CA1340891C - Sondes a papillomavirus et procede de diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des papillomavirus, particulièrement des ADN-HPVs obtenus à partir de ces papillomavirus IP5 ou IP6, ou encore des sondes contenant ces ADN-HPVs ou des fragments obtenus à partir de ceux-ci. Elle concerne en outre des nécessaires ou "kits" contenant des groupes distincts de sondes, contenant l'un de ces ADN-HPVs ou fragments d'ADN-HPV, ainsi qu'un procédé de détection et d'identification de papillomavirus mettant en jeu ces différentes sondes.

Description

1 1.3~0~9ï
Sondes à papillomavirus et procédé de diagnostic in vitro d'infections à papillomavirus L'invention concerne des ADNs de papillomavirus, et plus particulièrement des sondes dérivées de ces papillomavirus, ainsi. que des procédés les mettant en oeuvre pour le diagnostic in vitro d'infections à
papillomavirus.
L'expression "papillomavirus" recouvre un grand nombre de virus ayant en commun d'être tenus pour responsables de plusieurs formes d'infections virales s'étageant entre les verrues cutanées ou de muqueuses, relativement bénignes, et des hyperplasies susceptibles de dégénérer en néoplasies intra-épithéliales et en cancers de la peau et des muqueuses. Parmi des infec-fions à papillomavirus, on mentionnera également plus particulièrement l'épidermodysplasie verruciforme, qui sera quelquefois ci-après désignée sous l'expression "EV".
Un certain nombre de types de papillomavirus a déjà été décrit. La demande de brevet européen n°
85.402362.9-2105 déposée le 29 novembre 1985 et publiée le 10 septembre 1986 sous le n° 0192001, décrit un certain nombre de types et sous-types nouveaux de papillomavirus qui ont été isolés à partir de verrues, de lésions maculaires, susceptibles de donner lieu au développement de cancers de la peau chez d'importantes proportions des malades qui en sont affectés, et à
partir de lésions pré-cancéreuses de la peau, de lésions d'hyperplasies orales et d'un cancer du col de l'utérus.
Le rôle majeur de divers types de virus de pa-pillomes humains (HPV) dans la genèse des néoplasies a été reconnu. leur pathogénicité est également influencée par des facteurs génétiques divers, notamment immuni-taires et/ou extrinsèques, tels que des rayonnements actiniques ~ dans la pathogénèse des infections aux 13~U~9~

2 papillomavirus.
Plusieurs types et sous-types de papillomavirus nouveaux ont été identifiés dans la demande antérieure.
L'utilisation, dans des techniques de diagnostic in vitro plus affinées, des ADNs de ces papillomavirus nouveaux, pris isolément ou en association, entre eux et/ou avec des ADNs d'HPV antérieurement connus, a également été décrite dans cette demande.
D'une façon générale, il a été remarquê dans la demande européenne que les papillomavirus, bien que très différents entre eux, avaient des tailles de l'ordre de 7000-8000 paires de bases. En outre, leurs génomes peuvent présenter certains degrés d'homologie, évalués en pourcentages d'homologies entre types et sous-types de papillomavirus, dans des essais d'hybridation réalisés dans des conditions dites non stringentes ou non strictes ou encore dans des conditions d'hybridation stringente ou stricte.
I1 a été dit que les papillomavirus qui pré-Sentent des pourcentages d'homologie inférieurs à 50 dans des conditions strictes ou stringentes apparte-naient à des types différents. Les virus pour lesquels on observe, dans r_es conditions strictes ou stringentes, des pourcentages d'homologie supérieurs à 50 ~ sont considérés comme appartenant au même type. Ils peuvent former des sous-types différents au sein de ce mie type.
Les essais d'hybridation dans les conditions non strictes ou non stringentes impliquent la mise en con-tact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans les conditions suivantes décrites par HEILMAN C.A.
et al. 1980, J. Virol., 36, 395-407, et CROISSANT et al, 1982, C.R. Acad. Sc. Paris, 294, 581-586 (molécules hétéroduplexes).
Les essais d'hybridation dans les conditions ~3~~89_t

