KR940010023B1 - 활성화 인간 프로테인 c의 분리 방법 - Google Patents

활성화 인간 프로테인 c의 분리 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법
본 발명은 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법에 관한 것이고, 보다 특별하게는 인간 프로테인 C의 감마-카르복시클루탐산(Gla) 도메인에 결합된 칼슘 이온과 인간 프로테인 C의 복합체에 대한 항체를 사용하여 활성화 인간 프로테인 C를 분리하는 방법에 관한 것이다.
프로테인 C, 비타민 K-의존성 플라즈마 프로테인은 응고 및 섬유소 분해 시스템의 제어 인자로서 살아있는 유기체에 중요한 역활을 한다. 프로테인 C는 세틴 프로테아제의 전구체이다. 생리학적으로, 그것은 관다발형 내피의 표면층에서 트롬보모듈린에 결합된 트롬빈에 의해 활성화되어 항응고 및 섬유소 분해 촉진 활성을 갖는 활성화 프로테인 C가 된다.
본 명세서에 있어서, 프로테인 C는 종종 "PC"로 약칭되고, 활성화 프로테인 C는 "활성화 PC"로 약칭된다.
생체내에서, PC 활동의 중요성은 선천성 PC-결핍 환자의 심각한 재발성 혈전 색전중에서 고찰된다(Broekmans et al., New Eng. J. Med.,309,340-344, 1983 ; Saligsorn et al., New Eng. J. Med., 310, 559-562, 1984). 섬유소 분해 활성에 있어 혈액의 응고 시간 지연 및 증가는 정제된 소(bovine) 활성화 PC가 개에게 투약되는 시험(Comp et al., J. Clin. Inv, 68, 1221-1228, 1981)과 정제된 인간 활성 PC가 고양이에게 투약되는 실험 (Burdick et al., Thrombosis Research 45, 413-419, 1987) 에서 결정되었다. 이들 실험들은 활성 PC를 투약시켜 응고 및 섬유소 분해의 장애를 치료함을 제안한다.
최근 유전자 재조합 기술의 발달로 동물 세포들내의 인간 PC 유전자를 증식시켜 재조합 인간 PC를 생산 할 수 있게 되었으며, 선천성 PC-결핍증, 혈전 색전증, 전염성 혈관내 응고 및 심근 경색의 치료를 위해 생산된 인간 PC 사용 가능성이 고려되고 있는 중이다. (일본국 특개소 제205487/1986호 참조). 치료제로서, PC는 처방되는 조건에 따라 PC 또는 활성화 PC로 투약될 수 있다.
활성화 PC로서의 투약에 대해, 플라즈마 또는 응고 인자 농축물로부터 정제된 야생 PC 또는 트롬빈, 트롬빈-트롬보모듈린 복합체, 뱀의 독 등을 사용한 동물 세포들의 배양 상층액으로부터 정제된 재조합 인간 PC를 활성화시키고, 얻어진 활성화 PC를 분리시켜야만 한다. 예를 들면, 소 트롬빈으로 정제된 인간 PC를 활성화시키고, 세파덱스 C-50컬럼과 QAE 세파덱스 Q 50컬럼(Pharmacia)을 사용한 활성화 PC를 정제하는 것으로 이루어지는 방법(Comp et al., J. clin., Invest. 68 ; 1221-1228, 1981)과 정제된 소 트롬빈을 불용성 담체에 고착된 정제된 토끼 트롬보모듈린에 결합시키고 트롬빈-트롬보모듈린 복합체가 고정된 담체와 정제된 PC용액을 접촉시켜 활성화 PC를 얻는 것으로 이루어지는 방법(일본국 특허 출원 공개 제 205487/1986호 참조)이 보고되어 있다. 이들 방법들은 활성화 PC 분리에 많은 시간이 필요하며, 미량의 트롬빈이 활성화 PC에 포함될 수 있으며, 또는 정제된 인간 트롬빈 또는 정제된 트롬보모듈린이 다량 필요하다는 문제점이 있으며, 정제된 활성화 PC의 다량 제조에 전적으로 만족될 수 없다.
