｍａｔｏｌ、７６：９７−１０２゜（１５）　　
０ｒｔｈ、　　Ｇ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　１９７９．
　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３９：１０７４−１０８２
゜ （１６）　　Ｏｓｔｒｏｗ、　　Ｒ，Ｓ、　　ｅｔ　ａ
ｌ、、　　１９８２．　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　　７９：
１６３４−１６３８゜（１７）　　　Ｏｓｔｒｏｗ、　
　Ｒ，Ｓ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　１９８３．　　Ａ
ｎｎ、　　八ｃａｄ。

Ｄｅｒｖａｔｏｌ、８　　：３９８−４０４゜（１８）
　　Ｐｆｉｓｔｅｒ、　　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　　１９
８３．　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４３：１４３６−１４４１゜ （１９）　　Ｐｆｉｓｔｅｒ、　　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、
　　１９８３．　　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　　４７．３
６３−３６６゜ （２Ｇ）　　Ｐｆｉｓｔｅｒ、ｔｌ、ｅｔ　ａｌ、、１
９８１．　　Ｉｎｔ、　　Ｊ、　　Ｃａｎｃｅｒ。

２７：ｆ３４５−６５０゜ （２１）　　Ｒｕｅｄａ、　　Ｌ、Ａ、　　ｅｔ　ａｌ
、、　　１９７６、　　Ｈｅｄ、　　Ｃｕｔ、　　Ｉ。

Ｌ、＾、２：１１３−１３６゜ （２２）　　Ｒｕ１ｔｅｒ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　
　Ｉｎｖｅｓｔ、　　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、。

４７：２４７−２５２゜ （２３）　　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　　Ｊ、Ｇ、、　　
１９７８．　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｄ、５
：２７２１−２７２８゜ （２４）　　　Ｔｓｕｍｏｒｉ、Ｔ、　　ｅｔ　　ａｌ
、、１９８３．　　Ｊ、　　Ｇｅｎ、　　Ｖｉｒｏｌ。

６４：９６７−９６９゜ 以下の文献も考慮すべきである（いくつかの文献の前に
付けたＨＰＶの名称はその文献で最初に記載されたもの
である）。

ＨＰＶ１８：　　　８０８１１＾ＲＴ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ
、、　１９８４．　ＥＨＢＯＪ、　３：１１５１−１１
５７ 奮ＩＰＶ−ＩＰ２：　　ＢＥＡＵＤＥＮＯＮ　Ｓ、　ｅ
ｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ。

３２１：２４６．２４９ Ｂ［八〇〇ＥＮＯＮ　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９Ｂ？
、　Ｊ、　Ｉｎｖ。

ＤＯ１’１ａｔ０１．、　８８　ＮＯｌにＡＷＡＳＩＩ
ＩＨＡ　　Ｍ、　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８６ａ、Ｊ、
Ｖｉｒｏｌ、。

５７：６８ｇ−６９２ にＡＷＡＳＩＩＩＨＡ　　Ｈ，ｅｔ　　ａｌ、、１９８
６ｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

１５４　　：３８９−３９４ １ＩＰＶ６：　　　　ＤＥ　　ＶＩＬＬＩＥＲ３［、Ｈ
，ｅｔ　ａｌ、、　　１９８１．　　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、、４０：９３２−９３５ ＨＰＶ１１：　　　　ＧＩＳＳＨＡＮＮ　　Ｌ、　　ｅ
ｔ　　ａｔ、、１ｓａｚ、　　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、。

４４：３９３−４００ ＨＰｖ３１：　　　　ＬＯ旧ＮＣＺ　＾、　　ｅｔ　ａ
ｌ、、１９８６ａ、　　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、。

