JPS6173067A - Immunoassay using covalent joining body of polymerized enzyme and antibody - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 酵素標識抗体の免疫細胞化学的検出への最初の使用は、
１９６６年にＡｖｒａｍｅａｓおよびσｒｉａｌ（ＣＡ
Ｒ，５ｅａｎｃｅｓムｃａｄ＊　Ｅｌｃｉ、　１３ｓｒ
、、　Ｄ２６２＋　２５４３（１９６６）　）およびＮ
ａｋａｎｅおよびＰｉｅｒｃｅ　（、Ｔ。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The first use of enzyme-labeled antibodies for immunocytochemical detection was
In 1966 Avrameas and σreal (CA
R, 5eances cad* Elci, 13sr
,, D262+ 2543 (1966) ) and N
akane and Pierce (, T.

Ｈｌａｔｏｅｈｅｍ、　Ｏｙｔｏｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ
ｕｍｅ　１４：９２９（１９６６）］によって報告され
た。これら酵素標識抗体の診断医学上の重要性は、Ｉｎ
ｇｖａｌｌおよびＰｅｒｌｍａｎｎ〔工ｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｅｔｒｙ、　Ｖｏｌｕｍｅ　ｓｌ　８７１（１９
７１）参照〕およびｖａｎ　Ｗｅｅｍａｎと５ｃｈｕｕ
ｒｓ（米国特許３．６５４，０９０（１９７２）：）が
抗体−酵素接合体の定食的酵素結合イムノアッセイへ０
（ｊｅ用を記述した１９７１頃までは正しくは理解され
ていなかった。それ以来、抗体およびそれらの断片を各
種酵素に結合するための方法を記載する数多くの刊行物
が存在している。Hlatoehem, Oytochem,, Vol.
ume 14:929 (1966)]. The diagnostic medical importance of these enzyme-labeled antibodies is that
gvall and Perlmann
emietry, Volume sl 871 (19
71)] and van Weeman and 5chuu.
rs (U.S. Pat. No. 3,654,090 (1972):) to a routine enzyme-linked immunoassay of antibody-enzyme conjugates.
(It was not properly understood until about 1971, when it was described for use with J. je.

広範に用いられつつあり、また酵素標識抗体を用いる一
群の異質イムノアッセイはイムノメトリック参アッセイ
（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ）と呼ばれる
。１つのタイプのイムノメトリック・アッセイはいわゆ
るサンドインチ・アッセイである。サンドインチ・アッ
セイでは（１）固相の未標識抗体、（ｌｉ）目的とする
被分析物および（１０可溶性標識抗体から三成分系コン
プレックスが形成される。サンドイッチ・アッセイは目
的とする化合物が多価である。すなわち、２Ｍ１以上の
異なる抗原決定基または単一の多重的に存在する決定基
を有することを必要とする。A group of heterogeneous immunoassays that are becoming widely used and that also use enzyme-labeled antibodies are called immunometric assays. One type of immunometric assay is the so-called sandwich assay. In a sandwich assay, a ternary complex is formed from (1) an unlabeled antibody on a solid phase, (li) an analyte of interest, and (10) a soluble labeled antibody. ie, it requires having 2M1 or more different antigenic determinants or a single multiply present determinant.

サンドイッチ・アッセイは標識抗体の添加方法に応じて
フォワード式、リバース式および同時式アッセイに分け
ることができろ。フォワード式サンドイッチ・アッセイ
では、標識抗体が固相抗体および被分析物の予め形成さ
れた二成分系コンプレックスに添加される。リバース式
サンドイッチ・アッセイでは、固相抗体を添加する前に
標識抗体と被分析物とのコンプレックスを形成させる。Sandwich assays can be divided into forward, reverse, and simultaneous assays depending on the method of adding labeled antibodies. In a forward sandwich assay, labeled antibody is added to a preformed binary complex of solid phase antibody and analyte. In reverse sandwich assays, the labeled antibody and analyte complex is formed before adding the solid phase antibody.

同時式サンドイッチにおいては、被分析物含有検体を標
識抗体と固相抗体の両方と同時に接触させる。フォワー
ド式アッセイは洗浄段階を２回必要とするのに対し、リ
バース式および同時式アッセイは１回の洗浄段階しか必
要としない。In a simultaneous sandwich, the analyte-containing sample is contacted with both the labeled antibody and the solid phase antibody simultaneously. Forward assays require two wash steps, whereas reverse and simultaneous assays require only one wash step.

５ｈｕｕｒｓおよびＶａｎ　ｆｏｅｍａｎにより最初に
記載され〔米国特許第３，６５４，０９０号明細書（１
９７２年）参照〕、そしてＭＯｃｈｉｄａおよびＯｇａ
ｗａ　（米国特許第４，２００，４３６号明細書（１９
８０年）参照〕およびＦｒｅｙｔａｇら［０１ｉｎｉｃ
ａｌ　Ｏｈｅｍ、　８４巻、４１７−（１９８４年）参
照〕により発展された単一抗体イムノメトリック・アッ
セイの場合には、簡易さ、速度、融通性、および聡体的
感度という要素が加わる。更にまた、被分析物は多価で
ある必要はない。このアッセイ方式では（好ましくは一
価の）過剰な標識抗体を被分析物含有検体と混合する。5 hours and Van foeman [U.S. Pat. No. 3,654,090 (1
972)], and MOchida and Oga.
wa (U.S. Pat. No. 4,200,436 (19
1980)] and Freytag et al.
The single-antibody immunometric assay developed by John Al Ohem, Vol. 84, 417-(1984)] adds the elements of simplicity, speed, flexibility, and intelligent sensitivity. Furthermore, the analyte need not be polyvalent. In this assay format, an excess of labeled antibody (preferably monovalent) is mixed with the analyte-containing sample.

短時間インヤユベーションして被分析物を結合させた後
、過剰の未反応標識抗体を、その混合物を固体支持体に
固定された抗原に晒すことにより除去する。次に遊離（
または結合）画分を定量するが、それは被分析物濃度の
直接の尺度である。After a brief incubation to bind the analyte, excess unreacted labeled antibody is removed by exposing the mixture to antigen immobilized on a solid support. Then free (
or bound) fraction, which is a direct measure of analyte concentration.

抗体−酵素接合体の品質および性質がイムノアッセイの
抗原の定量への究極的な有用性に深く影響することが示
されている。Ｉｓｈｉｋａｗａらはモノマー性非凝集ｔ
ａｂ　／酵素接合体は、特サンドインチ型二重抗体イム
ノメトリック・アッセイにおいて最低の非特異的バック
グラウンドおよび最高の感度を与えることを報告してい
る〔工ｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ、　ｅｄ、ｓ、　ＡｖｒａｊＩ１８ａｓＥｌａｅ
ｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌ、　Ｂ、　Ｖ、　
ｐｐ、　２１９〜２３２（１９８３ン参照〕。モノマー
性Ｆａｂ−酵素接合体は単一抗体イムノメトリック・ア
ッセイにおける性能を最大とするために必要でもある〔
工ｓｈｉｋａｗａ　、前掲書および同時係属特許出願（
ｘｐ　−０４５８’）参照〕。しかしながら極めて低レ
ベル（＜１　ｆｍｏｌｅ　）の被分析物を分析するとき
は、これらのアッセイは、測定のために有意量の酵素生
成物を生成させるために長時間のインキュベーションを
必要とスル。It has been shown that the quality and nature of the antibody-enzyme conjugate profoundly influences the ultimate utility of the immunoassay for antigen quantification. Ishikawa et al.
The ab/enzyme conjugate has been reported to give the lowest nonspecific background and the highest sensitivity in sandwich-type double antibody immunometric assays.
ues, ed, s, AvrajI18asElae
vier 5science Publ, B, V,
pp. 219-232 (1983). Monomeric Fab-enzyme conjugates are also necessary to maximize performance in single antibody immunometric assays.
Shikawa, supra and co-pending patent application (
xp-0458')]. However, when analyzing very low levels (<1 fmole) of analytes, these assays require long incubations to generate significant amounts of enzyme product for measurement.

抗体上の単一結合部位に単一＃素分子を結合するための
共有結合法が知られている〔例えば、工ｍａｇａｗａほ
か、Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、　４巻、４０
０（１９８２）参照〕。Covalent methods for attaching a single elementary molecule to a single binding site on an antibody are known [e.g., Eng. Magawa et al., J. Appl. Biocham, vol. 4, 40.
0 (1982)].

凝集抗体−酵素接合体の信号発生が純モノマー性抗体−
酵素接合体のそれよりも高いことはこれまで長い間認め
られているところである。Agglutinated antibodies - Enzyme conjugate signal generation is pure monomeric antibodies -
It has been recognized for a long time that it is higher than that of enzyme conjugates.

