JPH03167475A - 免疫測定方法および装置 - Google Patents

免疫測定方法および装置

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JPH03167475A
JPH03167475A JP30461489A JP30461489A JPH03167475A JP H03167475 A JPH03167475 A JP H03167475A JP 30461489 A JP30461489 A JP 30461489A JP 30461489 A JP30461489 A JP 30461489A JP H03167475 A JPH03167475 A JP H03167475A
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JP
Japan
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antibody
microparticles
cea
antigen
fine particles
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Pending
Application number
JP30461489A
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English (en)
Inventor
Satoshi Takahashi
智 高橋
Kazunobu Okano
和宣 岡野
Kenji Yasuda
健二 保田
Daizo Tokinaga
時永 大三
Kazunari Imai
一成 今井
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Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業Hの利用分野】
本発明は,微粒子を用いた免疫測定方法およびその装置
に関するものである。 (従来の技術】 微粒子を使用した免疫測定方法として,表面に抗体を結
合させたラテックス粒子と抗原とを反応させ、抗原抗体
反応によって生成するラテックス粒子の凝集状態を吸光
度または散乱光強度により測定して抗原濃度を測定する
方法が知られている(ぶんせき, 16, 605(1
987)) . Lかし,ラテックス粒子の凝集状態は
一定ではなく分布を持つため,反応液全体の平均値を測
定するこれらの方法では,抗原濃度の算出に鯖度的な問
題があり,極低濃度の抗JfX量の定量などが困難であ
った。 そこで、反応液をブローセルに導いて、セル内も流れる
微粒子の散乱光または供光強度を測定する方法が開発さ
れた[検査と技術, 16, 607(1988).特
開昭62−81567,ジャーナル オブ イムノロジ
カノレ メソッズ(J. Immunol. Meth
ods)  18. 33(1977) ]。この方法
によれば、個々の凝集塊の大きさを計測することができ
ることから、抗原濃度の算出拵度を向上させることがで
きる。また、蛍光微粒子を用いて抗原抗体反応を起こさ
せ、その凝集像を画像処理することにより凝集状態を解
析し抗))X m度を算定する方法もある(特開昭64
−35373) . ヒ記従来方法は、ホモジニアス系でラテックス粒子表面
の抗体(または抗原)と抗原(または抗体)とが反応し
て凝集をおこすことを利用している。そのため、抗原過
剰領域で抗原抗体反応が抑制される現象、いわゆるプロ
ゾーン現象が避けられない.また,試料中に共存する散
乱体や,色素算の吸収体・做光体の影響を完全に除去す
ることは困難である。さらに、抗原と抗体とが1対1に
結合するとは限らないため、凝集塊の数を計数する従来
方式では特に極低濃度領域での計数値の誤差が発生しや
すいという問題がある。 ブロゾーン現象や共存物質の影響を受けない方法として
,特開昭56−151357のようなヘテロジニアス系
の反応がある。しかし、この方法では簡便性・多項目測
定が可能になるが,高感度化に対する配慮がなされてい
ない。
【発明が解決しようとする課題1 本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し,微粒
子を利用した高感度で多項目測定ができる免疫測定方法
およびその装岡を提供することにある。 【課題を解決するための手段】 上記目的は,測定試料中の複数の被測定物質のそれぞれ
と特異的に結合する物質を固定化した反応容器と、該被
測定物質のそれぞれと特異的に結合する物質をそれぞれ
固定化した複数の異なる種類の微粒子を使用し,反応容
器に固定化した被測定物質と特異的に結合する物質と.
a定試料中の被測定物質と.*粒子に固定化した被測定
物質と特異的に結合する物質とを接触させて結合させる
ことにより,微粒子を反応容器に捕捉し、異なる種類ご
との微粒子数を計数することにより達或できる。 複数の異なる神類の微粒子には、径の異なる微粒子が使
用できる6 反応容器に捕捉した微粒子の種類と数を計測するには,
微粒子の像を両像化し、画像処理することで達成するこ
とができ、顕微鏡、画像入力装置(TVカメラ等),及
び画像処理装置から成る装置によって達成できる.まず
、画像入力装置により得られた画像をもとに、個々の微
粒子の大きさを測定し,粒径の違いにより複数の微粒子
群に分類し,各分類毎の微粒子数を計数する.測定試料
中の被allJ定物質および被測定物質と特異的に結合
する物質の組合せとしては、抗M(または抗体)と抗体
(または抗原)が代表的な組合せである.その他に、例
えばホルモンとレセプター、糖とレクチンなどの組合せ
も可能である。 計数される粒子としては、ポリスチレン、アクリル、ス
チレンーブタジエン共重合体,スチレンーアクリル酸共
重合体などの比重が1〜1.4糊度の材質の拉子が適当
である.比重が1〜1.4程度の粒子のとき、反応が効
果的に行われる6またその粒径は.3μm以下,特に0