인간 프로테인 C에 대한 단일 클론성 항체가 제안되어 있다. (Blood ＆ Vessel, 1984 ; Vol 15, No.2, 171-174 ; J. Biochem., Vol 97, No. 1, 1985, 127-138 ; 및 일본국 특허 출원 공개 제120,825/1985). 이들 자료들은 인간 프로테인 C에 대해 총 13개의 단일 클론성 항체들을 개시한다. 이들중 여섯은 프로테인 C의 L-사슬에 결합하고 ; 다섯은 프로테인 C의 H-사슬에 결합하고 ; 그리고 둘은 프로테인 C의 L-사슬과 H-사슬 사이 부분을 인지한다. 문헌(J. Biochem., Vol 97, No.1, 1985, 127-138)에서 "제조된 본 항체들중, 일부는 단백질의 금속 이온 의존성 구조로 향해진 구조-특이 항체일 수도 있다."라고 후미에 언급하고 있다. 그러나, 이는 추측일 뿐이다. 이 논문은 또한 "광선 사슬에 대해 특이한 항체들은 감마-카르복시글루탐산-도메인에 결합하지 않았다."라고 언급하고 있다. 이 논문은 이러한 구조-특이 항체를 실제로 얻었다는 사실은 언급하고 있지 않다. 이러한 사실은 이후로도 전혀 보고되고 있지 않다.
또한, 상기 인간 프로테인 C에 대한 13개의 단일 클론성 항체들의 결합부위들은 프로테인 C와 PIVAK-PC 에 공통인 부위들이다. 따라서, 이들 단일 클론성 항체들에 의해, 프로테인 C 및 PIVAK-PC는 식별가능하게 측정 및 결정될 수 없다.
문헌(FEBS Letters, Vol 191, No.1, 1985, 10, 75-81)에는 인간 프로테인 C에 대한 4개의 단일 클론성 항체가 언급되어 있다. 이들중 셋은 칼슘 이온의 존재 또는 부재와는 관계없이 인간 프로테인 C에 결합하고, 나머지 항체 하나는 칼슘 이온 존재하에 인간 프로테인 C에 결합하나, 칼슘 이온이 없으면 인간 프로테인 C에 실질적으로 결합하지 않는다. 이 논문은 또한 상기 세개의 항체들 모두가 인간 프로테인 C의 활성화 펩티드 영역에 에피토프들을 갖는다는 것을 언급하고 있다.
본 출원인에 의해 출원된 계류중인 미합중국 특허 출원 제804,255호(유럽특허 출원 공개 공보 제0205046호)는 인간 프로테인 C와 인간 프로테인 C의 Gla 도메인에 결합한 칼슘 이온의 복합체에 대해 특이한 단일클론성 항체와 단일 클론성 항체를 이용한 인간 프로테인 C를 분리하는 방법을 언급하고 있다.
본 발명의 목적은 활성화 인간 프로테인 C를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 항체가 활성화 인간 프로테인 C에 결합한다는 획기적인 발견에 기초하여 Gla 도메인에 결합된 칼슘 이온과 인간 프로테인 C의 복합체에 대한 항체를 사용하여 활성화 인간 프로테인 C를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 Gla 도메인을 갖는 활성화 프로테인 C를 대단히 용이하게 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 활성화되며, 세린 프로테아제 활성을 가지며, 인간 프로테인 C보다 덜 안정한 활성화 인간 프로테인 C를 불활성화시키지 않고 유리하게 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 예를들면, 효소 및 각종 불순물등에 의해 활성화된 인간 프로테인 C를 함유한 혼합물로부터 고순도의 활성화 인간 프로테인 C를 용이하게 수득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 인간 프로테인 C와 활성화 인간 프로테인 C의 혼합물로부터 인간 프로테인 C와는 독립적으로 활성화 인간 프로테인 C를 수득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적들은 그 잇점과 더불어 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 목적들 및 잇점들은 감마-카르복시글루탐산(Gla) 도메인을 갖는 활성화 인간 프로테인 C를 함유하는 혼합물을 칼슘 이온의 존재하에 불용성 담체와 그에 고정되고, 인간 프로테인 C와 Gla 도메인에 결합된 칼슘 이온의 복합체에 대한 항체를 함유하는 고정된 항체와 접촉시켜, 활성화 인간 프로테인 C가 칼슘 이온이 Gla 도메인에 결합된 형태로 고정된 항체에 의해 포획되는 것으로 이루어짐을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C를 분리하는 방법에 의해 성취된다.
본 발명에 사용된 항체는 인간 프로테인 C와 Gla 도메인에 결합된 칼슘 이온의 복합체에 대한 항체이며, 특히 칼슘 이온이 Gla 도메인에 결합되지 않은 인간 프로테인 C를 인지하지 않으나, Gla 도메인에 결합된 칼슘 이온을 갖는 인간 프로테인 C를 인지하는 항체이다.