凝集抗体−酵素接合体は一般に、非特異的結合化学、例
えばゲルタールアルデヒド架橋（糊ｖａｌｌおよびＰｅ
ｒｌｍａｎｎ、、工ｍｍｕｎｏｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ　８
巻、８７１（１９７１ン参照〕または過沃素酸塩酸化（
Ｂｏｏｒａｍａおよび５ｔｒｅｅｆｋｅｒｋ、　Ｊ、工
ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３０巻、２４５（
１９７９）　　参照〕などを用いて調製されている。こ
れら接合体の調製は、抗体または抗体断片が凝集コンプ
レックス内に深く埋設される可能性があるため抗原結合
目的には大刀近接し得ない状態にとどまる無秩序架橋法
よりなる。更に、これら無定形高分子コンプレックスは
再現性よく調製することが困難である。このような凝集
抗体−酵素接合体を利用するイムノアッセイには非特異
的結合の故に常にパックグラウンド・ブランクが極めて
高いという罐点があり、またイムノメトリック・アッセ
イで達成しうる究極的感度ｈｓ著しく低下してしまう〔
工ｓｈｉｋａｗａほか、Ａｎｎ、　Ｃ１１ｍ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、　１９巻、３７９（１９８２）参照〕。Agglutinated antibody-enzyme conjugates are generally produced using non-specific binding chemistries, such as geltaraldehyde cross-linking (glue vall and Pe
rlmann,, 工mmunoch@m1stry 8
Vol. 871 (see 1971) or periodate oxidation (
Boorama and 5treekerk, J., Eng. mmuno1. Methods, Volume 30, 245 (
1979)]. Preparation of these conjugates consists of a disordered cross-linking process in which the antibody or antibody fragment can become deeply embedded within the aggregation complex and thus remains inaccessible for antigen binding purposes. Furthermore, these amorphous polymer complexes are difficult to prepare with good reproducibility. Immunoassays that utilize such aggregated antibody-enzyme conjugates always suffer from extremely high background blanks due to non-specific binding, and the ultimate sensitivity hs that can be achieved with immunometric assays is significantly reduced. Resulting in〔
Shikawa et al., Ann, C11m, Bio
chem, vol. 19, 379 (1982)].

Ｌｅａｒｙらはモノマー註醇素なジスク７ンイミジルス
ベレートで架橋することによる重合アルカリ性ホスファ
ターゼの形成を報告している。Leary et al. report the formation of polymeric alkaline phosphatase by cross-linking with monomer-rich disuccinimidyl suberate.

次いでその、ｄ　ＩＪママ−酵素はビオチニル−ε−ア
ミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
でビオチニル化された。そのビオチニル化酵素を次に過
剰のアビジンと反応させ總生成接合体を次いでビオチニ
ル化核酸プローブと反応させろと重合酵素がプローブに
対し非共有結合的に結合した。［Ｌｅａｒｙほか、　　
Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。The dIJ momenzyme was then biotinylated with biotinyl-ε-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester. The biotinylating enzyme was then reacted with excess avidin and the resulting conjugate was then reacted with the biotinylated nucleic acid probe, so that the polymerizing enzyme was non-covalently bound to the probe. [Leary et al.
P, N, A, S.

（σ、３．Ａ、）、　８０巻、４０４５（１９８３）参
照　〕。(σ, 3.A,), vol. 80, 4045 (1983)].

非共有結合化学を利用して高い酵素対抗比をもって抗体
−酵素接合体を生成させる多（の方法が報告されている
。例えばＢｕｔｌｅｒは、ペルオキシダーゼ−抗ペルオ
キシダーゼ抗体またはホスファターゼ−抗ホスファター
ゼ抗体という免疫コンプレックスよりなる抗体−酵素接
合体を記載している。（Ｂｕｔｌｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　Ｋｎｚｙｍｏｌ、。Many methods have been reported for producing antibody-enzyme conjugates with high enzyme-to-enzyme ratios using non-covalent chemistry. For example, Butler et al. (Butler, Method
s Knzymol,.

７３巻ユニ８２〜５２３（１９８１）参照）　。Ｈｏ１
ｂｅｃｋおよびＮｅｐｏｍはプロティンＡおよび抗−プ
ロチインへ−西洋わさびペルオキシダーゼ接合体ノコン
プレックスよりなる抗体−酵素接合体を記載している（
　Ｈｏ１ｂｅｃｋおよびＮｏ　ｐｏｍ　、　、Ｔ、工ｆ
ｆＬｍｕｎｏ　ｌ。(See Vol. 73 Uni 82-523 (1981)). Ho1
Beck and Nepom describe an antibody-enzyme conjugate consisting of protein A and an anti-protein to protein-horseradish peroxidase conjugate complex (
Ho1beck and No pom, ,T.
fLmuno l.

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　６０巻、４７（１９８３）参照）。Methods, Vol. 60, 47 (1983)).

Ｇｕｅｓｄｏ　ｎらはワシ血清アルブミンと＃索標識抗
りシ血臂アルブミン抗体との接合体を用いた抗体−鉢累
コンプレックスの調製方法をｄ己載している。Guesdon et al. describe a method for preparing an antibody-column complex using a conjugate of eagle serum albumin and a #labeled anti-eagle albumin antibody.

［Ｇｕａｓｄｏｎら、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、　５８巻。[Guasdon et al., J. Eng. Meth
ods, 58 volumes.

１３３（１９８３）参照〕。最後に、Ｙｏｌｋｅｎらは
アビジンと醇素標識ビオナンとのコンプレックスよりな
る抗体−＃素接合体を記載している。133 (1983)]. Finally, Yolken et al. describe an antibody-#element conjugate consisting of a complex of avidin and fluorinated bionan.

［ＹＯｌｋｏｎほか、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　、　５６巻。[Yolkon et al., J. Eng. mmuno1. Meth
ods, 56 volumes.

３１９（１９８３）参照］。前述の方法にはすべて、抗
体の酵素への結合が共有結合でないため、望ましくない
解離を受けやすい可逆的結合が生じるという欠点がある
。319 (1983)]. All of the aforementioned methods have the disadvantage that the binding of the antibody to the enzyme is not covalent, resulting in reversible binding that is susceptible to unwanted dissociation.

もとの醇索活性およびもとの免役反応性のいずれもが維
持されている、共有結合的に結合されたポリマー性醇素
／抗体接合体を調製するための再現性の高い方法が必要
とされている。There is a need for a highly reproducible method for preparing covalently linked polymeric conjugates/antibody conjugates that retain both the original conjugate activity and the original immunoreactivity. has been done.

この必要性は本発明により満たされる。本発明は一面に
おいて、次の工程、すなわち、（＆）　　少くとも２つ
の酵素分子を共Ｍ結合的に結合させて予め重合した酵素
を生成させ、そして （１））　　予め重合した酵素を抗体またはその断片に
共有結合的に結合させる 工程よりなるポリマー性＃素／抗体接合体の製造方法で
ある。This need is met by the present invention. In one aspect, the present invention comprises the following steps: (&) co-binding at least two enzyme molecules to produce a prepolymerized enzyme; and (1)) combining the prepolymerized enzyme with an antibody or This is a method for producing a polymeric #element/antibody conjugate, which comprises the step of covalently bonding to the fragment.

もう一つの面において、本発明は予め重合された酵素と
抗体または抗体断片との共有結合接合体を用いるイムノ
アッセイに関する。In another aspect, the invention relates to immunoassays using covalent conjugates of prepolymerized enzymes and antibodies or antibody fragments.

もう一つの面において、本発明は抗体と予め重合された
酵素との共有結合接合体である。In another aspect, the invention is a covalent conjugate of an antibody and a prepolymerized enzyme.

一般に本発明の方法は、イムノアッセイに用いられる抗
体に結合されうる実質的にすべての酵素に適用される。Generally, the methods of the invention are applicable to virtually any enzyme that can be conjugated to antibodies used in immunoassays.

適切な酵素は、 ！−Ｄ−ガラクトシダーゼ、 グルコースオキシダーゼ、 西洋わさびペルオキシダーゼ、 アルカリ性ホスファターゼ、 β−ラクタマーゼ、 グルコース−６−ホス７エートデヒドロゲナーゼ、ウレ
アーゼ、 ウリカーゼ、 スーパーオキシドディスムターゼ ルシ７工２−ゼ、 ピルベートキナーゼ、 ラクテートデヒドロゲナーゼ、 ガラクトースオキシダーゼ、 アセチルコリンエステラーゼ、 エンテロキナーゼ チロ７ナーゼ、および キサンチンオキシダーゼ である。The right enzyme! -D-galactosidase, glucose oxidase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-lactamase, glucose-6-phos7ate dehydrogenase, urease, uricase, superoxide dismutase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, galactose oxidase, acetylcholinesterase, enterokinase tyro7nase, and xanthine oxidase.

好ましい酵素はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、およびア
ルカリ性ホスファターゼである。極めて好ましいものは
β−Ｄ−ガラクトシダーゼである。Preferred enzymes are β-D-galactosidase, glucose oxidase, horseradish peroxidase, and alkaline phosphatase. Highly preferred is β-D-galactosidase.

β−Ｄ−ガラクトシダーゼは細菌である大腸菌（Ｋ、　
ｃｏｌｉ）から精製される酵素であり、また商業的に入
手しつる。この酵素はいくつかの望ましい特徴を有して
いる。すなわち、 （＆）　　それは、極めて高い酵素ターンオーＡ　＋　
ａ（ｅｎｚ）ｒｍｉｃ　ｔｕｒｎｏｖｅｒ　ｎｕｍｂｅ
ｒ）を有する：（ｂ）　　それは簡単な比色測定用基質
を有する；（Ｃ）　　それは比較的安定な酵素である：
（ａ）　　それは大抵の生物学的標本からの干渉がない
；そして極めて重要な点として （ｅ）　　それは酵素活性には必要とされない多数（１
２〜２０）の遊離スルフヒドリル基を茨面のあたりに有
している。β-D-galactosidase is produced by the bacterium Escherichia coli (K,
It is an enzyme purified from E. coli and is also commercially available. This enzyme has several desirable characteristics. That is, (&) it has extremely high enzyme turnover A +
a(enz)rmic turnover number
r) has: (b) it has a simple colorimetric substrate; (C) it is a relatively stable enzyme:
(a) it is free of interference from most biological specimens; and, crucially (e) it is free from interference from most biological specimens;
It has 2 to 20) free sulfhydryl groups around the thorn face.

