JPS622163A

JPS622163A - 体液成分の測定方法

Info

Publication number: JPS622163A
Application number: JP14109085A
Authority: JP
Inventors: Shigehiro Fukuda; 福田　滋弘
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1985-06-27
Filing date: 1985-06-27
Publication date: 1987-01-08
Anticipated expiration: 2009-12-12
Also published as: JPH06100599B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野この発明は、抗原抗体反応を利用した体液成分の測定方
法に関するものである。

従来の技術粒状担体に抗体または抗原を付着させ抗原抗体反応を行
わせて体液成分を光学的に測定する方法としては、比濁
法と計数法とが知られている。前者は抗体（または抗原
）を付着（感作）させた担体を含有した溶液に抗原（ま
たは抗体）を含む試料を加えて特異的な抗原抗体反応に
基づく免疫学的凝集作用によって粒子が凝集するときの
溶液の濁度変化を透過および（または）散乱光の変化で
捉える方法であり、凝集が進むにつれて溶液の濁度は減
少する。一方、後者の方法は本出願人の出願になる特願
昭５８−２１９７５３号、同５９−１０００９０号にみ
られる方法であり、前記と同様にして凝集反応を行わせ
た反応液をフローセルに流して粒子検出曲線により凝集
粒子数を凝集していない粒子等と弁別しそれぞれの計数
比率から試料の測定値を得るものである。また、これら
以外に免疫学的な沈降反応を利用した一元放射状免疫拡
散法（ＳＲＩＤ法）、エンザイムイムノアソセイ法（Ｅ
　Ｉ　Ａ法）、ＲＩＡ法などが従来よりよく知られてい
る。

発明が解決しようとする問題点上記比濁法や計数法のように粒子の凝集作用を利用する
方法では、必要とする抗原抗体反応が起きても、次に粒
子の凝集にまで至らなければ検知することができないた
め、感度が悪く、また他の要因で凝集が起こり測定誤差
を生じるおそれがあった。

また、その他の測定方法の場合は、測定に長時間を要す
るうえに、放射性物質、酵素などを使用するため測定前
後の処理に特別の注意を要するという問題があった。

この発明の主たる目的は、叙上の問題を排除し短時間に
かつ高精度で体液成分を定量することができる体液成分
の測定方法を提供することである。

この発明の他の目的は、同時に複数項目の体液成分を定
量することができる体液成分の測定方法を提供すること
である。

問題点を解決するための手段この発明の体液成分の測定方法は、担体に抗体（または
抗原）を付着させて試薬を作成する工程と、前記試薬を
試料体液に加え試料体液中に含有される未知濃度の抗原
（または抗体）と第１の抗原抗体反応を行わせる工程と
、反応後９反応液に標識抗原（または標識抗体）を加え
未反応抗体（または未反応抗原）と第２の抗原抗体反応
を行わせる工程と、第２の抗原抗体反応で得た反応液か
ら標識抗原（または標識抗体）の前記試薬との反応量を
求める工程と、得られた反応量を、前記標識抗原（また
は抗体）のみを前記試薬と反応させて得られた基準反応
量と比較してその変化量から試料体液中の抗原（または
抗体）濃度を定量する工程とを含むものである。

また、この発明の他の測定方法は、粒径が異なる複数種
の担体にそれぞれ異なる抗原（または抗体）に対する抗
体（または抗原）を付着させた試薬を作成する工程と、
前記試薬を試料体液に加え試料体液中に含有される未知
濃度の複数種の抗原（または抗体）とそれぞれ第１の抗
原抗体反応を行わせる工程と、反応後１反応液に前記複
数種の抗原にそれぞれ対応する標識抗原（または標識抗
体）を加え未反応抗体（または未反応抗原）と第２の抗
原抗体反応を行わせる工程と、第２の抗原抗体反応で得
た反応液から前記標識抗原（または標識抗体）の前記試
薬との反応量を求める工程と、得られた反応量を、前記
ＰＪ識抗原（または標識抗体）のみを前記試薬と反応さ
せて得られた基準反９量と比較してその変化量から試料
体液中の抗原（または抗体）濃度を定量する工程とを含
むものである。

以下、この発明の詳細な説明するが、説明の便宜上、前
記担体には抗体を付着させて試料体液中の抗原量を測定
するものとする。これとは逆に、担体に抗原が付着され
試料体液中の抗体量を測定する場合も同様にして通用可
能である。

