JPH06502298A - ポリメラーゼ・チェーン・リアクションを用いたヒト・パピローマウイルス16型の診断方法 - Google Patents
ポリメラーゼ・チェーン・リアクションを用いたヒト・パピローマウイルス16型の診断方法Info
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- JPH06502298A JPH06502298A JP3512559A JP51255991A JPH06502298A JP H06502298 A JPH06502298 A JP H06502298A JP 3512559 A JP3512559 A JP 3512559A JP 51255991 A JP51255991 A JP 51255991A JP H06502298 A JPH06502298 A JP H06502298A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ポリメラーゼ・チェーン・リアクションを用いたヒト・パピローマウィルス16
型の診断方法本発明は、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR)を用
いたヒト・パピローマウィルス(HPV)、特にHPV16の改良された検出方
法に関する。
パピローマウィルスはヒトや他の哺乳動物に様々な疾患を起こす密接に関連した
ウィルスの一群である。現在では57以上の種々の型のヒト・パピローマウィル
スがある。新しい型の定義は、標準プロトコルにより液相でそれが既知の種のD
NAと50%以下の交差ハイブリッド形成を有することである。数々のヒトの疾
患は特定のパピローマウィルス型によるものである;例えば足底いぼはパピロー
マウィルス1型により、また尋常性症贅はパピローマウィルス7型による。
ヒト・パピローマウィルスは子宮頚癌の発生にも関係している(zur Hau
sen、 1977) oこれは、HPV感染が子宮頚部上皮内異常増殖(CI
N)および子宮頚部の侵潤性癌腫を有する患者に高い割合で存在するという観察
に基づいていた(Walkerら、 1983)。
特定のHPV型のクローン化DNAが入手できることにより、一連のハイブリッ
ド形成実験を用いて、疾患組織のHPV感染の存在を判定することが可能となっ
た。これらの実験は、顕著なCIN病変および侵潤性癌の60−90%がHPV
DNA配列を含むが、正常対照の間でのHPVDNAの感染率は9−23%で
あることを示した。HPVのいくつかの型、例えばHPV16.31.33およ
び35は子宮頚部の悪性腫瘍変化により強く関係しており、−次ヒト・ケラチノ
サイトを不死化し、かつ確立された細胞系をトランスフオームすることが分子分
析から明らかである。HPV6および11のようなHPVの他の型は良性病変お
よび尖形コンジロームと関連している。これらのデータは、HPV感染、特にH
PV16が確かに鱗状癌の原因または誘因物質であるという仮説を支持する。
PCRC3aikiら、1988)は、標的配列の反射路にハイブリッド形成す
る2つのオリゴヌクレオチドブライマーを用いる、DNA標的フラグメントの酵
素的増幅に基づいている。プライマーはその3′末端が互いに対向するように方
向を定められている。
最近の2つの研究(Youngら、1989、Tidyら、1989)はPCR
を用いて、子宮頚部組織からの特定のHPV配列を増幅した。これらの研究者に
より用いられた条件下では、他のハイブリッド形成研究とは対照的に、正常集団
におけるHPV型についての陽性シグナルは70−84%であることが示された
。最近、ひとつの研究(Tidyら、1989)が一部撤回され(Tjdyおよ
びFarrel I、1989)、その結果、子宮頚部のHPVの存在を同定す
るためにPCRを用いることに関連した問題が興味をひくようになった。
Ti dyらは、上流調節領域内の配列(ヌクレオチド7765−75)を増幅
し、一方Youngらはオリゴヌクレオチドブライマーを用いてE6遺伝子内の
ヌクレオチド421−540の領域を増幅した。
これらの研究で報告されているHPV16感染の発生率は、サザンプロット、フ
ィルター1n−situハイブリッド形成、ドットブロット研究およびイ<ツか
のPCR研究(Van der Brute、 1989)からのデータと比較
した場合、驚く程高い。これらPCR研究で同定された高い感染率は、オリゴヌ
