JPS6214059A - 液体クロマトグラフイ−による物質の分離精製システム装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ、発明の目的 〔産業上の利用分野〕 本発明は、液体クロマトグラフィーによる物質の分離精
製システムに関する。

〔従来の技術〕

液体クロマトグラフィーは、溶質として複数種の物質（
無機物質、有機物質、生化学的物質等）が混ざり合って
存在する粗製原料液（原試料）から目的の１種、或は数
種、若しくは全ての成分物質を分取（分離精製）するに
有効な手段の１つである。

その基本的操作を第４図面の簡単な説明する。

（ａ）各成分物質のクロマト分離・展開操作内部に固定
相として固体充填剤２が詰められ、一端側に流体導入口
３、他端側に同流出口４を有するカラム１内に導入口３
から、必要に応じて濃度を適当に調整した所定量の原料
液Ａを導入すると共に、展開溶媒Ｂ（所定塩濃度のリン
酸緩衝液・ＫＣＩ溶液φＮａＣｌ溶液等）を導入する。

５・６はカラム内の上端側と下端側に配設したフィルタ
部材である。

そうするとカラム内の固体充填剤２中を流出口４方向に
流れる原料液Ａに含まれる各成分物質が、それ等測々の
固体充填剤２に対する吸着性や分配係数等の差異により
、各成分物質量相互に移動速度差を生じ、その結果カラ
ム内充填剤２に対して原料液の流れ方向に沿って各成分
物質ごとに相互分離した各成分物質の吸着帯ができる。

即ち各成分物質が相互にクロマト分離される。

所定量の原料液Ａを導入した後も展開溶媒Ｂについては
その導入を更に適当時間続行することにより充填剤２に
対する各成分物質の分離吸着帯は全体的に溶媒Ｂの流れ
方向に移動しつつ各吸着帯相互の間隔が開き（展開）、
いっそうよく分離する。

（ｂ）各クロマト分離物質の分取操作 カラム充填剤２に対する各成分物質の分離吸着帯の展開
が適当に進行したら、カラムｌの導入口３から、カラム
内充填剤２に対して相互分離吸着帯として保持されてい
る各分離成分物質のうち分取すべき目的の成分物質につ
いてのみ充填剤２から離脱を生じさせる塩漬度範囲の分
取溶媒Ｃを導入する。この分取溶媒Ｃは前記展開溶媒Ｂ
と同じくリン酸緩衝液−ＫＣＩ溶液・Ｎａ１ｌ溶液等で
あるが、その塩濃度を上記目的成分物質の離脱発生濃度
範囲に調整したものである。

そうすると目的の成分物質のみが選択的に充填剤２から
離脱して分取溶媒Ｃと共にカラムｌの流出口４から流出
して分取される。他の成分物質も夫々の物質について特
定される塩濃度の分取溶媒Ｂをカラム１内に導入するこ
とにより夫々上記と同様に分取することができる。

或はカラムｌ内に導入する分取溶媒Ｃの塩濃度を予め設
定したグラジェント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）経時的推移計
画に従って無段階的（第２図）に或は段階的（第３図）
に経時変化させつつ導入することによりその導入分取溶
媒Ｃの塩濃度の経時変化につれてカラム充填剤２に保持
されている、各分離成分物質イ・口・ノい・・が順次に
充填剤２から離脱して分取溶媒Ｃと共にカラム１の流出
口４から流出する。そこで鎖目４から順次に流出する各
分取成分物質含有溶媒流を１個々の成分物質含有溶媒流
部分ごとに、或は目的の成分物質含有溶媒流部分につい
て分別採取する。

（ｃ）カラム内クリーニング等 カラム内充填剤２に保持されている各分離成分物質のう
ち目的の１種、或は数種、若しくは全ての成分物質の分
取を終了したら、カラム充填剤に離脱せずに吸着残存し
ている全ての物質を離脱させる塩濃度の溶媒を導入して
充填剤２のクリーニング操作をする。

