JPH0627112A - 免疫学的測定方法 - Google Patents
免疫学的測定方法Info
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- JPH0627112A JPH0627112A JP18417392A JP18417392A JPH0627112A JP H0627112 A JPH0627112 A JP H0627112A JP 18417392 A JP18417392 A JP 18417392A JP 18417392 A JP18417392 A JP 18417392A JP H0627112 A JPH0627112 A JP H0627112A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】被検液中の２種以上の測定物質を明確に区別し
て、高精度にて検出することができると共に、同時測定
することができる項目数を多くすることができる免疫学
的測定方法を提供することにある。 【構成】屈折率の異なる２種以上の粒子にそれぞれ異な
る測定物質と結合する抗体又は抗原を固相化してなる試
薬を被検液及び蛍光標識抗体と共に混合し、反応させた
後、フローサイトメーターにて上記粒子の蛍光強度を測
定する。
て、高精度にて検出することができると共に、同時測定
することができる項目数を多くすることができる免疫学
的測定方法を提供することにある。 【構成】屈折率の異なる２種以上の粒子にそれぞれ異な
る測定物質と結合する抗体又は抗原を固相化してなる試
薬を被検液及び蛍光標識抗体と共に混合し、反応させた
後、フローサイトメーターにて上記粒子の蛍光強度を測
定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的測定方法に関
し、詳しくは、フローサイトメーターを用いて、測定物
質と蛍光標識抗体の複合体を結合した粒子の蛍光強度を
測定することによつて、被検液中の２種以上の測定物質
を同時に高精度にて定量することができる免疫学的測定
方法に関する。
し、詳しくは、フローサイトメーターを用いて、測定物
質と蛍光標識抗体の複合体を結合した粒子の蛍光強度を
測定することによつて、被検液中の２種以上の測定物質
を同時に高精度にて定量することができる免疫学的測定
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、医療分野をはじめ、生化学、衛生
学、免疫学等の種々の分野において、血液等の中の微量
物質を定量的に正確に測定することの重要性が増してい
る。血清等の被検液中の抗原や抗体を抗原抗体反応を利
用して検出する測定方法として、従来より、ＲＩＡ、Ｅ
ＩＡ、ＦＩＡ等が知られている。ＥＩＡは、被検液中の
抗原や抗体の量と酵素活性が比例することを利用した方
法であつて、酵素標識体と基質の反応による発色を分光
光度計等によつて測定するものである。ＦＩＡは、例え
ば、被検液中の抗原と蛍光標識抗原を一定量の抗体と競
合的に結合させた後、励起光を照射して、そのときに放
出される蛍光を蛍光光度計にて測定するものである。
学、免疫学等の種々の分野において、血液等の中の微量
物質を定量的に正確に測定することの重要性が増してい
る。血清等の被検液中の抗原や抗体を抗原抗体反応を利
用して検出する測定方法として、従来より、ＲＩＡ、Ｅ
ＩＡ、ＦＩＡ等が知られている。ＥＩＡは、被検液中の
抗原や抗体の量と酵素活性が比例することを利用した方
法であつて、酵素標識体と基質の反応による発色を分光
光度計等によつて測定するものである。ＦＩＡは、例え
ば、被検液中の抗原と蛍光標識抗原を一定量の抗体と競
合的に結合させた後、励起光を照射して、そのときに放
出される蛍光を蛍光光度計にて測定するものである。
【０００３】最近、抗体又は抗原を固相化したラテツク
ス粒子等の微小な粒子に測定物質を抗原抗体反応にて結
合させ、更に、これに蛍光標識体を反応させた後、この
粒子の蛍光強度をフローサイトメーターで測定すること
によつて、測定物質を定量する方法が提案されている。
フローサイトメーターによれば、レーザー光を照射した
ときの散乱光を検出することによつて、レーザー光照射
部を通過する個々の物質の大きさの情報を得ることがで
き、大きさの異なる各物質ごとの蛍光強度を測定するこ
とができる。従つて、抗体又は抗原を固相化した粒子と
被検液と蛍光標識体の混合反応溶液中に存在する未結合
の過剰蛍光標識体を上記粒子と区別して測定することが
できるので、フローサイトメーターによる測定前に過剰
の蛍光標識体をＢ／Ｆ分離する必要がない。更に、散乱
光強度によつて、粒子の大きさの情報を得ることができ
ることを利用して、以下のような多項目同時測定が提案
されている。
ス粒子等の微小な粒子に測定物質を抗原抗体反応にて結
合させ、更に、これに蛍光標識体を反応させた後、この
粒子の蛍光強度をフローサイトメーターで測定すること
によつて、測定物質を定量する方法が提案されている。
フローサイトメーターによれば、レーザー光を照射した
ときの散乱光を検出することによつて、レーザー光照射
部を通過する個々の物質の大きさの情報を得ることがで
き、大きさの異なる各物質ごとの蛍光強度を測定するこ
とができる。従つて、抗体又は抗原を固相化した粒子と