クレオチドブライマーが対象の標的DNA配列に対して特異性を示す能力がなく
、試料中に存在する他のパピローマウィルス型の増幅DNAフラグメントをもた
らした結果であると説明できる。
PCR反応の基本的必要事項はDNA配列(この配列に対してプライマーは相補
的である)に特異的で、標的配列の効率的増幅を可能にするオリゴヌクレオチド
ブライマーを入手できることである。“特異的″とは、オリゴヌクレオチドの配
列が標的配列の1、末端の一方または他方以外に、PCR反応で分析しようとす
る試料中に存在するどのDNA配列とも、有意な度合でハイブリッド形成しない
ことを意味する。
他の密接に関連したパピローマウィルス型、特に6、l118および3I型とH
PVI 6DNA配列を比較した広範囲にわたる、コンピューターによる相同性
と配列整合性調査の結果、我々はパピローマ・ウィルスの16型に特有のHPV
16ゲノムの領域を同定した。これらの領域は本発明で用いられる好適な標的を
提供する。
HPVI6DNAは顕著な子宮頚部疾患の宿主細胞DNAにE6とE7遺伝子だ
けが転写されるように組み込まれることが知られている。組み込みは、オーブン
・リーディング・フレームElおよびE2を破壊するように起こる。この情報を
用いて、我々はHPVI6のE6遺伝子の遠位領域およびE7遺伝子の基部領域
にハイブリッド形成する2つのプライマーを選択した。E6遺伝子の翻訳停止コ
ドンとE7タンパク質のメチオニン開始コドンとの間の距離は2ヌクレオチドで
あるが、密接に関連したHPV6および11において、E6タンパク質の終止コ
ドンはE7タンパク質のメチオニン開始コドンと24ヌクレオチド重複腰その結
果プライマーとHPV6および11との間のどのようなミスマツチプライマー結
合も種々の大きさの増幅体(ampl imar)のためにすぐにわかるだろう
。従って、この領域にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを利用して、H
PV16標的DNAの増幅領域を特異的に同定できる。
従って本発明はオリゴヌクレオチドA:5’ GGGGTCGGTGGACCG
GTCGATGTA 3’およびその誘導体を提供する。
本発明はまたオリゴヌクレオチドB:
5’ GGGCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTC3’およびその誘導
体を提供する。
完全長の配列AおよびBは、HPVI6ゲノムのそれぞれ489−512位およ
び689−712位でハイブリッド形成する。
AおよびBの誘導体には少なくともIOヌクレオチド長のAおよびBのフラグメ
ントおよびそのようなフラグメントを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。その
ようなフラグメントを含むオリゴヌクレオチドは例えば10−40、好ましくは
12−24ヌクレオチド長のPCRプライマーとして用いるのに好適な大きさで
ある。望ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドはAおよびBが誘導される領
域に隣接する天然HPV16配列から得られる。通常、そのようなオリゴヌクレ
オチドはAについては477−524位から、そしてBについては677−72
4位から得られるだろう。
少なくともIOl例えば12.15.18または21ヌクレオチド長のAおよび
Bのフラグメントは24ヌクレオチド長の配列AおよびBから得られる連続配列
に相当する。好ましくは、AおよびBのフラグメントおよびこのようなフラグメ
ントを含むオリゴヌクレオチドは、例えば50%以上の、高いGC含有量を有す
る。
特にことわらない限り、以後オリゴヌクレオチドAおよびBと記載するものは、
上で定義したようなAおよびBの誘導体も含む。
本発明はまた試料中のHPVl 6DNAの存在を検出するための一対のPCR
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドAとBを提供する。
本発明はさらに、HPVI6に特異的な上で定義しているオリゴヌクレオチドを
作製し、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR)により試料中のHP
V16DNAを検出するためにこれらのオリゴヌクレオチドを用いることからな