이 항체는 상기 특징을 지닌다면, 단일 클론성이든, 폴리 클론성이든 무방하다. 본 발명에 있어서는 물질 제조의 용이함 때문에 단일 클론성 항체가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 이 항체는 불용성 담체에 고정된 채로 사용된다. 불용성 담체는 예를들면, 셀룰로오스, 아가로오스, 교차 결합된 덱스트란, 폴리아크릴아미드, 말레산 중합체, 다공질 유리, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 이러한 불용성 담체에 대해 이 항체를 고정시키는 방법은 그 자체로서 공지되어 있다.
하기 설명은 단일 클론성 항체들을 사용한 경우들에 해당된다.
단일 클론성 항체는 인간 프로테인 C에 대한 항체를 제조할 수 있으며, 배양 생성물로부터 인간 프로테인 C에 대한 항체를 분리 및 회수할 수 있는 하이브리도마(혼성세포)를 배양하여 제조한다.
본 발명의 방법은 칼슘 이온의 존재하에 Gla 도메인을 갖는 활성화 인간 프로테인 C를 함유하는 혼합물을 불용성 담체에 고정된 항체와 접촉시켜 수행된다.
상기 혼합물은 예를들면, 활성화 인간 프로테인 C를 제조할 수 있는 동물 세포들, 가령 재조합 기술에 의해 얻어진 동물 세포들의 배양 유체의 상층액으로부터 얻어진 혼합물(예 : 일본국 특허 출원 공개 공보 제111690/1987호 및 29th Annual Meeting of Americam Society of Hematology, Summary 1400, 1987), 또는 인간 프로테인 C를 활성화 인간 프로테인 C로 전환시키는 처리, 가령 효소 처리등을 하여 수득된 혼합물일 수 있다. 특별히, 그것을 예를 들면, 트롬빈, 트롬빈-트롬보모듈린 복합체 또는 뱀의 독으로 제조합 PC를 제조하는 동물 세포들의 배양 상층액으로부터 수득된 인간 프로테인 C를 활성화시켜 얻은 활성화 인간 프로테인 C를 함유하는 혼합물, 또는 재조합 활성화 PC를 제조하는 동물 세포들의 배양 상층액으로부터 수득된 재조합 활성화 인간 프로테인 C를 함유하는 혼합물일 수 있다.
본 발명에서 언급된 바와 같이, 인간 프로테인 C와 활성화 인간 프로테인 C가 Gla 도메인을 가지기만 한다면, 천연형과 돌연 변이형 모두 포함될 수 있다는 것은 상술된 바로부터 명백하다.
칼슘 이온의 존재하에 고정된 항체가 활성화 인간 프로테인 C를 함유하는 혼합물과 접촉될때, 그 칼슘 이온의 농도는 0.1mM 내지 50mM, 바람직하기로는 1내지 5mM이 적절하다. 필요에 따라, 칼슘 이온 부분은 다른 금속 이온으로 대체될 수도 있다.
상기 접촉은 배치 방식 또는 컬럼 방식에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 활성화 인간 프로테인 C는 칼슘 이온이 Gla 도메인에 결합된 형태로 고정된 항체에 의해 포획된다. 그 다음, 활성화 인간 PC를 포획한 고정된 항체는 통상 칼슘 이온의 존재하에 완전히 세척되어 미흡착된 프로테인 불순물들을 제거한다. 최종적으로, 그것을 칼슘 이온이 거의 없는 수용성 매질, 바람직하게는 칼슘 이온이 거의 없는 완충 수용액 또는 EDTA를 함유하는 용액으로 처리된다.
결과적으로, 활성화 인간 프로테인 C는 Gla 도메인내의 칼슘 이온을 결합시키지 않은 형태의 고정된 항체로부터 분리 및 회수될 수 있다.
