JP2008526248A - 生体試料におけるヒトパピローマウイルス検出のためのシステム、方法、および組成 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、限定的ではないが、ほ乳類の体液および子宮頸部擦過標本を含むがそれに限定されない、生体試料中のヒトパピローマウイルス(HPV)をシングルコピーレベルまで検出、同定、および定量するシステム、方法、および組成を含む。
【選択図】図1
Description
本出願は、全体を参照して本明細書に組み入れられる、2005年1月14日に出願された米国仮特許出願第60/644,374号に基づく、優先権を主張する。
本発明の基調を成す研究は、一部はミシガン・ライフサイエンス・コリドー(Michigan Life Science Corridor)(MEDC-410)、ミシガン・トリテクノロジー・コリドー(Michigan Tri-Technology Corridor)、NIH(R21 DK69877、R21 DK070237、CA104830、およびCA94328)、NIH頭頸部癌研究拠点特別プログラム(Head/Neck Cancer SPORE)(1 P50 CA97248)、およびMDRTC細胞分子生物学コア(Cell and Molecular Biology Core)(DK20572)による援助を受けた。政府が本発明において一定の権利を有する可能性もある。
本発明は、生体試料における微生物病原体の検出および取扱いの分野に関する。
最近の研究は、ヒトパピローマウイルス(human papillomavirus「HPV」)が、子宮頸癌、頭頸部癌、肛門癌、および住血吸虫症に関連した膀胱癌のかなりの割合に関連していることを示している。子宮頸癌および肛門癌は、ほぼ一様にHPV感染と関連している。発表された報告についての近年の総説は、頭頸部腫瘍におけるHPVのDNAの全体的な保有率が35%であることを見いだした。さらに最近、ある研究グループは、これらの知見を腫瘍試料253件の大規模な研究で裏付けるために、定量PCR(Qunantitative PCR「QPCR」)を用い、検体の25%にHPVのDNAを検出した。またHPVは、肛門異形成および癌にも関連している。別の研究グループは、住血吸虫症に起因する膀胱癌の50%近くが、HPVのDNAを持つことをインサイチューハイブリダイゼーション法(in situ hybridization)により見いだした。
本発明は、限定的ではないが、癌および異形成の検出、治療、および/または管理を目的とする、ほ乳類の体液および子宮頸部の擦過標本(scrapings)などを限定的でなく含む生体試料における、HPVのシングルコピー(single copy)レベルに至るまでの検出、同定、および定量のためのシステム、方法、および組成などを含む。いくつかの好ましい実施態様においては、本発明は、個別のHPV配列を同定し、HPV-DNAの検出感度を向上させ、いくつかの腫瘍タイプと血清および/または末梢血HPV-DNAとのより高頻度な関連性をもたらす、より高感度の質量分析手法を含む。従って、本発明は、HPVが関与する症例での遺残腫瘍または異形成のマーカーとして、HPV-DNAに関する末梢血および血漿のスクリーニングを可能にするシステム、方法、および組成を含む。
限定的ではないが、いくつかの実施態様では、本発明は、腫瘍または異形成組織由来の癌または異形成と関連する、HPVの一つ以上のタイプの解析および判定を同時に行うためのシステム、方法、および組成を含む。本発明を用いると、この解析および判定は、HPVの検出のために現在米国食品医薬品局(「FDA」)に認可されている1000〜5000コピーが必要な試験[1]より感受性が高く、HPVコピー数を100以下にまで下げても実施されることが可能である。本発明は、所定の個別のHPV配列の探索によって感度をさらに向上させることにより、1aM(いくつかの実施態様で用いられる、5μLのPCR容量中の個別の分子)までの検出が可能である。向上したこの感度は、その他の生体試料のうち血液および血清中の病原性HPVを検出することもできる。
本発明のいくつかの実施態様の以下の例は、本発明を、本明細書に述べられた実施態様のみに限定せずに提供される。
腫瘍、血清、末梢血、および尿沈渣試料が、腫瘍の生体組織検査の際に個別の癌患者から単離された。血清および/または末梢血は、HPVに曝露されていない正常コントロールから、住血吸虫症の個人(既知の膀胱癌の有無にかかわらず)から、腫瘍の外科的除去後の住血吸虫症に関連した膀胱癌の個人から、頭頸部癌の個人から、および、子宮頸癌または肛門癌もしくは子宮頸部異形成の個人から、単離された。尿沈渣は、住血吸虫症に関連した膀胱癌の被験者から、および膀胱の腫瘍を持たないコントロール被験者(control subjects)から、単離された。尿沈渣は、ベックマン(Beckman)J2-21M遠心管で、約8,000rpmで約10分間の尿の遠心後に、ペレットとして単離された。胎盤は、正常分娩後に入手された。組織、末梢血、および尿沈渣のDNAは、ZRゲノミックDNA Iキット(ZR Genomic DNA I kit)(カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社(Zymo Research Corp))を用いて単離された。DNAは、約0.3mL〜5mLの血清から、ZRゲノミックDNA単離キット(ZR Serum DNA Isolation kit)を用いて単離された。
HPV-DNAの縮退PCRプローブは、ウイルスのL1領域内に作成された[13]。GP5+およびGP6+プライマーの出典は、デ・ローダ・フスマン(de Roda Husman)ら[15]である。MY18およびMY1019プライマーの出典は、ネルソン(Nelson)ら[16]である。縮退タックマン[13]セットの構築に、我々はタックマンセットを得る二つの外側のプライマー(GP5+およびGP6+に基づく)およびプローブ(MY18およびMY1019に基づく)配列を組み合わせた。融解温度(Tm)は、キアゲン(Qiagen、http://www.operon.com/oligos/toolkit.php?)のオリゴ計算機(oligo calculator)を用いて得た。
MY1019最終プローブは、等量のMY1019アナログ1およびMY1019アナログ2を混合することで作成された。最終プローブは、等量のMY18アナログおよびMY1019最終アナログから作成された。
全ての正常血清は少量の正常ゲノムDNAを含むため[16]、我々は、血清DNAが全てタックマンerbB-2ゲノミックDNAプローブ[13]を含む試料から調製されたものであることの検証を行った。同様の方法で、我々は、DNAが全て、用いられた別の試料から単離された事を確認した。約95℃で約5分間の変性後、erbB-2の増幅のために、約95℃で約15秒間の変性および約60℃で約30秒間のアニーリングの2段階のプログラム、40サイクルが用いられた。約95℃で約5分間の変性後、HPV-DNAのQPCR増幅のために、我々が至適化後にパーキンエルマーモデル7700(Perkin-Elmer model 7700)で用いた条件は、約52℃で約60秒間(アニーリングおよび伸長)、および約95℃で約15秒間の変性の2段階のプログラム、40サイクルだった。また我々は、質量分析PCR法の最後の増幅段階で用いられる55サイクルと対応させるために、多数の試料でこの条件を約55サイクル行った。通常のアニーリングおよび伸長の温度である約52℃よりも低いことは、我々が縮退プローブを使用していることを反映している。縮退HPV-DNAプローブでのタックマン反応のために、各数値は、4通りに(quadruplicate)反復された。試料は、パーキンエルマーモデル7700でタックマン法[13]により解析された。DNAシーケンシングは、ミシガン大学コア(University of Mishigan Core)のシーケンシング施設により行われた。