被検液と蛍光標識体の混合反応溶液中に存在する未結合
の過剰蛍光標識体を上記粒子と区別して測定することが
できるので、フローサイトメーターによる測定前に過剰
の蛍光標識体をＢ／Ｆ分離する必要がない。更に、散乱
光強度によつて、粒子の大きさの情報を得ることができ
ることを利用して、以下のような多項目同時測定が提案
されている。
【０００４】即ち、被検液中に存在する複数の項目の測
定物質に対して、それぞれ特異的に結合する抗体又は抗
原を粒子径の異なる一群の粒子にそれぞれ固相化し、か
かる粒子径の異なる粒子からなる試薬と被検液と蛍光標
識体との混合反応液をフローサイトメーターにて１回測
定するのみで、被検液中の複数の測定物質を同時に検出
することができるというものである（特開昭５２−１５
８１５号公報）。
定物質に対して、それぞれ特異的に結合する抗体又は抗
原を粒子径の異なる一群の粒子にそれぞれ固相化し、か
かる粒子径の異なる粒子からなる試薬と被検液と蛍光標
識体との混合反応液をフローサイトメーターにて１回測
定するのみで、被検液中の複数の測定物質を同時に検出
することができるというものである（特開昭５２−１５
８１５号公報）。
【０００５】しかし、通常、このような測定を行なう場
合、試薬粒子は、塩等を含む緩衝液中に置かれるので、
粒子の凝集が生じることが多い。また、測定物質が結合
した粒子が蛍光標識体を橋かけとして凝集することがあ
る。このように、粒子が凝集した場合、フローサイトメ
ーターでは、見掛け上、粒子径の大きい粒子として検出
されるので、粒子径の異なる別の一群の粒子と区別する
ことができなくなり、その結果、正確な多項目同時測定
を行なうことができないという問題がある。
合、試薬粒子は、塩等を含む緩衝液中に置かれるので、
粒子の凝集が生じることが多い。また、測定物質が結合
した粒子が蛍光標識体を橋かけとして凝集することがあ
る。このように、粒子が凝集した場合、フローサイトメ
ーターでは、見掛け上、粒子径の大きい粒子として検出
されるので、粒子径の異なる別の一群の粒子と区別する
ことができなくなり、その結果、正確な多項目同時測定
を行なうことができないという問題がある。
【０００６】更に、粒子径の異なる粒子は、フローサイ
トメーターの前方散乱光強度（横軸）／側方散乱光強度
（縦軸）ドツトプロツト図では、右上りの直線上だけに
並ぶので、測定できる粒子径の異なる粒子の種類が少な
くなり、従つて、同時測定し得る項目数が限られること
となる。
トメーターの前方散乱光強度（横軸）／側方散乱光強度
（縦軸）ドツトプロツト図では、右上りの直線上だけに
並ぶので、測定できる粒子径の異なる粒子の種類が少な
くなり、従つて、同時測定し得る項目数が限られること
となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述したよ
うな従来のフローサイトメーターを用いる多項目同時測
定における問題を解決するためになされたものであつ
て、被検液中の２種以上の測定物質を明確に区別して、
高精度にて検出することができると共に、同時測定する
ことができる項目数を多くすることができる免疫学的測
定方法を提供することを目的とする。
うな従来のフローサイトメーターを用いる多項目同時測
定における問題を解決するためになされたものであつ
て、被検液中の２種以上の測定物質を明確に区別して、
高精度にて検出することができると共に、同時測定する
ことができる項目数を多くすることができる免疫学的測
定方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明による免疫学的測
定方法は、屈折率の異なる２種以上の粒子にそれぞれ異
なる測定物質と結合する抗体又は抗原を固相化してなる
試薬を被検液及び蛍光標識抗体と共に混合し、反応させ
た後、フローサイトメーターにて上記粒子の蛍光強度を
測定することを特徴とする。
定方法は、屈折率の異なる２種以上の粒子にそれぞれ異
なる測定物質と結合する抗体又は抗原を固相化してなる
試薬を被検液及び蛍光標識抗体と共に混合し、反応させ
た後、フローサイトメーターにて上記粒子の蛍光強度を
測定することを特徴とする。
【０００９】本発明において用いる粒子は、フローサイ
トメーターにて測定し得る粒子であれば、特に限定され
るものではなく、例えば、合成高分子重合体粒子、赤血
球、ゼラチン粒子等が用いられる。これらのなかでも、
本発明においては、粒子の屈折率を容易に変えて調整す
ることができることから、水不溶性水分散型合成高分子
重合体粒子が好ましく用いられる。
トメーターにて測定し得る粒子であれば、特に限定され
るものではなく、例えば、合成高分子重合体粒子、赤血
球、ゼラチン粒子等が用いられる。これらのなかでも、
本発明においては、粒子の屈折率を容易に変えて調整す
ることができることから、水不溶性水分散型合成高分子
重合体粒子が好ましく用いられる。
【００１０】一般に、水不溶性水分散型合成高分子重合
体粒子は、適宜の単量体の乳化（共）重合や懸濁（共）
重合等によつて得ることができることが既に知られてい
るが、屈折率の異なる粒子は、適宜の単量体の（共）重
合による粒子の製造において、用いる単量体の組成を適
切に選択することによつて得ることができる。例えば、
屈折率の高い粒子として、ポリスチレン粒子（屈折率1.