る、試料中のHPV16DNAの存在を検出する改良された方法を提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドは標準PCR条件下(Saikiら、1988)で
用いられる。分析されるDNAの試料をオリゴヌクレオチドAおよびBと共に反
応混合物に加え、試料中のD N Aを変性するために加熱し、オリゴヌクレオ
チドAおよびBがその標的配列とアニーリングするように冷やし、DNAポリメ
ラーゼ、例えばTaqポリメラーゼを加えることによりPCR反応を開始させる
。
反復サイクルにより、例えば加熱およびアニーリングを20−40サイクル繰り
返し、必要に応じて各サイクル中に新しいポリメラーゼを添加することにより標
的DNAの増幅が得られる。通常、各サイクルにおいて混合物を約95℃で約1
分間にわたり加熱し、約40℃で1−3分間アニーリングし、約72℃で1−2
分間反応させる。
一般に、PCR緩衝液は、10−5010−5O、好ましく ハ20−30mM
ノTris−HCI、 10−25mMの、好ましくは15−20mMの硫酸ア
ンモニウム、1−10mMの、好ましくは2−5 mMの塩化マグネシウム、5
−13mMの、例えば8−12mMノ2−ノル−プトエタノール、0.001−
0.004%のゼラチン、100−300mMの各デオキシヌクレオチド三リン
酸(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)を含む。望ましくは、15
μM以下、例えば1−10または1−5μM (最終濃度)のプライマーAおよ
びBを反応に(有利には等モル量で)用い、そして0.5−5単位のTaqポリ
メラーゼを用いて反応を開始させる。
PCR反応は、90−98℃で1−10分間の変性、続t、1テ20−40、例
えば30〜35サイクルの増幅により行われることが好ましく、lサイクルは、
90−98°Cで1−3分間の変性、50−70℃で1−3分間のプライマー・
アニーリング、そして60−80℃で1−4分間のDNA重合を意味する。
本発明のオリゴヌクレオチドは下記の条件下で用いることが最も好ましい:反応
緩衝液は、25mMのTris−HCI/pH8,4,17mMの硫酸アンモニ
ウム、3mMの塩化マグネシウム、l0mMの2−メルカプトエタノール、0.
002%のゼラチン、1μMのHPV16プライマー、】単位のTaqポリメラ
ーゼ、200μMの各デオキシヌクレオチド三リン酸(デオキシアデノシン三リ
ン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシグアノンン三リン酸、およびデオキ
シチミジン三リン酸)である。PCRは下記のように行うこともできる。
95℃で6分間の変性、続いて35サイクルの増幅を行い、lサイクルは、94
℃で1分30秒間の変性、60℃で1分30秒間のプライマー・アニーリングそ
して72℃で2分間のDNA重合を意味する。
35回目のサイクルの後、試料は72℃でさらに10分間インキュベートするこ
とが好ましい。
上記反応は、3mMの塩化マグネシウムを用いること、Taq緩衝混合液中に最
終濃度lμMの濃度で各プライマーが存在すること、そしてアニーリング温度6
0℃を用いる点で、5aikiら(1988)により詳述された方法とは異なっ
ている。これらの変更によりプライマーHPV16AおよびBとの反応の忠実度
が高められる。
図面の説明
図1は、上記のプライマーAおよびBを用いたPCRによる、異種DNAおよび
他のHPV型のDNAの存在下におけるHPV16DNAの同定を示す。上記の
最適反応条件下においてHPV16は増幅されるが、関連するパピローマウィル
スの増幅へ導く交差反応は全く見られない。
図2は、HPV16検出の感度が5ゲノム当量であったことを示す。感度の低下
なしに特異性を維持することは、本発明で記載された条件およびプライマーの重
要な一面であり、正常な女性および疾患を有する女性からの子宮頚部塗抹標本中
のHPV16の正確な検出に役立つ。
図3および4は、実施例1で記載された実験の結果を示す。
図5は、HPV16のヌクレオチドl−1000の配列を示す。記載された配列
はE M B Lデータベース人力PA16を示す。
下記の実施例に記載されているように、プライマーAおよびBを用いたHPV1
6の診断は、HPV16の感染率が、例えばYoungら、1989およびTi
dyら、1989他で測定されたものよりも低いことを示している。これは、少
なくとも5ゲノム当量のHPV16を含む全ての試料を正確に同定しながらも、