而して以後前記（ａ）Φ　（ｂ）−（ｃ）の操作を１サ
イクルとして繰り返すことにより原料液からの所要の成
分物質の分取を順次回分的に実行することができる。

目的の分取成分物質を含有する個々の溶媒は濃縮装置で
所要濃度に濃縮される。或は更に乾燥操作等により目的
の分取成分物質のみにされる。

以上のように液体クロマトグチフィーは物質の分離精製
手法として有効なものであるが、特にカラム内充填剤２
としてハイドロキシアパタイト結晶（通常、化学組１＆
Ｃａ＋ｏ　（ｐｏ、　）　ｂ　　（ＯＨ）　２、へ方品
系学位格子：　ａＡｂ−１２０°、ａ　Ａ　Ｃ＝　ｂ　
Ａ　Ｃ−９０ｃ′、　１ａｌ＝　１ｂｌ＝　９．２４λ
、１ｃ）＝　８．８８＾によって特徴づけられるリン酸
カルシウムの一種であり、板状ないしは鱗片状結晶体）
を用いた場合は、他の充填剤例えばイオン交換樹脂・活
性アルミナ・炭酸カルシウムなどを用いる場合には困難
であった、微細な構造差を有する物質量の相互分離、例
えば分子量１０’〜１０９ダルトンの生体関連高分子（
免疫グロブリン・インターフェロン・酵素類等の蛋白質
類、ＲＮＡ・ＤＮＡ・プラスミド等の核酸類、ウィルス
類など）についても鋭敏等高精度に分取操作することが
可能であり１例えばバイオテクノロジー分野での遺伝子
組換え、細胞融合、細胞大量培養法等により合成された
各種の目的有用物質を高純度に分離精製する手段として
、特に注目されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところで従来、上記のような液体クロマトグラフィーに
よる物質の分離精製操作を可及的にシステム装置化した
ものはある。しかしそれ等は単に最初に設定したプログ
ラム通りにクロマトシステム操作が機械的に進行するだ
けの単純なものにすぎず、例えば何等かの理由でシステ
ムに実際に流されている溶媒の塩濃度が許容範囲から外
れていたり、システムに実際に流されている流体の流量
が許容範囲から外れていたり、システム流路に気泡が発
生していたりする等のアクシデントを生じていたとして
も、それに拘らずシステムは単純に機械的に進行するも
のである。そのために予定した理想的なりロマト過程と
、実際に行われつつあるクロマト過程との間にずれが生
じ易く、分取精度的にも、クロマトデータ的にも信頼性
の低いものであった。

本考案は上記に鑑みて、信頼性が極めて高く、例えば高
精度の目的物質分取能力、大量処理能力等の要求される
バイオテクノロジー分野の工業的物質分取装置としても
十分に実用できる、この種のシステム装置を開発して提
供することを目的とする。

口、発明の構成 〔問題点を解決するための手段〕 即ち本発明は、 内部に固定相としての固体充填剤が詰められ導入された
Ｍ料液中の各成分物質を相互にクロマト分離・展開する
１個のカラム或は複数個のカラムからなるクロマト分離
カラム系と、 上記カラム系のカラム内に原料液を導入する原料液供給
装置と、 同じ〈カラム系のカラム内に溶媒液を、該溶媒液の含有
塩濃度を基準のグラジェント経時的推移設定に従って無
段階的に或は段階的に経時変化させつつ導入する溶媒供
給装置と、 カラム系のカラムから順次に流出する各分取成分物質含
有溶媒流を、個々の成分物質含有溶媒液部分ごとに、或
は目的の成分物質含有溶媒液部分について分別採取する
フラクションコレータと、溶媒供給装置からカラム系の
カラム内へ入る溶媒流の一部、或はカラム系のカラム内
から流出する溶媒液の１部をサンプル溶媒として受けて
溶媒の塩濃度の経時変化状態を測定する塩濃度測定装置
と、 カラム系のカラム内から流出する溶媒流の１部をサンプ
ル溶媒として受けてカラム内から分取される各成分物質
の経時的順次分取状態を測定する成分物質分取状態測定
−モニタ装置と。

