JPS62119239A - 高分子ポリガラクタンと窒素化合物の錯体の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は高分子ポリガラクタンと窒素化合物からなる
新しい錯体の調整方法に関するもので、この錯体は窒素
含有栄養物を含んだ微生物用のゲル状培養基の再構成に
使われる。また、この錯体の使用にも関する。

〔従来の技術〕

微生物学では、微生物（バクテリア、酵母、小真菌類、
小昆虫、小植物など）の分離に使われる培養基の大多数
は、表面分離に必要な固体伏の培養基を得るために、海
藻から製した不活性物質であるゲル化製品つまり寒天を
含んでいる。また異なった起源をもつ色々な栄養物、及
びそれに付随する反応性物質（染料、指示薬など）も含
有している。

使用に際して、これらの培養基は別々に販売されている
製品から作られる。寒天を溶かした温水中でこれらの製
品を混合し、かつ溶解させ、この温水を冷却化すると、
寒天はゲル化する。

寒天と乾燥栄養物質を含む粉状混合物は、既に市販され
ているので、一定量の粉状混合物を秤量して、温水に溶
かせばよい、これらの粉状混合物は、いつも単純混合物
である。

微生物が必要とする栄養物は、非常に多様で、複雑なの
で、天然の複合栄養物、特に、幾分とも加水分解して容
易に同化できるようにした蛋白質を与えるのが普通にな
ってきている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、このような培養基の標準化は、困難である。な
ぜなら、培養基は、一般に、重量の２／３が化学的に変
化しやすい、天然の産物−たとえば寒天や蛋白質の水解
物−から成っているからである。基本成分もまた、勝状
であり、水分率とか粉末度分布とか、化学的安定化とか
に関して互いに異なっている。さらに、粉状混合物は、
出来あがって数個のバッチに分けられると、均質性を失
うことがあることが確認されている。このことは、出発
原料が精製カンテンと、例えば、精製標準化ペプチドで
あるときでも同様である。

上述した欠点は、特許請求の範囲第１項に記載の方法に
よって得られるような、高分子のポリガラクタンと窒素
化合物との錯体、例えばペプチドを使用することで容易
に取除きうろことが判明した。実際、前記の方法により
、機械的に解離しない安定した錯体を得ることができ、
この錯体を使えば今日、寒天と窒素含有栄養物から作ら
れているすべての培養基の再構成が可能になる。

〔作用〕

驚くべきことに、この発明が開示する錯体は、同じ基本
成分をもつ単純な混合物とは異った反応をすることが判
明した；まず、単純な混合物の組成とは異なり、粉砕し
ても篩にかけても、錯体の組成は変らない；次に窒素含
有物質、例えばアミノ酸やペプチドの安定性が高くなっ
ている；さらに、老化に対する抵抗も増加している。そ
して水に溶解したあとの窒素含有栄養物の特性も、この
発明による錯体の組成の一部を成している基本成分の特
性に比べて変化しない。

本発明の方法は、まず直線構造の高分子ポリガラクタン
と、窒素化合物を室温において、きめられた割合で、均
質の生成物が得られるまで撹拌し、その得られた混合物
を放置し、乾燥させた後、粉砕する。必要であれば、さ
らに篩にかけて選別するというものである。

こうして得られた高分子ポリガラクタンと窒素化合物の
錯体は、窒素含有化合物を含んだ、微生物用のゲル化培
養基の再構成に、効果的に用いることができる。

本発明では、出発成分として使用しているのは線状高分
子構造のポリガラクタンである。この表現で、意味され
ているのは、乾燥状態又はゲル状態において、立体的な
空間配列を有する天然アガローズの高分子と異なり、そ
の糖成分の配列が、完全とはいわないまでも、はぼ直線
状であるような高分子のことである。実際、少なくとも
ゲル状態においては、アガローズ（ポリガラクタン）分
子は、対をなして存在していること、より正確には、二
重らせんの形で存在していることが知られている。この
ような形状は、この発明の方法を実施するのに適してい
ない。

直線構造の高分子ポリガラクタンは、例えば天然アガロ
ーズを、通常の方法で凝集化し、安定化して得ることが
できる。−最に、加熱されて溶解状態に保たれたアガロ
ーズの水溶液に、極性有機溶剤を加えると、アガローズ
は綿くずのように凝集する。をｍ溶剤としては、たとえ
ばメタノール、エタノール、プロパツール、イソプロパ
ツール、アセトン、あるいはこれら溶剤の混合物が、使
用に適している。綿くず状に凝集したアガローズは、一
旦集めて濾過したのち、上記有機溶剤のうちのいずれか
を少量（２〜ＩＯ重量％）加えて安定化さす、綿くず状
に凝集し、エチルアルコールによって安定化した天然ア
ガローズは、この発明の方法を実施するのに最適である
。