3 strictes ou stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans les conditions décrites par HEILMAN C.A. et al., 1980, et KREMSDORF, D. et al. ((1982), J. Virol. 43:436-447 et 1983, J. Virol. 48:340-351) et DAVIS R.W. et al., 1971, Methods Enzymol., 21, 413-418 (molécules hétérodu-plexes).
Partant de ces considérations, plusieurs virus nouveaux ont fait l'objet d'une description dans la de-mande antérieure. De mëme ont été décrits des recombi-nants génétiques comprenant tout ou partie des génomes (dénommés ADN-HPVs) de ces virus. L'invention de la demande antérieure concernait par conséquent chacun des ADN-HPVs choisis parmi l'ensemble des ADNs qui pré-sentent des tailles qui s'étagent entre 7000 et 8000 paires de bases et sont caractérisés par les cartes de restriction qui apparaissent dans les dessins également reproduits dans cette demande, en ce qui concerne plus particulièrement les ADN-HPVs obtenus à partir des PaPillomavirus et qui répondent aux désignations HPV2d, HPV10b, HPV14a, HPV14b, HPV15, HPV17a, HPVl7b, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV28, HPV29, HPV31, HPV32, HPV-IP2 et HPV-IP4.
L'invention de la demande antérieure concernait également des mélanges ou "cocktails" d'ADN-HPVs isolés à partir des papillomavirus nouveaux ou antérieurement connus, à la date de dépôt de la demande antérieure, ou des sondes d'hybridation les contenant et. susceptibles d'être mis en oeuvre plus efficacement pour le diagnostic de diverses catégories d'infections, voire des niveaux de risques qu'accompagnent la découverte chez un patient de papillomavirus déterminés. Le nombre des sondes à papillomvirus décrites dans la demande antérieure, auxquelles s'ajoutent celles constituées à
Partir des ADNs génomiques de papillomavirus déjà isolés précédemment et leurs associations dan;; des mélanges 1~~~~9i

4 déterminés, permet donc la réalisation de diagnostics affinés, notamment une grande discrimination des di-verses catëgories d'infections imputables aux divers types de papillomavirus ou susceptibles de se développer sous l'effet de ces derniers types et, au sein d'une catégorie d'infections déterminées, de mieux pro-nostiquer le degré de risque que ces derniéres se trans-forment en des maladies plus redoutables. En particu-lier, l'invention de la demande antérieure fournissait des moyens permettant, dans le cas des infections se manifestant par des épidermodysplasies verruciformes, de mieux apprécier le degré de risque que ces dernières évoluent vers des cancers cutanés.
A ce titre, l'invention de la demande antérieure concernait plus particulièrement des compositions de diagnostic ; un groupe de compositions préférées était défini comme contenant .
1) au moins l'ADN de l'HPV2d, 2) au moins l'un des ADNs de HPV10b, 28 et 29, 3) au moins l'un des ADNs de HPV17, 24, 4) au moins l'un des ADNs de HPV14, 15, 17,. 19, 20, 21, 22, 23 et IP4,

5) au moins l'un des ADNs de HPV15 et 17,

6) l'ADN de HPV24,

7) l'ADN de HPV14, 32 et IP4,

8) l'ADN de HPV31,

9) l'ADN de HPV32,

10) au moins l'un des ADNs de HPV16, 18 et IP2, étant entendu que les ADNs des dix groupes étaient choi sis de façon à être en toutes circonstances différents les uns des autres.
Dans le groupe 10) l'ADN de HPV-IP2 est, de préférence, associé à l'ADN de HPV16 ou de HPV18.
Dans les figures 1 à 10 des dessins ci-annexés, sont représentées les cartes physiques de restriction des ADN-HPVs concernés.