５８：２２５−２２９ ＨＰＶ３５：　　　　１０１（ＩＮＣＺ　Ａ、　　ｅｔ
　ａｌ、、　　１９８６ｂ、　　Ｂａｍｂｕｒｙｒｅｐ
ｏｒｔ、２１：２２５−２３７１゜ＨＰＶ１６：　　　
　ＤＵＲ３Ｔ　　ｅｔ　　ａｔ、　　１９８３本明細書
中に記載したいくつかのＨＰＶの名称は現在実施されて
いる国際命名法の範囲内で改称されている。特に、以下
の表で右にあげた単離株の名称（本明細書中での名称）
はその後表中の左にあげた名称でよばれている。

ＨＰＶ３２”１ｌＰＶ３１　　（ＢＥＡＵＤ［ＮＯＭ　
Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）ＨＰＶ３４−１ｆＰ
Ｖ３２　　（ＫＡＷ＾５）ＩＩＮＡ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、
、　１９８６）１１ＰＶ３３−ＨＰＶ−ＩＰ５　（ＢＥ
ＡＵＤＥＮＯＮ　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６）＋
１ＰＶ３Ｇ−１ｆＰＶ−ＩＰ５　　（ＫＡＷＡＳ旧ＨＡ
　　Ｎ、　　ａｔ　　ａｔ、、　　？９８６）１１ＰＶ
３９−１１ＰＶ−ＩＰ５　（Ｂ［ＡＵＤＥＮＯＮ　Ｓ、
　ｅｔ　ａｌ、、準備中）ＨＰＶ４２−＋１ＰＶ−ＩＰ
５　（ＢＥ＾ＩｊＯＥＮＯＮ　Ｓ、　ｅ、ｔ　ａ！、、
準備中）