HC2反応は、HPVの13の各高リスクタイプのDNAに相補的なRNAプローブを含む。HPV-DNAおよび任意の相補的RNAプローブの間のハイブリダイゼーションは、RNA:DNAハイブリッドを標的とする捕捉抗体[1]を用いて検出される。最初の試験で、相対発光量の切り捨て率(relative light unit (RLU) cuttoff ratio)≧10の検体を、陽性と見なした。RLU切り捨て率<約0.8の検体は、陰性とみなされた。RLU切り捨て率が約0.8〜9.99の検体は、再度試験された。反復的にRLU切り捨て率≧1だった場合、試料は陽性と見なされた。陽性として反復しなかった不明瞭な検体は、本研究には含めなかった。試料は、2群(HC2(+)およびHC2(−))に分けられ、匿名化され、余剰のシンプレップ材料が、マスアレイ(MassARRAY)手法により研究された。
示されたように我々は、リバースラインブロット解析のロシュ法[12]によって選択された試料のHPVタイプを得た。別法として、我々はHPVのL1領域内の縮退プライマーで増幅される可能性がある最も多くのHPV配列を検出するために、HPVのL1領域内の縮退プライマーを用いた[15,17]。この手法は、HPV52(我々の試験では、HPV52および縮退プライマーの間の相違が、プライマーが結合するには大きすぎた)を除くHPV病原性タイプ13種類の全てで目的通りに機能した。
所定の試料中のDNA量を測定するために、我々はerbB-2遺伝子内固有のイントロンに対して、バイオラド・アイサイクラーでタックマン蛍光QPCR[12]を用いた。プライマーは、5'-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-3'(SEQ ID NO. 139)および5'-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3'(SEQ ID NO. 140)であり、タックマンプローブは、5'-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-3'(SEQ ID NO. 141)だった。我々は、7.7x103半数体ゲノム当量(haploid genome equivalents)/蛍光単位の値のerbB-2プローブを得た。また我々は、このイントロンに対して質量分析法で解析され(表1)、もはやアイサイクラーでの分離解析の必要がないプローブを、22プローブの混合物に組み入れた。
いくつかの実施態様に従い、限定的ではないが、本発明は、数分子ほどの初期の分子を検出するために、マトリックスシリコンチップアレイ(matrix-loaded silicon chip array)上の産物を分離する、リアルタイム競合PCR(rcPCR)、プライマー伸長、およびMALDI-TOF MSの複数段階の過程を含む[8]。PCRのためのHPV標的配列に適合させるために、合成中に導入される競合物中の単一塩基変異以外の競合ヌクレオチドテンプレート(単なる一例として、およそ100nt)が合成される。次に、単一塩基変化は、SNP遺伝子型決定で行われるのと同様に、MALDI-TOF MSでの産物の質量分解(product resolution)(数ダルトンに)した状態でのプライマー伸長反応を用いて、HPV標的対立遺伝子から区別することもできる[10]。好ましくは、限定的ではないが、競合テンプレートは、PCR反応に既知の量で添加され、従って、標的DNA量の測定のための標準曲線を作成するために、滴定されることもできる。標的対立遺伝子および競合テンプレート対立遺伝子のピーク面積が等しい場合、二つの分子の濃度は、およそ1:1の比率であり、反応液中の標的DNAの量を表す。質量分析解析は、この例示的な実施態様において非常に特異的であり、所定のプライマー伸長産物が、およそ20ダルトンの分解能まで識別された。従って、任意の混入物産物が偽陽性シグナルを生じるには、この特定のサイズでなければならない。内部標準(競合プレート)の存在は、PCRに必要な酵素が機能していること、および、試料がPCRの阻害剤を含まないように精製されたことを確認するためにも役立つ。
いくつかの実施態様に従い、プライマー3(Primer3)ソフトウェア(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)を用いて様々なHPV系統のE6領域から、最初のPCRおよび伸長プライマー配列を抽出することによって、13単位のHPVアッセイが設計された。これらの配列は、次に、マスアレイアッセイデザイナーソフトウェアv3.0(カリフォルニア州サンディエゴのシーケノム社(Sequenom, Inc.))[8]に用いるための投入配列の境界を明らかにするために用いられた。この方法で、我々は高リスクHPV(図1)の個々の13タイプのそれぞれを識別することができた[1]。順方向および逆方向のプライマー、伸長プライマー、および競合配列は、表2に開示されている。いくつかの実施態様は、この目的のためにカスタマイズされ、我々が綿密に作成した別のソフトウェアを用いる、さらに徹底的なスクリーニングも含む。このソフトウェアを用いて、我々は、オリジナルのHPVの13タイプ、追加のHPV6タイプ、所定の小分注でヒトDNAの量の定量が可能なゲノムDNAシングルコピープローブ、ならびに淋菌(Neisseria gonorrhoea)およびトラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)のプローブを含む、22の配列タイプを含むプローブを作成した(例えば、表1A〜表1Cを参照)。一次PCR反応のための温度は、約60℃で、二次プライマー伸長反応のための温度は、約58℃である。
我々は、組織、血清、末梢血、および尿沈渣に対する、一連のコントロールを試験した。組織コントロールは、正常胎盤由来のDNA試料だった。血清および末梢血のコントロールは、HPVに対する曝露の有無が不明な匿名の被験者の血清および末梢血から、我々が単離したDNA試料だった。尿沈渣は、正常なボランティアからのDNA試料だった。本明細書で報告された全ての例では、タックマンによるerbB-2コントロールプローブでの反応は陽性であり、QPCR品質のDNAが存在していたことが確認された。コントロール試料は、通常縮退HPV-DNAプローブに対して4ウェル全てで陰性であり、また稀に1/4ウェルで陽性だった。従って、我々は慎重を期して、≧3/4ウェルで陽性に反応した試料のみを使用した。
我々は、子宮頸部上皮内新生物CIN IまたはCIN IIに分類される異形成があると判定された病理学的に異常な試料に対する、質量分析アッセイおよびリバースラインブロット[12]の結果の比較を行った。49試料に対して、質量分析アッセイ手法が約40aM以上の濃度で13種類の病原性HPVタイプの一つの存在を示した場合には、質量分析アッセイおよびリバースラインブロットの間には完全な一致があった(データは示されていない)。しかし、さらに少量のHPVでは、この一致は崩れた(表6)。DNAシーケンシングおよびリバースラインブロット法が共に<約40aMの量では、13種類の高度病原性のHPVタイプの検出に失敗するか、または別のHPVタイプを検出したが、質量分析アッセイ解析は、一貫して<約40aMの量で13種類の病原性HPVタイプの一つを検出した(表6)。我々は、リバースラインブロットで認められたHPVタイプまたは別の非病原性のHPVタイプのいずれかを示したこの結果(一部分のみが重複するリバースラインブロットおよびDNAシーケンシングによって検出されたHPVタイプの範囲は、なぜこれらの二つの手法が異なる答えを与える可能性があるのかを説明する。しかし、両方の手法は、13種類全ての病原性HPVタイプに利用可能である(縮退シーケンシング法を用いると十分に増幅しないHPV52を除く))を、縮退DNAシーケンシングによって確認した。その他の感度が劣る方法では正しく評価され得ない低タイターについてのこの結果が、コントロールの血液試料(HPVは存在せず)またはパップテスト陰性試料(試料の大部分にはHPVは存在せず(図3D))と異なる点に留意されたい。このことは、過去に顕著だったが現在は消滅しつつあるHPV感染の消失しつつある痕跡を表すと思われる、これらの過去に正しく評価されなかった病原性HPVの低タイターの重要性を、強く主張する。これは、大部分のHPV感染が、6ヶ月〜2年後に完治するという観察と一致する。同時にこのことは、長期的に追跡することが可能であったならば、自然に症状が治まった(self-limited)であろう病巣を切除するための数多くの外科的処置を回避し得る、長期的なタイターを得ることの重要性を主張する。