134~û~9.i Les cartes physiques donnent les positions de sites de coupure par diverses endonucléases de restric-tion. L'origine des cartes est généralement constituée par un site unique de coupure. Les distancies à l'origine 5 sont exprimées en pourcentage de longueur de génome.
La présente invention concerne des papillomavi-rus nouvellement isolés, les ADNs génomiques qui peuvent en être extraits ou des fragments de ces ADNs génomi-ques, ainsi que de nouvelles sondes d'hybridation qui peuvent être formées à partir de ces ADN-HPVs ou frag-ments d'ADN-HPVs.
L'invention concerne aussi un procédé de fabri-cation d'une sonde d'ADN-HPV, caractérisé par le clonage d'un vecteur dans un hô te approprié, ce vecteur ayant Prëalablement été modifié par recombinaison in vitro de tout ou partie d'un ADN d'un virus choisi parmi HPV-IP5 et HPV-IP6 et d'un vecteur approprié, pour obtenir un ADN-recombinant contenant cet ADN dans un site de ce vecteur permettant son clonage dans cet hôte, notamment dans une bactérie, et par la récupération et la purifi-cation de l'ADN recombinant cloné. Avantageusement, le vecteur utilisé est un plasmide ou un phage capable d'être répliqué dans un micro-organisme procaryote, tel que ~ coli.
De Préférence encore cette sonde.ADN-HPV est encore marquée, pour faciliter les conditions de son utilisation. On peut avoir recours à tout principe de marquage radioactif immunofluorescent enzymatique, etc..
L'invention concerne encore des "cocktails"
nouveaux de sondes les contenant ou leur utilisation dans des "cocktails°' de sondes déjà décrits dans la demande antérieure, cependant complétés avec l'un ou l'autre des ADN-HPVs faisant l'objet de la présente demande et, par conséquent, des trousses ou "kits" de diagnostic encore davantage perfectionnés.
Les ADN-HPVs selon la présente invention sont caractérisés par les cartes de restrictions faisant les objets des figures J_'~ w!-. i.L ~'~ respectivement dénommés HPV-IPS et HPV-IP6.
Les sondes d'hybridation construites à partir du génome de HPV-IP5 ou du génome de HPV~-IP6 sont particu-Lièrement utiles, pour le diagnostic et/ou le dépistage .in vitro, dans les conditions, qui ont été décrites dans :La demande antérieure et qui seront encore décrites plus loin, des types de papillomavirus qui constituent un :risque pour le développement de néoplasies génitales et, en particulier, de cancers du col de l'utérus.
Ces sondes d'hybridation seront avantageusement incorporées aux mélanges de diagnostic des affections du même type sur lesquels il sera revenu plus loin.
~5 L'invention concerne également des fragments des ADN-HPVs précédents ou capables de s'hybrider avec ceux-c:i, notamment dans des conditions strictes. De mê me, elle concerne les ADNs recombinants contenant tout ou partie de chacun des ADN-HPVs sus-indiqués, et plus par-20 ticulièrement des ADNs recombinants contenant des frag-ments correspondant aux gènes E1, E2, E6-E7,- L1, L2 et à
.La région intergénique, NC, respectivement ou encore des fragments contenant des séquences correspondant aux ré-gions intergéniques desdits ADN-HPVs. Elle concerne en-25 f:in les sondes qui peuvent être constituées à partir de ces ADN-HPVs respectifs ou à partir des fragments cor-respondants, et les procédés de diagnostic ~ 'tro met-tant en jeu lesdites sondes.
Les préparations d'ADN viral ont été extraites 30 selon les techniques qui seront décrites ci-après dans l.es exemples 1 et 2.
Dans ce qui suit seront décrites de façon plus précise les conditions dans lesquelles les virus ont été
isolés, puis les conditions dans lesquelles ont été
35 obtenus les ADN-HPVs à partir de ces virus.

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Clonacre moléculaire et caractérisationd'un nouvau type d'HPV associé à des néoplasies crénitales et à des can-cers du col de l'utérus (HPV-IP5) L1n nouveau type d'HPV a été mis en évidence dans l'ADN extrait de biopsies de néoplasie~s intraépithé
liales (papules bowenoïdes du pénis), par hybridation moléculaire sur réplique, dans des conditions non strictes, avec une sonde d'ADN radioactive spécifique du HPV6 ou du HPV10. L'étude de la sensibilité de l'ADN de Cet HPV à plusieurs endonucléases de restriction a montré que l'enzyme EcoRI coupe une fois l'ADN viral.
Après digestion de l'ADN extrait des lésions par l'enzyme EcoRI, la fraction renfermant des molécules d'ADN de 8 kb a été purifiée par centrifugation dans un gradient de saccharose. Les molécules d'ADN de 8 kb ont été insérées, par le site EcoRI, dans l'ADN du bacté-riophage ~gtWES~B. Après encapsidation de l'ADN
recombinant et infection de bactéries Escherichia soli K12 (souche LA101), les bactériophages recombinants ayant intégré l'ADN de HPV ont été sélectionnés par la technique d'hybridation sur plages de lyse (Benton et Davis), en utilisant une sonde d'ADN radioactive spécifique de l'ADN du HPV6, dans des conditions non strictes. Plusieurs bactériophages recombinants, contenant la totalité des séquences virales, ont été
isolés. La coupure de l'ADN des bactériophages recombinants par l'enzyme d'insertion EcoRI engendre un fragment de 8 kb hybridant avec l'ADN du HPV6 dans des conditions non strictes. La coupure de l'ADN des bacté-riophages recombinants et de la préparation ADN extrait d es lésions par le mélange des endonucléases EcoRI et 1?stI engendre les mé mes sept fragments, dont le poids moléculaire total correspond à celui d'un génome de HPV
~( 8 k b ) .
L'ADN du nouvel HPV a été excisé des séquences de l'ADN phagique et recloné dans le plasmide pSP65. Une ~. a 4 ~.i ~ .~ ~_ carte de restriction de l'ADN viral a été construite à
partir de l'étude de la sensibilité de cet ADN à 16 endonucléases de restriction. 22 sites de coupure ont ainsi été localisés (fig. 1Q). La carte de restriction du nouvel HPV est différente de celle de tous les HPV
identifiés à ce jour. Le degré d'homologie entre l'ADN
du nouvel HPV et l'ADN des HPV identifiés à ce jour a été analysé par des expériences d'hybridation sur ré-plique, dans des conditions strictes, en utilisant une sonde radioactive préparée à partir de l'ADN purifië du nouvel HPV. Une homologie partielle a été détectée avec l'ADN du HPV18 et, à un degré moindre, du HPV26 et une homologie faible a étë détectée avc l'ADN des HBVs types 2, 6, 10, 13, 29, 31 et HPV-IP2. Le degré d'homologie entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN du HPV18 a été
déterminé plus précisément par des expériences de réassociation ADN-ADN en milieu liquide, suivie par un traitement des hybrides par la nucléase S1. Un taux d'hybridation de 2 ~ a été détecté entre ces deux ADNs.
2~ Le nouveau virus caractérisé à partir de papules bowenoïdes du pénis constitue donc. un nouveau type d'HPV, provisoirement dénommé HPV--IP5.
L'analyse, au microscope électronique, de molé
cules hétéroduplexes formées, dans différentes condi fions, entre l'ADN de HPV-IP5 et l'ADN du HPV-16 a per mis d'aligner les cartes physiques de ces deux génomes et de définir les positions théoriques de différents gènes portés par l'ADN d'HPV-IPS, par rapport à l'ori-gine de la carte de cet ADN. Les positions sont exprimées en pourcentages de longueur du génome à partir de cette origine (point 0 sur la carte de restriction de la fig. 1Q ) .