共有結合的に結合された酵素の高分子コンプレックスは
所定の架橋剤を用いてその酵素を所定の官能基を介して
架橋することにより合成することができる。適当な架橋
剤は例えば以下に列挙されるようなホモ２官能性剤、お
よびヘテロ２官能性剤である。A polymeric complex of covalently bound enzymes can be synthesized by crosslinking the enzyme via a given functional group using a given crosslinking agent. Suitable crosslinking agents are, for example, homobifunctional agents and heterobifunctional agents such as those listed below.

重合されるべき酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである
場合には、フォール特異性ホモ２官能性ｊｌｉｌＪ　ｏ
　−；ｙエニレンジマレイミドが好ましい。If the enzyme to be polymerized is β-D-galactosidase, the fall-specific homobifunctional jlilJ o
−;y Enylene dimaleimide is preferred.

ヘテロ２官能性架橋剤 ｍ−マレイミトヘンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル Ｎ−スクシンイミジル５−（２−ピリジルジチオ）プロ
ビオネート スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレートスフクンイミジル−４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベ
ンゾエート マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル ｍ−マレイミドベンゾイルスルフォスフシンイミドエス
テル スルフォスフシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル
）フクロヘキサン−１−カルボギアレート スル７オスクンンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）ブチレート Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシン
イミド、 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエ
ート スルフォスフシンイミジル６−（４’−アジド−２′−
二トロフェニルアミノ）−ヘキサノエート ホモ２官能性架橋剤 ０−７二二レンジマレイミト ３．３’　−’、；チオビス（スルフォスクシンイミジ
ルプロピオネート） ビス（スルフォスフシンイミジル）スベレート ビス（マレイミド）メチルエステル ジメチルスベリミデート・２に−ＩＣＩ。Heterobifunctional crosslinkers m-Maleimithenzoyl N-hydroxysuccinimide ester N-succinimidyl 5-(2-pyridyldithio)probionate Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Sulfur imidyl-4
-(p-Maleimidophenyl)butyrate N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimide ester m-maleimidobenzoyl sulfosufuccinimide ester sulfosufuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) Fuclohexane-1-carbogyalate sulfur 7-oscnnimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide, N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate sulfur Phosfucinimidyl 6-(4'-azido-2'-
(nitrophenylamino)-hexanoate homobifunctional crosslinker 0-7 22 dimaleimito 3.3'-', ;thiobis(sulfosuccinimidylpropionate) bis(sulfosuccinimidyl) Suberate bis(maleimide) methyl ester dimethyl suberimidate 2-ICI.

ジメチルピメリミデート ジメチルアジピミデート ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート　） 重合方法は、所定サイズのポリマーの形成を制御できか
つ再現性よ（行うことができる条件下に実施される。酵
素のａ度、緩衝剤の［）ｄ、架橋剤に対する遊離官能性
基の化学量論、温度および反応時間はすべてこの制御可
能なプロセスを達成する上で重要な要因である。Dimethylpimelimidate Dimethyladipimidate Dithiobis(succinimidylpropionate) The polymerization process is carried out under conditions that permit the formation of polymers of a given size to be controlled and reproducible. The a degree of the enzyme, the [)d of the buffer, the stoichiometry of free functional groups to the crosslinker, temperature and reaction time are all important factors in achieving this controllable process.

例えば、高タンパク濃度では、重合は、ポリマー性酵素
がゲル化し溶液から析出し【くる程に急速に生じる。他
方、５＃素濃度が低過ぎると、重合は極めて僅かしか起
こらない。反応の−ｌは、水性溶液中での架橋剤の安定
性および酵素の相対的−感受性に対し重要な要因である
。一般にこれらの架橋剤は水に極めて難溶性であり、ま
た６、０以上のｐｉ（では水性溶液中で迅速に加水分解
する。従って反応の−は、架橋剤の不安定性および非中
性声に対する＃素の感受性のバランスがとれるよう注意
深（選択されなければならない。反応温度および時間も
重要である。その理由にはこの場合も架橋剤の不安定性
および至適−よりも低い声に晒された場合の酵素の失活
可能性が挙げられろ。最後に、架橋剤と架橋されるべき
酵素上の官能基の化学量論は好ましい重合度を達成する
上で重要である。この至適化学量論は実験的に決定され
なければならず、また各酵素および／または架橋剤ごと
にいくらか異なる可能性ρ・大ぎい。For example, at high protein concentrations, polymerization occurs so rapidly that the polymeric enzyme gels and precipitates out of solution. On the other hand, if the 5# element concentration is too low, very little polymerization occurs. The -l of the reaction is an important factor for the stability of the crosslinker in aqueous solution and the relative -sensitivity of the enzyme. In general, these crosslinkers are extremely poorly soluble in water and rapidly hydrolyze in aqueous solutions with a pi of 6.0 or higher. The reaction temperature and time are also important, again due to the instability of the crosslinker and exposure to lower than optimal temperatures. Finally, the stoichiometry of the crosslinking agent and the functional groups on the enzyme to be crosslinked is important in achieving the desired degree of polymerization. Stoichiometry must be determined experimentally and is likely to vary somewhat for each enzyme and/or crosslinker.

至適な架橋が達成された後、過剰の架橋剤または酵素上
の官能基を消費する適当なりエンチング剤を添加するこ
とにより止めることができる。重合された酵素はゲル濾
過クロマトグラフィにより反応混合物から分離すること
ができ、それによって既知サイズの純粋な重分された均
質高分子植’ｔ　４ることかできる。After optimal cross-linking is achieved, it can be stopped by adding excess cross-linking agent or a suitable quenching agent that consumes the functional groups on the enzyme. The polymerized enzyme can be separated from the reaction mixture by gel filtration chromatography, thereby yielding a pure, polymerized, homogeneous polymeric plant of known size.

次に抗体、好ましくはＦａｂ’−８Ｈ断片を、重合反応
の停止に用いられた架橋剤または第２の部位特異性架橋
剤の導入により提供される過剰の官能基を介してＪ　リ
マー性酵素の「外側」に結合させる。抗体−酵素接合体
の化学量論は、イムノアッセイにおける感度が最高とな
りそしてバックグラウンド活性が最低となるように注意
深（選択することができる。この至適化は、抗体（また
は抗体断片）をポリマー性酵素に様々なモル比で結合さ
せ、次いで生成接合体を所定のイムノアッセイで試験す
ることにより実験的に行われなければならない。一般に
、当該被分析物に対する単因子抗体を用いるのが望まし
い。The antibody, preferably the Fab'-8H fragment, is then transferred to the J remer enzyme via the crosslinker used to terminate the polymerization reaction or the excess functional groups provided by the introduction of a second site-specific crosslinker. Connect to the "outside". The stoichiometry of the antibody-enzyme conjugate can be carefully selected to maximize sensitivity and minimize background activity in the immunoassay. This has to be done experimentally by binding the analyte in various molar ratios and then testing the resulting conjugate in a routine immunoassay.In general, it is desirable to use a single factor antibody directed against the analyte of interest.

アフイニテイ精製による単因子抗体剤の調製方法は当該
技術分野において周知である〔Ｗｅｉｒ。Methods for preparing single factor antibody agents by affinity purification are well known in the art [Weir.

Ｄ、Ｍ、、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ工ｍｍｕｎｏｌｏｇ７゜Ｂ工ａｃｋｖｒｅｌ
ｌ　Ｓｃｉ、　Ｐｕｂｌ、　、　Ｌｏｎｄｏｎ、第３版
、１９７８年〕。抗体はポリクローナルまたはモノクロ
ーナルのいずれの起源のものであってもよい。−価抗体
断片、すなわち、抗原結合部位を１つしかもたないもの
は、当該技術分野においてやはり周知の方法によりアフ
イニテイ精製抗体から調製することができる。D.M., Handbook of Experiment
ental engineering mmunolog7゜B engineering ackvrel
I Sci, Publ., London, 3rd edition, 1978]. Antibodies may be of either polyclonal or monoclonal origin. -valent antibody fragments, ie, those with only one antigen binding site, can be prepared from affinity purified antibodies by methods also well known in the art.

例えば、　　Ｆａｂ−断片は工ｇＧのパ／ぐイン消化に
より得られる；ハｂ′断片は！ｇＧのペプシン消化によ
り得られるＦ（ＩＬＩ）９２のジスルフィド還元により
得られる。半一抗体は工ｇＧの選択的サルファイド分解
により得られる。これらの方法は前掲のＷｅｉｒ、　Ｄ
ＩＩＭＩＩ　ｏ　ｒ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｏｆ　Ｋｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａＩＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊに記載さ
れている。For example, the Fab-fragment is obtained by p/in digestion of engineered G; the Fab-fragment is! Obtained by disulfide reduction of F(ILI)92 obtained by pepsin digestion of gG. Half-antibodies are obtained by selective sulfide cleavage of engineered gG. These methods are described by Weir, D.
IIMII or Handbook of Kxp
erimentaIImmunology J.