病理学的に異常な子宮頸部異形成の試料と同様に、質量分析アッセイは、リバースラインブロット法、縮退DNAシーケンシング法、またはHC2よりも、一層高感度である。約50コピー以上の病原性HPVタイプが識別される場合には、質量分析アッセイとリバースラインブロット法との間に、約500コピー以上の病原性HPVタイプが識別される場合には、質量分析アッセイと縮退DNAシーケンシング法との間に、および約5000コピー以上の病原性HPVタイプが識別される場合には、HC2と質量分析アッセイとの間に、優れた一致がある。3つの手法全てにわたる良好な一致は、質量分析アッセイで約5000コピーを超える試料により解析されたHC2陽性の試料98/125件のうち、これらの例で観察された(表7)。病原性HPVのタイター<約5000コピーの残りの27/125件のHC2(+)の例では、リバースラインブロットおよび/または縮退DNAシーケンシング法は、我々の質量分析アッセイで検出された13種類の高度病原性タイプ以外のHPVタイプを検出した(表8)。これらは、偽陽性であるHC2によって同定された異形成の中で、有意の割合を含んでいると思われる[2,36]。
(1) ほ乳類の生体試料におけるHPV-DNAの検出、同定、および/または定量のための方法において、
ほ乳類の生体試料からDNAを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列(competitor sequence)の存在下で、前記抽出されたDNAの少なくとも一部のPCRによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致(homologous)したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記のHPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のHPVタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー(extension primer)、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のHPVタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含む、方法。
(2) 実施態様1に記載の方法において、
前記ほ乳類の生体試料が、体液または組織試料である、方法。
(3) 実施態様1に記載の方法において、
前記測定段階が、約200アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの測定を含む、方法。
(4) 実施態様1に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のHPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、各々が異なる既知のHPVタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
(5) 実施態様4に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、HPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82のうちの二つ以上を含む、方法。
(6) 実施態様4に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、少なくともHPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82を含む、方法。
(7) 実施態様4に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたDNAの少なくとも一部のPCRによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーの濃度を測定する段階と、
をさらに含む、方法。
(8) 実施態様1に記載の方法において、
前記一次増幅が、erbB-2遺伝子のDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在を含み、前記競合配列が、前記erbB-2遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
(9) 実施態様1に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
少なくとも一つの競合配列が、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、およびSEQ ID No.85からなる群から選択される、方法。
(11) 実施態様10に記載の方法において、
SEQ ID No.86、87、および88からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列をさらに含む、方法。
(12) 実施態様1に記載の方法において、
前記一次増幅が、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.23、SEQ ID No.2およびSEQ ID No.24、SEQ ID No.3およびSEQ ID No.25、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.26、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.27、SEQ ID No.6およびSEQ ID No.28、SEQ ID No.7およびSEQ ID No.29、SEQ ID No.8およびSEQ ID No.30、SEQ ID No.9およびSEQ ID No.31、SEQ ID No.10およびSEQ ID No.32、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.33、SEQ ID No.12およびSEQ ID No.34、SEQ ID No.13およびSEQ ID No.35、SEQ ID No.14およびSEQ ID No.36、SEQ ID No.15およびSEQ ID No.37、SEQ ID No.16およびSEQ ID No.38、SEQ ID No.17およびSEQ ID No.39、SEQ ID No.18およびSEQ ID No.40、ならびにSEQ ID No.19およびSEQ ID No.41からなる、前記既知のHPVタイプに対する、少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
(13) 実施態様12に記載の方法において、