我々のプライマーの高い特異性が以前に達成されたものよりもはるかに少ない偽
陽性をもたらすためである。
子宮頚部の病変に関しては“正常”であると予想された一般集団の試料からと、
顕著な子宮頚部疾患を有していると同定されたこれら同じ女性の部分集団からの
、子宮頚部塗抹標本から抽出されたDNA中の)(PV16DNAを検出するた
めの本発明に記載された診断方法の有用性が、それぞれ実施例1および2に記載
されている。PCR反応にオリゴヌクレオチドAおよびBを用いて、我々は一般
集団中のHPV16感染率が他のPCRによる研究で測定されたそれよりも低く
、18.9%であるらしいことを明示する。
さらに、実施例2が示すように、我々のプライマ一対を用−いた子宮頚部塗抹標
本のHPV16の検出は、疾患の現状と相関しているように思える。従って、細
胞学のような既存の方法と共に用いる場合、本発明は顕著な子宮頚部疾患を有す
る患者を同定する診断方法として用いられ、子宮頚癌へと進行する高い危険性を
有する患者を識別することにも用いられる。
実施例1
1987年5月−9月に、細胞学および膣鏡検査と合せて子宮頚部スクリーニン
グ・サービスを、ロンドンとハートフォードシャーの境界に近い一般診療所の全
ての成人女性患者に(彼等が最後に子宮頚部塗抹標本検査を行った時期に関係な
く)提供した。その診療所は圧倒的に中産階級地区にあった。21才以上の28
79人の全女性患者のうち249人の女性がこのサービスに進んで参加した。
実験群の249人の女性は細胞学、膣鏡検査、そしてG11esら(1988)
に記載されているような特定生検の組織学的分析により調へた。各患者から2つ
の子宮頚部塗抹標本を採取した:ひとつは標準細胞学的検査のためてあり、他の
ひとつはあとに続く、ウィルス学的分析に用いるために冷たいリン酸緩衝溶液1
0m1に入れた。
これらの細胞を遠心により集め、Sambrookら(1989)に記載されて
いるように5DS−プロテイナーゼに溶解およびフェノール/クロロホルム精製
、その後のエタノール沈澱によりDNAを抽出した。
このように単離されたDNA 1μgをPCR分析にかけた。PCR反応緩衝液
は、25mMのTris−HCI/pH8,4,17mMの硫酸アンモニウム、
301Mの塩化マグネシウム、10mMの2−メルカプトエタノール、0.00
2%のゼラチン、lμMのHPV16プライマー、1単位のTaqポリメラーゼ
、200MMの各デオキシヌクレオチド三リン酸(デオキシアデノシン三リン酸
、デオキシンチジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、およびデオキシチ
ミジン三リン酸)を含有していた。PCRは95℃で6分間の変性、続いて35
サイクルの増幅により行い、lサイクルは94℃で1分30秒間の変性、60℃
で1分30秒間のプライマー・アニーリングそして72℃で2分間のDNA重合
を意味する。15試料から得られた結果を図3および4に示す。全ての試料は、
コード化された子宮頚部塗抹標本試料から抽出したDNAを用いて、別々に2回
分析された。矛盾した結果が得られた試料をさらに2回のPCR分析にかけ、最
初の陽性シグナルの原因となるHPV16DNAの混入を除外した。各分析にお
いて、それぞれクローン化HPV16DNAおよび水からなる陽性および陰性対
照を用いて、結果を確認し、混入による偽陽性シグナルを避けた。
累積的分析により、これら女性において、18.9%(47/249)のHPV
16の感染率が得られた。
実施例2
実施例1で検査された249人の女性の膣鏡検査は29人の女性が実際に子宮頚
部異常を有し、これらは子宮頚部疾患の下記の段階に段階針けし得ることを示し
た。
CIN I n=16
CIN2 n=8
CIN3n=5
この出願に記載された我々のPCRを用いた場合、これらの患者のHPV16の
感染率は下記のようであった。
疾患の段階 HPV陽性の数 患者の数 HPV陽性の%ClN3 4 5 8
0
CIN2 4 8 50
CINI 2 16 12.5
正常 37 220 16.8
合計 47 249 18.9
従って、上記の方法を用いて、HPVI6が顕著な子宮頚部疾患(CIN3)を
有する5人の女性のうち4人に、中程度の疾患(]IN)を有する8人の女性の
うち4人に、軽症/境界線上の疾患(CINI)を存する14人の女性のうち2
人に検出された。
子宮wi部異常のない女性において、37/220の女性はHPVI6陽性であ