ヒンジ領域に遊離スルフヒドリルを有する抗体断片（例
えばＦａｂ’−８Ｈまたは半−工ｇＧ　）を利用するこ
とが望ましい。何故なら、ポリマー性酵素コンプレック
スをこれらチオールを通して、スルフヒドリル特異性架
橋剤〔例えば、０−フエニＶンジマＶイミドまたはスク
シンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート〕を用いて結合させること
ができ、従ってそのグミストリーおよび結合を抗体結合
部位から遠位に離間された状態に維持できるからである
。ポリマー性酵素を抗体分子の炭水化物部分を通して結
合させる場合にもそれと同じことがいえる。前者の方が
好ましいが、適当な部位特異的架橋剤を用いて抗体のア
ミン基またはカルボキシル基を通して結合を達成するこ
とができる。It may be desirable to utilize antibody fragments with free sulfhydryls in the hinge region (eg, Fab'-8H or semi-engineered gG). This is because the polymeric enzyme complexes can be linked through these thiols using sulfhydryl-specific crosslinkers [e.g., 0-phenymide or succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate]. This is because the gummy tissue and the binding can thus be maintained distally spaced from the antibody binding site. The same is true when polymeric enzymes are attached through the carbohydrate moiety of the antibody molecule. Although the former is preferred, attachment can be achieved through the amine or carboxyl groups of the antibody using a suitable site-specific cross-linking agent.

これら、４５１Ｊマー性酵素−抗体接合体を二重抗体ま
たは単一抗体イムノメトリック・アッセイに用いると信
号発生が高まり、従ってアッセイ時間は短縮され、また
全体としての感度は高まる。更にまた、これら抗体−酵
素接合体の調製方法により、酵素および免疫反応性の維
持は最大となりそして非特異的吸着は最小となる。The use of these 451J-mer enzyme-antibody conjugates in double- or single-antibody immunometric assays increases signal generation, thus reducing assay time and increasing overall sensitivity. Furthermore, these methods of preparing antibody-enzyme conjugates maximize maintenance of enzyme and immunoreactivity and minimize nonspecific adsorption.

本発明を次の非制限的実施例により説明する。The invention is illustrated by the following non-limiting examples.

実施例　１ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ０重合およびＦａｂ’−８Ｈ
への結合 （凍結乾燥した）／−Ｄ−ガラクトシダーゼヲ０．０５
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ％０．１５Ｍ　Ｎａ０Ｊ！、０．
０００１ＭＭｇＯｊ！２、α００２Ｍ　Ｎ！１ＤＴＡ（
ｐＨ６，５）に様々な濃度（１〜４〜／−タンパク）で
溶解し、次に５倍モル過剰の０−２二二レンジマレイミ
ド（Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミドに１１Ｍ１／ｄｌ
１１度で溶解ンで処理した。４℃で１６時間反応させた
後、付加的アｌＪ：’−）（２００倍モル過剰）の０−
７二二レンジマレイミドを添加した。２５℃で４５分間
インキュベートした後、その酵素混合物を、同じτｒｉ
ｇ−ＮａＣ１−ＭｇＣ１２緩衝液（ＩＤＴＡ不使用）で
平衡したＥｉｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（１，５
Ｘ４０ｍ）にかけ九下記の表は、重合工程に用いられた
β−Ｄ−ガ２クトシダーゼの儂度がポリマー性酵素接合
体の究極的なサイズおよびその特異的鉢素活性にどのよ
うに影響するかを示している。Example 1 β-D-galactosidase 0 polymerization and Fab′-8H
Binding to (lyophilized)/-D-galactosidase 0.05
M Tris-HCA%0.15M Na0J! ,0.
0001MMgOj! 2. α002M N! 1DTA(
pH 6.5) at various concentrations (1-4 to/- protein) and then a 5-fold molar excess of 0-22 dimaleimide (11 M1/dl in N,N'-dimethylformamide).
Treated with lysin at 11 degrees. After reacting for 16 hours at 4°C, additional AlJ:'-) (200-fold molar excess) of 0-
722 rangemaleimide was added. After incubation for 45 minutes at 25°C, the enzyme mixture was incubated at the same τri
Eiephadex G-25 column (1,5
The table below shows how the strength of the β-D-gactosidase used in the polymerization process affects the ultimate size of the polymeric enzyme conjugate and its specific potency. It shows.

第１表 ｍｏｎｏｍｅｒ　　５４０，０００　　　　　６３９１
．０　　３，４００．０００　　　　５３０２．０　　
１８，０００，０００　　　　５２９五０　　３９−６
６．０００，０００　　　６０３４．０　　７１４−８
７０，０００，０００　　５６２＊Ｓθｐｈａｃｒｙｌ
　Ｓ−１０００カラムでの溶出位置により測定カラムか
らボイド容量ずつ溶出させたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
ポリマーを様々なｔｏ用時還元アフイニテイ精製Ｆ′ａ
ｂ’−８Ｈ断片と合一させ九Ｂ’ａｂＬＳＨ断片は、ウ
アバイン−アガロースカラムでの一工程アフイニテイク
ロマトグラフイにおいてジゴキシン−ウシ血清アルブミ
／に対するウサギ抗血清よりそれ自体免疫精製されたジ
ゴキシン特異的工ｇ（）から調製された。この手順の詳
細は、更に、Ｆｒｅｙｔａｇらによって記載されている
（　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　、　８４巻、４１７（１
９８４）参照〕。ジゴキシン特異的工ｇＧは、ドデシル
硫酸ナトリクムポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定
した場合７９５チの純度であり、また１４０９Ｍ−１の
アフイニテイ定数を有した。その工ｇＧをやはり前述の
方法と同様にして［ＥＰｒｅｙｔａｇほか、前掲書参照
〕、ペプシン消化によりＥｌ’（ａｂ’）２断片に変え
た。Table 1 monomer 540,000 6391
．． 0 3,400.000 5302.0
18,000,000 52950 39-6
6.000,000 6034.0 714-8
70,000,000 562*Sθphacryl
The β-D-galactosidase polymer eluted by void volume from the measurement column depending on the elution position on the S-1000 column was subjected to reduction affinity purification F'a for various purposes.
The nine B'abLSH fragments combined with the b'-8H fragment were themselves immunopurified from rabbit antiserum against digoxin-bovine serum albumin in a one-step affinity chromatography on an ouabain-agarose column. Prepared from Engineering g(). Details of this procedure are further described by Freytag et al. (C11n, Chem, 84, 417 (1
984)]. The digoxin-specific protein was 795% pure as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and had an affinity constant of 1409M. The engineered gG was converted to El'(ab')2 fragments by pepsin digestion, also as previously described [see EPreytag et al., supra].

Ｆａｂ’−８Ｈの各種マレイミド−β−ガラクトシダー
ゼポリマーへの接合を４℃で１６時時間待させた後、そ
れら様々な接合体をＥｌｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−１０
００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ、　Ｕｐｐｓａｌａ。After waiting the conjugation of Fab'-8H to various maleimido-β-galactosidase polymers for 16 hours at 4°C, the various conjugates were incubated with Elephacryl S-10.
00(Pharmacia Fine Chemica
ls, Uppsala.

８ｗｅａｓｎ　）でのカラムクロマトグラフィにかけた
。8weasn) column chromatography.

接合体のピーク溶出位置は抗体−酵素接合体の分子サイ
ズ測定を可能にした。The peak elution position of the conjugate allowed for determination of the molecular size of the antibody-enzyme conjugate.

アクイニテイカラムー介在イムノメトリック会アッセイ 各種ｔａｂ’　−ｇ　ＩＪマー性β−ガラクトシダーゼ
接合体の性能をジゴキシンのアフイニテイカラムー介在
イムノメトリック・アッセイで分析した。このアッセイ
は、まずアリコートの各種Ｆａｂ’−β−ガラクトシダ
ーゼ接合体（１〜１０μＬ）を様々な量のジゴキシン（
０、α５．１．５．３．５および５．０ＩＩｑ／ｄ）を
含有する血清キャリブレータ−（ｉｏｏμ２）と混合す
ることにより行った。室温で１０〜１５分間ブレインキ
ュベーション行った後、その反応混合物を、ウアバイン
−ウシ血清アルプミンアフイニテイカラム（０，５Ｘ１
３ｃｒｎ）を通して１ｒｎｔ／分の流速で溶出した。カ
ラムから溶出したβ−ガラクトシダーゼ活性の量を、０
．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈａｎ　（ＰＨ７，５）、ｃＬｌ
　５Ｍ　Ｎａ０Ａ、　０．００１Ｍ　ＭｇＯ！２に溶解
された２、５ｍＭｏ−ニトロフェニルガラクトピラノシ
ドを用い３７℃で分光測光的に定量した。酵素的に生じ
たＯ−ニトロフェル−トイオンによる吸光度変化を４’
Ｏ５ｎｍで測定した。Aquinity Column-Mediated Immunometric Assay The performance of various tab'-g IJ-meric β-galactosidase conjugates was analyzed in a digoxin affinity column-mediated immunometric assay. The assay involves first injecting aliquots (1-10 μL) of various Fab'-β-galactosidase conjugates into various amounts of digoxin (
0, α5.1.5.3.5 and 5.0 IIq/d). After a 10-15 minute incubation at room temperature, the reaction mixture was transferred to an ouabain-bovine serum albumin affinity column (0.5X1
3crn) at a flow rate of 1rnt/min. The amount of β-galactosidase activity eluted from the column was
．． 05M Tris-Han (PH7,5), cLl
5M Na0A, 0.001M MgO! It was quantified spectrophotometrically using 2,5mM Mo-nitrophenylgalactopyranoside dissolved in 2 at 37°C. The absorbance change due to enzymatically generated O-nitrophelte ions is 4'
Measured at O5nm.