−ａ的に言って、天然アガローズのようなポリガラクタ
ンを、凝集化し、かつ安定化さすための公知方法は、直
線構造の高分子を生成するものであるかぎり、すべて用
いることができる。

この発明では、高分子が所要の構造をもっているならば
、合成ポリガラクタン又は半合成ポリガラクタンを使用
してもよい。この点がら言って、例えばフランス特許比
１１１８３０３３６８で定義されている、合成酸化物ポ
リガラクタンも使用することができる。

本発明によれば、窒素化合物としては無機又は有機の窒
素化合物が使用される。無機窒素化合物としては、アル
カリ金属硝酸塩又はアルカリ金属亜硝酸塩−例えば硝酸
ナトリウム又は硝酸カリウム−１あるいはアンモニウム
塩−例えば硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸ニアンモニウム、硫酸ニアンモニウムーを必要に応じ
て使いわけることができる。有機窒素化合物としては、
クエン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、あるいは
酢酸アンモニウムのような、有機酸アンモニウム塩、又
は、例えば、第１アミン、第２アミン、第３アミンが使
用に適している。錯体の用途に応じて、アミノ酸、アミ
ノ酸同志の混合物、アミノ酸塩同志の混合物−例えばり
シン塩酸塩とかフェニルアラニン塩酸塩−１またはペプ
チド、ペプチド同志の混合物、ポリペプチド、あるいは
ポリペプチド同志の混合物を使用することもできる。ペ
プチド、又はペプチド同志の混合物としては、起源が多
様な蛋白質の酸水解物又は酵素水別物−例えば牛乳カゼ
インとか、ホエーとか、大豆蛋白とかの水Ｍ狗−を精製
し、標準化した混合物を特に挙げることができる。

選択した各成分を、あらかじめ決定した割合ではかり、
通常の方法で、溶剤を加えずに撹拌する。

そして、いずれのケースでも、窒素化合物−例えばアミ
ノ酸の塩酸塩−に因る酸の量に応じて、この酸を中和す
るのに必要な量のアルカリを、その作成中の混合物に混
入する。それには、比較的揮発性に富む液体塩基のアン
モニア水を用いるのが望ましい。なぜなら、過剰に加え
た時も、過剰分を蒸発によって容易に除去できるからで
ある。

上述のアルカリは別にして、使用成分のポリガラクタン
と窒素化合物は、□窒素化合物については、これは発明
の理想的な実施に不可欠な条件ではないのだが□乾燥し
た粉状であるのが望ましい。

各成分を充分混合したあと得られた均質の生成物を、錯
体の形成と、必要ならば中和とが可能なかぎり完全に行
われるよう、ケースに応じてそれぞれ１２時間、２４時
間、あるいは４８時間の間、放置する。撹拌する場合と
同様、この放置も、原則的に室温で行なう。そして、得
られた生成物は、過剰の揮発成分を除くため゛に、出来
れば減圧下で乾燥させたあと、最後に通常の方法で粉砕
する。

このようにして得られた乾燥粉砕物質を、次に篩にかけ
て選別する。この操作により粉末度分布に関して、完全
に均質な粉状錯体を得ることができる；したがって培養
基作成のために、その錯体を同等の粉末度分布をもつ他
の成分と、容易に混合することができる。無機塩、有機
塩、アミノ酸、あるいはペプチドの粉末度分布は、あら
かじめ決められているから、最終段階の篩分けは、特に
、錯体化されなかった過剰な窒素化合物がある場合、そ
れを取り除くことを可能にするという利点をもっている
。

この発明の方法によって、錯体□窒素成分の組成を正確
に規定することができ、完全に均質な中性の粉状錯体□
の調製が可能になる。このような錯体は、通常の保存条
件下で特に安定であることが証明されている。また、そ
れらはいつでも、例えば使用直前に、小バンチに分ける
ことができる。場合によっては、染料、指示薬、電解質
、あるいはその他のような物質を加え、次に所定量の温
水（１１０℃あるいはそれ以上）に溶解し、適当な支持
体上にその溶液を拡げて、冷却すると、ゲル状培養基□
窒素含有栄養物の含量が正確に決められるゲル状培養基
□が得られる。