５９）を用いることができ、他方、屈折率の低い粒子と
して、メタクリル酸トリフルオロエチル（屈折率1.４
５）等のメタクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
の（共）重合体粒子を用いることができる。必要に応じ
て、上記粒子を調製する際に、共単量体として、例え
ば、アクリル酸等の重合性不飽和カルボン酸を用いるこ
とによつて、得られる粒子の表面にカルボキシル基を導
入することができ、このような官能基は、粒子に抗体や
抗原を共有結合にて結合させるために有利に用いられ
る。更に、本発明において用いる粒子は、上記のような
合成高分子重合体粒子の内部に無機物、金属等を内包さ
せて、その屈折率を調節することもできる。本発明にお
いて用いる粒子の屈折率は、フローサイトメーターにて
測定し得る範囲であれば、特に限定されるものではな
い。
体粒子は、適宜の単量体の乳化（共）重合や懸濁（共）
重合等によつて得ることができることが既に知られてい
るが、屈折率の異なる粒子は、適宜の単量体の（共）重
合による粒子の製造において、用いる単量体の組成を適
切に選択することによつて得ることができる。例えば、
屈折率の高い粒子として、ポリスチレン粒子（屈折率1.
５９）を用いることができ、他方、屈折率の低い粒子と
して、メタクリル酸トリフルオロエチル（屈折率1.４
５）等のメタクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
の（共）重合体粒子を用いることができる。必要に応じ
て、上記粒子を調製する際に、共単量体として、例え
ば、アクリル酸等の重合性不飽和カルボン酸を用いるこ
とによつて、得られる粒子の表面にカルボキシル基を導
入することができ、このような官能基は、粒子に抗体や
抗原を共有結合にて結合させるために有利に用いられ
る。更に、本発明において用いる粒子は、上記のような
合成高分子重合体粒子の内部に無機物、金属等を内包さ
せて、その屈折率を調節することもできる。本発明にお
いて用いる粒子の屈折率は、フローサイトメーターにて
測定し得る範囲であれば、特に限定されるものではな
い。
【００１１】本発明において、用いる粒子の粒子径は、
フローサイトメーターにて測定可能なものであれば何ら
の問題もないが、通常、１〜２０μｍの粒子が好適に用
いられる。また、屈折率が異なる粒子は、粒子径が異な
るものを用いてもよい。本発明においては、屈折率の異
なる粒子にそれぞれ異なる測定物質と結合する抗体又は
抗原を固相化し、これを混合して試薬として用いる。こ
こに、屈折率の異なる粒子の混合割合は、特に限定され
るものではないが、しかし、屈折率の異なる粒子間で粒
子径も異なる場合は、それぞれの粒子の検出個数を合わ
せるためには、粒子数を合わせて混合するのが好まし
い。
フローサイトメーターにて測定可能なものであれば何ら
の問題もないが、通常、１〜２０μｍの粒子が好適に用
いられる。また、屈折率が異なる粒子は、粒子径が異な
るものを用いてもよい。本発明においては、屈折率の異
なる粒子にそれぞれ異なる測定物質と結合する抗体又は
抗原を固相化し、これを混合して試薬として用いる。こ
こに、屈折率の異なる粒子の混合割合は、特に限定され
るものではないが、しかし、屈折率の異なる粒子間で粒
子径も異なる場合は、それぞれの粒子の検出個数を合わ
せるためには、粒子数を合わせて混合するのが好まし
い。
【００１２】本発明において、粒子に抗体又は抗原を固
相化する方法は、特に限定されるものではなく、従来よ
り知られている任意の方法によることができる。そのよ
うな方法の代表例として、例えば、抗体や抗原を粒子に
物理吸着させる方法や、前述したように、カルボキシル
基を有する粒子にカルボジイミド等を用いて抗体や抗原
を共有結合にて固相化する方法等を挙げることができ
る。
相化する方法は、特に限定されるものではなく、従来よ
り知られている任意の方法によることができる。そのよ
うな方法の代表例として、例えば、抗体や抗原を粒子に
物理吸着させる方法や、前述したように、カルボキシル
基を有する粒子にカルボジイミド等を用いて抗体や抗原
を共有結合にて固相化する方法等を挙げることができ
る。
【００１３】次に、本発明による免疫学的測定方法につ
いて説明する。その方法によれば、先ず、前述したよう
に、屈折率の異なる２種以上の粒子にそれぞれ異なる測
定物質と結合する抗体又は抗原の固相化したものを混合
して、粒子混合試薬を調製し、かかる粒子混合試薬の所
定量に、血清等の被検液を所定量加えて、数分乃至数時
間反応させる。次に、この反応液にＦＩＴＣ（fluoresc
ein isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin)等の蛍光
物質で標識された抗体を所定量加える。或いは、粒子混
合試薬に被検液と蛍光標識体とを同時に加えて反応させ
てもよい。その結果、被検液中に測定物質が存在すると
きは、測定物質を橋かけとして、粒子に蛍光標識体が結
合する。次に、この反応液をフローサイトメーターで測
定するのであるが、Ｂ／Ｆ分離せずに、測定することも
できるし、或いは、遠心分離等によつて、過剰の蛍光標
識体を除去した後に、測定することもできる。
いて説明する。その方法によれば、先ず、前述したよう
に、屈折率の異なる２種以上の粒子にそれぞれ異なる測
