JPH0470000B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、NAD(P)Ｈまたは反応してNAD(P)Ｈ
を形成または消費する基質または酵素の測定に対
して拡張された測定範囲を有する試験試薬および
方法に関する。 多くの場合、臨床パラメータの測定は、反応過
程でNAD(P)Ｈが直接または間接に形成または消
費される高度に特異的な脱水素酵素反応を用いて
行われる。それによつて反応したNAD(P)Ｈの絶
対量または単位時間あたりの量が流体中の被験物
質濃度の尺度となる。この脱水素酵素反応は化学
量論の点および干渉に対する感受性の点のいずれ
の点でも特に有利であることがわかつている。一
方、その補酵素分子の吸収特性のために、測定の
ための反応の評価がUV測定範囲を有する光度計
を用いてのみ可能であり、純粋な肉視による評価
を行うことができないという不利がある。後者
は、NAD(P)Ｈを形成する実際の反応を呈色反応
と組合わせることによつて可能となるに過ぎな
い。酸化還元当量を各種酸化還元指示薬に直接伝
達するかまたは電子伝達剤例えばフエナジンメト
サルフエートまたはジアフオラーゼなどを用いて
伝達することによりこれを達成する多くの方法が
記載されている。後者の物質には例えばチトクロ
ーム、錯化またはキレート化鉄イオン、ジクロロ
フエノール−インドフエノール、テトラゾリウム
塩などが含まれる。測定反応を反応系列と結合さ
せることも知られており（***特許出願公告第
1598263号明細書、ヨーロツパ特許明細書第54146
号参照）、中間体として形成される物質を経て染
料形成が行われる。一連の反応過程で第１の部分
の反応の各生成物を第２のもの等の出発物とする
ことがすべてのこれらの公知技術に共通してい
る。***特許出願第Ｐ−3211167号明細書には、
被験物質を反応させて区別できるさまざまな生成
物とし、従来の試験に比べ、同じ測定精度でより
広い測定範囲が得られる方法が記載されている。
これは、相互に独立的に同じ被験物質と反応する
いくかの酵素系（一つの系はNAD−依存性脱水
素酵素でありもう一つはNAD−非依存性脱水素
酵素である）を用いることにより達せられる。こ
の方法の唯一の不利な点は、臨床診断薬において
大部分の被験物質に必要とされるNAD−非依存
性脱水素酵素が、対応するNAD−依存性酵素と
は対照的に市販されていないことである。 本発明の目的は従来の試験試薬よりも一段と広
い測定範囲を有し、しかも随時市販されている酵
素を用いて実施できるNAD(P)Ｈ測定試験用溶液
ならびにそれを用いた試験試薬を提供することに
ある。 驚くべきことに、本発明者は、ある種の条件下
でNAD(P)Ｈを各種酸化還元指示薬と独立的に反
応させることができることを見出した。ここで、
「独立的」とは、例えば、（低い方の電気化学電位
を有する）第２の酸化還元指示薬の反応が、（高
い方の電気化学電位を有する）第１の酸化還元指
示薬の反応が大方完了した後にのみ生起し、従つ
て別々の評価が可能であることを意味する。複数
の指示薬が同時に共存する場合には、個々の物質
の間の相互作用および外的影響（酵素、供試物
質）のために干渉が生じるものと予測されること
から、このことはなお一層驚くべきことである。 それ故、本発明は、相互に独立的にNAD(P)Ｈ
に関する電子受容体として働き、異なる電気化学
電位を有する数種の酸化還元指示薬を同時に含有
することを特徴とする、NAD(P)Ｈまたは反応し
てNAD(P)Ｈを形成または消費する基質または酵
素の測定に対して拡張された測定範囲を有する試
験試薬に関する。 本発明はまた、相互に独立的にNAD(P)Ｈに関
する電子受容体として働き、異なる電気化学電位
を有する数種の酸化還元指示薬で試料溶液を同時
に処理し、これらにより分析的に区別でき測定技
術によりまたは肉視により評価される異なる最終
生成物を生成させることを特徴とする、水溶液中
のNAD(P)Ｈまたは反応してNAD(P)Ｈを形成また
は消費する基質または酵素の測定法法に関する。 酸化還元指示薬のタイプに応じて、電子伝達は
直接、あるいはいわゆる電子伝達剤を用いて生起
することができる。試験試薬は酸化還元指示薬に
対し触媒作用を及ぼす電子伝達剤を含むのが好ま