〔実施例〕

以下に、この発明による微生物用培養基を再構成するた
めの、錯体のい（つかの実施例を述べる（量は、水１０
００ｍ　１２当りのものである）。

−塩化アンモニウム　　　　　　　　１．９１　ｇポリ
ガラクタン　　　　　　　　１２．００　ｇ（同化可能
な窒素　　　　　　　　　０．５ｇ／ｌ）−硝酸アンモ
ニウム　　　　　　　　２．８６　ｇポリガラクタン　
　　　　　　　１２．００　ｇ（同化可能な窒素　　　
　　　　　　１．０ｇ／ｌ２）−リン酸ニアンモニウム
　　　　　　９．４３ｇ３ｇポリガラクタン　　　　　
　１２．００　ｇ（同化可能な窒素　　　　　　　　　
２．０ｇ＃り一カゼインから得られたペプチド　　５．
０ｇポリガラクタン　　　　　　　　１２．００　ｇ−
ホエーから得られたペプチド　　１０．０Ｏｇポリガラ
クタン　　　　　　　　１２．００ｇ−カゼインとホエ
ーから得られたペプチド１０．００　ｇ ポリガラクタン　　　　　　　　１２．００ｇ−大豆蛋
白から得られたペプチド　　５．００　ｇポリガラクタ
ン　　　　　　　　１２．００　ｇこのような錯体は、
標準化された栄養培養基の再構成に最適である。

以下に、より詳細な実施例を述べるが、この発明はそれ
らに限定されるものではない。

〔実施例１〕 アガローズとカゼインペプチドの許　の！　７ａ、アガ
ローズのフロキュレーション（綿くず状の凝集化） 細菌学上の寒天７０ｇを５ｊ＋の反応器に入れ、水１０
００ｍ　ｊ！　ヲ加える。この混合物をオートクレーブ
中で、１１０℃で約１５分間、溶液が透明になるまで加
熱する。５０〜６０℃まで冷却した後、溶液を、純エチ
ルアルコール５１を含んだ容器に注ぐとフロキュレーシ
ョン生成物が得られ、それらは形成されるにつれて容器
の底に堆積する。

この凝集塊を濾過して集め、練りロール機で粉砕し、最
後に脱水を行う。次に、得られた生成物を、ウォーター
トラップの存在下、アルコール雰囲気中で、乾燥’Ｃ９
０％以上の残留物が得られるまで乾燥する。こうして得
られた白色粉状主成分を、粉末１００　ｇにつき純アル
コール５ｇの割合で、エチルアルコールを加えて安定化
させ、耐漏洩容器に保存する。

ｂ、ｔｉ体の調製 綿状に凝集し、安定化したアガローズＬｏｇ（乾燥残留
物９ｇ；上記ａ項参照）を、２５ＶＯＬアンモニア水０
．９１１１、及び分子！３００〜１０００のペプチドを
含有するカゼインの酸水解物１５ｇと混合する。

この混合物を、均質のペースト状物質が生じるまでこね
まわす。そして、得られた生成物を、真空中で乾燥する
前に、２４時間放置しておく。

最後に、得られた生成物を粉砕し、篩にかけて選別する
。このようにして、中性ｐＨのクリーム状白色粉末が、
集められる。この生成物は、例えば水に溶解したのち得
られるゲルの固さ、及び／又は総窒素の定量分析によづ
て、チェックすることができる。

このようにして調製された錯体は、アガローズとペプチ
ドの比（乾燥時の重量）によって特徴づけられる。上記
の例の場合９７１５である。

この錯体は尿中細菌の培養に適したＢＣＰ型培養基（ブ
ロモクレゾールパープル培養基）の調製に次のようにし
て用いることができる：−アガローズとカゼインペプチ
ドの 比が９７１５の錯体　　　　　　　　　　　　２２ｇラ
クトーズ　　　　　　　　　　　　　　１０ｇブロモク
レゾールパープル　　　　　０．０２５ｇ上記成分を混
合した後、必要量を秤量し、水に加え（例えば水１００
０ｍ　Ａ当り３２．０２５　ｇ　）、１１０℃のオート
クレーブ中で、２０分間加熱し、最後にペトリ皿にふり
分ける。

〔実施例２〕 アガローズとりシンとのＷ　　の８′ 実施例１　　（ａ項）の方法で、綿くず状に凝集化し、
かつ安定化したアガローズ１０ｇと、リシン塩酸塩１ｇ
を、塩酸塩の塩酸を中和するのに必要な分量があるアン
モニア水の存在下で、均質でペースト状の塊ができるま
で撹拌する。

この得られた生成物を、室温で２４時間保存し、真空で
乾燥した後、粉砕し、そして所要の特性が得られるまで
篩にかけ選別する。

分析の結果、このようにして得られた錯体においては、
分量が決められていた窒素の内９９％がリジン状で存在
し、錯体化したりシンの内９９％が単分子状（分子１１
４６）で存在することが判明している。

〔実施例３〕 アガローズとカゼインペプチドの比が６／１０である、
最初の錯体は、実施°例１の方法により、綿くず状に凝
集したアガローズとカゼインの酸水解物とから調製する
。