前記担体としては、均一な粒径を有する高分子ラテック
スがあげられ、このものは安定な分散媒に浮遊させて互
いに凝集しないようにする。ラテックスの粒径が不均一
なときは、後述のように蛍光強度と散乱光強度とから積
算蛍光強度を求める場合に粒子の径を示す前方散乱光強
度がばらつき、データの解析が困難となる。これは、粒
径で項目情報を解析するためである。前記高分子ラテッ
クスとしては、ポリスチレン、カルボキシル化ポリスチ
レン、アミノ基を有するカルボキシル化ポリスチレン、
ポリビニルトルエン、スチレン−ブタジェン共重合体、
カルボキシル化スチレン−ブタシェフ共重合体、スチレ
ン−ジビニルベンゼン共主合体、ビニルトルエン−第三
ブチルスチレン共生合体、ポリエステル、ポリアクリル
酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、アクリ
ロニトリル−ブタジェン−スチレン共重合体、ポリ酢酸
ビニルアクリレート、ポリビニルピロリドン。

塩化ビニル−アクリレート共重合体等の合成高分子ラテ
ックス粒子からなるラテックスがあげられ、さらにこれ
らの合成高分子ラテックス粒子の表面を非イオン界面活
性剤等で処理したものも使用可能である。また、ラテッ
クスのほかに、１（ＩＩの合成高分子物質（たとえばベ
ントナイト、カオリン。

コロジオン等）も使用可能である。

担体粒子の表面に付着される抗体としては、特定の抗原
に対してのみ反応する抗体を使用する。

かかる抗体としては、モノクロナール抗体が好適に採用
可能であり、このものは抗体産生細胞と腫瘍細胞との細
胞融合によって得られた細胞を培養して得られる。この
モノクロナール抗体は単一の抗原決定基にのみ結合する
ので、ある抗体が表面にその抗体と結合しうる決定基が
１つしかない場合には、すでにある抗原と結合した抗体
はもはや他の抗原と結合しない、そのため、担体の粒子
表面にモノクロナール抗体を結合させたものは抗原を仲
立ちとして粒子同士が凝集することはない。

これに対し、ポリクロナール抗体は抗原のもつ多くの抗
原決定基に対して反応性を有する抗体の集団であり、こ
のような抗体を用いた場合は担体粒子が抗原を介して互
いに凝集する可能性がある。

このような凝集は測定誤差の原因となるので好ましくな
い。ただし、抗原自身がただ１つのエピトープしか有し
ない場合はモノクロナール抗体と同様の作用となり粒子
同士の凝集は起こらないので、ポリクロナール抗体でも
使用可能である。また、粒子同士の凝集を防ぐための他
の手段としては、たとえばラテックスやその他の合成高
分子物質の有するゼータ電位を利用する方法がある。す
なわち、粒子表面のゼータ電位は一４ＱｍＶ以上になる
と、粒子同士の反発力が強くなり安定な分散媒をつくる
のに対し、−４０ｍＶより小さいときは反発力が弱く自
然に凝集してしまう。そこ°で、粒子のゼータ電位を調
整することにより、抗原を介して粒子同士が凝集するの
を防止する。このような方法であっても、粒子表面の抗
体と遊離の抗原との結合に悪影響を及ぼすことはない。

その他、粒子を安定な状態に保ちかつ抗原抗体反応によ
って粒子が凝集するのを防止しうる限り、種々の方法が
採用可能である。

担体表面の抗体が試料体液中の抗原と反応したのち、未
反応の抗体と結合する標識抗原としては、たとえばＦＩ
ＴＣ（フルオレッセインイソチオシアネート）などの蛍
光色素を付着させた抗原があげられる。ただし、標識の
操作においては、抗原性が失われないように注意するこ
とが必要である。

作用この発明によれば、担体に付着した抗体に試料体液に含
まれる抗原を反応させる第１の抗原抗体反応を行い、つ
いで試料中の抗原と反応せずに残った未反応抗体に標識
抗原を反応させる第２の抗原抗体反応を行わせるので、
この場合の標識抗原の抗体との反応量を測定し、標識抗
原のみを反応させたときの基準反応量との変化Ｉｔ（減
少量）を求めると、これが試料体液に含まれる抗原量と
対応しており、容易にかつ高精度に抗原濃度の定量を行
うことができる。