カラム系に流入する溶媒流の流量、又はカラム系のカラ
ム内から流出する溶媒流の流量、又はその両方を経時的
に測定する溶媒流量測定装置と、前記塩濃度測定装置か
ら出力される溶媒塩濃度の経時変化測定値と基準の塩濃
度経時変化関数値とを比較し、その比較情報を塩濃度経
時変化制御手段にフィードバックして溶媒供給装置から
カラム系のカラム内へ導入される溶媒の塩濃度を適正に
更正する塩濃度自動調節系統、及び前記溶媒流ｉ測定装
置から出力される溶媒流量の経時変化測定値と基準の流
量値とを比較し、その比較情報を流量制御手段にフィー
ドバックして溶媒供給装置からカラム系のカラム内へ導
入される溶媒流量を適正に更正する溶媒流量自動調節系
統を含み、システムを構成する前記の各構成装置を所定
の操作条件に従って連係制御するシステムコントロール
装置と。

からなる、ことを特徴とする液体クロマトグラフィーに
よる物質の分離精製システム装置を要旨とする。

〔作　用〕

上記本発明システム装置の大きな特徴は、システム装置
に実際上流されている溶媒の塩濃度並びに流量の経時的
変化を夫々自動的に測定して夫々の適正値と比較させ、
それ等の比較情報を塩濃度経時変化制御手段並びに流量
制御手段にフィードバックして、システム装置に実際上
流される溶媒の塩濃度並びに流量を夫々常に適切な設定
条件になるように自動制御する制御系統を有する点にあ
り、これにより現在進行中のクロマト過程に何等かの理
由で設定条件ずれが生じても直ちにその条件ずれの更正
が自動的になされるので、クロマト過程は終始理想的な
設定条件で実行される。即ち極めて信頼性の高いシステ
ム装置が構成される。

〔実施例〕

第１図は上記本発明に従う一実施例装置の構成を示すブ
ロック図である。

１０は、内部に固定相として例えばハイドロキシアパタ
イト結晶等の固体充填剤が詰められ、導入された原料液
中の各成分物質を相互にクロマト分離・展開する１個の
カラムｌ又は複数個のカラムからなるクロマト分離カラ
ム系である。

１１は原料液供給装置であり、原料液Ａの貯溜タンク１
２、原料液抜き出しポンプ１３、カラムｌの流体導入口
側の配管１５内に所定量の原料液を注入する原料液イン
ジェクタ１４等からなる。

１６は溶媒供給装置であり、塩濃度を低く調製した溶媒
（低、濃度溶媒）の貯溜供給部１７と、塩濃度を高く調
製した溶媒（高濃度溶媒）の貯溜供給部２１と、その両
供給部からの低濃度溶媒と高濃度溶媒との合流混合室２
５とからなる。

低濃度溶媒貯溜供給部１７は、リン酸緩衝液・ＫＣ１溶
液・ＮａＣ１溶液などの各種の溶媒について塩濃度を低
く調製したものを夫々貯溜させた複数のタンク１８．　
　・１８□・・・１８ｎと、それ等のタンクの選択切換
えコック装置１９と、該コック′！ｌ装置１９により選
択されたタンク中の低濃度溶媒を混合室２５に導入する
ポンプ２０等からなる。

又高濃度溶媒貯溜供給部２１は同じくリン酸緩衝液＠Ｋ
ＣＩ溶液・Ｍａｉｌ溶渣など各種の溶媒について塩濃度
を高く調製したものを夫々貯溜させた複数のタンク２２
宜　・２２２・・・２２ｎと、それ等のタンクの選択切
換えコック装置２３と、該コック装置２３により選択さ
れたタンク中の高濃度溶媒を混合室２５に導入するポン
プ２４等からなる。

溶媒混合室２５の溶媒は配管１５を通じてカラム系ｌＯ
のカラム１内に導入される。２６は溶媒混合室２５と、
前記原料インジェクタ１４との間の配管部分に設けた圧
力計である。