定物質と結合する抗体又は抗原の固相化したものを混合
して、粒子混合試薬を調製し、かかる粒子混合試薬の所
定量に、血清等の被検液を所定量加えて、数分乃至数時
間反応させる。次に、この反応液にＦＩＴＣ（fluoresc
ein isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin)等の蛍光
物質で標識された抗体を所定量加える。或いは、粒子混
合試薬に被検液と蛍光標識体とを同時に加えて反応させ
てもよい。その結果、被検液中に測定物質が存在すると
きは、測定物質を橋かけとして、粒子に蛍光標識体が結
合する。次に、この反応液をフローサイトメーターで測
定するのであるが、Ｂ／Ｆ分離せずに、測定することも
できるし、或いは、遠心分離等によつて、過剰の蛍光標
識体を除去した後に、測定することもできる。
【００１４】フローサイトメーターにて上記反応液を測
定するとき、粒子１個ずつが細管を流れ、レーザー光が
照射される。レーザー照射角１８０°で前方散乱光を、
レーザー照射角９０°で側方散乱光をそれぞれ検出す
る。更に、側方散乱光は、フイルターを通過させた後、
特定の波長の蛍光を検出する。例えば、ＦＩＴＣは５３
０ｎｍ、ＰＥは５７５ｎｍの波長で検出することができ
る。
定するとき、粒子１個ずつが細管を流れ、レーザー光が
照射される。レーザー照射角１８０°で前方散乱光を、
レーザー照射角９０°で側方散乱光をそれぞれ検出す
る。更に、側方散乱光は、フイルターを通過させた後、
特定の波長の蛍光を検出する。例えば、ＦＩＴＣは５３
０ｎｍ、ＰＥは５７５ｎｍの波長で検出することができ
る。
【００１５】図９にフローサイトメーターで測定した前
方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを示す。
Ａ１、Ａ２、Ａ３は、同じ屈折率で、粒子径が異なる粒
子群を示す。Ａ1'、Ａ2'は、Ａ１、Ａ２の粒子が２個凝
集した粒子群を示す。各粒子がそれぞれ完全に単分散の
粒子群であれば、ドツトプロツト上で分別できるが、粒
子が凝集しているときは、Ａ1'とＡ２、Ａ2'とＡ３の粒
子群が重複しているので、正確な測定ができない。ま
た、Ａ１、Ａ２、Ａ３は、右上りの直線上にのみあらわ
れ、各粒子群が相互に重複しないようにするには、多く
の種類の粒子を用いることができない。
方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを示す。
Ａ１、Ａ２、Ａ３は、同じ屈折率で、粒子径が異なる粒
子群を示す。Ａ1'、Ａ2'は、Ａ１、Ａ２の粒子が２個凝
集した粒子群を示す。各粒子がそれぞれ完全に単分散の
粒子群であれば、ドツトプロツト上で分別できるが、粒
子が凝集しているときは、Ａ1'とＡ２、Ａ2'とＡ３の粒
子群が重複しているので、正確な測定ができない。ま
た、Ａ１、Ａ２、Ａ３は、右上りの直線上にのみあらわ
れ、各粒子群が相互に重複しないようにするには、多く
の種類の粒子を用いることができない。
【００１６】一方、Ｂ１は、Ａ１〜Ａ３よりも屈折率が
低く、粒子径がＡ１と同じ粒子群を示し、Ｃ１は、Ｂ１
より更に屈折率が低く、粒子径がＡ１と同じ粒子群を示
している。Ｂ１、Ｃ１は、上記右上りの直線上とは異な
る位置にドツトプロツトがあらわれるので、より多くの
種類の粒子を分別して測定することができる。また、Ｂ
1'、Ｃ1'は、Ｂ１、Ｃ１の粒子が２個凝集した粒子群を
示しているが、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ａ1'、Ｂ1'、Ｃ1'の
粒子群は重複することがないので、正確な測定が可能と
なる。
低く、粒子径がＡ１と同じ粒子群を示し、Ｃ１は、Ｂ１
より更に屈折率が低く、粒子径がＡ１と同じ粒子群を示
している。Ｂ１、Ｃ１は、上記右上りの直線上とは異な
る位置にドツトプロツトがあらわれるので、より多くの
種類の粒子を分別して測定することができる。また、Ｂ
1'、Ｃ1'は、Ｂ１、Ｃ１の粒子が２個凝集した粒子群を
示しているが、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ａ1'、Ｂ1'、Ｃ1'の
粒子群は重複することがないので、正確な測定が可能と
なる。
【００１７】フローサイトメーターによる測定では、粒
子１個ずつに関して、前方散乱光強度、側方散乱光強
度、蛍光強度が測定される。例えば、Ａ１の粒子群がも
つ蛍光強度を解析するには、ドツトプロツト上でＡ１粒
子群にある粒子だけを取出し、これらの粒子の蛍光強度
の平均値として計算される。従つて、ドツトプロツト上
で分別された粒子は、別々に蛍光強度を求めることがで
きるので、多項目同時測定を行なうことができる。
子１個ずつに関して、前方散乱光強度、側方散乱光強
度、蛍光強度が測定される。例えば、Ａ１の粒子群がも
つ蛍光強度を解析するには、ドツトプロツト上でＡ１粒
子群にある粒子だけを取出し、これらの粒子の蛍光強度
の平均値として計算される。従つて、ドツトプロツト上
で分別された粒子は、別々に蛍光強度を求めることがで
きるので、多項目同時測定を行なうことができる。
【００１８】被検液中の測定物質濃度を求めるには、よ
く知られているように、予め検量線を作成しておけば、
蛍光強度より直ちに計算にて得ることができる。
く知られているように、予め検量線を作成しておけば、