前記一次増幅が、SEQ ID No.20およびSEQ ID No.42、SEQ ID No.21およびSEQ ID No.43、ならびにSEQ ID No.22およびSEQ ID No.44からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組をさらに含む、方法。
(14) 実施態様1に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、およびSEQ ID No.63からなる群から選択される、方法。
(15) 実施態様14に記載の方法において、
前記二次増幅が、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、およびSEQ ID No.66からなる群から選択される、少なくとも一つの伸長プライマーをさらに含む、方法。
(16) 実施態様1に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のHPVタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
(17) 実施態様1に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
ほ乳類の体液の非細胞画分からDNAを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたDNAの少なくとも一部のPCRによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記HPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のHPVタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のHPVタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含む、方法。
(19) 実施態様18に記載の方法において、
前記体液が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、汗、唾液、痰、または涙である、方法。
(20) 実施態様18に記載の方法において、
前記測定段階が、約200アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。
(21) 実施態様18に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のHPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、異なる既知のHPVタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
(22) 実施態様21に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、HPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82のうちの二つ以上を含む、方法。
(23) 実施態様21に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、少なくともHPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82を含む、方法。
(24) 実施態様21に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下でのPCRによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。
(25) 実施態様18に記載の方法において、
前記一次増幅が、erbB-2遺伝子のDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在を含み、
前記競合配列が、前記erbB-2遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
(27) 実施態様18に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、およびSEQ ID No.85からなる群から選択される、方法。
(28) 実施態様27に記載の方法において、
SEQ ID No.86、87、および88からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列をさらに含む、方法。
(29) 実施態様18に記載の方法において、
前記一次増幅が、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.23、SEQ ID No.2およびSEQ ID No.24、SEQ ID No.3およびSEQ ID No.25、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.26、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.27、SEQ ID No.6およびSEQ ID No.28、SEQ ID No.7およびSEQ ID No.29、SEQ ID No.8およびSEQ ID No.30、SEQ ID No.9およびSEQ ID No.31、SEQ ID No.10およびSEQ ID No.32、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.33、SEQ ID No.12およびSEQ ID No.34、SEQ ID No.13およびSEQ ID No.35、SEQ ID No.14およびSEQ ID No.36、SEQ ID No.15およびSEQ ID No.37、SEQ ID No.16およびSEQ ID No.38、SEQ ID No.17およびSEQ ID No.39、SEQ ID No.18およびSEQ ID No.40、ならびにSEQ ID No.19およびSEQ ID No.41からなる、前記既知のHPVタイプ関連する、少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
(30) 実施態様29に記載の方法において、
前記一次増幅が、SEQ ID No.20およびSEQ ID No.42、SEQ ID No.21およびSEQ ID No.43、ならびにSEQ ID No.22およびSEQ ID No.44からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
(31) 実施態様18に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、およびSEQ ID No.63からなる群から選択される、方法。
(32) 実施態様31に記載の方法において、
前記二次増幅が、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、およびSEQ ID No.66からなる群から選択された、少なくとも一つの伸長プライマーをさらに含む、方法。
(33) 実施態様18に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のHPVタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
(34) 実施態様18に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