しい。適当な電子伝達剤としては例えばフエナジ
ンメトサルフエート（PMS）、フエナジンエトサ
ルフエート（PES）、メトキシフエナジンメトサ
ルフエート（MPMS）、メルドラ・ブルー
（Meldola′s blue）、ジアホラーゼ等およびこれら
物質の混合物が挙げられる。 原則として、NAD(P)Ｈ／NAD(P)よりも高い電
気化学電位を有し、その酸化型および還元型を肉
視により、光度測定によりあるいは電気化学的方
法を用いることにより明瞭に区別できる物質はす
べて酸化還元指示薬として適切である。本発明の
試験試薬に適した酸化還元指示薬としては、例え
ばオキサジン系およびチアジン系染料、テトラゾ
リウム塩類など（***特許第2834743号明細書、
Proc.Soc.Exp.Biol.104、407（1960）参照）、好ま
しくは、ジクロロフエノール−インドフエノール
（DIP）、３−（４−ヨードフエニル）−２−（４−
ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾ
リウムクロライド（INT）および３−（４，５−
ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフ
エニル−2H−テトラゾリウムプロマイド
（MTT）などが挙げられる。脱水素酵素試験試
薬におけるこれら酸化還元指示薬の使用は、これ
まで一つだけの酸化還元指示薬を有する試薬に限
られてきた。驚くべきことに、本発明者は今般、
異なる標準電位を有する数種の酸化還元指示薬が
共存させると拡張された測定範囲を有する試験試
薬を利用することが可能となることを示すことが
できた。酸化還元指示薬の標準電位は−0.3〜＋
0.5、特に−0.3〜＋0.3にすべきである。一般に、
測定は緩衝された水性溶液中で行われ、そのPHを
4.5〜8.0、好ましくは5.0〜7.0とすることが必要
である。これらのPH値の設定に適した緩衝剤とし
ては、例えば燐酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、
２−Ｎ−（モルホリノ）エタンスホン酸ナトリウ
ム、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノトリス
（ヒドロキシメチル）メタン、ピペラジン−Ｎ，
N′−ビス（２−エタンスルホン酸）二カリウム
塩などが挙げられ、燐酸塩緩衝剤およびクエン酸
塩緩衝剤が好ましい。 本発明の試験試薬に用いる酸化還元指示薬の選
択は、反応の際に生じる測定信号を区別する可能
性に従つて行われ、好ましくは各種波長での吸光
度の変化（光度測定による評価が可能となる）に
従つて、あるいは、区別できる供試溶液の色の変
化（肉視による評価が可能となる）に従つて行わ
れる。後者の場合、各々の一方の型が無色または
わずかに呈色しているに過ぎない酸化還元指示薬
の組合せが特に適している。いくつかの好ましい
酸化還元指示薬例およびそれらのPH７での標準電
位および適当な色の変化を下に掲げる。
を形成または消費する基質または酵素の測定に対
して拡張された測定範囲を有する試験試薬および
方法に関する。 多くの場合、臨床パラメータの測定は、反応過
程でNAD(P)Ｈが直接または間接に形成または消
費される高度に特異的な脱水素酵素反応を用いて
行われる。それによつて反応したNAD(P)Ｈの絶
対量または単位時間あたりの量が流体中の被験物
質濃度の尺度となる。この脱水素酵素反応は化学
量論の点および干渉に対する感受性の点のいずれ
の点でも特に有利であることがわかつている。一
方、その補酵素分子の吸収特性のために、測定の
ための反応の評価がUV測定範囲を有する光度計
を用いてのみ可能であり、純粋な肉視による評価
を行うことができないという不利がある。後者
は、NAD(P)Ｈを形成する実際の反応を呈色反応
と組合わせることによつて可能となるに過ぎな
い。酸化還元当量を各種酸化還元指示薬に直接伝
達するかまたは電子伝達剤例えばフエナジンメト
サルフエートまたはジアフオラーゼなどを用いて
伝達することによりこれを達成する多くの方法が
記載されている。後者の物質には例えばチトクロ
ーム、錯化またはキレート化鉄イオン、ジクロロ
フエノール−インドフエノール、テトラゾリウム