본 발명에 따르면, 활성화 인간 프로테인 C와 인간 프로테인 C를 함유한 혼합물로부터 활성화 인간 프로테인 C와 인간 프로테인 C를 쌍방으로부터 독립적으로 분리하는 방법을 또한 제공한다. 특히, 본 발명은
(1) 인간 프로테인 C와 Gla 도메인을 갖는 활성화 인간 프로테인 C를 함유하는 제1혼합물을 불용성 담체와 그에 고정되고, 활성화 인간 프로테인 C가 아닌, 인간 프로테인 C에 대한 제1항체로 이루어진 제1고정 항체와 접촉시켜 인간 프로테인 C가 제1고정 항체에 의해 포획되는 동안 인간 프로테인 C가 거의 없는 제2혼합물을 형성하고,
(2) 칼슘 이온의 존재하에 제2혼합물을 불용성 담체와 그에 고정된, Gla 도메인에 결합된 칼슘 이온과 인간 프로테인 C의 복합체에 대한 제2항체로 이루어진 제2고정 항체와 접촉시켜, 활성화 인간 프로테인 C가 칼슘 이온이 Gla 도메인에 결합되는 형태로 제2고정 항체에 의해 포획되는 것을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C를 분리하는 방법을 제공한다.
제(1)단계에 사용된 항체는 활성화 인간 프로테인 C에 대한 것이 아닌, 인간 프로테인 C에 대한 항체이고, 칼슘 이온이 Gla 도메인에 결합되는지의 여부와는 관계없이 인간 프로테인 C를 인지하나, 활성화 인간 프로테인 C를 인지하지 못한다.
상기 항체는 상기 특성을 가지기만 한다면, 단일 클론성이든 폴리 클론성이든 관계없으나, 단일 클론성 항체가 본 발명에 바람직하다.
단일 클론성 항체는 인간 프로테인 C에 대한 항체를 제조할 수 있고, 활성화 인간 프로테인 C에 대한 항체가 아닌, 인간 프로테인 C에 대한 항체를 배양 생성물로부터 분리 및 회수할 수 있는 하이브리도마를 배양시켜 수득될 수 있다.
이러한 항체는 불용성 담체에 고정되며 제(1)단계에 사용된다. 제(1)단계의 접촉은 칼슘 이온의 존재 또는 부재하와 관계없이 수행된다.
제(1)단계에 따르면, 인간 프로테인 C는 고정항체에 의해 포획되어 인간 프로테인 C가 거의 없는 혼합물을 생성한다.
본 발명의 상기 설명은 제(1)단계의 다른 항목들과 제(2)단계의 모든 항목들에도 응용될 수 있음을 알아야 한다.
본 발명에 사용될 수 있는 단일 클론성 항체들을 제조하는 특정 방법들이 이하 상세히 설명될 것이다.
A. 항원의 분리 및 정제
항원으로서 사용된 인간 프로테인 C는 인간 플라즈마로부터 분리되고 스즈끼 등(J. Biol. Chem., 258, 1914-1920,1983)의 방법에 의해 정제된다.
B. 인간 프로테인 C와 생쥐의 면역화
암컷 Balb/c 생쥐가 사용될 수 있으나, 다른 균주의 생쥐들도 사용될 수 있다. 인간 프로테인 C의 농도와 면역화 계획은 항원성으로 자극된 림프구들을 충분한 양으로 형성하도록 선택되어야만 한다. 예를 들면, 생쥐는 인간 프로테인 C 50㎍으로 2주 간격으로 세번 복강내로 면역화시키고, 최종적으로 인간 프로테인 C 30㎍을 정맥내로 투여한다. 최종면역 수일 후 , 융합을 위해 동물 세포로부터 비장 세포를 추출한다.
C. 세포융합
면역화된 생쥐로부터 비장을 무균적으로 취하고, 비장 세포의 현탁액을 제조하였다. 적당한 융합 촉진제의 존재하에 적당한 세포 계통으로부터 비장 세포들을 생쥐 골수종 세포들과 융합시켰다. 비장 세포 대 골수종 세포의 비는 약 20:1 내지 약 2:1이 바람직하며, 융합 배지는 약 108비장 세포들 당 0.5∼1.5㎖의 양으로 사용되는 것이 적당하다.
세포 융합에 사용되는 생쥐 골수종 세포들은 잘 알려져 있다. 본 발명에서는 P3-X63-Ag 8-U1세포들(P3-U1)[D.E. Yelton et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1(1978)]이 사용된다.
융합 촉진제는 1000∼4000의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜이 바람직하다. 종래기술에 공지된 다른 융합 촉진제들 또한 사용될 수 있다. 본 발명에서는 1540의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 것이 바람직하다.