蛍光強度より直ちに計算にて得ることができる。
【００１９】
【発明の効果】以上のように、本発明の方法によれば、
屈折率の異なる粒子にそれぞれ異なる測定物質と特異的
に結合する抗体又は抗原を固相化してなる試薬を用い
て、フローサイトメーターによつて蛍光強度を測定する
ので、散乱光ドツトプロツトの出現位置の違いによつ
て、２種以上の測定物質を同時に正確に測定することが
できる。
屈折率の異なる粒子にそれぞれ異なる測定物質と特異的
に結合する抗体又は抗原を固相化してなる試薬を用い
て、フローサイトメーターによつて蛍光強度を測定する
ので、散乱光ドツトプロツトの出現位置の違いによつ
て、２種以上の測定物質を同時に正確に測定することが
できる。
【００２０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではな
い。 実施例１ (a) 粒子への抗体の固相化 シード重合法で調製したカルボキシル化ポリスチレン粒
子（粒子径2.５μｍ、屈折率1.５９）の５％蒸留水分散
液５ml、ホウ酸緩衝液（0.１Ｍ、pH7.５）２ml及び蒸留
水１１mlを混合し、これに１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２
mg／ml）２mlを加え、１０分後に抗ヒトＡＦＰ抗体（マ
ウスＩｇＧ）水溶液（２mg／ml）５mlを加え、１０℃で
２時間反応させた。次いで、ホウ酸緩衝液（0.０１Ｍ、
pH８）で遠心分離洗浄を３回行なつた後、同様の緩衝液
に再分散させて、抗ＡＦＰ抗体固相化粒子分散液を調製
した。
本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではな
い。 実施例１ (a) 粒子への抗体の固相化 シード重合法で調製したカルボキシル化ポリスチレン粒
子（粒子径2.５μｍ、屈折率1.５９）の５％蒸留水分散
液５ml、ホウ酸緩衝液（0.１Ｍ、pH7.５）２ml及び蒸留
水１１mlを混合し、これに１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２
mg／ml）２mlを加え、１０分後に抗ヒトＡＦＰ抗体（マ
ウスＩｇＧ）水溶液（２mg／ml）５mlを加え、１０℃で
２時間反応させた。次いで、ホウ酸緩衝液（0.０１Ｍ、
pH８）で遠心分離洗浄を３回行なつた後、同様の緩衝液
に再分散させて、抗ＡＦＰ抗体固相化粒子分散液を調製
した。
【００２１】次に、シード重合法で調製したカルボキシ
ル化（スチレン／2,2,２−トリフルオロエチルメタクリ
レート）共重合体粒子（スチレン／2,2,２−トリフルオ
ロエチルメタクリレート共重合重量比３／１、粒子径2.
５μｍ、屈折率1.５５）に上記と同様にして、抗ヒトＣ
ＥＡ抗体（マウスＩｇＧ）を固相化した粒子分散液を調
製した。
ル化（スチレン／2,2,２−トリフルオロエチルメタクリ
レート）共重合体粒子（スチレン／2,2,２−トリフルオ
ロエチルメタクリレート共重合重量比３／１、粒子径2.
５μｍ、屈折率1.５５）に上記と同様にして、抗ヒトＣ
ＥＡ抗体（マウスＩｇＧ）を固相化した粒子分散液を調
製した。
【００２２】更に、カルボキシル化（スチレン／2,2,２
−トリフルオロエチルメタクリレート）共重合体粒子
（スチレン／2,2,２−トリフルオロエチルメタクリレー
ト共重合重量比１／１、粒子径2.５μｍ、屈折率1.５
１）に上記と同様にして、抗ヒトβ2 −ミクログロブリ
ン抗体（マウスＩｇＧ）（以下、単に、β2 −抗体とい
うことがある。）を固相化した粒子分散液を調製した。 (b) ＦＩＴＣ標識抗体の調製 抗ヒトＡＦＰ抗体（ウサギＩｇＧ）を炭酸緩衝液（0.５
Ｍ、pH9.５）で透析した後、この抗体（１mg／ml）３ml
にＦＩＴＣ（0.２mg／ml）0.６mlを加え、２５℃で３時
間、静置した。次いで、Sephadex G-25 で上記反応液中
の過剰のＦＩＴＣを除去し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＡＦＰ
抗体（リン酸緩衝液、pH８、Ｆ／Ｐ＝３）を得た。
−トリフルオロエチルメタクリレート）共重合体粒子
（スチレン／2,2,２−トリフルオロエチルメタクリレー
ト共重合重量比１／１、粒子径2.５μｍ、屈折率1.５
１）に上記と同様にして、抗ヒトβ2 −ミクログロブリ
ン抗体（マウスＩｇＧ）（以下、単に、β2 −抗体とい
うことがある。）を固相化した粒子分散液を調製した。 (b) ＦＩＴＣ標識抗体の調製 抗ヒトＡＦＰ抗体（ウサギＩｇＧ）を炭酸緩衝液（0.５
Ｍ、pH9.５）で透析した後、この抗体（１mg／ml）３ml
にＦＩＴＣ（0.２mg／ml）0.６mlを加え、２５℃で３時
間、静置した。次いで、Sephadex G-25 で上記反応液中
の過剰のＦＩＴＣを除去し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＡＦＰ
抗体（リン酸緩衝液、pH８、Ｆ／Ｐ＝３）を得た。
【００２３】次に、上記と同様にして、ＦＩＴＣ標識抗
ヒトＣＥＡ抗体（リン酸緩衝液、pH８、Ｆ／Ｐ＝３）と
ＦＩＴＣ標識抗ヒトβ2 −ミクログロブリン抗体（リン
酸緩衝液、pH８、Ｆ／Ｐ＝３）を得た。 (c) フローサイトメーターによる測定 (a) で調製した抗ヒトＡＦＰ抗体固相化粒子分散液（0.