塩などが含まれる。測定反応を反応系列と結合さ
せることも知られており（***特許出願公告第
1598263号明細書、ヨーロツパ特許明細書第54146
号参照）、中間体として形成される物質を経て染
料形成が行われる。一連の反応過程で第１の部分
の反応の各生成物を第２のもの等の出発物とする
ことがすべてのこれらの公知技術に共通してい
る。***特許出願第Ｐ−3211167号明細書には、
被験物質を反応させて区別できるさまざまな生成
物とし、従来の試験に比べ、同じ測定精度でより
広い測定範囲が得られる方法が記載されている。
これは、相互に独立的に同じ被験物質と反応する
いくかの酵素系（一つの系はNAD−依存性脱水
素酵素でありもう一つはNAD−非依存性脱水素
酵素である）を用いることにより達せられる。こ
の方法の唯一の不利な点は、臨床診断薬において
大部分の被験物質に必要とされるNAD−非依存
性脱水素酵素が、対応するNAD−依存性酵素と
は対照的に市販されていないことである。 本発明の目的は従来の試験試薬よりも一段と広
い測定範囲を有し、しかも随時市販されている酵
素を用いて実施できるNAD(P)Ｈ測定試験用溶液
ならびにそれを用いた試験試薬を提供することに
ある。 驚くべきことに、本発明者は、ある種の条件下
でNAD(P)Ｈを各種酸化還元指示薬と独立的に反
応させることができることを見出した。ここで、
「独立的」とは、例えば、（低い方の電気化学電位
を有する）第２の酸化還元指示薬の反応が、（高
い方の電気化学電位を有する）第１の酸化還元指
示薬の反応が大方完了した後にのみ生起し、従つ
て別々の評価が可能であることを意味する。複数
の指示薬が同時に共存する場合には、個々の物質
の間の相互作用および外的影響（酵素、供試物
質）のために干渉が生じるものと予測されること
から、このことはなお一層驚くべきことである。 それ故、本発明は、相互に独立的にNAD(P)Ｈ
に関する電子受容体として働き、異なる電気化学
電位を有する数種の酸化還元指示薬を同時に含有
することを特徴とする、NAD(P)Ｈまたは反応し
てNAD(P)Ｈを形成または消費する基質または酵
素の測定に対して拡張された測定範囲を有する試
験試薬に関する。 本発明はまた、相互に独立的にNAD(P)Ｈに関
する電子受容体として働き、異なる電気化学電位
を有する数種の酸化還元指示薬で試料溶液を同時
に処理し、これらにより分析的に区別でき測定技
術によりまたは肉視により評価される異なる最終
生成物を生成させることを特徴とする、水溶液中
のNAD(P)Ｈまたは反応してNAD(P)Ｈを形成また
は消費する基質または酵素の測定法法に関する。 酸化還元指示薬のタイプに応じて、電子伝達は
直接、あるいはいわゆる電子伝達剤を用いて生起
することができる。試験試薬は酸化還元指示薬に
対し触媒作用を及ぼす電子伝達剤を含むのが好ま
しい。適当な電子伝達剤としては例えばフエナジ
ンメトサルフエート（PMS）、フエナジンエトサ
ルフエート（PES）、メトキシフエナジンメトサ
ルフエート（MPMS）、メルドラ・ブルー
（Meldola′s blue）、ジアホラーゼ等およびこれら
物質の混合物が挙げられる。 原則として、NAD(P)Ｈ／NAD(P)よりも高い電
気化学電位を有し、その酸化型および還元型を肉
視により、光度測定によりあるいは電気化学的方
法を用いることにより明瞭に区別できる物質はす
べて酸化還元指示薬として適切である。本発明の
試験試薬に適した酸化還元指示薬としては、例え
ばオキサジン系およびチアジン系染料、テトラゾ
リウム塩類など（***特許第2834743号明細書、
Proc.Soc.Exp.Biol.104、407（1960）参照）、好ま
しくは、ジクロロフエノール−インドフエノール
（DIP）、３−（４−ヨードフエニル）−２−（４−
ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾ
リウムクロライド（INT）および３−（４，５−
ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフ
エニル−2H−テトラゾリウムプロマイド
（MTT）などが挙げられる。脱水素酵素試験試
薬におけるこれら酸化還元指示薬の使用は、これ
まで一つだけの酸化還元指示薬を有する試薬に限