第２表は、抗体−酵素接合体の分子サイズおよびＦ’ａ
ｂ’−断片：β−Ｄ−ガラクトシダーゼモル比が、バッ
クグラウンドおよびアッセイ感度としてみた全体的アッ
セイ性能にどのように影響するかを示している。Table 2 shows the molecular size and F'a of the antibody-enzyme conjugate.
Figure 3 shows how the b'-fragment:β-D-galactosidase molar ratio affects the overall assay performance in terms of background and assay sensitivity.

第２表 ５４０．０００　　１／１　　０．０２０　　　　α０
１０１３．０００，０００　４７／１　　　α０４４　
　　　α０２５１３．０００．０００　２４／１　　　
０．１４５　　　　α０６８２０．０００，０００　３
０／１　　　［１１０１Ｇ、０３５２０．０００，００
０　２０／１　　０．２２３　　　０．０６６３５．０
００，０００　４０／１　　　α０７５　　　　α１０
８７１４．０００．０００　７９３／１　　０．３７８
　　　０．３０８上記データから分かるように、ホリマ
ー性β−ガラクトシダーゼの分子量が大きい程、このア
ッセイで達成しうる最高感度が太き（なる一般的傾向が
ある。また、所定の分子量の任意の、４　＋）マー性β
−ガラクトシダーゼについては１、ｄ　リマー性β−ガ
ラクトシダーゼ１個あたりに結合する抗体部位数が多い
程パツクグラウ・“ンド・ブランク活性および感度が低
（なる。Table 2 540.000 1/1 0.020 α0
1013.000,000 47/1 α044
α02513.000.000 24/1
0.145 α06820.000,000 3
0/1 [1101G, 03520.000,00
0 20/1 0.223 0.06635.0
00,000 40/1 α075 α10
8714.000.000 793/1 0.378
0.308 As can be seen from the above data, there is a general tendency that the higher the molecular weight of the oligomeric β-galactosidase, the greater the maximum sensitivity that can be achieved in this assay. +) Mer property β
- Regarding galactosidase, the greater the number of antibody sites that bind to one d-limer β-galactosidase, the lower the blank activity and sensitivity.

至適化された予め重合した酵素（分子量２Ｃ１，０００
，０００およびＦ′ａｂ’／β−ガラクトシダーゼモル
比２０）を用いて達成しうる感度増加と七ツマー性酵素
接合体を用いた場合とを直接比較したのが第１図である
。七ツマー性接合体を用いると直線状検量曲線が得られ
るものの、予め重合したｔＦａｂ′−β−ガラクトシダ
ーゼ接合体を用いろと感度が２０〜５０倍高くなる。Optimized pre-polymerized enzyme (molecular weight 2C1,000
, 000 and a F'ab'/β-galactosidase molar ratio of 20) and a direct comparison of the sensitivity increase achievable using a heptameric enzyme conjugate. Although a linear calibration curve is obtained using a heptameric conjugate, the sensitivity is 20-50 times higher when using a prepolymerized tFab'-β-galactosidase conjugate.

カラム介在二重抗体イムノメトリック・アッセイＥＩ′
ａｂ′−ポリマー性β−ガラクトシダーゼ接合体（分子
量＝　３５，０００，０００　：　［Ｆａｂ’／β−Ｇ
ａｐ　ｗ４０／１）の性能をサンドイッチ型二重抗体イ
ムノメトリック・アッセイにおいてＦａｂ’モノマー性
−β−ガラクトシダーゼ接合体のそれと比較した。被分
析物であるジゴキシンは、次の方法を用いて７〜１２個
のジゴキシン分子をウシ血清アルブミンに共有結合的に
結合させることによりポリエピトーピック（ｐｏｌｙｅ
ｐｉｔｏｐｉｃ　）　（すなわち多重的に存在する抗原
決定基を有するよう）にした。すなわち、結晶性ジゴキ
シン（１，２５１）を７５−のエタノールに溶解し、次
いで１、８３　Ｆのメタ過沃素酸ナトリウム（Ｎａ工０
４）を含有する水１５０ｒｎｔと合一した。（暗所で）
攪拌しながら室温（２０〜３０℃）で２時間経過させた
後、その混合物を１００−のＤｏｗｅｘ　ｊ　ＸＸ　８
陰イオン交換樹脂（Ｂｉｏ　−Ｒａａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　Ｒｌｃｈｍｏｎｄ。Column-mediated double antibody immunometric assay EI'
ab'-polymeric β-galactosidase conjugate (molecular weight = 35,000,000: [Fab'/β-G
ap w40/1) was compared to that of the Fab' monomeric-β-galactosidase conjugate in a sandwich double antibody immunometric assay. The analyte, digoxin, is made polyepitopic by covalently linking 7 to 12 digoxin molecules to bovine serum albumin using the following method.
pitopic) (ie, having multiple antigenic determinants). That is, crystalline digoxin (1,251) was dissolved in 75% ethanol, and then 1,83F sodium metaperiodate (Na
4) was combined with 150rnt of water containing. (in the dark)
After 2 hours at room temperature (20-30°C) with stirring, the mixture was transferred to a 100-Dowex j XX 8
Anion exchange resin (Bio-Raa Laborat
ories, Rlchmond.

ＣＡ　９４８０４　）床に通すことによって酸化を停止
させた。その溶出液をウシ血清アルブミンの溶液（２，
５１を１００ｍ／のα６Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
ａ５）に溶解）と合一した。２０〜２３℃で１時間経過
後、０．２４１の固体ナトリウムシアノボロハイドライ
ドを混合しながら添加し、その溶液を２０〜２６℃で４
８時間反応させた。未接合ジゴキシンおよび反応副生物
を、流蒸留水に対して２日間そして次に２０谷のｃＬｏ
　１５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）、（Ｌ１
５ＭＮａＯλに対して４℃で透析（ビスキング（Ｖｉｌ
ｉｋｉｎｇ　）膜、６０００〜８０００分子量カットオ
フ）することによりその溶液から除去した。Oxidation was stopped by passing the mixture through a CA 94804) bed. The eluate was mixed with a solution of bovine serum albumin (2,
51 in 100 m/α6M sodium phosphate buffer (pH
a5)). After 1 hour at 20-23°C, 0.241 of solid sodium cyanoborohydride was added with mixing and the solution was heated at 20-26°C for 4 hours.
The reaction was allowed to proceed for 8 hours. Unconjugated digoxin and reaction by-products were incubated against running distilled water for 2 days and then 20 trough cLo.
15M sodium phosphate buffer (pH 7.0), (L1
Dialysis (Visking (Vil) at 4°C against 5M NaOλ
iking) membrane, 6000-8000 molecular weight cutoff) from the solution.

固定された抗ジゴキシン支持体を合成した。An immobilized anti-digoxin support was synthesized.

２０ｄ（Ｄｏ、ＩＭ硼硼酸ナトタウ（１）Ｎａ５）に溶
解した２６ｗｌ１のアフイニテイ精製抗ジゴキシン工ｇ
Ｇを５Ｆのカルボジイミダゾールで活性化され調節され
た細孔を有するガラスピーズ〔カルボジイミダゾールで
活性化され、グリセロールで被覆され、調節された細孔
を有するガラスピーズ、細孔径２５０ｋ、　１２０／２
００メツシユ、ＰｉｅｒｃｅＯｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
、　Ｒｏａｋｆｏｒｄ、工Ｌ６１１０５製〕と合一した
。一定したゆるやかな混合を加えながら４℃で１６時間
反応させた後、それらガラスピーズな２０ｒｎｔの０．
１Ｍ硼酸ナトリウム（ｐＨａ５　）で洗浄し、次に１η
／−のヒト血清アルブミンを含む２０Ｗ１ｔの０．１Ｍ
燐酸ナトリウム緩衝液（ｍ　７．０　）で再び合一した
。更に一夜４℃で反応させた後、それらガラスピーズを
α０１５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、　　α１５
Ｍ　Ｎａ０Ａ　（５０（ｌｄ）で十分洗浄した。その樹
脂を使用のために、小さなカラム（５Ｘ８０ｓｍ）に充
填した。Affinity purified anti-digoxin compound of 26wl1 dissolved in 20d (Do, IM boroborate natau(1)Na5)
Glass beads activated with carbodiimidazole and with controlled pores of G to 5F [Glass beads activated with carbodiimidazole, coated with glycerol, with controlled pores, pore size 250k, 120/ 2
00Metsuyu, PierceOchemical Co.
, manufactured by Roakford, Engineering L61105]. After reacting for 16 hours at 4°C with constant gentle mixing, 20rnt of these glass peas were added to 0.
Wash with 1M sodium borate (pH 5), then 1η
0.1M of 20W1t containing /- human serum albumin
It was combined again with sodium phosphate buffer (m 7.0 ). After further reacting overnight at 4°C, the glass beads were treated with α015M sodium phosphate (pH 7.0), α15
Washed thoroughly with M Na0A (50 (ld)). The resin was packed into a small column (5X80sm) for use.