.1〜1μmの範囲が適当である.この粒子の表面に杭
体くまたは抗原〉などを結合させるには、通常知られて
いる物理吸着、化学結合などが利用できる。 本発明によりヒトα−フェトプロテイン(AFP)、痒
胎児性抗原(CEA).フェリチン、風疹抗体、エイズ
ウィルス抗体、ヒト絨毛性ゴナドト口ピン(HCG)な
ど神々の抗原,抗体,ホルモンなどが測定できる.
【作用1 本発明によれば、複数の被測定物質のそれぞれに異なっ
た4%の微粒子が結合するため,同一容鼎内で多柚類の
被測定物質を計側でき、多項目化が達成できる。さらに
、被測定物質の1個に対して1個の微粒子が結合するこ
とから、高感度に被測定物質を計測することができる. [実施例】 以下、本発明の実施例を.AFPとCEAの2つの抗原
を例にとり、多項目計測方法について説明する。 固定化抗体の調製: マイクロプレートのウェルを反応容器とし、内面にA 
F PとCEAに対する抗体を固定化する.平底のマイ
クロプレートのウェルに濃度10μg/mQの抗ヒトA
FP抗体溶液25μ党と濃度10μg / m Dの抗
CEA抗体溶液25μ悲を注入し,2時間間欠的に攪拌
し反応させて抗ヒトA I” P抗体および抗CEA抗
体を固定化する。 微粒子eA¥a抗体の調製: 直径が0.41μmおよび0.76pmで、表面にカル
ボキシル基を有するアクリル系微粒子を標識物として使
用する.カルボジイミド法により、0.41μ+n4%
の微粒子の表面に抗ヒトAFP抗体を固定化し(固定化
量約0.7mg/g).微粒子標識抗ヒトA F P抗
体を調製する。同様に,0.76μm径の微粒子の表面
に抗CEA抗体を固定化し(固定化量約0.7mg/g
).微粒子標識抗CEA抗体を調製する。 AFPとCEAを含む試料直消50μ悲を抗ヒトAFP
抗体と抗CEA抗体を固定化した反応容器(ウェル)に
注入して、2時間反応させ、測定抗[(AFPおよびC
EA)を反応容器(ウェル)に捕捉する。その後、0.
5%BSAを含むりん酸緩神j液(0.5%BSA−P
BS)で洗浄し、反応しなかった抗原などを除去する。 次に、微粒子濃度が0.1%になるように調製した微粒
子標識抗ヒトAFP抗体溶液60μαおよび微粒子標識
抗CEA抗体溶液60μaを注入し、5時間静置して反
応させ,反応容器(ウェル)に捕捉したヒトAFPおよ
びCEAに微粒子標識抗体を結合させる.次に、0.5
%B S A − I) BSで静かに洗浄し、余分の
微粒子標識抗体を除去する. このときの抗原と微粒子標識抗体の結合状態は、第1図
のような模式図で表すことができる.反応容器(ウェル
)1上に固定化された抗ヒトAFP抗体2と抗CEA抗
体3に試料血清中のヒトAF1) 4とCEA5が抗原
抗体反応により結合する.さらにヒトAFP4には,抗
ヒトA F’ P抗体6を介して0.41μm径の微粒
子7が結合する.またCEA5には、抗CEA抗体8を
介して0.76μm径の微粒子9が結合する。 なお、微粒子標識抗体溶液の微粒子の濃度は、0.01
%から1%が適当である.比重のやや小さいポリスチレ
ン微粒子を使用した場合は、その微粒子濃度は.0.0
5%から5%が適当である.その他の微粒子についても
、微粒子濃度は微粒子の比重の大きさや粒径等によって
決定される.第2図に平底のマイクロプレートのウェル
に捕捉した微粒子の径と数を計測する装置の概略図を示
す。装置は(倒立型の)顕wj鏡10とTVカメラ11
と画像処理装置12,さらにモニターテレビ13と出力
装置14とで構成される.微粒子が捕捉されたマイクロ
プレートのウェル15を顕微鏡10のステージに載せ、
ウェル15内の微粒子l6の顕微鏡像をTVカメラ11
で写しとる。顕微鏡像は通常の透過像の他にf1“t相
差・微分干渉像等が使用できる。 本実施例では、拉相差像によりMl 察した。TVカメ
ラ11からの出力を両像処理装置12で処ア■する。ま
ず、像を8ビットにディジタル化して両像メモリに蓄積
する。この操作を64フレーl1行ない、像のS/Nを
良くする。得られた画像データから微粒子の径と数を計
測する。同じ粒径の微粒子でもバラツキがあり、また顕
微鏡焦点{+ZRと微粒子の局在位置とのずれ算により
、見掛けの粒径は多少変動する。そこで、計測された微
粒子を、粒#モが0.3μm=0.6μmの範囲の微粒
子群と粒径が0.6μm”0.9μmの範囲の微狩子群
とに分類し、それぞれの分類ごとに微粒子数を計数した
.0.3μmより小さいものおよび0.9μmより大き
いものは、ゴミ等と判断して、計数から除外した。 本方法によりヒトAFPまたはC E A 73度を定
量するには、あらかじめ濃度が既知の試料で検量線をつ
くり、それぞれの粒子数から濃度を算定すれば良い。 本実施例では、測定抗原と標識物である微粒子との結合
比率が一定となるため、精度が高く、高感度な定量が可
能になった。また,抗原過剰領域で抗原抗体反応が抑制
される現象、いわゆるプロゾーン現象が生じないため,
高濃度の抗原濃度域での定辰も可能である。 [発明の効果】 本発明によれば、抗原抗体反応などの特異的な反応によ
り、測定抗原などの被測定物質量に対して一定比串の微
粒子を反応容器に捕捉することができ、また試料中に含
まれる光散乱体等の影響を受けないため,高感度に抗原
濃度を定量できる効果がある。さらに,被測定物質の穐
類に応じて異なる粒径の微粒子を結合させることにより
,多項目計測が可能になる.
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の実施例における抗原と微粒子標識抗体
の結合状態を示す模式−1、第2図は本発明の一実施例
の測定装置の概略図である。 符号の説明 1・・・反応容器(ウェル) 2・・・抗ヒトA F’ I)抗体 3・・・抗CEA抗体 4・・・ヒトA P I) 5・・・CEA 6・・・抗ヒトA F })抗体 7・・・0.41μm径の微粒子 8・・・抗CEA抗体 9・・・0.76μm径の微粒子 10・・・(倒立型)顕微鏡 1l・・・TVカメラ l2・・・画像処列1装置 13・・・モニターテレビ 14・・・出力装置