られてきた。驚くべきことに、本発明者は今般、
異なる標準電位を有する数種の酸化還元指示薬が
共存させると拡張された測定範囲を有する試験試
薬を利用することが可能となることを示すことが
できた。酸化還元指示薬の標準電位は−0.3〜＋
0.5、特に−0.3〜＋0.3にすべきである。一般に、
測定は緩衝された水性溶液中で行われ、そのPHを
4.5〜8.0、好ましくは5.0〜7.0とすることが必要
である。これらのPH値の設定に適した緩衝剤とし
ては、例えば燐酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、
２−Ｎ−（モルホリノ）エタンスホン酸ナトリウ
ム、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノトリス
（ヒドロキシメチル）メタン、ピペラジン−Ｎ，
N′−ビス（２−エタンスルホン酸）二カリウム
塩などが挙げられ、燐酸塩緩衝剤およびクエン酸
塩緩衝剤が好ましい。 本発明の試験試薬に用いる酸化還元指示薬の選
択は、反応の際に生じる測定信号を区別する可能
性に従つて行われ、好ましくは各種波長での吸光
度の変化（光度測定による評価が可能となる）に
従つて、あるいは、区別できる供試溶液の色の変
化（肉視による評価が可能となる）に従つて行わ
れる。後者の場合、各々の一方の型が無色または
わずかに呈色しているに過ぎない酸化還元指示薬
の組合せが特に適している。いくつかの好ましい
酸化還元指示薬例およびそれらのPH７での標準電
位および適当な色の変化を下に掲げる。
【表】
この表から明らかなように、DIP／INTの酸化
還元指示薬組合せは、第一段階で青から無色へ、
そして第二段階で無色から赤へ変色し、特に有利
である。それら二つの物質は各物質の酸化型と還
元型との間に、またそれら物質相互間に、吸収ス
ペクトルおよび肉視による色感上著しい差を示
す。それら二つの物質をNAD(P)Ｈと混合反応さ
せるとDIPおよびINTが独立的に反応するため、
測定範囲はこれら物質の一方のみを含む各試薬に
比べて相当拡張される。高い方の標準電位を有す
る物質（DIP）は第二物質（INT）が反応する前
にほぼ完全に反応する。DIPを唯一の酸化還元指
示薬として用いるNAD(P)Ｈ測定では、測定可能
な濃度範囲は約0.26mmol（ミリモル）／までで
あり、INTを用いた場合はその範囲は約
0.13mmol／までとなり、DIPとINTとの組合
せを用いた場合はその範囲は約0.55mmol／ま
でとなる。すなわち、本発明の試験試薬を用いる
と、測定可能のNAD(P)Ｈ濃度範囲は２倍ないし
４倍以上も増大する。光度測定による評価は、例
えば、２種類の異なる波長（460および650nm）
での吸光度を記録することにより行うことができ
る。肉視による評価の際に、いわゆる背景染料
（例えばチタン・イエロー）を添加することによ
り、得られた色調段階をさらに増大させることが
できる。 INTとチオニンとの酸化還元指示薬組合せで
は、標準電位に適合して、まずINTが、次いで
チオニンが還元される。選択される評価方法に応
じて、広い範囲にわたるさまざまな酸化還元指示
薬組合せを本発明方法に用いることができる。 本発明の試験試薬は基本的に、NAD(P)Ｈすべ
ての測定およびNAD(P)Ｈを消費または形成する
すべての反応に用いることができる。検査すべき
試料は、好ましくは体液、例えば血清、血漿、尿
などである。本発明方法は、酵素的方法に通常用
いられる方法で行われ、一般にまずNAD(P)Ｈを
転換する反応を完了させ、次いで形成ないし消費
されたNAD(P)Ｈを測定する。明白なことである
が、NAD(P)Ｈを形成する反応の場合には、直接
カツプリングさせることも可能である。更に特定
の時点で反応を止め、この時間までに形成ないし
消費されたNAD(P)Ｈを測定することにより酵素
活性を測定することもできる。酸化還元指示薬は
試料溶液に同時に添加するのが好ましいが、異な
る時点で添加することも可能である。 本発明の試験試薬は、それを含浸させた吸収材
料の形としてもNAD(P)Ｈ測定用指示薬として適
している。 実施例 １ NAD(P)Ｈの測定 次の三種類の混合物を調製した。
還元指示薬組合せは、第一段階で青から無色へ、