まず２００μＬアリコートの様々な量のジゴキシン−Ｂ
ＳＡを含有する検体を約１Ｑ　Ｑ　ｆｍｏｌの抗体−酵
素接合体（前述の如く調製されたモノマー性またはポリ
マー性Ｆ！ａｂ’−β−ガラクトシダーゼ）と混合する
ことによりアッセイ応答曲線を作成した。周囲温度（２
０〜２３℃）で６０分間インキュベーションした後、そ
の検体混合物を抗ジゴキシンー調整細孔ガラスカラムを
通して１０μλ／θの流速で溶出し１次いで１．５１１
１７！のα１５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，８）
を溶出した。First, 200 μL aliquots of various amounts of digoxin-B
Assay response curves were generated by mixing the sample containing SA with approximately 1 Q Q fmol of antibody-enzyme conjugate (monomeric or polymeric F!ab'-β-galactosidase prepared as described above). Ambient temperature (2
After incubation for 60 minutes at 0-23°C, the sample mixture was eluted through an anti-digoxin-adjusted pore glass column at a flow rate of 10 μλ/θ, then 1.511
17! α15M sodium phosphate buffer (pH 7,8)
was eluted.

カラムを通して未結合画分に溶出したβ−ガラクトシダ
ーゼ活性量を３岬の０−ニトロフェニルガラクトピラノ
シドを含有する２、３ｄＣＤ水を添加することにより定
量した。黄色（ｏ−ニトロフェル−トイオン）の生成を
４０５　ｎｍで分光測光的に測定した。そのデータを第
６図に示す。The amount of β-galactosidase activity eluted in the unbound fraction through the column was quantified by adding 2,3 dCD water containing 3 caps of 0-nitrophenylgalactopyranoside. The formation of yellow (o-nitrophelto ion) was measured spectrophotometrically at 405 nm. The data are shown in FIG.

それら２種類の接合体の性能は免疫化学的感受性の点で
は同様であったが、ポリマー性酵素接合体の与える信号
生成は一段と大きかった。すなわち、ポリマー性酵素接
合体を用いた場合には結果を測定するための時間が相当
に短縮された。例えば０〜１．２Ｘ１０　　　モルのジ
ゴキシン−ＢＳＡでは、ポリマー性酵素接合体を用いた
場合の４０５ｎｍでの１分あたりの吸光度変化は０−０
１５であったのに対し、モノマー性酵素接合体を用いた
場合の吸光度変化は０．００２にすぎなかった。Although the performance of the two conjugates was similar in terms of immunochemical sensitivity, the polymeric enzyme conjugate provided greater signal generation. That is, the time to measure results was significantly reduced when using polymeric enzyme conjugates. For example, for 0-1.2 x 10 moles of digoxin-BSA, the absorbance change per minute at 405 nm using the polymeric enzyme conjugate is 0-0.
15, whereas the absorbance change using the monomeric enzyme conjugate was only 0.002.

第３表 ０　　　　　　（Ｌ１７０　　　　［１Ｌ０１８１．２
Ｘ　１０−２０（１１６４−−−−１，２ＸＩＣ１”８
Ｑ、１５６　　　　α０１６１．２Ｘ１０−１６　　　
０．１４２　　　　　０．０１３１．２Ｘ１０−１４　
　　　（１１２４０，００８１，２Ｘ１０−１２　　　
　［１０５２０，００４実施例　２ β−ガラクトシダーゼの重合および工ｇＧへの結合β−
ガラクトシダーゼの重合 ６■のβ−ガラクト７ダーゼ（酵素イムノアッセイ級、
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐ、
工ｎ６ｉａｎａｐｏｌｉｓ。Table 3 0 (L170 [1L0181.2
X 10-20 (1164----1,2XIC1"8
Q, 156 α0161.2X10-16
0.142 0.0131.2X10-14
(11240,0081,2X10-12
[10520,004 Example 2 Polymerization of β-galactosidase and binding to gG β-
Polymerization of galactosidase 6■ β-galactosidase (enzyme immunoassay grade,
Boehringer-Mannheim Corp.
Engineering n6ianapolis.

ＩＮ）を３−のα０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＦｉＯＸ　（ｐ
Ｈ７，０）、ＣＬ１５ＭＮａ　ｃｌ、、１ｍＭ　ＭｇＣ
ｊ１２．５ｍＭＦＤＴＡに溶解し、次いで１．１μ２の
Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解された１４．７
μｍの０−フェニレンジマレイミドと混合した。４℃で
１６時間後、その混合物を前述したものと同じＴｒｉｓ
−Ｎａｉｊ！−ＭｇＯＪ１２−ＩＩ）ＴＡ緩衝液を用い
て５ｅｐｈａｄａｘ　Ｇ−２５カラム（１，５Ｘ４０ｃ
ｍ）でのクロマトグラフィにかけた。重合したβ−ガラ
クトシダーゼをボイド容量画分からプールした。IN) to 3- α05 M Tris-FiOX (p
H7,0), CL15MNa cl, 1mM MgC
j 14.7 dissolved in 12.5 mM FDTA and then 1.1 μ2 N,N'-dimethylformamide
μm of 0-phenylene dimaleimide. After 16 hours at 4°C, the mixture was treated with the same Tris as described above.
-Naij! -MgOJ12-II) 5ephadax G-25 column (1,5X40c) using TA buffer
m). Polymerized β-galactosidase was pooled from the void volume fraction.

１−（α８９ＨＩ）のβ−ヒト絨毛ゴナドトロピン（β
−ｈＯＧ　）に対するモノクローナルエｇＧ［Ｈｙｂｒ
ｉｔｅｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　１３ａｎ　Ｄ
ｉｅｇｏ、　ｃ／ｋ　］を１２のα０１５Ｍ燐酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，０）、ｃｌ、１　Ｓ　Ｍ　ＮａＣＪ＆、
　１　ｍＭ　ＫＤＴＡに対し４℃で１６時間透析した。1-(α89HI) of β-human chorionic gonadotropin (β
-hOG) against monoclonal gG [Hybr
itech Corporation, 13anD
iego, c/k] in 12 α015M sodium phosphate (pH 7,0), cl, 1 S M NaCJ&;
Dialysis was performed at 4° C. for 16 hours against 1 mM KDTA.

透析後、その抗体を５．９μｋＯＮ、Ｎ’−ジメチルホ
ルムアミドに溶解された５９μｆのスクシンイミジル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレートと２０〜２５℃で１時間反応させた。そ
の混合物を、ａｏ　１５Ｍ燐酸ナトリウム（声７．０　
）　、０．１５ＭＮａ０１゜１ｍＭ　ＫＤＴＡ中で平衡
化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（１，５Ｘ４
０ｃｒｎ）に通すことにより反応を止めた。After dialysis, the antibody was dissolved in 5.9 μk ON, 59 μf succinimidyl-N′-dimethylformamide.
It was reacted with 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate at 20-25°C for 1 hour. The mixture was mixed with ao 15M sodium phosphate (voice 7.0
), 5ephadex G-25 column (1,5X4
The reaction was stopped by passing the solution (0 crn).

力２ムのボイド容量として溶出するマレイミドー工ｇ［
）をプールしそして加圧−過により１．１３ｍまで濃縮
した。The maleimido compound eluted as a void volume of 2 μm
) were pooled and concentrated to 1.13 m by pressure-filtration.

抗体のポリマー性酢素への接合は１．１３ｄ（Ｑ、６１
ｎｉ／ｎｔｔ）の前記マレイミドーエｇＧを５．７３−
の重合したβ−ガラクトシダーゼ（ＣＬ８７〜／−）と
合一し、そして２０時間４℃で混合することにより行っ
た。その混合物を加圧濾過することによりλ０−まで濃
縮し、次いで４℃で、α０５ＭＴｒｉｓ−Ｈａｎ（ｐＨ
７，５）、α１５ＭＮａ０ｊｌ、Ｑ、００１　Ｍ　Ｍｇ
ＯＡ２で平衡化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂカラム（
１，５Ｘ９０ｃＩＭ）でのクロマトグラフィにかけた。Conjugation of antibody to polymeric acetate is 1.13d (Q, 61
5.73-
was carried out by combining with polymerized β-galactosidase (CL87~/-) and mixing for 20 hours at 4°C. The mixture was concentrated to λ0− by pressure filtration and then incubated at 4°C with α05M Tris-Han (pH
7,5), α15MNa0jl, Q, 001 M Mg
5epharose 4B column equilibrated with OA2 (
1,5×90 cIM).

カラムのボイド容量中に溶出した工ｇＧ−β−ガラクト
シダーゼ接合体をプールしそして４℃で貯蔵した。The gG-β-galactosidase conjugates eluted into the void volume of the column were pooled and stored at 4°C.

β−ｈＣＧアフイニテイカラムの調製 １０■のβ−ｈＯＧ　（Ｄｉｏｓｙｎｔｈ、　Ｏｈｉｃ
ａｇｏ、工Ｌ）を５ｔｄＯα１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液
（ｍａｓ　）に溶解し、５Ｆのカルボジイミダゾールで
活性化され、調整された細孔を有するガラスビーズ（Ｏ
ＤニーＯＰＧ　１Ｐｉｅｒｃｅ　Ｏｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ａｍ　、　Ｒｏｃｋｆｏｚｄ。Preparation of β-hCG affinity column 10 μm of β-hOG (Diosynth, Ohic
Ago, Eng.
D knee OPG 1Pierce Chemical C
am, Rockfozd.

工Ｌ）と合一し、そして４℃で１６時間混合しへその樹
脂にα１Ｍ硼酸ナトリウム緩衝液に溶解されたウシ血清
アルブミンの１０Ｈ１／ｍ１ｌｌ液１０ｄを添加し、そ
して４℃で更に１６時間混合を続けた。そのアフイニテ
イ樹脂を次いでα１５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，８）で十分洗浄した。L) and mixed for 16 hours at 4°C, added 10d of a 10H1/ml solution of bovine serum albumin dissolved in α1M sodium borate buffer to the umbilical resin and mixed for a further 16 hours at 4°C. continued. The affinity resin was then washed with α15M sodium phosphate buffer (pH 7).
, 8).