D. 융합 세포들의 선택
분리 용기(마이크로타이터 플레이트 등)에, 융합되지 않은 비장 세포들, 미융합 생쥐 골수종 세포들 및 융합된 하이브리도마 세포들을 함유하는 혼합물을 융합되지 않은 생쥐 골수종 세포들을 부양하지 않는 선택적 배지로 희석하고, 미융합 세포들을 죽일 수 있는 충분한 시간(약 1주일)동안 배양한다. HAT 배지와 같은, 미융합 생쥐 골수종 세포들을 부양하지 않는 배양 배지가 사용된다. 선택적 배지에서 미융합 골수종 세포는 죽는다. 미융합 비장 세포들은 전이되지 않은 세포들이므로, 그들은 시간이 지나면(1주일) 사멸한다. 한편, 사용된 세포들은 그들이 골수종의 어미 세포들의 종양성과 어미 지라 세포들의 성질 모두 지니므로, 선택적 배지에서 살아남을 수 있다.
E. 인간 프로테인 C의 결정
하이브리도마 세포들이 검출되고 나서, 배양 상층액은 효소 결합 흡착분석(ELISA)에 의해 인간 단백질 C에 대한 항체를 샘플링하고 스크리닝하였다. 이 분석은 임의 농도의 CaCl2를 배양 상층액, 효소로 표지된 항체 용액 및 세척액에 가하고, CaCl2부재하에 수행한다. 그들을 선택함에 의해 CaCl2존재하에서만 양성으로 확인된 하이브리도마들이 선택된다. 이들 하이브리도마는 칼슘 이온의 부재하에 인간 프로테인 C를 인지하지 않으나, 칼슘 이온의 존재하에 인간 프로테인 C를 인지하는 항체를 생성 및 분비한다.
F. 소망의 항체 및 항체의 산물을 생성하는 하이브리도마 세포들의 증식(cloning)
소망의 항체를 생성시킬 수 있는 하이브리도마 세포들은 제한 희석법 등의 적당한 방법으로 증식되고, 소망의 항체는 다음 두가지 다른 방법들에 의해 제조될 수 있다. 제1방법에 따르면, 하이브리도마 세포들은 임의의 시간동안 적당한 배지에서 배양되고, 하이브리도마 세포들에 의해 생성된 단일 클론성 항체는 배양된 상층액으로부터 분리될 수 있다. 제2방법에 따르면, 하이브리도마 세포들은 동질 유전자 또는 반 동질 유전자를 가진 생쥐에게 복강내로 주입된다. 얼마후, 하이브리도마 세포들에 의해 생성된 단일 클론성 항체는 숙주 동물의 혈액 및 복수로부터 분리될 수 있다.
다음의 실시예들은 본 발명을 더욱 구체적으로 예시한다.
[실시예1]
두마리의 암컷 Balb/c 생쥐(생후 4주)를 정제된 인간 PC로 14일 간격으로 4회 면역시킨다. 인산염 완충염수(PBS)에 용해한 50㎍의 인간 PC 및 동 부피의 완전 프로인트 보조액의 혼합물(유체)을 생쥐에 0.5㎖/마리의 양으로 복강내 투여하여 일차 면역을 수행한다. 생쥐에 50㎍의 인간 PC 및 프로인트 불완전 보조액의 혼합물을 복강내 투여하여 이차 및 삼차 면역을 실행한다. 최종 면역은 생쥐의 꼬리 정맥내에 30㎍의 인간 PC의 PBS 용액을 투여하여 수행한다. 최종 면역 3일후, 면역시킨 생쥐의 비장 세포를 세포 융합에 사용한다.
면역시킨 생쥐의 비장 세포 및 동종의 생쥐 골수종 세포(P3-U1)를 약 2:1 내지 15:1의 범위로 혼합시키고, 쾰러 및 밀스타인의 방법에 따라 50% 폴리에틸렌글리콜 1540(Wako Pure chemicals, Co., Ltd의 상품) 의 존재하에 융합시킨다. 융합된 세포를 RPMI-1640배지(10% FCS를 함유함)에 현탁시켜 세포의 농도가 1×106/㎖이 되도록 한다. 현탁액을 웰당 100㎕의 양으로 96웰 마이크로플레이트(Coster)의 웰에 분산시킨다.
용합 세포를 CO2인큐베이터에서 보온시킨다.(5% CO2, 37℃). 하루후, 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배지(HAT배지)를 각 웰에 가하고, 각 웰중의 절반 부피의 배지를 제거하고, 각 웰에 매 2또는 3일 간격으로 HAT 배지를 가한다. 그런 다음, 비장 세포 및 골수종 세포로 이루어진 하이브리도마 세포를 스크리닝한다.