そして第二段階で無色から赤へ変色し、特に有利
である。それら二つの物質は各物質の酸化型と還
元型との間に、またそれら物質相互間に、吸収ス
ペクトルおよび肉視による色感上著しい差を示
す。それら二つの物質をNAD(P)Ｈと混合反応さ
せるとDIPおよびINTが独立的に反応するため、
測定範囲はこれら物質の一方のみを含む各試薬に
比べて相当拡張される。高い方の標準電位を有す
る物質（DIP）は第二物質（INT）が反応する前
にほぼ完全に反応する。DIPを唯一の酸化還元指
示薬として用いるNAD(P)Ｈ測定では、測定可能
な濃度範囲は約0.26mmol（ミリモル）／までで
あり、INTを用いた場合はその範囲は約
0.13mmol／までとなり、DIPとINTとの組合
せを用いた場合はその範囲は約0.55mmol／ま
でとなる。すなわち、本発明の試験試薬を用いる
と、測定可能のNAD(P)Ｈ濃度範囲は２倍ないし
４倍以上も増大する。光度測定による評価は、例
えば、２種類の異なる波長（460および650nm）
での吸光度を記録することにより行うことができ
る。肉視による評価の際に、いわゆる背景染料
（例えばチタン・イエロー）を添加することによ
り、得られた色調段階をさらに増大させることが
できる。 INTとチオニンとの酸化還元指示薬組合せで
は、標準電位に適合して、まずINTが、次いで
チオニンが還元される。選択される評価方法に応
じて、広い範囲にわたるさまざまな酸化還元指示
薬組合せを本発明方法に用いることができる。 本発明の試験試薬は基本的に、NAD(P)Ｈすべ
ての測定およびNAD(P)Ｈを消費または形成する
すべての反応に用いることができる。検査すべき
試料は、好ましくは体液、例えば血清、血漿、尿
などである。本発明方法は、酵素的方法に通常用
いられる方法で行われ、一般にまずNAD(P)Ｈを
転換する反応を完了させ、次いで形成ないし消費
されたNAD(P)Ｈを測定する。明白なことである
が、NAD(P)Ｈを形成する反応の場合には、直接
カツプリングさせることも可能である。更に特定
の時点で反応を止め、この時間までに形成ないし
消費されたNAD(P)Ｈを測定することにより酵素
活性を測定することもできる。酸化還元指示薬は
試料溶液に同時に添加するのが好ましいが、異な
る時点で添加することも可能である。 本発明の試験試薬は、それを含浸させた吸収材
料の形としてもNAD(P)Ｈ測定用指示薬として適
している。 実施例 １ NAD(P)Ｈの測定 次の三種類の混合物を調製した。
【表】
さまざまな量のNADH（NADPH）をこれら混
合物の各々２mlに添加する。各例について10分後
各供試溶液の460および650nmにおける吸光度お
よび色感を測定した。全供試溶液中に用いられた
NADHまたはNADPHの濃度に応じて次のよう
な色感結果が得られる。
合物の各々２mlに添加する。各例について10分後
各供試溶液の460および650nmにおける吸光度お
よび色感を測定した。全供試溶液中に用いられた
NADHまたはNADPHの濃度に応じて次のよう
な色感結果が得られる。
【表】
各供試溶液における吸光度の変化を第１図に示
す。 混合物ＡおよびＢの場合、最高0.25mmol／
までの範囲のNADH濃度肉視測定が可能である
のに対し、混合物Ｃの場合は0.55mmol／まで
の測定が可能である。 実施例 ２ NADHの測定 0.01mmol／のMPMS 0.2mmol／のINT 0.3mmol／のオニンおよび 0.15mol／のクエン酸緩衝、PH5.2 を含有する溶液２mlにさまざまな量のNADHを
添加する。10分後に各供試溶液の460および
600nmにおける吸光度を測定する。得られた結果
を、全供試溶液に用いられたNADH濃度の関数
として第２図に示す。 ２種類の染料を含有する供試混合物について得
られるNADH測定に対する測定範囲は一種類の
染料のみ含有する相当する供試混合物のそれの約
２倍である。 実施例 ３ NADHの測定 次の混合物を調製する。 混合物 Ａ 混合物 Ｂ 0.01mmol／ 0.01mmol／ メルドラブルー メルドラブルー 0.25mmol／ 0.25mmol／ DIP DIP 0.025mmol／ 0.2mmol／ チタン・イエロ INT ー 0.15mmol／ 0.025mmol／ クエン酸塩緩衝 チタン・イエロ 剤PH5.8 ー 0.15mol／ クエン酸塩緩衝 剤PH5.8 それら混合物の各々２mlにさまざまな量の