1~~0~91 Localisation putative des principaux gènes et de la région intergénique (NC) du HPV-IP5 E2 51,5-66 L2 69,5-89 NC 7, 5-18 L'utilisation de sondes radioatives préparées à
partir de l'ADN du HPV-IP5 purifié a permis de déterminer le pouvoir pathogène de ce virus. Au cours d'une étude de 1522 prélèvements de cellules cervico-vaginales, destinées à précier la fréquence de l'infection de l'épithélium du col de l'utérus par un HPV, HPV-IP5 a été mis en évidence dans 5 des 110 prélèvements contenant un HPV. D'autre part, HPV-IP5 a été détecté dans 3 des 93 biopsies de cancers invasifs du col de l'utérus analysées. Dans ces trois cas, l'intégration de la totalité des séquences d'ADN du HPV-IP5 dans l'ADN cellulaire a été observée.
HPV-IP5 constitue donc un type d'HPV génital, présentant un potentiel oncogène. I1 est donc souhai table de l'incorporer à tous mélanges d'ADN de HPV des tinés à la préparation de sondes moléculaires, en vue du diagnostic ou du dépistage des types d'HPV constituant un risque pour le développement de néoplasies génitales et, en particulier, de cancers du col de l'utérus.
~lonage moléculaire et caractérisation d'un nouveau type d'HPV associé à des lésions Qénitales (HPV-IP6 Un autre nouveau type d'HPV a été mis en éviden-ce dans l'ADN extrait de lésions vulvaires décrites comme des papillomes montrant ds atypies cellulaires minimes, par hybridation, dans des conditions strictes, avec une sonde d'ADN radioactive spécifique du HPV-31.

1~~-~8~.~
Une étude de la sensibilité de l'ADN de cet HPV à
plusieurs enzymes de restriction a montré que l'enzyme BamHI coupe une fois l'ADN viral. Après digestion de l'ADN extrait des lésions par l'enzyme BamHI, les 5 molécules d'ADN de 8 kb ont été purifiées par centrifugation dans un gradient de saccharose, puis insérées par le site BamHI dans l'ADN du bactériophage lambda L 47.1. Après encapsidation de l'ADN recombinant et infection de bactéries Escherichia coli K12 (souche 10 LA 101), les bactériophages recombinants ayant intégré
l'ADN du nouvel HPV ont été sélectionnés par la tech-nique d'hybridation sur plages de lyse (Benton et Davis), en utilisant une sonde d'ADN radioactive spécifique du HPV31 dans des conditions strictes.
Plusieurs bactériophages recombinants contenant la totalité des séquences virales ont étê isolés. La coupure de l'ADN des bactériophages recombinants par l'endonucléase BamHI engendre un fragment ~ kb hybridant avec l'ADN du HPV31 dans des conditions strictes. La coupure de l'ADN des bactériophages recombinants et de la préparation d'ADN extrait des lésions, par le mélange des endonucléases BamHI et PstI, engendre les mêmes 7 fragments, dont le poids moléculaire total. correspond à
celui d'un génome de papillomavirus.
L'ADN du nouvel HPV a été excisé des séquences d'ADN phagique et recloné dans le plasmide pSP64. Une carte de restriction de l'ADN du nouvel HPV a été cons-truite à partir de l'étude de la sensibilité de cet ADN
à 20 endonucléases de restriction. 26 sites de coupure ont ainsi été localisés (fig. 10). Cette carte est dif-férente de celle de tous les HPV isolés à ce jour. Le degré d'homologie entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN des HPV identifiês à ce jour a été analysé par des expérien-ces d'hybridation su.r réplique, dans des conditions strictes, en utilisant une sonde d'ADN radioactive spé-cifique du nouvel HPV. Une hybridation partielle a été