２７はカラム系１０のカラム１の流体流出口側の配管２
８に設けた流出溶媒流ｉ測定装置、２９はその次位に設
けたフラクションコレータ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｏｒ）、３０はフラクションコレータで分別採
取された所要の各成分物質含有溶媒液部分の分配を受け
て夫々濃縮処理する濃縮装置である。

３１は前記流量測定装置２７から延出させた小量のサン
プル溶媒を採取する分岐管、３２・３３・３４はその分
岐管路に順次直列に配設したサンプル溶媒送すボンブ、
成分物質分取状態測定−モニタ装置、塩濃度測定装置で
ある。

３５はシステムコントロール装置（制御回路部）である
、このコントロール装Ｍ３５はシステムを構成する各構
成装置をコンソール部４０で予め設定した所定の操作条
件に従って連係制御する。具体的には原料液供給装Ｍ１
１のポンプ１３、低濃度溶媒供給装置１７のコック装Ｍ
１９及びポンプ２０、高濃度溶媒供給装置２１のコック
装置２３及びポンプ２４、フラクションコレータ２９、
ｆＩｉ縮装置１３０、サンプル溶媒送りポンプ３２等を
連係制御する。尚システム中の各ポンプは全て無脈動ポ
ンプである。

又上記のコントロール装Ｗ１３５は、溶媒流駿測定装Ｆ
ａ２７、成分物質分取状態測定−モニタ装置３３、ｆＪ
ｉ濃度測定装置３４から夫々出力されるクロマト回転進
行状態情報を受けて所定のシステム自動更正制御を行う
と共に１所要データの出力・表示、警告等も行う。

以下作動を説明する。

■コントロール装置３５に所定の操作条件を設定する。

システムをオンにする。

■溶媒供給装置１６からカラム系ｌＯのカラム１に対し
て溶６１　Ｃが、予め設定したグラジェント経時的推移
設定に従って含有塩濃度が無段階的（ｗ４２図）に或は
段階的（ｔｉ４３図）に自動的に経時変化制御されなが
ら連続的に導入される。上記装置１６からカラム１へ導
入される溶媒Ｃの含有塩濃度の自動的な経時変化制御は
具体的には次のようにしてなされる。

即ちシステムがオンされると、低濃度溶媒供給部１７に
ついて、予め選択指定した種類の溶媒タンク（例えば低
濃度のリン酸緩衝液を貯溜したタンク１８１）に対応す
る、コック装置１９中のコックがコントロール装置３５
により開き状態に保持される。一方高濃度溶媒供給部１
８についても、予め選択指定した種類の溶媒タンク（例
えば高濃度のリン酸緩衝液を貯溜したタンク２２１）に
対応する、コック装置２３中のコックがコントロール装
２ｔ３５により開き状態に保持される。

次いでポンプ２０の作動がなされて低濃度溶媒Ｃｔ、が
混合室２５へ導入される。又ポンプ２４の作動がなされ
て高濃度溶媒Ｃｏが同じく混合室２５へ導入される。こ
の混合室２５への上記両溶媒ＣＬとＣＨの導入は、ポン
プ２０と同２４のコントロール装置３５による制御によ
り、低濃度溶媒ＣＬについては最初は大量に、以後経時
的に所定の減少関数に従って導入量が減少されるように
、又高濃度溶媒ＣＨについては上記とは逆に、最初は零
か或は極〈少量で、以後経時的に所定の増大関数に従っ
て導入量が増大され、且つ混合室２５へ導入される両溶
６ＩＣＬとＣＨのトータル量は経時的に略一定となる関
係に制御される。

これにより混合室１６からカラム１内に溶媒Ｃが、予め
設定したグラジェント経時的推移設定に従って含有塩濃
度が無段階的に或は段階的に経時変化しつつ導入される
。

■溶媒Ｃのカラムｌ内への導入が開始む　されてから１
．時点において、原料液供給？装置１１のポンプ１３が
コントロール装置３５で作動制御されて所定量の原料ｍ
Ａがインジェクタ１４により、混合室２５からカラムｌ
へ至る配管１５内に導入され、その原料液Ａが溶媒Ｃと
共にカラム１内に入る。