β−ｈＯＧに対するアフイニテイカラム介在イムノメト
リック番アッセイ １００μぶのβ−ｈＯＧキャリブレータ−（０，５，１
０，２５，５０および１００ｍ工Ｕ／−）を５μ２の工
ｇＧ−！−ガ２クトシダーゼ接合体と２０℃で６０分間
混合した。それら検体を次に、再使用可能な！−ｈＯＧ
アフイニテイカラム（３Ｘ１５ｍｍ）を通して５μＬ／
秒の流速で連続的に溶出させ、次いで２５０μλの０．
１５Ｍ燐酸ナトリウム緩＠液（ｐＨ７，８）を溶出させ
た。アリコート（７７μＡ）のカラム流出液を、それを
６２０μ２の２．５ｍＭｏ−二トロフェニルガラクトシ
ドと６７℃で合一させることによりアッセイした。黄色
（４０５ｎｍ　）の生成を動力学的速度方式により分光
測光的に定量した。この用量一応答曲線の結果を第２図
に示す。この図に示された結果はβ−ｈＯＬ）の検出の
ための従来技術の感度および速度を示す。Affinity column-mediated immunometric assay for β-hOG with 100μ of β-hOG calibrators (0, 5, 1
0, 25, 50 and 100m U/-) to 5μ2 Engineering gG-! - Mixed with G2 tosidase conjugate for 60 minutes at 20°C. Those specimens can then be reused! -hOG
5μL/through affinity column (3X15mm)
Continuously elute at a flow rate of 250 μλ and then
A 15M sodium phosphate solution (pH 7, 8) was used for elution. An aliquot (77μA) of the column effluent was assayed by combining it with 620μ2 of 2.5mMo-nitrophenylgalactoside at 67°C. The production of yellow color (405 nm) was quantified spectrophotometrically by a kinetic rate method. The results of this dose-response curve are shown in FIG. The results shown in this figure demonstrate the sensitivity and speed of the prior art for the detection of β-hOL).

実施例　６ グルコースオキシダーゼの重合および工ｇＧまたはｒ（
ａｂつ２への結合 燐酸す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ６，５）に溶解された
グルコースオキシダーゼ（１〜４〃ｌ／−タンパクンを
２５〜２００倍モル過剰のＮ　、　Ｎ’−ジメチルホル
ムアミドに溶解されたＳ−アセチルメルカプトコハク酸
無水物と反応させる。２０〜２６℃で３０〜６０分間ま
たは４℃で一夜反応させた後、アリコートのα０５Ｍヒ
ドロキシルアミン−ａａｉ　（ｐＨ７、０）、１ｍＭ　
ＦＩＤＴＡを３０℃で５分間添加し、次いで、そのスル
フヒドリル−活性化＃素を小さな（１，５８４０ｃｍ）
　５ｅｐｈａｄｅｘ　ｅ−２５カラムで脱塩する。その
スルフヒドリル−活性化酵素をボイド容量画分として集
める。Example 6 Polymerization and engineering of glucose oxidase gG or r(
Glucose oxidase (1-4 l/- protein dissolved in IJum buffer (pH 6,5) dissolved in 25-200 times molar excess of N,N'-dimethylformamide) After reaction at 20-26 °C for 30-60 minutes or overnight at 4 °C, an aliquot of α05M hydroxylamine-aai (pH 7,0), 1 mM
FIDTA was added for 5 minutes at 30°C, then the sulfhydryl-activated # element was added to a small (1,5840 cm)
Desalt with a 5ephadex e-25 column. The sulfhydryl-activated enzyme is collected as a void volume fraction.

燐酸ナトリウム緩衝液ＣｐＨ６，５）に溶解されたグル
コースオキシダーゼ（１〜５ＷＩＩ／ｒ！Ｌ１．タンパ
クンノモウ一つの検体を１０〜１００倍モル過剰のスク
シンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチルンシクロヘキ
サン−１−カルボキシレート（ｓＭｃｃ）と２０〜２３
℃で３０〜９０分間反応させる。次いでその検体を小さ
な（１，５Ｘ　４０　ｃｍ　）　５ｅｐａｄｅｘ　Ｇ−
２５カラムで脱塩する。マレイミド活性化酵素をポイド
容量画分として集める。Glucose oxidase (1-5 WII/r!L1. Carboxylate (sMcc) and 20-23
React for 30-90 minutes at °C. The specimen was then placed in a small (1,5X 40 cm) 5epadex G-
Desalt with 25 columns. The maleimide-activated enzyme is collected as a void volume fraction.

スル７ヒドリルー活性化グルコースオキシダーゼとマレ
イミド活性化グルコースオキシダーゼとを様々なモル比
（例えば１：１，２：１、または１：２）で４〜１６時
間４℃で合一する。その結合反応を次いで２−メルカプ
トエチルアミン（マレイミド含量に対しややモル過剰）
の添加によりクエンチし、そしてポリマー性酵素を５ｅ
ｐｈａａｅｘ　（）−２５カラムで脱塩する。Sul-7hydryl-activated glucose oxidase and maleimide-activated glucose oxidase are combined at various molar ratios (eg, 1:1, 2:1, or 1:2) for 4 to 16 hours at 4°C. The coupling reaction is then carried out with 2-mercaptoethylamine (slight molar excess relative to the maleimide content).
and the polymeric enzyme was quenched by the addition of 5e
Desalt with a phaaex ()-25 column.

燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）に溶解された工ｇ
Ｇまたはｔｒ（ａｂう２断片（１〜５ｖ／ｌｎｔタンパ
ク）を２０〜６０倍モル過剰ｏａＭｃｃと２０〜２５℃
で５０〜９０分間反応させついで５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
−２５カラムで脱塩する。マンイミド−活性化抗体を予
め重合したグルコースオキシダーゼと様々な酵素：抗体
比（例えば１：１．１：２または２二１）で合一し、そ
して４℃で１６〜２０時間反応させる。g dissolved in sodium phosphate buffer (pH 6,5)
G or tr (abU2 fragment (1-5v/lnt protein) was added to a 20- to 60-fold molar excess of oaMcc at 20-25°C.
for 50 to 90 minutes, then 5ephadex G
Desalt with -25 column. Manimide-activated antibodies are combined with prepolymerized glucose oxidase at various enzyme:antibody ratios (eg, 1:1.1:2 or 221) and reacted for 16-20 hours at 4°C.

次いでその接合体をα１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）中で平衡した８ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂカラム
でのクロマトグラフィーにかけ、そしてその接合体をボ
イド容量画分として集める。この予め重合したグルコー
スオキシダーゼ−抗体接合体を単一または二重イムノメ
トリック・アッセイに用いれば、抗体とモノマー性グル
コースオキ７ダーゼとの接合体により生成される信号よ
りも信号発生が増大するものと期待される。The conjugate was then placed in α1M sodium phosphate buffer (pH
7,0) and the conjugate is collected as a void volume fraction. The use of this prepolymerized glucose oxidase-antibody conjugate in single or dual immunometric assays should result in increased signal generation over that produced by the conjugate of antibody and monomeric glucose oxidase. Be expected.

【図面の簡単な説明】 第１図は至適化され予め重合した＃累を用いて達成しう
る感度増加とモノマー性酵素接合体を用いた場合とを直
接比較したものであり、第２図はβ−ｈＯＧに対するア
フィニティヵラム介在イムノメトリック・アッセイ例の
用量応答曲線である。 ＦＩＧ、１ （ジゴ渣シン）ｎｃ４／＊Ｌ ＦＩＧ、２ （ｈｃＧｌ　　ｍＩＵ／ｍＬBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS: Figure 1 provides a direct comparison of the increased sensitivity achievable using an optimized, pre-polymerized complex with monomeric enzyme conjugates, and Figure 2. is a dose-response curve for an example affinity column-mediated immunometric assay for β-hOG. FIG, 1 (Digoresin) nc4/*L FIG, 2 (hcGl mIU/mL