ほ乳類の生体試料からDNAを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたDNAの少なくとも一部のPCRによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記HPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のHPVタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のHPVタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含み、
前記一次増幅が、少なくとも一つの競合配列で実質的に対応する既知のHPVタイプに対する少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
少なくとも一つの伸長プライマーが、同じ前記既知のHPVタイプと関連する、方法。
(36) 実施態様35に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、およびSEQ ID No.85からなる群から選択され、
少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組が、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.23、SEQ ID No.2およびSEQ ID No.24、SEQ ID No.3およびSEQ ID No.25、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.26、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.27、SEQ ID No.6およびSEQ ID No.28、SEQ ID No.7およびSEQ ID No.29、SEQ ID No.8およびSEQ ID No.30、SEQ ID No.9およびSEQ ID No.31、SEQ ID No.10およびSEQ ID No.32、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.33、SEQ ID No.12およびSEQ ID No.34、SEQ ID No.13およびSEQ ID No.35、SEQ ID No.14およびSEQ ID No.36、SEQ ID No.15およびSEQ ID No.37、SEQ ID No.16およびSEQ ID No.38、SEQ ID No.17およびSEQ ID No.39、SEQ ID No.18およびSEQ ID No.40、ならびにSEQ ID No.19およびSEQ ID No.41からなる群から選択され、
少なくとも一つの伸長プライマーが、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、およびSEQ ID No.63からなる群から選択される、方法。
(37) 実施態様35に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のHPVタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
(38) 実施態様35に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
(39) 実施態様35に記載の方法において、
前記測定段階が、約200アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
(41) 実施態様35に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のHPV-DNA配列中には存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、異なる既知のHPVタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
(42) 実施態様41に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、HPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、および82のうちの二つ以上を含む、方法。
(43) 実施態様41に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、少なくともHPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82を含む、方法。
(44) 実施態様41に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下でPCRによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。
(45) 実施態様35に記載の方法において、
前記一次増幅が、erbB-2遺伝子のDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下で前記抽出されたDNAを含み、
前記競合配列が、前記erbB-2遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
(46) 実施態様35に記載の方法において、
前記一次増幅が、
SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、およびSEQ ID No.88からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列と、
SEQ ID No.20およびSEQ ID No.42、SEQ ID No.21およびSEQ ID No.43、ならびにSEQ ID No.22およびSEQ ID No.44からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組と、
を含み、
前記二次増幅が、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、およびSEQ ID No.66からなる群から選択された、少なくとも一つの伸長プライマーを含む、方法。
生体試料中の微生物DNAの検出、同定、および/または定量のための競合配列であって、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、およびSEQ ID No.88からなる群から選択された、競合配列、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
(48) 一対の合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物DNAの検出、同定、および/または定量のための順方向および逆方向プライマーであって、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.23、SEQ ID No.2およびSEQ ID No.24、SEQ ID No.3およびSEQ ID No.25、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.26、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.27、SEQ ID No.6およびSEQ ID No.28、SEQ ID No.7およびSEQ ID No.29、SEQ ID No.8およびSEQ ID No.30、SEQ ID No.9およびSEQ ID No.31、SEQ ID No.10およびSEQ ID No.32、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.33、SEQ ID No.12およびSEQ ID No.34、SEQ ID No.13およびSEQ ID No.35、SEQ ID No.14およびSEQ ID No.36、SEQ ID No.15およびSEQ ID No.37、SEQ ID No.16およびSEQ ID No.38、SEQ ID No.17およびSEQ ID No.39、SEQ ID No.18およびSEQ ID No.40、SEQ ID No.19およびSEQ ID No.41、SEQ ID No.20およびSEQ ID No.42、SEQ ID No.21およびSEQ ID No.43、ならびにSEQ ID No.22およびSEQ ID No.44からなる群から選択された、順方向および逆方向プライマー、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