り、細胞学的に正常な女性集団において16.8%のHPV感染率であった。軽
症または全く疾患のない女性と顕著な疾患(CIN2または3)を有する女性の
HPVI6保持状態の全体的比較により、HPVI6は子宮頚部疾患と関連して
いることが示された。
opvis保持状態 CI N 2/3 グループの全数なし あり
陽性 39 8 47
これらの結果は、下に示すように感度、特異性、陽性予想値および陰性予想値お
よび相対的危険度について評価するために用いられる。
感 度 8/13 (0,62)
特 異 性 197/237 (0,83)陽性予想値 8/47 (0,17
)
陰性予想値 197/202 (0,98)相対的危険度 6.9
この診断検査の陰性予想値および特異性は高いが、顕著な子宮頚部疾患を有する
女性を同定するためにHPVI6のみを用いる陽性予想値は低い。すなわち多く
の正常な女性がHPVI6を有している。しかしながら、顕著な子宮頭部疾患を
有する女性は、その塗抹標本に6.9倍も多くHPVI6を有する。
これらのデータを基にして、本発明に記載された方法は顕著な子宮頚部疾患の危
険のある女性を同定できる可能性があり、子宮頚癌に進行する女性を同定するた
めの診断的価値を有する。
実施例3
この実験群(実験群B)は・軽度の子宮頚部異常の塗抹標本レポートにより継続
的にRoyal Free Ho5pitalの膣鏡検査クリニックに通院して
いる200人の患者から成っていた。この集団の臨床的詳細はGi Iesら(
1988)に記載されている。最終的な診断はこの群の21人の女性には行なわ
れず、これらはPCR分析がら除外された。この集団の平均年令は29才であっ
た(INを有する女性の平均年令は26.9才;病理学的に正常な子宮頚部を有
する女性の平均年令は33.5才)。各患者から2つの子宮頚部掻き取り試料を
採取した;ひとっは標準細胞学分析に用い、他のひとつは冷たいリン酸緩衝溶液
10m1に入れた。後者の試料の細胞を遠心によりベレット化し、DNAを5D
S−ブロティナーゼに溶解で抽出し、フェノール/クロロホルム抽出およびエタ
ノール沈澱により精製した。
ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(P CR)を実施例1に記載したよう
に行った。
結果の分布の統計的分析はN2または適宜にフィッシャーの正確なテストを用い
て決定した。重い疾患とHPVI6を有する相対的危険は、HPV16陽性群の
疾患の発生率をHPV16陰性群の疾患の発生率で割ることにより計算した。
実施例1−3の考察
本発明のPCRアッセイを用いて、軽度の疾患を示す塗抹標本で膣鏡検査クリニ
ックに照会された179人の女性から得られた子宮頚部掻き取り試料中のHPV
l 6DNAを検査した。この実験集団中のHPVI6の全体的感染率は表1に
示す。さらに、実施例1ににおける女性(実験群A)のHPVI6の感染率も示
す。
2つの実験集団では、HPVI6の感染率において有意差があった。HPVI6
を実験群Aの33人の女性(18%)から、また実験群Bの109人の女性(6
1%; p <0.0001)から検出した。
全ての患者の膣鏡検査および適宜に生検試料の組織検査の後に、両実験集団の女
性は次のグループに分けられた:正常、いぼウィルス感染(WVI) 、CIN
I、(、IN2、ClN3゜実験群A(実施例1)およびB(実施例3)の各グ
ループのHPV16感染率は表2に示す。HPVI6は両実験群において高い等
級のCIN、特にClN3を有する患者に感染率が高かった(実験群Aては75
%、実験群Bでは74.3%)。各実験集団中のCI N 2とClN3グルー
プ両方のHPVlGの感染率は有意差がなかった。
しかしながら、実験群BのCINIを有する女性は実験群AのCTNを有する女
性よりもHPV16陽性が多いようであった(p< 0.03)。さらに、両実
験集団の子宮頚部異常の徴候が全くない女性のHPV16保持状態の分析は2つ
の実験集団間で有意差を示した( p < 0.0001)。
子宮頚部疾患を全く持ったことのない女性と組織学的に子宮頚部異常と示された
女性とのHPVI 6!@染率の比較を表3に示す。
これらのデータは2つの実験集団を一緒にすることにより得られ、HPVI6が
子宮頚部疾患をもった女性により多く存在しているらしい(p < 0.000
1)ことを示す。異常な子宮頚部病変を有する女性を軽症段階(WVIとCIN
I)または重症段階(CIN2とClN5)疾患に従って段階分けした場合、後