하이브리도마 세포의 배양 상층액중의 항체는 항원으로서 인간 PC로 피복된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 ELISA 방법으로 탐지한다. 2차 항체로서, 알칼린 포스파타제-표지된 토끼 항-생쥐 IgG 항체를 사용하고, 칼슘 이온의 존재시 인간 PC에 대한 항체의 결합과 칼슘 이온의 부재시의 것과의 차이를 측정하기 위하여, 5mM CaCl2를 함유하는 TBS(0.02M 트리스/HCl, 0.14M NaCl, pH 7.4)를 하나의 웰로부터 하나의 상층액에 가하고, CaCl2가 없는 TBS 를 동일한 웰로부터의 다른 상층액에 가한다. 또한, 5mM CaCl2, 0.05% 트윈 20/0.02% NaN3를 함유하는 TBS, 또는 TBS/0.05% 트윈 20/0.02% NaN3를 2차 항체용 희석제 및 세척 완충액으로 사용한다.
융합 세포가 도말된 총 541웰중에서, 콜로니의 형성이 523웰에서 관찰된다. 이들로부터 하기 표1에 나타낸 바와 같이, 44웰은 항체 생산이 양성임이 밝혀졌다. 44웰이 칼슘 이온의 존재하에서 인간 PC에 결합하였고, 32웰이 칼슘 이온의 부재하에서 인간 PC와 결합하는 것을 관측하였다.
이들 양성 웰은 제한 희석법으로 두차례로 클로닝하였다. 생성된 클론화된 세포를 690% FCS-10% DMSO 중에 현탁시키고, 액체 질소중에서 보관한다.
각 클론에서 생성된 단일 클론성 항체는 Balb/c 생쥐의 복강내에서 증식시킨다. 인간 PC를 생쥐의 복수로부터 단리시키고, 단백질 A-세파로우스 4 B칼럼을 사용하여 정제한다.
[표 1]
Figure kpo00001
[실시예 2]
생쥐의 복수로부터 정제한 각 클론의 IgG들을 서브클래스, 인간 PC의 활성의 발현에 대한 효과, L-사슬 또는 H-사슬에의 결합의 활성 및 그의 Gla 도메인을 알파-키모트립산을 사용하는 효소 처리에 의하여 제거시킨 인간 PC에의 결합의 활성에 대해 시험한다.
각 클래스에 특이한 항-생쥐 항혈청을 사용하여 오우크테를로니법(Ouchterlony method)로 서브클래스를 결정한다.
인간 PC의 활성 발현에 대한 효과는 5:1의 몰비로 IgG와 인간 PC를 혼합하고, 혼합물을 4℃로 밤새 보관하고, 트롬빈-트롬보모듈린 복합체로 보관된 인간 PC를 활성화시키고, 합성 기질을 사용하여 아미도 분해 활성을 측정함으로써 인간 PC 활성을 측정하여 결정한다. 합성 기질로서 H-Val-Leu-Arg-NH
Figure kpo00002
No2·2HCl(식중, Val은 광학적으로 활성인 D-발린을, Leu은 광학적으로 활성인 L-류이신은, Arg은 광학적으로 활성인 L-아르기닌을 나타낸다. S-2266으로 표시된 스웨덴의 Kabi Vitrum As의 상품)이 있다.
L-사슬 또는 H-사슬에의 결합 활성은 환원 조건하에서 인간 PC를 전기 영동하여 L-사슬 및 H-사슬을 분리하고, 이어서 니트로셀룰로오스 막 및 HRP-표지된 염소 항-생쥐 IgG 항체를 사용하여 면역 블로팅시켜 결정한다.
Gla 도메인이 제거된 인간 PC는 에스몬 등의 방법(N,L Esmon et al., J. Bio Chem. 258,5548-5553,1983)에 따라 알파-키모트립신을 사용하여 제한 가수분해시켜 제조하며, 면역 블로팅시켜 Gla 도메인에 대한 항체의 결합성을 결정한다.
여섯개의 클론에 의해 제조되는 항체의 특성은 표2에 요약한다. 칼슘 이온 의존성 항체 모두가 L-사슬에 결합하며, 칼슘 이온의 존재하에서조차 Gla 도메인이 제거된 인간 PC에 결합하지 않는다. 이들 항체는 칼슘 이온이 결합한 Gla 도메인에 의존하는 구조적 변화를 거친 인간 PC만을 인식함을 알 수 있다.