(49) 合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物DNAの検出、同定、および/または定量のための伸長プライマーであって、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、およびSEQ ID No.66からなる群から選択される、伸長プライマー、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
(50) 生体試料中の微生物DNA検出のためのキットにおいて、
容器と、
実施態様47、48、および49に記載の合成ポリヌクレオチドのうちの一つ以上と、
を含む、キット。
Claims (50)
- ほ乳類の生体試料におけるHPV-DNAの検出、同定、および/または定量のための方法において、
ほ乳類の生体試料からDNAを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたDNAの少なくとも一部のPCRによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記HPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のHPVタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のHPVタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記ほ乳類の生体試料が、体液または組織試料である、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記測定段階が、約200アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のHPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、各々が異なる既知のHPVタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。 - 請求項4に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、HPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82のうちの二つ以上を含む、方法。 - 請求項4に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、少なくともHPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82を含む、方法。 - 請求項4に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたDNAの少なくとも一部のPCRによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記一次増幅が、erbB-2遺伝子のDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在を含み、
前記競合配列が、前記erbB-2遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、およびSEQ ID No.85からなる群から選択される、方法。 - 請求項10に記載の方法において、
SEQ ID No.86、87、および88からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列をさらに含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記一次増幅が、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.23、SEQ ID No.2およびSEQ ID No.24、SEQ ID No.3およびSEQ ID No.25、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.26、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.27、SEQ ID No.6およびSEQ ID No.28、SEQ ID No.7およびSEQ ID No.29、SEQ ID No.8およびSEQ ID No.30、SEQ ID No.9およびSEQ ID No.31、SEQ ID No.10およびSEQ ID No.32、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.33、SEQ ID No.12およびSEQ ID No.34、SEQ ID No.13およびSEQ ID No.35、SEQ ID No.14およびSEQ ID No.36、SEQ ID No.15およびSEQ ID No.37、SEQ ID No.16およびSEQ ID No.38、SEQ ID No.17およびSEQ ID No.39、SEQ ID No.18およびSEQ ID No.40、ならびにSEQ ID No.19およびSEQ ID No.41からなる、前記既知のHPVタイプに対する、少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。 - 請求項12に記載の方法において、
前記一次増幅が、SEQ ID No.20およびSEQ ID No.42、SEQ ID No.21およびSEQ ID No.43、ならびにSEQ ID No.22およびSEQ ID No.44からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組をさらに含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、およびSEQ ID No.63からなる群から選択される、方法。 - 請求項14に記載の方法において、
前記二次増幅が、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、およびSEQ ID No.66からなる群から選択される、少なくとも一つの伸長プライマーをさらに含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のHPVタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。 - ほ乳類の体液の非細胞画分におけるHPV-DNAの検出、同定、および/または定量のための方法において、