NADHを添加する。各例について20分後に各試
溶液の色感を測定する。全供試溶液に用いられた
NADH濃度に応じて次のような色感結果が得ら
れる。
す。 混合物ＡおよびＢの場合、最高0.25mmol／
までの範囲のNADH濃度肉視測定が可能である
のに対し、混合物Ｃの場合は0.55mmol／まで
の測定が可能である。 実施例 ２ NADHの測定 0.01mmol／のMPMS 0.2mmol／のINT 0.3mmol／のオニンおよび 0.15mol／のクエン酸緩衝、PH5.2 を含有する溶液２mlにさまざまな量のNADHを
添加する。10分後に各供試溶液の460および
600nmにおける吸光度を測定する。得られた結果
を、全供試溶液に用いられたNADH濃度の関数
として第２図に示す。 ２種類の染料を含有する供試混合物について得
られるNADH測定に対する測定範囲は一種類の
染料のみ含有する相当する供試混合物のそれの約
２倍である。 実施例 ３ NADHの測定 次の混合物を調製する。 混合物 Ａ 混合物 Ｂ 0.01mmol／ 0.01mmol／ メルドラブルー メルドラブルー 0.25mmol／ 0.25mmol／ DIP DIP 0.025mmol／ 0.2mmol／ チタン・イエロ INT ー 0.15mmol／ 0.025mmol／ クエン酸塩緩衝 チタン・イエロ 剤PH5.8 ー 0.15mol／ クエン酸塩緩衝 剤PH5.8 それら混合物の各々２mlにさまざまな量の
NADHを添加する。各例について20分後に各試
溶液の色感を測定する。全供試溶液に用いられた
NADH濃度に応じて次のような色感結果が得ら
れる。
【表】
混合物Ａを用いた場合には0.25mmol／まで
の範囲のNADH濃度肉視測定が可能であるのに
対し、混合物Ｂを用いた場合には0.5mmol／ま
での測定が可能である。 実施例 ４ 血清中尿素の測定 各々異なつた尿素含量を有する25μの血清試
（尿素の添加により調整し、そして標準的方法で
チエツクする）を、 0.03mol／の燐酸塩緩衝剤、PH7.6 2.2mmol／のADP 4.0mmol／のケトグルタレート 0.5mmol／のNADH 30KU／のグルタメート脱水素酵素、および 30KU／のウレアーゼ を含有する反応溶液1.5mlにそれぞれ添加する。 10分後、 0.35mol／のクエン酸塩緩衝剤、PH5.8 0.05mmol／のPMS 1.34mmol／のDIP 1.1mmol／のINT 0.13mmol／のチタン・イエロー、および 250U／のジアホラーゼ を含有する350μの溶液を各々に添加し、そし
て更に５〜10分後反応溶液の色感を透過照明によ
つて測定する。得られた結果は次のとおりであ
る。 尿素（mg／dl） 得られる供試溶液の色感 ０ 赤 色 30 赤褐色 45 褐 色 55 橙 色 60 黄土色 70 黄緑色 80 緑 色 100 青緑色 120 淡青色 150 暗青色 180 深青色 一種の染料を含む供試混合物を用た場合には70
mg／dlまでの肉視測定を行うことができるが、本
発明による試薬は180mg／dlまでの測定を可能に
する。 実施例 ５ 尿中尿酸の測定 異なる量の尿酸を含有する200μの尿試料
（尿酸の添加により調整し、そして標準的方法よ
りチエツクする）を、 0.03mol／の燐酸塩緩衝剤、PH8.5 42mmol／のKCL 1.43mol／のエタノール 0.5mmol／のNADP+ 1750U／のカタラーゼ 150U／のアルデヒド脱水素酵素、および 50U／のウリカーゼ を含有する1.3mlの反応溶液に添加する。20分後
に、次の成分、 0.5mol／のクエン酸塩緩衝剤、PH5.8 0.05mmol／のPES 1.34mmol／のDIP 1.10mmol／のINT、および 0.13mmol／のチタン・イエロー を含有する350μの溶液を各供試溶液に添加す
る。更に10分後、反応溶液の色感を透過照明によ
り測定する。得られた結果は次のとおりである。 尿素（mg／dl） 得られる供試溶液の色感 ０ 深青色 ９ 暗青色 15 青 色 21 淡青色 29 青緑色 37 緑 色 40 黄緑色 42 黄土色 45 褐 色 50 赤褐色 57 赤 色 64 暗赤色 一種類の染料のみ含有する適当な試験を用いた