■これによりカラム１内において原料導入時点１、から
時点ｔ２の間に原料液Ａ中の各成分物質のクロマト分離
・展開がなされる。

■溶媒Ｃは引続きカラムｌ内に供給されておリ、塩濃度
が経時的に増大していく、而してその塩濃度が最大値（
高濃度溶媒ＣＨの濃度）に到達する時点ｔ３までの間に
、その塩濃度の経時変化につれてカラム内充填剤に保持
されている、各クロマト分離中展開物質イ・口・ハ・・
・が順次に充填剤から離脱して溶媒Ｃと共に配管２８に
流出する。

（Φその流出溶媒は次いでフラクションコレータ２９に
より、順次に流出する個々の成分物質含有溶媒液部分ご
とに、或は目的の有用成分物質含有溶媒部分について分
別採取される。

不要成分物質を含む溶媒液部分は排液３６される。

■次いで、分別採取された各有用成分物質を含有する溶
媒液は濃縮装置３０へ導入されて、濃縮液として夫々取
り出される。

■一方力ラム１から配管２８に流出する実際上の溶媒流
量が流量測定装置２７により経時的に測定され、その経
時的測定値がコントロール装置３５に入力され、それが
予め設定されている基準の流量値と比較され、その比較
情報が流量制御回路部にフィードバックされて、カラム
１内に導入される溶媒流量が常に基準値量に保持される
ように、溶媒供給装置１６のポンプ２０又は／及び同２
４の作動状態が関係的に自動調節制御される。

■又カラムｌから配管２８に流出する溶媒流の極〈一部
が流ｉ測定装置２７から延出させた分岐管３１からサン
プル溶媒として分流される。そのサンプル溶媒はポンプ
３２により連続的に成分物質分取状態測定−モニタ装置
３３に送られ該装置を通過する。そしてその通過過程で
該装置３３によりカラムｌ内から順次に分取される各成
分物質の経時的順次分取状態が測定−モニタされ（第２
図の鎖線はそのモニタクロマトグラム）、その情報がコ
ントロール装置３５へ入力される。この各成分物質の経
時的順次分取状態の測定−モニタは例えばサンプル溶媒
の紫外線吸収特性の経時的変化を測定する方式により精
度よく検出される。

［株］上記装置３３を通過したサンプル溶媒は次位の塩
濃度測定装置３４に入り、システムを流れる溶媒Ｃの塩
濃度の実際上の経時変化状態が測定される。測定後のサ
ンプル溶媒は排液３７される。

溶媒Ｃの塩濃度の経時変化は、例えば溶媒Ｃの屈折率の
経時的変化を測定する方式、電気伝導度の経時的変化を
測定する方式等により検出できるが、前者の屈折率測定
方式の方が後者の方式に比べて電気分解現象等なくリニ
アに精度よく検出できることから実用的である。

而してその経時的測定値がコントロール装！１３５に入
力され、その経時的測定値が予め設定されている基準の
塩濃度経時変化関数値（予定したグラジェント経時的推
移設定）と比較され、その比較情報が塩濃度制御回路部
にフィードバックされてカラムｌ内に導入される溶媒の
塩濃度の経時変化が予定の推移設定に保持されるように
、溶媒供給装置１６ポンプ２０又は／及び同２４の作動
状態が関係的に自動調節制御される。

０カラム１内へ導入される溶媒Ｃの塩濃度が最大値に到
達した時点ｔ３から所定の時点ｔ４までの間はカラムｌ
内には引続き溶媒Ｃが塩濃度最大値のまま導入される。

この間にカラム内充填剤に残存している全ての吸着成分
物・質が離脱してコレータ２９から排液３６されること
によりカラム１内のクリーニングが行われる。

Ｏ以後上記■〜◎を１分取操作サイクルとして同じサイ
クルが繰り返して自動的に実行されて、原料液供給装置
１１から間欠的にカラム内へ導入される原料液から目的
の成分物質が高精度に連続的に分取されていく。