~:~~0~~ o:

11 observée avec l'ADN du HPV31 et une hybridation croisée faible a été obtenue avec les ADNs des HPV6, 13 et HPV-IP2. Les homologies entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN
du HPV31 ont été déterminées plus précisément par réas-sociation ADN-ADN en milieu liquide, suivie par un traitement des hybrides par la nucléase S1. Une hybri dation de 20 ~ a été détectée entre les deux ADNs. Le virus isolé à partir de papillomes boweno3des vulvaires constitue donc un nouveau type d'HPV, provisoirement dénommé HPV-IP6.
L'analyse, au microscope électronique, de molé-cules hétéroduplexes formées dans différentes conditions entre l'ADN de HPV-IP6 et l'ADN du HPV31 a permis d'ali-gner les cartes physiques de ces deux génomes et de dé-finir la position théorique des différents gènes portés par l'ADN de l'HPV-IP6, comme indiqué ci-après et par rapport à l'origine de la carte de la fig. 11 et en pourcentages de longueur.
Localisation putative des principaux gènes et de la région intergénique (NC) du HPV-IP6 E6-E7 11,5-21,5 E1 21,5-46,5 E2 45-59,5 L2 63-82,5 L1 80,5-15 NC 1,5-11,5 L'utilisation de sondes radioactives préparées à
Partir de l'ADN HPV-IP6 purifié a permis de déterminer le pouvoir pathogène de ce virus.
Des prélèvements de lésions prolifératives bé-nignes (condylomes, papillomes) ou de néoplasies intra-épithéliales des organes génitaux externes, de la région périanale et du col utérin provenant de 163 malades ont été analysés. L'ADN du HPV-IP6 a été détecté chez 10 134i~~9~

12 malades présentant des lésions bénignes (condylomes, pa-pillomes).
Au cours d'une étude de 1522 prélèvements de cellules cervico-vaginales, destinée à préciser la fréquence de l'infection de l'épithélium du col utérin par un HPV, l'ADN du HPV-IP6 a été mis en évidence dans 9 prélèvements correspondant à une cytologie normale ou inflammatoire ou à une dysplasie légère sur 110 prélè-vements contenant un ADN d'HPV.
Le HPV-IP6 constitue donc un type additionnel d'HPV génital relativement fréquent, ne possédant vrai-semblablement qu'un potentiel oncogène faible. I1 est donc souhaitable de l'incorporer à tous mélanges d'ADNs de HPV destinés à la préparation de sondes moléculaires, en vue du diagnostic ou du dépistage des types d'HPV
sexuellement transmis, agents de tumeurs génitales bénignes, ne constituant pas un risque majeur pour le développement de néoplasies génitales et, en particulier, de cancers du col de l'utérus.
Etant donné la grande diversité des HPVs sus-ceptibles d'ë tre isolés à partir des différentes formes de verrues ou autres lésions cutanées ou de muqueuses, il est cependant préféré d'utiliser, pour le diagnostic de chaque type d'affection mentionné dans le tableau, des mélanges comportant plus d'un ou deux ADN-HPVs, dès lors que d'autres ADN-HPVs ont été reconnus comme pou-vant également intervenir dans le développement du mine type d'affection. Le diagnostic de la nature de l'infec-tion et de son évolution possible sera d'autant plus efficace que le nombre de sondes utilisées sera plus élevé. En outre, des essais d'hybridation réalisés avec ds mélanges différents de sondes permettra des diagnos tics différentiels présentant un degré de probabilité
également plus important de la nature du mal dont souffre le patient.
L'invention concerne donc plus particulièrement 1344~~i

13 encore des mélanges ou cocktails de différents ADNs-HPVs (ou sondes contenant ces ADNs-HPVs ou de séquences de ces derniers?, susceptibles d'être utilisés en combinai-son pour réaliser des diagnostics globaux des différen-tes formes d'infections à papillomavirus, cwentuellement aux fins de pronostiquer l'évolution possible de l'in-fection.
Des mélanges préférés conformes à l'invention sont identifiés dans le tableau ci-après .