場合には約40mg／dlまでの範囲の尿酸を肉視測定
できるが、本発明の試薬を用いれば60mg／dlを超
える尿酸であつてもなお信頼性よく測定すること
ができる。 実施例 ６ 血清中ラクテート脱水素酵素の測定 異なる活性のLDHを含有する血清試料100μ
（LDHの添加により調整し、そして標準的方法で
チエツクする）を、 0.03mol／の燐酸塩緩衝剤、PH7.5 0.6mmol／のピルベートおよび 0.5mmol／のNADH を含有する1.2mlの反応溶液に添加する。25℃で
10分後に、 0.5mol／のクエン酸塩緩衝剤、PH5.8 1.34mmol／のDIP 1.10mmol／のINT 0.05mmol／のPMS 0.13mmol／のチタン・イエロー、および 4mmol／のオキサム酸 を含有する300μの溶液を添加する。10分後、
各々の全供試溶液の色感を測定する。得られた結
果は次のとおりである。 LDH（Ｕ／） 得られる供試溶液の色感 ３ 赤 色 96 赤褐色 160 褐 色 210 橙 色 225 黄土色 225 黄緑色 290 緑 色 370 青緑色 430 淡青色 500 青 色 560 暗青色 640 深青色 一種類の染料のみを含有する適当な試験を用い
た場合には最高225U／の範囲の肉視評価によ
るLDH測定が可能であるのに対し、本発明によ
る試験試薬を用いれば600U／を超えるLDH測
定が可能である。
の範囲のNADH濃度肉視測定が可能であるのに
対し、混合物Ｂを用いた場合には0.5mmol／ま
での測定が可能である。 実施例 ４ 血清中尿素の測定 各々異なつた尿素含量を有する25μの血清試
（尿素の添加により調整し、そして標準的方法で
チエツクする）を、 0.03mol／の燐酸塩緩衝剤、PH7.6 2.2mmol／のADP 4.0mmol／のケトグルタレート 0.5mmol／のNADH 30KU／のグルタメート脱水素酵素、および 30KU／のウレアーゼ を含有する反応溶液1.5mlにそれぞれ添加する。 10分後、 0.35mol／のクエン酸塩緩衝剤、PH5.8 0.05mmol／のPMS 1.34mmol／のDIP 1.1mmol／のINT 0.13mmol／のチタン・イエロー、および 250U／のジアホラーゼ を含有する350μの溶液を各々に添加し、そし
て更に５〜10分後反応溶液の色感を透過照明によ
つて測定する。得られた結果は次のとおりであ
る。 尿素（mg／dl） 得られる供試溶液の色感 ０ 赤 色 30 赤褐色 45 褐 色 55 橙 色 60 黄土色 70 黄緑色 80 緑 色 100 青緑色 120 淡青色 150 暗青色 180 深青色 一種の染料を含む供試混合物を用た場合には70
mg／dlまでの肉視測定を行うことができるが、本
発明による試薬は180mg／dlまでの測定を可能に
する。 実施例 ５ 尿中尿酸の測定 異なる量の尿酸を含有する200μの尿試料
（尿酸の添加により調整し、そして標準的方法よ
りチエツクする）を、 0.03mol／の燐酸塩緩衝剤、PH8.5 42mmol／のKCL 1.43mol／のエタノール 0.5mmol／のNADP+ 1750U／のカタラーゼ 150U／のアルデヒド脱水素酵素、および 50U／のウリカーゼ を含有する1.3mlの反応溶液に添加する。20分後
に、次の成分、 0.5mol／のクエン酸塩緩衝剤、PH5.8 0.05mmol／のPES 1.34mmol／のDIP 1.10mmol／のINT、および 0.13mmol／のチタン・イエロー を含有する350μの溶液を各供試溶液に添加す
る。更に10分後、反応溶液の色感を透過照明によ
り測定する。得られた結果は次のとおりである。 尿素（mg／dl） 得られる供試溶液の色感 ０ 深青色 ９ 暗青色 15 青 色 21 淡青色 29 青緑色 37 緑 色 40 黄緑色 42 黄土色 45 褐 色 50 赤褐色 57 赤 色 64 暗赤色 一種類の染料のみ含有する適当な試験を用いた
場合には約40mg／dlまでの範囲の尿酸を肉視測定
できるが、本発明の試薬を用いれば60mg／dlを超
える尿酸であつてもなお信頼性よく測定すること