[표 2]
Figure kpo00003
[실시예 3]
PC 및 활성화된 PC에 대한 단일 클론성 항체의 결합성 :
고체상 면역 라디오메트릭 정량은 프랭켈 등의 방법(Frankel et al, ; Mol, Immunol., 16, 101-106, 1979)에 따라 수행되며, PC 및 활성화된 PC에의 단일 클론성 항체의 결합반응의 해리 상수는 스크래챠드분석(Scratchard analysis)에 따라 결정된다.
두개의 항-PC 단일클론성 항체로 얻어진 결과를 표3에 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00004
10H11은 활성화된 PC에 결합하지 않는 항체임이 밝혀졌다.
[실시예 4]
불용성 담체에 대한 항체의 고정 :
브로모시아노겐으로 활성화된 세파로오스 4B(Pharmacia Fine Chemicals, Inc. 제)의 건조 겔(0.3g)은 팽윤되고 1mM HCl 100㎖로 세척하고 추가로 커플링 완충제(0.1M NaHCO3, pH 8.3, 0.5M NaCl 함유)로 세척하였다.
커플링 완충제는 흡입에 의해 제거되고 난 직후, 그 겔은 항원 6H2(3㎎/㎖)를 함유하는 커플링 완충제 2㎖에 현탁시켰다. 현탁액을 천천히 밤새 교반하였다. 이어서, 겔을 1M 에탄올아민-HCl(pH 8.0) 2㎖에 옮기고, 현탁액을 실온에서 2시간동안 교반하고, 잔여하는 활성 기들을 차단했다. 항체가 결합된 세파로오스 겔은 0.5M NaCl을 함유하는 0.1M 아세테이트 완충제 (pH 4.0)와 0.5M NaCl을 함유하는 0.1M 붕산염 완충제로 번갈아 유리 필터에서 세척하였다. 여액의 280nm에서의 흡광도가 0.01보다 작아질때, 5mM CaCl2와 벤즈아미딘 1mM을 함유하는 0.05M Tris/HCl(pH 7.4)로 평형시키고, 컬럼에 채웠다. 결과적으로, 항-인간 PC 단일 클론성 항체 6H2가 결합된 세파로오스 4B 컬럼(6H2 컬럼으로 약칭됨) 이 제조되었다. 상기와 같은 방법으로, 항-인간 PC 단일 클론성 항체 10H11이 결합된 컬럼 (10H11 컬럼으로 약칭됨) 이 항체 10H11을 사용하여 제조되었다. 활성화 PC는 이들 6H2 컬럼 및 10H11 컬럼을 사용하여 정제하였다.
[실시예 5]
6H2 컬럼 및 10H11 컬럼을 사용한 활성화 PC의 정제 :
트롬빈(1.5U)과 트롬보모듈린의 혼합물(30㎕)과 1% BSA-첨가 완충 용액(0.05M Tris/HCl, 0.15M NaCl, 2.5mM CaCl2,pH 7.4)300㎕가 정제된 인간 PC(720㎍/㎖)의 30㎕에 가해졌고, 그 혼합물은 37℃에서 90분간 보온시켜 PC를 활성화시켰다.
ATⅢ(20U)의 20㎕를 가하여 반응을 정지시켰다. 활성화 PC를 함유한 이 반응 혼합물(450㎕)은 먼저 10H11 컬럼을 통과시키고, 계속적으로 6H2 컬럼을 통과시켰다. 이들 컬럼들은 완충 용액(0.05M Tris/HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.4)으로 평형되어 있다. 이 컬럼들은 동일한 용액으로 세척하였고, 완충 용액(0.06M Tris/HCl, 0.15M NaCl, 20mM EDTA, pH 7.4)은 6H2 컬럼을 통과하여 흡수된 활성화 PC를 용액으로서 회수하였다.
이 용액을 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동시켰다. 회수된 활성화 PC는 전혀 PC를 함유하지 않았음이 확인되었고, 활성도로부터 측정된 회수율은 62%였다.