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、測定試料中の複数の被測定物質のそれぞれと特異的
    に結合する物質を固定化した反応容器と、該被測定物質
    のそれぞれと特異的に結合する物質をそれぞれ固定化し
    た複数の異なる種類の微粒子を使用し、該反応容器と測
    定試料と該微粒子を接触させることにより、微粒子を反
    応容器に捕捉し、微粒子の種類と微粒子数を計数する免
    疫測定方法。 2、微粒子の径によって複数の種類に識別することので
    きる微粒子を使用することを特徴とする特許請求の範囲
    第1項記載の免疫測定方法。 3、反応容器に捕捉した微粒子を画像により識別し、そ
    の種類と数を計測することを特徴とする特許請求の範囲
    第1項または第2項記載の免疫測定方法。 4、画像入力装置と、画像入力装置からの像を画像処理
    して微粒子の種類と数を計測する装置とからなる免疫測
    定装置。 5、個々の微粒子の大きさを計測し、同じ種類の粒子毎
    にその数を計数する処理を行うことを特徴とする特許請
    求の範囲第4項記載の免疫測定装置。
JP30461489A 1989-11-15 1989-11-27 免疫測定方法および装置 Pending JPH03167475A (ja)

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DE19904036288 DE4036288A1 (de) 1989-11-15 1990-11-14 Verfahren und vorrichtung fuer immunologische tests unter nutzung messbarer teilchen

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1373467A1 (en) * 2001-03-28 2004-01-02 Genetech Biotechnology (Shangai) Company Limited Device and method for detection of multiple analytes
US6825000B1 (en) 1998-05-15 2004-11-30 Sekisui Chemical Co., Ltd. Immunoassay reagent and immunoassay method
JP2009192222A (ja) * 2008-02-12 2009-08-27 Fujifilm Corp 免疫学的測定方法
WO2017183711A1 (ja) * 2016-04-22 2017-10-26 富士レビオ株式会社 レクチン標的分子の捕捉方法

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