０２％）１００μｌに既知濃度のヒトＡＦＰ溶液１００
μｌを加え、次に、(b) で調製したＦＩＴＣ標識抗ヒト
ＡＦＰ抗体（0.０２mg／ml）１００μｌを加え、３７℃
で３時間反応させた。この混合溶液をフローサイトメー
ター（ベクトンデイツキンソン製、ＦＡＣＳｃａｎ）に
よる測定を行なつた。得られた前方散乱光強度／側方散
乱光強度ドツトプロツトを図１に示し、また、各ヒトＡ
ＦＰ濃度における蛍光強度を表１に示す。
ヒトＣＥＡ抗体（リン酸緩衝液、pH８、Ｆ／Ｐ＝３）と
ＦＩＴＣ標識抗ヒトβ2 −ミクログロブリン抗体（リン
酸緩衝液、pH８、Ｆ／Ｐ＝３）を得た。 (c) フローサイトメーターによる測定 (a) で調製した抗ヒトＡＦＰ抗体固相化粒子分散液（0.
０２％）１００μｌに既知濃度のヒトＡＦＰ溶液１００
μｌを加え、次に、(b) で調製したＦＩＴＣ標識抗ヒト
ＡＦＰ抗体（0.０２mg／ml）１００μｌを加え、３７℃
で３時間反応させた。この混合溶液をフローサイトメー
ター（ベクトンデイツキンソン製、ＦＡＣＳｃａｎ）に
よる測定を行なつた。得られた前方散乱光強度／側方散
乱光強度ドツトプロツトを図１に示し、また、各ヒトＡ
ＦＰ濃度における蛍光強度を表１に示す。
【００２４】次いで、(a) で調製した抗ヒトＣＥＡ抗体
固相化粒子分散液（0.０２％）１００μｌに既知濃度の
ヒトＣＥＡ溶液１００μｌを加え、次に、(b) で調製し
たＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＥＡ抗体（0.０２mg／ml）１０
０μｌを加え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶
液をフローサイトメーター（ベクトンデイツキンソン
製、ＦＡＣＳｃａｎ）による測定を行なつた。得られた
前方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図２
に示し、各ヒトＣＥＡ濃度における蛍光強度を表２に示
す。
固相化粒子分散液（0.０２％）１００μｌに既知濃度の
ヒトＣＥＡ溶液１００μｌを加え、次に、(b) で調製し
たＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＥＡ抗体（0.０２mg／ml）１０
０μｌを加え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶
液をフローサイトメーター（ベクトンデイツキンソン
製、ＦＡＣＳｃａｎ）による測定を行なつた。得られた
前方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図２
に示し、各ヒトＣＥＡ濃度における蛍光強度を表２に示
す。
【００２５】次に、(a) で調製した抗ヒトβ2 −ミクロ
グロブリン抗体固相化粒子分散液（0.０２％）１００μ
ｌに既知濃度のヒトβ2 −ミクログロブリン溶液１００
μｌを加え、次に、(b) で調製したＦＩＴＣ標識抗ヒト
β2 −ミクログロブリン抗体（0.０２mg／ml）１００μ
ｌを加え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶液を
フローサイトメーター（ベクトンデイツキンソン製、Ｆ
ＡＣＳｃａｎ）による測定を行なつた。得られた前方散
乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図３に、各
ヒトβ2 −ミクログロブリン濃度における蛍光強度を表
３に、それぞれ示す。
グロブリン抗体固相化粒子分散液（0.０２％）１００μ
ｌに既知濃度のヒトβ2 −ミクログロブリン溶液１００
μｌを加え、次に、(b) で調製したＦＩＴＣ標識抗ヒト
β2 −ミクログロブリン抗体（0.０２mg／ml）１００μ
ｌを加え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶液を
フローサイトメーター（ベクトンデイツキンソン製、Ｆ
ＡＣＳｃａｎ）による測定を行なつた。得られた前方散
乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図３に、各
ヒトβ2 −ミクログロブリン濃度における蛍光強度を表
３に、それぞれ示す。
【００２６】次に、(a) で調製した抗ヒトＡＦＰ抗体固
相化粒子分散液（0.０６％）、抗ヒトＣＥＡ抗体固相化
粒子分散液（0.０６％）及び抗ヒトβ2 −ミクログロブ
リン抗体固相化粒子分散液（0.０６％）を等量ずつ混合
し、ＡＦＰ、ＣＥＡ及びβ2−ミクログロブリン同時測
定用の粒子分散液を調製した。次に、(b) で調製したＦ
ＩＴＣ標識抗ヒトＡＦＰ抗体（0.０６mg／ml）、ＦＩＴ
Ｃ標識抗ヒトＣＥＡ抗体（0.０６mg／ml）、ＦＩＴＣ標
識抗ヒトβ2 −ミクログロブリン抗体（0.０６mg／ml）
を等量ずつ混合して、ＡＦＰ、ＣＥＡ及びβ2−ミクロ
グロブリン同時測定用の標識抗体溶液を調製した。
相化粒子分散液（0.０６％）、抗ヒトＣＥＡ抗体固相化
粒子分散液（0.０６％）及び抗ヒトβ2 −ミクログロブ
リン抗体固相化粒子分散液（0.０６％）を等量ずつ混合
し、ＡＦＰ、ＣＥＡ及びβ2−ミクログロブリン同時測
定用の粒子分散液を調製した。次に、(b) で調製したＦ
ＩＴＣ標識抗ヒトＡＦＰ抗体（0.０６mg／ml）、ＦＩＴ
Ｃ標識抗ヒトＣＥＡ抗体（0.０６mg／ml）、ＦＩＴＣ標
識抗ヒトβ2 −ミクログロブリン抗体（0.０６mg／ml）
を等量ずつ混合して、ＡＦＰ、ＣＥＡ及びβ2−ミクロ
グロブリン同時測定用の標識抗体溶液を調製した。
【００２７】次に、上記同時測定用の粒子分散液１００
μｌに既知濃度のヒトＡＦＰ溶液、ヒトＣＥＡ溶液及び
ヒトβ2 −ミクログロブリン溶液各１００μｌを加え、
更に、上記同時測定用ＦＩＴＣ標識抗体１００μｌを加
え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶液につい
て、フローサイトメーター測定を行なつた。得られた前
方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図４
に、各測定物質濃度における蛍光強度を表４に、それぞ
れ示す。
μｌに既知濃度のヒトＡＦＰ溶液、ヒトＣＥＡ溶液及び
ヒトβ2 −ミクログロブリン溶液各１００μｌを加え、