ほ乳類の体液の非細胞画分からDNAを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたDNAの少なくとも一部のPCRによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記HPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のHPVタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のHPVタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記体液が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、汗、唾液、痰、または涙である、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記測定段階が、約200アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のHPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、異なる既知のHPVタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。 - 請求項21に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、HPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82のうちの二つ以上を含む、方法。 - 請求項21に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、少なくともHPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82を含む、方法。 - 請求項21に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下でPCRによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記一次増幅が、erbB-2遺伝子のDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在を含み、
前記競合配列が、前記erbB-2遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、およびSEQ ID No.85からなる群から選択される、方法。 - 請求項27に記載の方法において、
SEQ ID No.86、87、および88からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列をさらに含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記一次増幅が、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.23、SEQ ID No.2およびSEQ ID No.24、SEQ ID No.3およびSEQ ID No.25、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.26、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.27、SEQ ID No.6およびSEQ ID No.28、SEQ ID No.7およびSEQ ID No.29、SEQ ID No.8およびSEQ ID No.30、SEQ ID No.9およびSEQ ID No.31、SEQ ID No.10およびSEQ ID No.32、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.33、SEQ ID No.12およびSEQ ID No.34、SEQ ID No.13およびSEQ ID No.35、SEQ ID No.14およびSEQ ID No.36、SEQ ID No.15およびSEQ ID No.37、SEQ ID No.16およびSEQ ID No.38、SEQ ID No.17およびSEQ ID No.39、SEQ ID No.18およびSEQ ID No.40、ならびにSEQ ID No.19およびSEQ ID No.41からなる、前記既知のHPVタイプ関連する、少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。 - 請求項29に記載の方法において、
前記一次増幅が、SEQ ID No.20およびSEQ ID No.42、SEQ ID No.21およびSEQ ID No.43、ならびにSEQ ID No.22およびSEQ ID No.44からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、およびSEQ ID No.63からなる群から選択される、方法。 - 請求項31に記載の方法において、
前記二次増幅が、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、およびSEQ ID No.66からなる群から選択された、少なくとも一つの伸長プライマーをさらに含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のHPVタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。 - 請求項18に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。 - ほ乳類の生体試料におけるHPV-DNAの検出、同定、および/または定量のための方法において、
ほ乳類の生体試料からDNAを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたDNAの少なくとも一部のPCRによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記HPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のHPVタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のHPVタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含み、
前記一次増幅が、少なくとも一つの競合配列で実質的に対応する既知のHPVタイプに対する少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
少なくとも一つの伸長プライマーが、同じ前記既知のHPVタイプと関連する、方法。 - 請求項35に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、およびSEQ ID No.85からなる群から選択され、
少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組が、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.23、SEQ ID No.2およびSEQ ID No.24、SEQ ID No.3およびSEQ ID No.25、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.26、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.27、SEQ ID No.6およびSEQ ID No.28、SEQ ID No.7およびSEQ ID No.29、SEQ ID No.8およびSEQ ID No.30、SEQ ID No.9およびSEQ ID No.31、SEQ ID No.10およびSEQ ID No.32、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.33、SEQ ID No.12およびSEQ ID No.34、SEQ ID No.13およびSEQ ID No.35、SEQ ID No.14およびSEQ ID No.36、SEQ ID No.15およびSEQ ID No.37、SEQ ID No.16およびSEQ ID No.38、SEQ ID No.17およびSEQ ID No.39、SEQ ID No.18およびSEQ ID No.40、ならびにSEQ ID No.19およびSEQ ID No.41からなる群から選択され、