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i~408~~, Le tableau susdit indique également les natures des affections susceptibles d'être plus particulièrement diagnostiquées par l'utilisation des mélanges figurant dans la partie gauche du tableau. I1 est rappelé que les 5 cartes de restriction des autres ADN-HPVs identifiés dans le tableau qui précède sont cont:mues dans les figures 1 à 9.
I1 est à remarquer que les HPV--IP5 et HPV-IP2 peuvent être considérés comme particulièrement représen 10 tatifs de sondes utilisables pour la détection des ris ques de développpement de cancers du col de l'utérus et le IP6 comme représentatif des sondes utilisables pour la détection des infections à papillomes bénignes.
L'ADN de HPV-IP6 peut être associé à l'ADN de

15 HPV-6 et/ou HPV11.
Enfin l'invention concerne aussi. le mélange de toutes les sondes.
De même l'invention concerne plus particuliè-rement un cocktail de sondes contenant l'ADN des HPV
spécifiques des cancers génitaux, ce cocktail conte-nant .

HPV35 .
L'IP6 est représentatif de sondes utilisables pour la détection d'infections à papillomavirus bé-nignes. L'ADN de l'IP6 peut ë tre associé à l'ADN de HP6 et/ou de HPV11.
L'invention concerne donc plus particulièrement encore des trousses ou "kits" de diagnostic comprenant ~340~9~

16 au moins 11 groupes figurant dans les groupes numérotés de 1 à 11 dans le tableau sous la rubrique "Désignation des mélanges".
Dans ce qui précède, on a surtout envisagé
l'utilisation, à tigre de sondes, des ADN-HPVs entiers clonés. Ceux-ci peuvent cependant être substituês par des fragments clonés de ces différents ADNs, notamment par les gènes E1 ou L1 et par les gènes E6-E7.
Le principe de base des détections in vitro d'ADN-HPV mettra naturellement en jeu des hybridations opérées dans des conditions strictes ou moins strictes.
On peut opérer par exemple comme suit, étant naturelle ment entendu que les essais de diagnostic décrits ne sauraient être considérés comme limitatifs des condi fions d'emploi des sondes ou mélanges de sondes selon l'invention.
L'objet des examens mettant en jeu des sondes préparées à partir de mélanges d'ADNs de HPVs clonés est de mettre en évidence un HPV et d'identifier le type d'HPV dans une biopsie, dans des cellules obtenues par grattage de lésions, ou dans des coupes de biopsies fixêes par exemple par le mélange de Carnoy (éthanol, chloroforme, acide acétique 6:3:1) et incluses dans la paraffine. L'examen nêcessite l'extraction préalable de l'ADN des nrPlPVPmantS ~Plnn ~A
2r 1340~~1 méthodes dont le principe est connu et met en jeu l'analy-se de cet ADN par des expériences d'hybridation molécu-laire, effectuées dans des conditions strictes ou moins strictes, à l'aide de sondes radioactives (marquées au 32P
au au 35S) préparées à partir de mélanges d'ADN-HPVs. Cha-que examen requiert, en général, l'utilisation de plu-sieurs mélanges de sondes.
Plusieurs méthodes d'hybridation peuvent étre uti lisées. On peut, par exemple, mettre en oeuvre.la méthode ~0 d'hybridation sur ;.ache. Cette méthode comporte, après dénaturation Ce 1~ADN, le dépôt d'une quant; té aliquote d'ADN sur des membranes (nitrocellulose ou C~enesc_eenplus), l'hybridat_on de chaque membrane, dans les conditions usuelles, avec un mélange de sondes et la ~5 détection des hydr~des radioactifs par expos~:lon des membranes au contact d'un film radiographique. On peut aussi utiliser une méthode d'hyb:idation sur réplique.
(.este méthoCe comprend la séparation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADN engendrés après ~0 traitement de l'~C~N par des enTymes de restrictmn, le transfert des frd_ments , apr ès Céna tur a t:on alca? _ne, sur des membranes (ni:rocellu=ose, Genescreenplus) et leur hybrldatlUn, Cans j.es COnd;tlOnS usuelles, avec d_f~érents mélanges de sondes. La formation d'hybrides radioactifs ~5 est détectée après exposition des membranes au contact d'un film radiographique.
On peut aussi avoir recours à une méthode d'hybri-dation in situ, par exemple sur des coupes de tissus fixés par lE mélange de Carnoy et incluses dans la paraffine.
30 Les sondes radioactives sont constituées soit par des ADNS d'HPVS marqués par la méthode de "nick-trans-lation", soit par des ARNS préparés par transcription d'ADNS viraux insérés dans un vecteur, par exemple de type p~P6. L'utilisation de sondes radioactives présente 35 l'avantage d'une grande sensibilité, mais ceci n'exclut pas l'utilisation de sondes non radioactives par exemple * Trademark r 1340~9~
- lt3 bi.otinylées et susceptibles d'étre reconnues par des anticorps soit marqués eux-mémos, soit eux-mémos reconnus par des anticorps portant un marqueur enzymatique, fluo-rescent, etc..
L'invention concerne donc encore des nécessaires ou "kits" contenant une pluralité des sondes sus-indi-quées, et comprennent .
- HPV-IP5 et HFV-IP6 respectivement pris de façons iso-lNes, - soit les sondes précédentes, en mélange avec d'autres, notamment celles définies plus haut, ces "kits" étant destinés à des études de diagnostic .n vitro par hybridation entre des préparations mrales ob tenues à partir de patients et les dmers groupes ou ~5 mé langes.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement - à ceux de ses modes d'application et de réalisat~.on qui ont été plus spécialement envisa4és , elle en emb:asse au p contraire toutes les variantes , notamment la ré~é:ence dans les revendications à une désignat;~n ADN-HPV suivie d'un nombre déterminé, et à laqueîle cor_espond un ADN-HPV
dont la ca: te de r este ict? cn a été four nie dans les Ces s.ins, s'entend comme signifiant crue ces revendvcations ~5 couvrent tous les ADN-HPVS qu1 ont en commun avec cet ADN-HPV particulier de pouvoir titre classés dans le mémo type, selon la définition qui en a été donnée plus haut, et a fortiori aux ADN-HPV appartenant au mémo sous-type.
On notera que les ADNS recombinants désignés 30 ci-après ont été déposés le 21 janvier 1986 à la C.N.C.M.
(Collection Nationale des Cultures de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris), sous les numéros apparais-sant ci-après .
pSP65/IP5 (plasmide àans E> coli) . n° I-507 35 pSP64/IP6 (plasmide dans E. coli) : n° I-508 1340~~1 BIBLIOGRAPHIE