者のグループはHPVI6を保持している可能性が高いようである(表4;pく
0、0002)。
HPVI6を有することと重症の子宮頚部疾患(CIN2とClN5)とに関連
した相対的危険度を両実験集団について計算し、表5に示す。実験群AではHP
VI6に関連した相対的危険度が5.68であるのに対し、実験群Bでは相対的
危険度が1.48である。
体的発生率
(本頁以下余白)
表2.実験集団AとBにおける病理学的に正常な子宮頚部、イホウイルス感染(
WVI)、CINI、ClN2およびCTN3と最終診断された女性のHPV
16DNAの発生率。各グループの2つの実験集団間の統計的有意差も示す(n
、 s、 =有意差なし)。
表3.病理学的に正常な子宮頚部を有する女性(すなわち子宮頚部異常の病歴な
し)と任意の程度の異常子宮頚部病変を有する女性とのHPV16DNA感染率
の比較。異常子宮頚部病変グループは実験群AとBの女性から成っていた。
X’=4]、4 : p<0.0001表4.軽症の子宮頚部疾患(CINI)
および重症の子宮頚部疾患(ClN2とCrN5)の女性のHPV16DNAの
感染率。分析は実験群AとBの結果を合せることにより得たデータに対して行っ
た。
X 2=14.3; p<0.0002表5.実験集団AとBにおけるHPV1
6DNAの存在と重症子宮頚部疾患とに関連した相対的危険度匁壓
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Immunol、 78. l。
HPV 16 DNAの量
PV16プライマーで増幅した子宮頚部塗抹標本試料1 23 As 6789
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AGAACCA 人Aλ丁GACAにT GATACACCTC国際調査報告
mywnemAeplm ahv Orインno Q’、/n1つ1り国際調査
報告
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(72)発明者 バヴイン、ペギー ジェーンイギリス国 エヌダブリュ32キ
ユージー ロンドン ハムステッド、ポンド ストリート、ロイヤル フリー
ホスピタルスクール オブ メディシン デパートメント オブ ヴイロロジ−
(72)発明者 ウォーカー、パトリックイギリス国 エヌダブリュ32キユー
ジー ロンドン ハムステッド、ポンド ストリート、ロイヤル フリー ホス
ピタルスクール オブ メディシン デパートメント オブ オブステトリック
ス アンド ガイニコロジー
Claims (10)
- 1.ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR)に用いるオリゴヌクレオ チドプライマーがオリゴヌクレオチドA:【配列があります】 およびその誘導体と、オリゴヌクレオチドB:【配列があります】 およびその誘導体であることを特徴とする、PCRを用いて試料中のHPVl6 DNAを検出することを含んでなる、試料中のHPVl6の存在を検出する方法 。
- 2.プライマーがオリゴヌクレオチドA:【配列があります】およびB: 【配列があります】である、請求の範囲1記載の方法。
- 3.プライマーが1μMの濃度でPCRに用いられる、請求の範囲1または2記 載の方法。
- 4.試料が子宮頸部塗抹標本である、請求の範囲1−3のいずれか1つに記載の 方法。
- 5.プライマ−A: 【配列があります】 またはその誘導体およびプライマ−B:【配列があります】 またはその誘導体である一対のPCRプライマーと、場合によりPCRに好適な 緩衝液とを含んでなる、試料中のHPVl6DNAの存在を検出するキット。
- 6.プライマーがA 【配列があります】 およびB: 【配列があります】 である、請求の範囲5記載のキット。
- 7.オリゴヌクレオチドA: 【配列があります】 またはその誘導体。
- 8.オリゴヌクレオチドB: 【配列があります】 またはその誘導体。
- 9.集団からの試料を請求の範囲1−4のいずれか1つに記載の方法により、ま たは請求の範囲5または6記載のキットを用いて分析することを含んでなる、H PVl6の存在について集団をスクリーニングする方法。
- 10.集団が成人女性集団である、請求の範囲9記載の方法。
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