ができる。 実施例 ６ 血清中ラクテート脱水素酵素の測定 異なる活性のLDHを含有する血清試料100μ
（LDHの添加により調整し、そして標準的方法で
チエツクする）を、 0.03mol／の燐酸塩緩衝剤、PH7.5 0.6mmol／のピルベートおよび 0.5mmol／のNADH を含有する1.2mlの反応溶液に添加する。25℃で
10分後に、 0.5mol／のクエン酸塩緩衝剤、PH5.8 1.34mmol／のDIP 1.10mmol／のINT 0.05mmol／のPMS 0.13mmol／のチタン・イエロー、および 4mmol／のオキサム酸 を含有する300μの溶液を添加する。10分後、
各々の全供試溶液の色感を測定する。得られた結
果は次のとおりである。 LDH（Ｕ／） 得られる供試溶液の色感 ３ 赤 色 96 赤褐色 160 褐 色 210 橙 色 225 黄土色 225 黄緑色 290 緑 色 370 青緑色 430 淡青色 500 青 色 560 暗青色 640 深青色 一種類の染料のみを含有する適当な試験を用い
た場合には最高225U／の範囲の肉視評価によ
るLDH測定が可能であるのに対し、本発明によ
る試験試薬を用いれば600U／を超えるLDH測
定が可能である。
第１図は三種類のNAD(P)Ｈ含有供試溶液につ
いての吸光度変化を示し、第２図はNADH含有
供試溶液についての吸光度変化を示す。
いての吸光度変化を示し、第２図はNADH含有
供試溶液についての吸光度変化を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 相互に独立的にNAD(P)Ｈに関する電子受容
体として働き、異なる電気化学電位を有し、分析
的に区別できる異なる最終生成物を生成し得る数
種の酸化還元指示薬を同時に含有することを特徴
とする、NAD(P)Ｈまたは反応してNAD(P)Ｈを形
成または消費する基質または酵素の測定に対して
拡張された濃度の測定範囲を有するNAD(P)Ｈ測
定試験用溶液を含有する試験試薬。 ２ 電子受容体として働く物質が−0.3〜＋0.5、
好ましくは−0.3〜＋0.3の標準電位を有する酸化
還元指示薬である、特許請求の範囲第１項記載の
試験試薬。 ３ 電子伝達剤を付加的に含有する特許請求の範
囲第１項または第２項記載の試験試薬。 ４ 酸化還元指示薬としてジクロロフエノール−
インドフエノールとテトラゾリウム塩とを含有す
る特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の
試験試薬。 ５ 電子伝達剤としてフエナジンメトサルフエー
ト、フエナジンエトサルフエート、メトキシフエ
ナジンメトサルフエート、メルドラ・ブルー、ジ
アホラーゼまたはこれら物質の混合物である特許
請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の試験試
薬。 ６ 背景染料を付加的に含有する特許請求の範囲
第１〜５項のいずれかに記載の試験試薬。 ７ 相互に独立的にNAD(P)Ｈに関する電子受容
体として働き、異なる電気化学電位を有し、分析
的に区別できる異なる最終生成物を生成し得る数
種の酸化還元指示薬で試料溶液を同時に処理し、
これにより分析的に区別できそして測定技術によ
りまたは肉視により評価される異なる最終生成物
を生成させることを特徴とする、水溶液中の
NAD(P)Ｈまたは反応してNAD(P)Ｈを形成または
消費する基質または酵素の測定方法。 ８ 測定を4.5〜８、好ましくは5.0〜７のPH範囲
の緩衝された水溶液中で行う特許請求の範囲第７
項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3247894.1 | 1982-12-24 | ||
| DE19823247894 DE3247894A1 (de) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | Testsystem und verfahren zur bestimmung von nad(p)h |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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