反応量の測定は蛍光色素を付着させた標識抗原に基づく
蛍光強度と粒子の散乱光強度とから積算蛍光強度を求め
る。この積算蛍光強度は標識抗原の反応量に対応してお
り、これから試料中の抗原量を知ることができる。粒子
の散乱光強度と蛍光強度はたとえばフローサイトメータ
ーに反応液を流して測定することができる。フローサイ
トメータとしては、たとえば米国特許４３２５７０６号
明細書に記載のものが使用可能である。

次に第１図〜第３図に基づいてより詳細に説明する。第
１図は担体表面に結合した抗体に過剰量の標識抗原を作
用させて基準となる積算蛍光強度を求める説明図である
。同図において、６はこの発明における試薬であり、こ
のものはラテフクスな゛どの担体１に抗体２を結合させ
たものである。

抗体２は特定の抗原とのみ反応する。使用する標識抗原
３はあらかじめ蛍光色素４を結合させたものであり、そ
れぞれが各抗体２と反応しすべての抗体２と結合する０
反応後、反応液をフローサイトメータに流し蛍光強度、
前方散乱光強度および側方散乱光強度をそれぞれ測定す
る。このとき、溶液は過剰の未反応標識抗原３を含有し
ているので、背後蛍光の影響を無視できるほど反応液を
希釈しなければならない０反応後は、担体１表面の抗原
３が遊離しないように、かつ担体１同士が結合しないよ
うに注意する必要がある。測定された蛍光強度および散
乱光強度から蛍光強度の積算値を求める。この積算値は
第１図に示す三次元のグラフのピーク５で示され、この
ピーク５の体積が積算蛍光強度となる。この値は粒子の
カウント数が一定ならば、はぼ一定である。すなわち、
１個の担体１に結合する抗体２の量は一定であり、これ
に結合する標識抗原３の量もほぼ一定であるから、ある
一定数の粒子をカウントすると、その総室光１）（総標
識抗原量）もほぼ一定となり、個々の担体１に結合する
標識抗原３の量にばらつきがあっても、充分に多い数を
カウントすれば、総量としては一定となるのである。な
お、小ピーク９は抗体２と結合しない遊離の蛍光色素の
ピークである。

試料体液中の抗原濃度を求める場合、この試料体液に前
記試薬６を加え、第２図に示すように試料体液中に含有
される抗原７と第１の抗原抗体反応をおこさせる。つい
で、前記と同じ標識抗原３で第２の抗原抗体反応をおこ
させる。このため、標識抗原３の抗体２への結合量（反
応量、第２図に示すピーク８）は試料に含まれていた抗
原量だけ減少することになる。したがって、求められた
積算蛍光強度は試料中の抗原量に応じて変化し、その変
化量は抗原量と一定の関係にあるので、これから抗原濃
度を定量することができる。

また、第３図に示すように、粒径の異なる複数種の担体
１ａ、ｌｂ、ｌｃ・・・にそれぞれ異なる抗原に対する
抗体を付着させると、１つの試料体液に含まれる多数の
抗原８ａ、８ｂ、８ｃ・・・を同時に測定することがで
きる。第３図のグラフに示す各ピーク５ａ、５ｂ、５ｃ
・・・はそれぞれの抗原の変化量を示している。

なお、第１図〜第３図では、三次元のグラフで積算蛍光
強度を示したが、この場合、Ｘ方向の前方散乱光強度で
粒子の径を示しており、これとＺ方向の蛍光強度とで積
算蛍光強度を算出することもできるので、側方散乱強度
の測定は省略してもよい、側方散乱光強度は粒子の性質
、とくに粒子の表面状態と関係がある。

また、蛍光色素による標識に代えて、酵素で標識した抗
原を用いて、反応後酵素量を測定するようにしてもよい
。

実施例次に例をあげてこの発明の方法を詳細に説明する。

例：粒径が０．７５μのポリスチレンラテックスにウサ
ギのイムノグロブリンＧ（ウサギＴｇＧ　）を吸着させ
た。すなわち、０．５％のラテックス溶液１ｍｌ当り４
０μｇのウサギＩｇＧが吸着したちのを調整した。つい
で、これに検体中の抗ウサギＩｇＧを各濃度で反応させ
た後、蛍光色素（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）で標識した標識抗ウサ
ギＩｇＧを反応させた。ここで、ウサギＩｇＧは抗原と
なり、抗ウサギＩｇＧは抗体となる０反応後、反応液を
第４図に示すフローサイトメーター（本出願人の製造に
かかるＡＲ−ＩＴ）によって蛍光強度を測定し、抗つサ
ギＴｇＧ濃度に対する平均蛍光強度を求め、これから第
５図に示す検量線を作成した。平均蛍光強度とはラテッ
クス１個当りの蛍光強度であって、積算蛍光強度十カウ
ント数で算出される。