なお、溶媒の塩濃度測定は溶媒のカラム内導入側配管１
５側からサンプル溶媒をとりだし、そのサンプル溶媒の
塩濃度を測定するようにしてもよい。

ハ１発明の効果 以ヒのように本発明のシステム装置は、進行中のクロマ
ト過程に何等かの理由で設定条件ずれが生じても直ちに
その条件ずれの更正が自動的になされるので、クロマト
過程は終始理想的な設定条件に実際的に従って実行され
る極めて信頼性の高いものであり、所期の目的がよく達
成され、例えばバイオテクノロジー分野における有用物
質の分取システム装置として極めて有効適切である。

【図面の簡単な説明】

第１図は一実施例システム装置の構成を示すブロック図
、第２図は溶媒塩濃度の無段階的経時変化推移設定グラ
フ例、第３図は同じく段階的経時変化推移設定グラフ例
、第４図はカラムの一構成例を示す縦断面図である。 ｌはカラム、１１は原料液供給装置、１６は溶媒供給装
置、２９はフラクションコレータ、３０は濃縮装置、３
５はシステムコントロール装置。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）内部に固定相としての固体充填剤が詰められ、導
   入された原料液中の各成分物質を相互にクロマト分離・
   展開する１部のカラム或は複数個のカラムからなるクロ
   マト分離カラム系と、 上記カラム系のカラム内に原料液を導入する原料液供給
   装置と、 同じくカラム系のカラム内に溶媒液を、該溶媒液の含有
   塩濃度を基準のグラジェント経時的推移設定に従って無
   段階的に或は段階的に経時変化させつつ導入する溶媒供
   給装置と、 カラム系のカラムから順次に流出する各分取成分物質含
   有溶媒流を、個々の成分物質含有溶媒液部分ごとに、或
   は目的の成分物質含有溶媒液部分について分別採取する
   フラクションコレータと、溶媒供給装置からカラム系の
   カラム内へ入る溶媒流の一部、或はカラム系のカラム内
   から流出する溶媒液の１部をサンプル溶媒として受けて
   溶媒の塩濃度の経時変化状態を測定する塩濃度測定装置
   と、 カラム系のカラム内から流出する溶媒流の１部をサンプ
   ル溶媒として受けてカラム内から分取される各成分物質
   の経時的順次分取状態を測定する成分物質分取状態測定
   −モニタ装置と、 カラム系に流入する溶媒流の流量、又はカラム系のカラ
   ム内から流出する溶媒流の流量、又はその両方を経時的
   に測定する溶媒流量測定装置と、前記塩濃度測定装置か
   ら出力される溶媒塩濃度の経時変化測定値と基準の塩濃
   度経時変化関数値とを比較し、その比較情報を塩濃度経
   時変化制御手段にフィードバックして溶媒供給装置から
   カラム系のカラム内へ導入される溶媒の塩濃度を適正に
   更正する塩濃度自動調節系統、及び前記溶媒流量測定装
   置から出力される溶媒流量の経時変化測定値と基準の流
   量値とを比較し、その比較情報を流量制御手段にフィー
   ドバックして溶媒供給装置からカラム系のカラム内へ導
   入される溶媒流量を適正に更正する溶媒流量自動調節系
   統を含み、システムを構成する前記の各構成装置を所定
   の操作条件に従って連係制御するシステムコントロール
   装置と、 からなる、ことを特徴とする液体クロマトグラフィーに
   よる物質の分離精製システム装置。
2. （２）前記塩濃度測定装置は、サンプル溶媒の屈折率の
   経時変化を測定して塩濃度の経時変化を検出する方式の
   装置である、特許請求の範囲第（１）項に記載のシステ
   ム装置。
3. （３）前記成分物質分取状態測定−モニタ装置は、サン
   プル溶媒の紫外線吸収特性の経時的変化を測定して各分
   取成分物質の経時的順次分取状態を検出する方式の装置
   である、特許請求の範囲第（１）項に記載のシステム装
   置。
4. （４）前記カラム内固体充填剤として、ハイドロキシア
   パタイト結晶を用いる、特許請求の範囲第（１）項に記
   載のシステム装置。