少なくとも一つの伸長プライマーが、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、およびSEQ ID No.63からなる群から選択される、方法。 - 請求項35に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のHPVタイプに関連した少なくとも一つの順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。 - 請求項35に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。 - 請求項35に記載の方法において、
前記測定段階が、約200アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。 - 請求項35に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。 - 請求項35に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のHPVタイプのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のHPV-DNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、異なる既知のHPVタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。 - 請求項41に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、HPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、および82のうちの二つ以上を含む、方法。 - 請求項41に記載の方法において、
前記複数の既知のHPVタイプが、少なくともHPVタイプ16、18、23、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、および82を含む、方法。 - 請求項41に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下でPCRによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのDNA配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、PCRによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。 - 請求項35に記載の方法において、
前記一次増幅が、erbB-2遺伝子のDNA配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下で前記抽出されたDNAを含み、
前記競合配列が、前記erbB-2遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。 - 請求項35に記載の方法において、
前記一次増幅が、
SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、およびSEQ ID No.88からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列と、
SEQ ID No.20およびSEQ ID No.42、SEQ ID No.21およびSEQ ID No.43、ならびにSEQ ID No.22およびSEQ ID No.44からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組と、
を含み、
前記二次増幅が、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、およびSEQ ID No.66からなる群から選択された、少なくとも一つの伸長プライマーを含む、方法。 - 合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物DNAの検出、同定、および/または定量のための競合配列であって、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、およびSEQ ID No.88からなる群から選択された、競合配列、
を含む、合成ポリヌクレオチド。 - 一対の合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物DNAの検出、同定、および/または定量のための順方向および逆方向プライマーであって、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.23、SEQ ID No.2およびSEQ ID No.24、SEQ ID No.3およびSEQ ID No.25、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.26、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.27、SEQ ID No.6およびSEQ ID No.28、SEQ ID No.7およびSEQ ID No.29、SEQ ID No.8およびSEQ ID No.30、SEQ ID No.9およびSEQ ID No.31、SEQ ID No.10およびSEQ ID No.32、SEQ ID No.11およびSEQ ID No.33、SEQ ID No.12およびSEQ ID No.34、SEQ ID No.13およびSEQ ID No.35、SEQ ID No.14およびSEQ ID No.36、SEQ ID No.15およびSEQ ID No.37、SEQ ID No.16およびSEQ ID No.38、SEQ ID No.17およびSEQ ID No.39、SEQ ID No.18およびSEQ ID No.40、SEQ ID No.19およびSEQ ID No.41、SEQ ID No.20およびSEQ ID No.42、SEQ ID No.21およびSEQ ID No.43、ならびにSEQ ID No.22およびSEQ ID No.44からなる群から選択された、順方向および逆方向プライマー、
を含む、合成ポリヌクレオチド。 - 合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物DNAの検出、同定、および/または定量のための伸長プライマーであって、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、およびSEQ ID No.66からなる群から選択される、伸長プライマー、
を含む、合成ポリヌクレオチド。 - 生体試料中の微生物DNA検出のためのキットにおいて、
容器と、
請求項47、48、および49に記載の合成ポリヌクレオチドのうちの一つ以上と、
を含む、キット。
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