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １）（１）少くとも２つの酵素分子を共有結合的に結合
させて予め重合した酵素を生成させ、そして （２）予め重合した酵素を抗体またはその断片に共有結
合的に結合させる ことよりなるポリマー性酵素／抗体接合体の製造方法。 ２）酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼ、β−ラクタマーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ
、スーパーオキシドディスムターゼ、ルシフェラーゼ、
ピルベートキナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ガ
ラクトースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
、エンテロキナーゼ、チロシナーゼおよびキサンチンオ
キシダーゼよりなる群から選択される特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３）酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカリ
性ホスファターゼよりなる群から選択される特許請求の
範囲第２項記載の方法。 ４）酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである特許請求の
範囲第３項記載の方法。 ５）結合工程（１）が架橋剤を用いて行われる特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ６）架橋剤がホモ２官能性架橋剤である特許請求の範囲
第５項記載の方法。 ７）ホモ２官能性架橋剤が、ｏ−フェニレンジマレイミ
ド、３，３’−ジチオビス（スルフォスクシンイミジル
プロピオネート）、ビス（スルフォスクシンイミジル）
スベレート、ビス（マレイミド）メチルエステル、ジメ
チルスベリミデート・２ＨＣｌ、ジメチルピメリミデー
ト、ジメチルアジピミデート、ジチオビス（スクシンイ
ミジルプロピオネート）よりなる群から選択される特許
請求の範囲第６項記載の方法。 ８）架橋剤が、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スクシンイミ
ジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボキシレート、スクシンイミジル−４−（ｐ−マ
レイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−スクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、マレイミ
ドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、ｍ−マレイミドベンゾイルスルフォスクシンイミド
エステル、スルフォスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、
スルフォスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）ブチレート、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイ
ルオキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジル−４−アジドベンゾエート、スルフォスクシンイミ
ジル６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ
）ヘキサノエートよりなる群から選択されるヘテロ２官
能性架橋剤である特許請求の範囲第５項記載の方法。 ９）架橋剤がｏ−フェニレンジマレイミドである特許請
求の範囲第７項記載の方法。 １０）結合工程（２）が架橋剤を用いて行われる特許請
求の範囲第１項記載の方法。 １１）架橋剤がｏ−フェニレンジマレイミド、３、３’
−ジチオビス（スルフォスクシンイミジルプロピオネー
ト）、ビス（スルフォスクシンイミジル）スベレート、
ビス（マレイミド）メチルエステル、ジメチルスベリミ
デート・２ＨＣｌ、ジメチルピメリミデート、ジメチル
アジピミデート、ジチオビス（スクシンイミジルプロピ
オネート）よりなる群から選択されるホモ２官能性架橋
剤である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２）架橋剤がｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スクシンイミ
ジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボキシレート、スクシンイミジル−４−（ｐ−マ
レイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−スクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、マレイミ
ドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、ｍ−マレイミドベンゾイルスルフォスクシンイミド
エステル、スルフォスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、
スルフォスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）ブチレート、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイ
ルオキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジル−４−アジドベンゾエート、スルフォスクシンイミ
ジル６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ
）ヘキサノエートよりなる群から選択されたヘテロ２官
能性架橋剤である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３）抗体またはその断片がＩｇＧ分子、Ｆａｂ断片、
Ｆａｂ′断片、Ｆ（ａｂ′）＿２断片または半分子であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １４）Ｆａｂ′断片がＦａｂ′−ＳＨ断片である特許請
求の範囲第１３項記載の方法。 １５）抗体がＦａｂ′−ＳＨ断片であり、酵素がβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼであり、そして結合工程（１）およ
び（２）がｏ−フェニレンジマレイミドを用いて行われ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １６）（１）液体試料を酵素標識抗−被分析物抗体と接
触させて、 （ｉ）酵素標識抗−被分析物抗体と被分析物とよりなる
コンプレックスおよび （ｉｉ）遊離酵素標識抗−被分析物抗体を形成し； （２）所望によりそのコンプレックスを遊離酵素標識抗
−被分析物抗体から分離し； （３）そのコンプレックスかまたは遊離酵素標識抗−被
分析物抗体の酵素活性を測定し；そして （４）その酵素活性を前記試料中に最初に存在した被分
析物量に関連付ける ことよりなる液体試料中の被分析物を測定するためのイ
ムノアッセイにおいて、前記酵素標識抗−被分析物抗体
として、予め重合した酵素と抗体またはその断片との共
有結合接合体を用いることを特徴とする前記イムノアッ
セイ。 １７）被分析物がジゴキシンであり、そして共有結合接
合体がＦａｂ′断片と約２０，０００，０００〜約３５
，０００，０００の分子量の予め重合したβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼとよりなり、そのＦａｂ′断片；予め重合
したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのモル比がそれぞれ約２
０：１〜約４０：１である特許請求の範囲第１６項記載
の方法。 １８）共有結合的に結合した少くとも２つの酵素分子よ
りなり、そして抗体またはその断片に共有結合的に結合
した予め重合した酵素よりなる接合体。 １９）酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性
ホスファターゼ、β−ラクタマーゼ、グルコース−６−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、ルシフェラーゼ
、ピルベートキナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、
ガラクトースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、エンテロキナーゼ、チロシナーゼ、およびキサンチ
ンオキシダーゼよりなる群から選択される特許請求の範
囲第１８項記載の接合体。 ２０）酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼおよびアルカ
リ性ホスファターゼよりなる群から選択される特許請求
の範囲第１９項記載の接合体。 ２１）酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである特許請求
の範囲第２０項記載の接合体。 ２２）抗体またはその断片がＦａｂ′断片である特許請
求の範囲第２１項記載の接合体。Claims: 1) (1) covalently linking at least two enzyme molecules to produce a prepolymerized enzyme; and (2) covalently linking the prepolymerized enzyme to an antibody or fragment thereof. A method for producing a polymeric enzyme/antibody conjugate, the method comprising: 2) The enzyme is β-D-galactosidase, glucose oxidase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-lactamase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, urease, uricase, superoxide dismutase, luciferase,
2. The method of claim 1, wherein the enzyme is selected from the group consisting of pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, galactose oxidase, acetylcholinesterase, enterokinase, tyrosinase and xanthine oxidase. 3) The method of claim 2, wherein the enzyme is selected from the group consisting of β-D-galactosidase, glucose oxidase, horseradish peroxidase and alkaline phosphatase. 4) The method according to claim 3, wherein the enzyme is β-D-galactosidase. 5) The method according to claim 1, wherein the bonding step (1) is performed using a crosslinking agent. 6) The method according to claim 5, wherein the crosslinking agent is a homobifunctional crosslinking agent. 7) The homobifunctional crosslinking agent is o-phenylene dimaleimide, 3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), bis(sulfosuccinimidyl)
Suberate, bis(maleimido)methyl ester, dimethyl suberimidate/2HCl, dimethylpimelimidate, dimethyladipimidate, dithiobis(succinimidylpropionate). The method described in Section 6. 8) The crosslinking agent is m-maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimide ester, N-succinimidyl 3-
(2-pyridyldithio)propionate, succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1
-carboxylate, succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate, N-succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate, maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimide ester, m-maleimidobenzoylsulfosuccinimide ester, sulfosuccinimide imidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate, N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide, N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate, Sulfosuccinimidyl 6-(4 6. The method of claim 5, wherein the heterobifunctional crosslinker is selected from the group consisting of '-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate. 9) The method according to claim 7, wherein the crosslinking agent is o-phenylene dimaleimide. 10) The method according to claim 1, wherein the bonding step (2) is performed using a crosslinking agent. 11) The crosslinking agent is o-phenylene dimaleimide, 3,3'
- dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), bis(sulfosuccinimidyl) suberate,
A homobifunctional crosslinking agent selected from the group consisting of bis(maleimido)methyl ester, dimethyl suberimidate/2HCl, dimethyl pimelimidate, dimethyl adipimidate, and dithiobis(succinimidyl propionate). 11. The method of claim 10. 12) The crosslinking agent is m-maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimide ester, N-succinimidyl 3-
(2-pyridyldithio)propionate, succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1
-carboxylate, succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate, N-succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate, maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimide ester, m-maleimidobenzoylsulfosuccinimide ester, sulfosuccinimide imidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate, N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide, N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate, Sulfosuccinimidyl 6-(4 11. The method of claim 10, wherein the heterobifunctional crosslinker is selected from the group consisting of '-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate. 13) The antibody or its fragment is an IgG molecule, a Fab fragment,
The method according to claim 1, which is a Fab' fragment, an F(ab')_2 fragment or a half molecule. 14) The method according to claim 13, wherein the Fab' fragment is a Fab'-SH fragment. 15) The antibody is a Fab'-SH fragment and the enzyme is β-D
-galactosidase and the coupling steps (1) and (2) are carried out using o-phenylene dimaleimide. 16) (1) Contacting a liquid sample with an enzyme-labeled anti-analyte antibody to form a complex consisting of (i) an enzyme-labeled anti-analyte antibody and an analyte and (ii) free enzyme-labeled anti-analyte antibody. forming the analyte antibody; (2) optionally separating the complex from the free enzyme-labeled anti-analyte antibody; (3) measuring the enzymatic activity of the complex or the free enzyme-labeled anti-analyte antibody. and (4) as said enzyme-labeled anti-analyte antibody in an immunoassay for measuring an analyte in a liquid sample comprising relating its enzymatic activity to the amount of analyte initially present in said sample. , the immunoassay characterized in that it uses a covalent conjugate of a prepolymerized enzyme and an antibody or a fragment thereof. 17) The analyte is digoxin and the covalent conjugate is about 20,000,000 to about 35
,000,000 molecular weight of prepolymerized β-D-galactosidase; the Fab' fragment thereof;
17. The method of claim 16, wherein the ratio is from 0:1 to about 40:1. 18) Conjugates consisting of at least two covalently linked enzyme molecules and a prepolymerized enzyme covalently linked to an antibody or fragment thereof. 19) The enzyme is β-D-galactosidase, glucose oxidase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-lactamase, glucose-6-
Phosphate dehydrogenase, urease, uricase, superoxide dismutase, luciferase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase,
19. The conjugate of claim 18 selected from the group consisting of galactose oxidase, acetylcholinesterase, enterokinase, tyrosinase, and xanthine oxidase. 20) The conjugate of claim 19, wherein the enzyme is selected from the group consisting of β-D-galactosidase, glucose oxidase, horseradish peroxidase and alkaline phosphatase. 21) The conjugate according to claim 20, wherein the enzyme is β-D-galactosidase. 22) The conjugate according to claim 21, wherein the antibody or fragment thereof is a Fab' fragment.