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Les lments bibliographiques qui suivent doivent encore tre pris en considration (certaines rfrenc es sont prcdes des dsignations de certains HPV, lo rsque ceux-ci ont t dcrits pour la premire fois par les auteurs correspondants) .

HPV18 . HOSHART M. et al., 1984, EMBO J., _3:1151-1157, HPV-IP2 . HEAUDENON S. et al., 1986, Nature,,~?1:246,249, BEAUDENON S. et al., 1987, J. Inv. Dermatol., Ei 88 N' 1 , KAWASHIMA M. et al., 1986a, J. Virol., 57:688-692, KAWASHIMA M. et al., 1986b, Virology, 154:389-394, HPV6 . DE VILLIERS E.M. et al., 1981, J.Virol., 40:932-935, HPV11 . GISSMANN L. et al., 1982, J. Virol., X4_:393-400, HPV31 . LORINCZ A. et al., 1986a, J. Virol., 58:225-229, HPV35 . LORINCZ A. et al., 1986b, Bambury report, x:225-237, HPV16 . DURST et al., 1983.

Les dnominations de certains des HPVs dcrits dans cette demande ont t modifies dans la nomenclature internationale maintenant en vigueur.
En particul ier, les isolats identifis droite dans le tableau qui suit (et tels qu'ils sont dsigns dans le prsent texte) portent dsormais les dsignations indique s gauche .

HPV32 au lieu de HPV31 (BEAUDENON S. et al., 1987), HPV34 au lieu de HPV32 (KAWASHIMA M. et al., 1986), HPV33 au lieu de HPV-IP2 (BEAUDENON S, et al., 1986), HPV36 au lieu de HPV-IP4 (KAWASHIMA M. et al., 1986),

Claims (11)

1. ADN-HPV ayant une taille comprise entre environ 7000 et environ 8000 paires de bases ou un fragment de cet ADN-HPV, cet ADN-HPV étant obtenu à
partir d'un des papillomavirus répondant aux désignations HPV-IP5 et HPV-IP6, et les fragments étant susceptible; d'être obtenus par traitement de l'ADN de HPV-IP5 par au moins une enzyme de restriction choisie parmi EcoRI, PstI, HindII, PvuII, BamHI, HindIII, KpnI, Aval et XbaI ou par traitement de l'ADN de HPV-IP6 par au moins une enzyme de restriction choisie parmi EcoRI, PstI, HindII, PvuII, BamHI, HindIII, KpnI, AccI, BglII, BglI, SspI, EcoRV et XbaI.

2. ADN, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment d'ADN selon la revendication 1 ou un fragment d'ADN hybridant, en condition de stringence élevée, avec un fragment d'ADN selon la revendication 1, et en ce qu'il correspond aux gènes E1, E6-E7, L1 ou L2 ou à la région intergénique NC de HPV-IP5 ou HPV-IP6.

3. ADN recombinant contenant un ADN-HPV selon la revendication 1 ou un fragment selon la revendication 2.

4. ADN, fragment ou ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'utilisation en tant que sonde de détection d'ADN-HPVs.