更に、上記同時測定用ＦＩＴＣ標識抗体１００μｌを加
え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶液につい
て、フローサイトメーター測定を行なつた。得られた前
方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図４
に、各測定物質濃度における蛍光強度を表４に、それぞ
れ示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】
【表４】
【００３２】表に示す結果から明らかなように、同時測
定においても、それぞれ単独で測定した場合と殆ど同じ
蛍光強度を得ることができた。
定においても、それぞれ単独で測定した場合と殆ど同じ
蛍光強度を得ることができた。
【００３３】比較例１ (a) 粒子への抗体の固相化 シード重合法で調製したカルボキシル化ポリスチレン粒
子（粒子径3.１μｍ、屈折率1.５９）を用いて、実施例
１と同様にして、抗ヒトＣＥＡ抗体固相化粒子分散液を
調製した。
子（粒子径3.１μｍ、屈折率1.５９）を用いて、実施例
１と同様にして、抗ヒトＣＥＡ抗体固相化粒子分散液を
調製した。
【００３４】次に、カルボキシル化ポリスチレン粒子
（粒子径4.２μｍ、屈折率1.５９）を用いて、実施例１
と同様にして、抗ヒトβ2 −ミクログロブリン抗体固相
化粒子分散液を調製した。 (b) フローサイトメーターによる測定 実施例１で調製した抗ヒトＡＦＰ抗体固相化粒子分散液
（0.０４％）１００μｌに既知濃度のヒトＡＦＰ溶液１
００μｌを加え、実施例１で調製したＦＩＴＣ標識抗ヒ
トＡＦＰ抗体（0.０２mg／ml）１００μｌを加え、３７
℃で３時間反応させた。この混合溶液について、フロー
サイトメーターによる測定を行なつた。得られた前方散
乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図５に示
し、各ヒトＡＦＰ濃度における蛍光強度を表５に示す。
（粒子径4.２μｍ、屈折率1.５９）を用いて、実施例１
と同様にして、抗ヒトβ2 −ミクログロブリン抗体固相
化粒子分散液を調製した。 (b) フローサイトメーターによる測定 実施例１で調製した抗ヒトＡＦＰ抗体固相化粒子分散液
（0.０４％）１００μｌに既知濃度のヒトＡＦＰ溶液１
００μｌを加え、実施例１で調製したＦＩＴＣ標識抗ヒ
トＡＦＰ抗体（0.０２mg／ml）１００μｌを加え、３７
℃で３時間反応させた。この混合溶液について、フロー
サイトメーターによる測定を行なつた。得られた前方散
乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図５に示
し、各ヒトＡＦＰ濃度における蛍光強度を表５に示す。
【００３５】(a) で調製した抗ヒトＣＥＡ抗体固相化粒
子分散液（0.０４％）１００μｌに既知濃度のヒトＣＥ
Ａ溶液１００μｌを加え、実施例１で調製したＦＩＴＣ
標識抗ヒトＣＥＡ抗体（0.０２mg／ml）１００μｌを加
え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶液につい
て、フローサイトメーターによる測定を行なつた。得ら
れた前方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを
図６に、各ヒトＣＥＡ濃度における蛍光強度を表６に、
それぞれ示す。
子分散液（0.０４％）１００μｌに既知濃度のヒトＣＥ
Ａ溶液１００μｌを加え、実施例１で調製したＦＩＴＣ
標識抗ヒトＣＥＡ抗体（0.０２mg／ml）１００μｌを加
え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶液につい
て、フローサイトメーターによる測定を行なつた。得ら
れた前方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを
図６に、各ヒトＣＥＡ濃度における蛍光強度を表６に、
それぞれ示す。
【００３６】次に、(a) で調製した抗ヒトβ2 −ミクロ
グロブリン抗体固相化粒子分散液（0.１０％）１００μ
ｌに既知濃度のヒトβ2 −ミクログロブリン溶液１００
μｌを加え、実施例１で調製したＦＩＴＣ標識抗ヒトβ
2 −ミクログロブリン抗体（0.０２mg／ml）１００μｌ
を加え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶液につ
いて、フローサイトメーターによる測定を行なつた。得
られた前方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツト
を図７に、各ヒトβ2 −ミクログロブリン濃度における
蛍光強度を表７に、それぞれ示す。
グロブリン抗体固相化粒子分散液（0.１０％）１００μ
ｌに既知濃度のヒトβ2 −ミクログロブリン溶液１００
μｌを加え、実施例１で調製したＦＩＴＣ標識抗ヒトβ
2 −ミクログロブリン抗体（0.０２mg／ml）１００μｌ
を加え、３７℃で３時間反応させた。この混合溶液につ
いて、フローサイトメーターによる測定を行なつた。得
られた前方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツト
を図７に、各ヒトβ2 −ミクログロブリン濃度における
蛍光強度を表７に、それぞれ示す。
【００３７】次に、実施例１で調製した抗ヒトＡＦＰ抗
体固相化粒子分散液（0.０６％）、上記抗ヒトＣＥＡ抗
体固相化粒子分散液（0.１２％）及び抗ヒトβ2 −ミク
ログロブリン抗体固相化粒子分散液（0.３０％）を等量
ずつ混合して、ＡＦＰ、ＣＥＡ及びβ2 −ミクログロブ
リン同時測定用の粒子分散液を調製した。次に、上記同
時測定用の粒子分散液１００μｌに既知濃度のヒトＡＦ
Ｐ溶液、ヒトＣＥＡ溶液及びヒトβ2 −ミクログロブリ
ン溶液各１００μｌを加え、更に、実施例１で調製した
同時測定用ＦＩＴＣ標識抗体１００μｌを加え、３７℃
で３時間反応させた。この混合溶液について、フローサ
イトメーターによる測定を行なつた。得られた前方散乱
光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図８に、各測
定物質濃度における蛍光強度を表８に、それぞれ示す。
体固相化粒子分散液（0.０６％）、上記抗ヒトＣＥＡ抗