アガローズと大豆ペプチドの比が６７３である、２番目
の錯体は、実施例１の方法により、綿くず状に凝集した
アガローズと大豆蛋白の酸水解物から調製する。

真空で乾燥させ、粉砕した後、得られた錯体のそれぞれ
を、篩で選別し、細菌学で使用する塩化ナトリウムと同
じ粉末度分布を持つ粉状生成物を得る。

所望の培養基は、最終的に次のようにして調製される： 一アガローズとカゼインペプチドの 比が６７１０の錯体　　　　　　　　　　　　　１６ｇ
アガローズと大豆ペプチドの 比が６／３の錯体　　　　　　　　　　　　　９ｇ塩化
ナトリウム　　　　　　　　　　　　　５ｇ計３０ｇ この３０ｇの混合物を水１０００ｍ　ｌに加え、完全に
溶けるまでオートクレーブ中で、約１１０℃で加熱し、
最後にペトリ皿にふり分ける。

〔効果〕

この粉末状混合物は、均質な粉末度分布を有するので、
少量ずつに分けても、その組成、中でも窒素ペプチドの
含有量が変化しない。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）窒素含有栄養物を含んだ、微生物用培養基の再構
   成に使われる、高分子ポリガラクタンと窒素化合物との
   中性無水錯体の調整方法において、直線構造をなす高分
   子ガラクタンと、窒素化合物を、あらかじめ決定した比
   率で、室温において、均質の生成物が得られるまで混ぜ
   あわせ、そのようにして得られた混合物を放置して、乾
   燥させたのち、粉砕し、必要であれば、篩によって選別
   することを特徴とする高分子ポリガラクタンと窒素化合
   物との中性無水錯体の調整方法。
2. （２）高分子ポリガラクタンが、凝集しかつ安定化した
   アガローズであることを特徴とする、特許請求の範囲第
   １項に記載の高分子ポリガラクタンと窒素化合物との中
   性無水錯体の調整方法。
3. （３）高分子ポリガラクタンが、合成酸化物ポリガラク
   タンのような、合成ポリガラクタンあるいは半合成ポリ
   ガラクタンであることを特徴とする、特許請求の範囲第
   １項に記載の高分子ポリガラクタンと窒素化合物との中
   性無水錯体の調整方法。
4. （４）窒素化合物が、アルカリ金属の亜硝酸塩、アルカ
   リ金属の硝酸塩、あるいは無機酸のアンモニウム塩、の
   ような無機窒素化合物であることを特徴とする、特許請
   求の範囲第１項に記載の高分子ポリガラクタンと窒素化
   合物との中性無水錯体の調整方法。
5. （５）窒素化合物が、有機酸のアンモニウム塩、第１ア
   ミン、第２アミン、第３アミン、アミノ酸、アミノ酸の
   混合物、アミノ酸塩、アミノ酸塩の混合物、ペプチド、
   ペプチドの混合物、ポリペプチド、あるいはポリペプチ
   ドの混合物、であるような有機窒素化合物であることを
   特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の高分子ポリ
   ガラクタンと窒素化合物との中性無水錯体の調整方法。
6. （６）有機窒素化合物が、カゼインの酸水解物、カゼイ
   ンの酵素水解物、大豆蛋白の酸水解物、あるいは大豆蛋
   白の酵素水解物であることを特徴とする、特許請求の範
   囲第５項に記載の高分子ポリガラクタンと窒素化合物と
   の中性無水錯体の調整方法。
7. （７）必要ならば、窒素化合物に帰因する酸性度を中和
   する、化学量論的分量の塩基性試薬の存在下で、撹拌を
   行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第６
   項のいずれかに記載の高分子ポリガラクタンと窒素化合
   物との中性無水錯体の調整方法。
8. （８）窒素化合物が、乾燥粉末状で存在することを特徴
   とする、特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか
   に記載の高分子ポリガラクタンと窒素化合物との中性無
   水錯体の調整方法。
9. （９）錯体化されない過剰な窒素化合物を、篩わけによ
   る選別の段階で、取り除くことを特徴とする、特許請求
   の範囲第１項ないし第８項のいずれかに記載の高分子ポ
   リガラクタンと窒素化合物との中性無水錯体の調整方法
   。
10. （１０）特許請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか
    に記載の高分子ポリガラクタンと窒素化合物との中性無
    水錯体の調整方法によって得られるような、高分子ポリ
    ガラクタンと窒素化合物との中性無水錯体。
11. （１１）微生物用ゲル状培養基の再構成を目的とする、
    特許請求の範囲第１０項に記載の高分子ポリガラクタン
    と窒素化合物との中性無水錯体の使用。