5. Composition utilisable pour la détection de papillomavirus dans un milieu biologique le contenant, caractérisée en ce qu'elle contient un ADN conforme à la revendication 1 ou 2 associé à un ou plusieurs ADN-HPVs distincts.

6. Procédé de fabrication d'une sonde ADN-HPV
conforme à l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le clonage d'un vecteur dans un hôte particulier, ce vecteur ayant préalablement été modifié, par recombinaison in vitro, par l'ADN ou le fragment d'ADN du susdit virus et d'un vecteur approprié, pour obtenir un vecteur recombinant contenant l'ADN ou le fragment d'ADN dérivé du virus dans un site de ce vecteur permettant son clonage ultérieur dans cet hôte, et par la récupération et la purification et, le cas échéant, le marquage de l'ADN recombinant cloné obtenu.

7. Procédé de fabrication d'une sonde ADN-HPV
conforme à la revendication 6, caractérisé en ce que ledit hôte est un microorganisme procaryote.

8. Nécessaire ou kit comportant une pluralité de sondes ou mélanges de sondes distinctes, caractérisé par 11 groupes de sondes; chacune desquelles comporte:
1) au moins l'ADN de l'HPV2d, 2) au moins l'un des ADNs de HPV 20b, 28 et 29, 3) au moins l'un des ADNs de HPV 17, 24, 4) au moins l'un des ADNs de HPV 14, 15, 17, 19, 20 21, 22 23 et IP4, 5) au moins l'un des ADNs de HPV 15 et 17, 6) l'ADN de HPV 24, 7) l'ADN de l'un des ADNs de HPV 14, 32 et IP4, 8) l'ADN de HPV 31,

9) l'ADN de HPV 32,

10) au moins l'un des ADNs de HPV 16, 18, IP2 et IP5,

11) au moins l'un des ADNs de HPV6, 11 et IP6, étant entendu que les ADNs des onze groupes sont choisis de façon à être en toutes circonstances différents les uns des autres dans la mesure où chacun des onze groupes serait réduit à un seul des ADNs qui le composent.

9. Nécessaire ou kit pour le diagnostic différencié in vitro entre différents types de verrues et hyperplasies répondant à des pronostics variables, s'étageant entre la conservation du caractère bénin de ces verrues et des formes susceptibles de dégénérer en néoplasies intra-épithéliales et en cancers de la peau et des muqueuses, caractérisé par la répartition des sondes recombinantes contenant des insérats d'ADNs de papillomavirus dans au moins l'un des mélanges suivants:
1) 1, 2d, 4 2) 3, 10a, 10b, 28, 29 3) 5, 17a, 24 4) 5, 8, 12, 14a, 14b, 19, 20, 21, 22, 23, IP4 5) 9, 15, 17a, 17b 6) 24 7) 5, 8, 14b, 32, IP4 8) 13, 31 9) 32, IP4 10) 16, 18, IP2 et IP5 11) 6, 11 et IP6;

ces sondes permettant alors, par les hybridations auxquelles ces mélanges sont susceptibles de donner lieu avec la préparation d'ADN provenant du patient concerné, d'assurer la détection de l'existence ou la potentialité
de l'une des maladies suivantes :
- Verrues cutanées ou muqueuses; diagnostic différentiel de l'épidermodysplasie verruciforme (mélange 1);
- Verrues planes ou intermédiaires cutanées ou muqueuses; néoplasies intra-épithéliales et cancers cutanés; diagnostic différentiel de l'épidermodysplasie verruciforme (mélange 2);
- Épidermodysplasie verruciforme; néoplasies intra-épithéliales et cancers cutanés (mélange 3);
- Épidermodysplasie verruciforme (mélange 4, 5 et 6);
- Cancers cutanés de l'épidermodysplasie verruciforme; néoplasies intra-épithéliales et cancers cutanés (mélange 7);
- Hyperplasie épithéliale focale orale;
diagnostic différentiel des néoplasies intra-épithéliales orales (mélange 8);

- Néoplasies intra-épithéliales et cancers cutanés. (mélange 9) ;
- Néoplasies génitales et cancers du col de l'utérus (mélange 10); et - Condylomes et papillomes (mélange 11).

10. Procédé de détection et d'identification de papillomavirus contenus dans un échantillon biologique comprenant la réalisation d'essais d'hybridation avec un plusieurs ADN-HPVs, fragments d'ADN-HPVs ou ADNs recombinants conformes à l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou encore plusieurs compositions distinctes conformes à la revendication 5, et la détection de ceux des ADN-HPVs, fragments ou ADNs recombinants ou encore compositions qui donnent lieu à
une hybridation préférentielle avec les ADN-HPVs préalablement obtenus à partir desdits échantillons biologiques.