フローサイトメーターは、第４図に示すように、Ａｒイ
オン・レーザ（５０ｍＷ）の光へをフローセル１０に導
びき、ピンホール板１）を経た前方散乱光Ｂを光検出器
１２で受け、電気信号に変換して増幅器１３へ送る。一
方、フローセル１０から放出される蛍光および側方散乱
光Ｃは第１および第２のカラーフィルター１４．１５を
経てピンホール板１６を通り、青反射グイクロイック文
子−１７、赤反射（５８０ｎｍ）ダイクロイックミラー
１８赤蛍光および線蛍光を反射させる。各反射光は受光
フィルタ２０．２１を通ってそれぞれの受光部２２，２
３．２４　（光増倍管、ＰＭＴ）で受けられる。線蛍光
信号（５４０〜５８０ｎｍ）Ｄは増幅器１３へ送られる
。増幅器１３へ送られた各信号はデータ解析部２５によ
り各粒子の蛍光強度が測定される。

前記検量線を作成することにより、抗つサギＩｇＧ量が
未知の試料の蛍光強度を検量線に照らし合わせてその濃
度を決定することができる。

発明の効果この発明によれば、抗原抗体反応による凝集作および全
反射ミラー１９でそれぞれ側方散乱光。

用を利用することなく、簡単にかつ高精度に試料中の抗
原（または抗体）の定量を行うことができるという効果
がある。

また、粒径が異なる複数種の担体にそれぞれ異なる抗原
（または抗体）に対する（または抗原）を付着させた試
薬を用いることにより、同時に複数項目の体液成分の測
定が可能になるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はこの発明の方法を示す説明図、第
３図はこの発明における他の方法を示す説明図、第４図
はこの発明の例におけるフローサイトメーターの説明図
、第５図は検量線を示すグラフである。１・・・担体、２・・・抗体、３・・・標識抗原、６・
・・試薬、７・・・抗原第４図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）担体に抗体（または抗原）を付着させた試薬を作
成する工程と、前記試薬を試料体液に加え試料体液中に
含有される未知濃度の抗原（または抗体）と第１の抗原
抗体反応を行わせる工程と、反応後、反応液に標識抗原
（または標識抗体）を加え未反応抗体（または未反応抗
原）と第２の抗原抗体反応を行わせる工程と、第２の抗
原抗体反応で得た反応液から前記標識抗原（または標識
抗体）の前記試薬との反応量を求める工程と、得られた
反応量を、前記標識抗原（または標識抗体）のみを前記
試薬と反応させて得られた基準反応量と比較してその変
化量から試料体液中の抗原（または抗体）濃度を定量す
る工程とを含む体液成分の測定方法。
（２）前記標識抗原（または標識抗体）が前記担体に付
着させた抗体（または抗原）と特異的に反応する抗原（
または抗体）に蛍光色素を付着させたものである特許請
求の範囲第（１）項記載の体液成分の測定方法。
（３）前記標識抗原（または標識抗体）の反応量が、反
応液に含まれる粒子の散乱光強度と蛍光強度とから求め
た積算蛍光強度より算出される特許請求の範囲第（１）
項記載の体液成分の測定方法。
（４）前記担体に付着した抗体がモノクロナール抗体で
ある特許請求の範囲第（１）項記載の体液成分の測定方
法。
（５）前記担体が均一な粒径を有するラテックス粒子で
ある特許請求の範囲第（１）項記載の体液成分の測定方
法。
（６）粒径が異なる複数種の担体にそれぞれ異なる抗原
（または抗体）に対する抗体（または抗原）を付着させ
た試薬を作成する工程と、前記試薬を試料体液に加え試
料体液中に含有される未知濃度の複数種の抗原（または
抗体）とそれぞれ第１の抗原抗体反応を行わせる工程と
、反応後、反応液に前記複数種の抗原にそれぞれ対応す
る標識抗原（または標識抗体）を加え未反応抗体（また
は未反応抗原）と第２の抗原抗体反応を行わせる工程と
、第２の抗原抗体反応で得た反応液から前記各標識抗原
（または標識抗体）の前記試薬との反応量を求める工程
と、得られた反応量を、前記標識抗原（または標識抗体
）のみを前記試薬と反応させて得られた基準反応量と比
較してその変化量から試料体液中の抗原（または抗体）
濃度を定量する工程とを含む体液成分の測定方法。