【図面の簡単な説明】

１１１！ｌ〜１９［を関連するＨＰＶ−ＤＮＡ（７）制
限地図、第１０図及び第１１図はそれぞれ本発明のＨＰ
Ｖ−ＩＰ５及びＨＰＶ−ＩＰ５　（７）ＤＮＡ１７）制
限地図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＰＶ−ＩＰ５及びＨＰＶ−ＩＰ６と指称される
   乳頭腫ウィルスのいずれかから得られた約７，０００〜
   約８，０００塩基対のサイズのＨＰＶ−ＤＮＡ又はその
   断片。
2. （２）遺伝子Ｅ１、Ｅ６−Ｅ７、Ｌ１又はＬ２に対応す
   るか、又は、前記ＨＰＶ−ＤＮＡの遺伝子間領域に対応
   する断片に対応することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項に記載のＤＮＡ断片。
3. （３）特許請求の範囲第１項のＨＰＶ−ＤＮＡ又は特許
   請求の範囲第２項の断片を含む組換ＤＮＡ。
4. （４）ＨＰＶ−ＤＮＡ検出用プローブとして使用するた
   めの特許請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載
   のＤＮＡ、断片又は組換ＤＮＡ。
5. （５）特許請求の範囲第１項に合致するＨＰＶ−ＲＮＡ
   を１種類以上の別のＨＰＶ−ＤＮＡと共に含むことを特
   徴とする、生物学的媒質中の乳頭腫ウィルス検出用に使
   用可能な組成物。
6. （６）乳頭腫ウィルスのＤＮＡ又はＤＮＡ断片と適当な
   ベクターとのｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換によってこのベクタ
   ーを予め変性して、原核微生物の如き特定宿主中で後に
   行なうこのベクターのクローニングを可能にする部位に
   前記ウィルス由来のＤＮＡ又はＤＮＡ断片を含む組換ベ
   クターを得、該ベクターを前記宿主中でクローニングし
   、得られたクローン化組換ＤＮＡを回収及び精製し、必
   要な場合は標識することを特徴とする、特許請求の範囲
   第１項から第４項のいずれかに合致するＨＰＶ−ＤＮＡ
   プローブの製造方法。
7. （７）１１グループのプローブから成り、各グループが
   夫々 １）少なくともＨＰＶ２ｄのＤＮＡ、 ２）ＨＰＶ２０ｂ、２８、２９のＤＮＡの少なくとも１
   つ、 ３）ＨＰＶ１７、２４のＤＮＡの少なくとも１つ、 ４）ＨＰＶ１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２
   、２３及びＩＰ４のＤＮＡの少なくとも１つ、 ５）ＨＰＶ１５及び１７のＤＮＡの少なくとも１つ、 ６）ＨＰＶ２４のＤＮＡ、 ７）ＨＰＶ１４、３２及びＩＰ４のＤＮＡの少なくとも
   １つ、 ８）ＨＰＶ３１のＤＮＡ、 ９）ＨＰＶ３２のＤＮＡ、 １０）ＨＰＶ１６、１８、ＩＰ２、ＩＰ５のＤＮＡの少
   なくとも１つ、 １１）ＨＰＶ６、１１及びＩＰ６のＤＮＡの少なくとも
   １つ、 を含み、各グループのＤＮＡは、各グループの構成ＤＮ
   Ａだけに減縮されるといかなる場合にも互いに異なるＤ
   ＮＡであるように選択されていることを特徴とする、複
   数のプローブ又は異なるプローブの混合物を含むキット
   。
8. （８）良性を維持するイボから上皮内腫瘍形成又は皮膚
   もしくは粘膜の癌に悪化し易い形態にわたる多様な予後
   徴候に対応する種々の型のイボ及び過形成をｉｎ　ｖｉ
   ｔｒｏ鑑別診断するための診断用キットであって、以下
   の混合物、即ち １−１、２ｄ、４ ２−３、１０ａ、１０ｂ、２８、２９ ３−５、１７ａ、２４ ４−５、８、１２、１４ａ、１４ｂ、１９、２０、２１
   、２２、２３、ＩＰ４ ５−９、１５、１７ａ、１７ｂ ６−２４ ７−５、８、１４ｂ、３２、ＩＰ４ ８−１３、３１ ９−３２、ＩＰ４ １０−１６、１８、ＩＰ２、ＩＰ５ １１−６、１１及びＩＰ６ 中に乳頭腫ウィルスのＤＮＡインサートを含む組換プロ
   ーブが配分されており、これらプローブは、これら混合
   物のいくつかと対象患者由来のＤＮＡ試料とのハイブリ
   ダイゼーションによって以下の疾患、即ち、 １、皮膚又は粘膜のイボ（特に尋常及び足底イボ）、イ
   ボ状表皮異形成の鑑別診断、 ２、皮膚又は粘膜の偏平又は中間イボ、上皮内腫瘍形成
   及び皮膚癌、イボ状表皮異形成の鑑別診断、 ３、イボ状表皮異形成、上皮内腫瘍形成及び皮膚癌、 ４、イボ状表皮異形成、 ５、イボ状表皮異形成、 ６、イボ状表皮異形成、 ７、イボ状表皮異形成の皮膚癌、上皮内腫瘍形成及び皮
   膚癌、 ８、病巣状口腔上皮過形成、口腔上皮内腫瘍□形成の鑑
   別診断、 ９、上皮内腫瘍形成及び皮膚癌、 １０、生殖器腫瘍形成及び子宮頚癌 １１、乳頭腫コンジローム のいずれか１つの存在又は可能性を確実に検出し得るこ
   とを特徴とする診断用キット。
9. （９）特許請求の範囲第１項から第４項のいずれかのＨ
   ＰＶ−ＤＮＡ、ＨＰＶ−ＤＮＡ断片もしくは組換ＤＮＡ
   の１種類以上か又は特許請求の範囲第５項の複数種の別
   の組成物とのハイブリダイゼーションテストを行ない、
   前記ＨＰＶ−ＤＮＡ、その断片もしくは組換ＤＮＡ又は
   前記組成物のうちで生物サンプルから予め得られたＨＰ
   Ｖ−ＤＮＡと優先的ハイブリダイゼーションを生じたも
   のを検出することを特徴とする、生物サンプル中に含ま
   れた乳頭腫ウィルスの検出及び同定方法。