Claims (13)

  1. 칼슘 이온의 존재하에 감마-카르복시글루탐산(Gla) 도메인을 갖는 활성화 인간 프로테인 C를 함유하는 불용성 담체 및 그에 고정된 Gla 도메인에 결합된 칼슘 이온과 인간 프로테인 C 복합체에 대한 항체를 함유하는 고정된 항체와 접촉시킴으로써 활성화 인간 프로테인 C가 칼슘 이온이 Gla 도메인에 결합되는 형태로 고정된 항체에 의해 포획됨을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 활성화 인간 프로테인 C의 Gla 도메인에 결합된 칼슘 이온을 갖는 활성화 인간 프로테인 C를 포획하는 고정된 항체를 칼슘 이온이 거의 없는 수용성 매질로 처리시킴으로써, 활성화 인간 프로테인 C가 Gla 도메인에서 칼슘 이온을 결합하지 않은 형태로 고정된 항체로부터 생성되는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 수용성 매질이 EDTA를 함유하는 수용성 매질임을 특징으로 하는 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 혼합물이 활성화 인간 프로테인 C를 생성시킬 수 있는 동물 세포들의 배양 상층액으로부터 유도됨을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 동물 세포들이 유전자 재조합에 의해 수득됨을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 단일 클론성 항체임을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  7. (1) Gla 도메인을 갖는 활성화 인간 프로테인 C 및 인간 프로테인 C를 함유하는 제1혼합물을 불용성 담체 및 그에 고정된 활성화 인간 프로테인 C에 대한 것이 아닌, 인간 프로테인 C에 대한 제1항체를 함유하는 제1고정 항체와 접촉시켜 인간 프로테인 C가 제1고정 항체에 의해 포획되는 동안 인간 프로테인 C가 거의 없는 제2혼합물을 형성시키고,
    (2) 칼슘 이온의 존재하에 제2혼합물을 불용성 담체 및 그에 고정된 Gla 도메인에서 결합된 칼슘 이온과 인간 프로테인 C의 복합체에 대한 제2항체를 함유하는 제2고정 항체와 접촉시킴으로써 활성화 인간 프로테인 C가 칼슘 이온이 Gla 도메인에 결합되는 형태로 제2고정 항체에 의해 포획됨을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 활성화 인간 프로테인 C의 Gla 도메인에 결합된 칼슘 이온을 갖는 활성화 인간 프로테인 C를 포획하는 제2항체를 칼슘 이온이 거의 없는 수용성 매질로 처리시킴으로써, 활성화 인간 프로테인 C가 Gla 도메인에서 칼슘이온을 결합하지 않은 형태로 제2고정 항체로부터 분리되는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 수용성 매질이 EDTA를 함유한 수용성 매질임을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 제1혼합물이 적어도 인간 프로테인 C를 생성할 수 있는 동물 세포들의 배양 상층액을 그중의 인간 프로테인 C부분을 활성화 인간 프로테인 C로 전환 처리시킴으로서 수득됨을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 동물 세포들이 유전자 재조합에 의해 수득됨을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 상기 제1항체가 단일 클론성 항체임을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 제2항체가 단일클론성 항체임을 특징으로 하는 활성화 인간 프로테인 C의 분리 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2645865B1 (fr) * 1989-04-12 1991-07-12 Fondation Nale Transfusion San Procede de preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue
FR2658517B2 (fr) * 1989-04-12 1992-06-19 Fondation Nale Transfusion San Preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue.
AT402262B (de) * 1991-06-20 1997-03-25 Immuno Ag Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c
AT395596B (de) * 1991-06-20 1993-01-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von aktiviertem protein c
AT402263B (de) 1991-06-20 1997-03-25 Immuno Ag Pharmazeutische präparation enthaltend eine thrombolytisch wirkende substanz
DE4320294A1 (de) * 1993-06-18 1994-12-22 Immuno Ag Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen
US6989241B2 (en) 2000-10-02 2006-01-24 Oklahoma Medical Research Foundation Assay for rapid detection of human activated protein C and highly specific monoclonal antibody therefor
TW200407335A (en) * 2002-07-22 2004-05-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Non-neutralizing antibody to inhibit the inactivation of activated protein C

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3485711D1 (de) * 1983-03-04 1992-06-17 Scripps Clinic Res Immunoadsorbens und verfahren zur zurueckgewinnung von vitamin-k-abhaengigen proteinen mittels dieses adsorbens.
GB8327860D0 (en) * 1983-10-18 1983-11-16 Fujisawa Pharmaceutical Co Monoclonal antiprotein c antibody
JPH0619352B2 (ja) * 1985-06-10 1994-03-16 帝人株式会社 ヒト・プロテインｃの測定方法

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