体固相化粒子分散液（0.１２％）及び抗ヒトβ2 −ミク
ログロブリン抗体固相化粒子分散液（0.３０％）を等量
ずつ混合して、ＡＦＰ、ＣＥＡ及びβ2 −ミクログロブ
リン同時測定用の粒子分散液を調製した。次に、上記同
時測定用の粒子分散液１００μｌに既知濃度のヒトＡＦ
Ｐ溶液、ヒトＣＥＡ溶液及びヒトβ2 −ミクログロブリ
ン溶液各１００μｌを加え、更に、実施例１で調製した
同時測定用ＦＩＴＣ標識抗体１００μｌを加え、３７℃
で３時間反応させた。この混合溶液について、フローサ
イトメーターによる測定を行なつた。得られた前方散乱
光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを図８に、各測
定物質濃度における蛍光強度を表８に、それぞれ示す。
【００３８】
【表５】
【００３９】
【表６】
【００４０】
【表７】
【００４１】
【表８】
【００４２】表に示す結果から明らかなように、単独測
定と比較して、同時測定によれば、ＡＦＰ濃度が高い場
合に、ＣＥＡ低濃度における蛍光強度が異常に高く、ま
た、ＣＥＡ濃度が高い場合は、β2 −ミクログロブリン
低濃度における蛍光強度が異常に高くなつており、正確
な同時測定を行なうことができなかつた。
定と比較して、同時測定によれば、ＡＦＰ濃度が高い場
合に、ＣＥＡ低濃度における蛍光強度が異常に高く、ま
た、ＣＥＡ濃度が高い場合は、β2 −ミクログロブリン
低濃度における蛍光強度が異常に高くなつており、正確
な同時測定を行なうことができなかつた。
【００４３】
【図１】、
【図２】、
【図３】及び
【図４】は、それぞれ本発明の方法による前方散乱光強
度／側方散乱光強度ドツトプロツトを示す図である。
度／側方散乱光強度ドツトプロツトを示す図である。
【図５】、
【図６】、
【図７】及び
【図８】は、それぞれ比較例としての従来の方法による
前方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを示す
図である。
前方散乱光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを示す
図である。
【図９】は、フローサイトメーターで測定した前方散乱
光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを示す図であ
る。
光強度／側方散乱光強度ドツトプロツトを示す図であ
る。
Claims (1)
- 【請求項１】屈折率の異なる２種以上の粒子にそれぞれ
異なる測定物質と結合する抗体又は抗原を固相化してな
る試薬を被検液及び蛍光標識抗体と共に混合し、反応さ
せた後、フローサイトメーターにて上記粒子の蛍光強度
を測定することを特徴とする免疫学的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18417392A JPH0627112A (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | 免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18417392A JPH0627112A (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | 免疫学的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0627112A true JPH0627112A (ja) | 1994-02-04 |
Family
ID=16148645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18417392A Pending JPH0627112A (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | 免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0627112A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999064867A1 (en) * | 1997-12-04 | 1999-12-16 | Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited | Multiple assay method |
| US6225046B1 (en) | 1995-04-03 | 2001-05-01 | Macquarie Research Ltd. | Method for detecting microorganisms |
| JP2006275905A (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 蛍光分析方法 |
-
1992
- 1992-07-10 JP JP18417392A patent/JPH0627112A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6225046B1 (en) | 1995-04-03 | 2001-05-01 | Macquarie Research Ltd. | Method for detecting microorganisms |
| WO1999064867A1 (en) * | 1997-12-04 | 1999-12-16 | Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited | Multiple assay method |
| JP2006275905A (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 蛍光分析方法 |
| JP4652868B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2011-03-16 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 蛍光分析方法 |
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