JPS61219394A - Production of hyaluronic acid through fermentation - Google Patents

Abstract

PURPOSE:The cultivation of a specific microorganism in Streptococcus enable outstandingly high-yield production of hyaluronic acid. CONSTITUTION:Streptococcus zeoopidemicus 1035 is inoculated in a culture medium containing carbon sources such as glucose, nitrogen sources such as ammonium sulfate, sodium chloride, vitamins and so on to effect aerobic cultivation under agitation at 30-37 deg.C, 5.5-9pH whereby hyaluronic acid is accumulated in the culture medium. Then, cell bodies, other insoluble components and mixed proteins are removed, then, lower molecular-weight substances are removed by ultrafiltration and treatment with ion-exchange resins and freeze-drying and other operations are carried out to effect the isolation and purification of hyaluronic acid.

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法に関す
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to a method for producing hyaluronic acid by a fermentation method.

［従来の技術］ 従来、ヒアルロン酸はウシの眼球のガラス液、ニワトリ
のトサカの他、調帯や関節液などから単離され、蛋白質
や他のムコ多糖および水と結合してゼリー状を保ち、潤
滑剤的な役割、バクテリアの侵入からの保護、水分の保
持などに役立っていることが知られているが、極めて高
価であることが問題点であった。[Prior art] Hyaluronic acid has conventionally been isolated from the glass fluid of cow eyes, the comb of chickens, as well as the zona and joint fluid, and it binds with proteins, other mucopolysaccharides, and water to maintain a jelly-like state. It is known that it acts as a lubricant, protects from bacterial invasion, and retains moisture, but the problem is that it is extremely expensive.

ストレプトコツカス属の細菌を利用したヒアルロン酸の
製造については、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　％ス
トレプトコッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｅｑｕｉ）　、ストレプトコッカス・エキシミリス（
Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉ
ｓ　）　、ストレプトコッカス・ディスガラクチイエ（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａ
ｅ）およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕ
ｓ　）などの細菌によりヒアルロン酸を比較的安価に製
造できることが知られており、たとえばホルムストレー
ム（Ｂ。Regarding the production of hyaluronic acid using bacteria of the genus Streptococcus, Streptococcus pyogenes (S
Streptococcus pyogenes
equi), Streptococcus excimilis (
S trep tococcusequisimili
s), Streptococcus dysgalactiae (
Streptococcus dysgalactia
e) and Streptococcus zooepidemicus (S
treptococcus zooepidemicu
It is known that hyaluronic acid can be produced relatively inexpensively by bacteria such as Holmström (B.

Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ　５Ａｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ　％　１９６７）　、ジエー・ビー・ウールコック（
Ｊ、Ｂ、Ｗｏｏｌｃｏｃｋ、　　８５．３７２〜３７５
、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｓ　１９７４）　
、イー・キエム（Ｅ、ＫｊｅｍＡｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ
、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、５ｃａｎｄ　ｓ　１９７６）ら
によって報告されている。Holmstrom 5App1. Microbia
l % 1967), G.B. Woolcock (
J. B. Woolcock, 85.372-375.
, J. Gen. Microbials 1974)
, E.KjemActa Pathol
, Microbial, 5cands 1976) et al.

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、これらはいずれも大量生産を目的としたもので
はないので、たとえばグルコース１％、培養時間２４時
間、ｐｔｒ　７．０〜７．６、温度３０〜３７℃などの
通常の培養条件で培養を行っても、ヒアルロン酸の収量
は０．６ｇ／ｌ以下と満足できる水準ではなかった。[Problems to be solved by the invention] However, since none of these are intended for mass production, for example, glucose 1%, culture time 24 hours, ptr 7.0-7.6, temperature 30-37 Even if the culture was carried out under normal culture conditions such as ℃, the yield of hyaluronic acid was less than 0.6 g/l, which was not a satisfactory level.

本発明者らは簡単で安価な培地でヒアルロン酸を収量よ
く安定に生成せしめることを意図して鋭意研究を続けて
おり、さきに糖成分３％以上を含有する栄養培地上で上
記菌株を培養することを特徴とする醗酵法によるヒアル
ロン酸の製造方法の出願（特開昭５８−５６６９２号公
報）を行った。The present inventors have been conducting intensive research with the intention of stably producing hyaluronic acid in high yields using a simple and inexpensive medium, and have first cultivated the above bacterial strain on a nutrient medium containing 3% or more of sugar components. An application was filed (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-56692) for a method for producing hyaluronic acid by a fermentation method characterized by the following.

この方法はヒアルロン酸を収率よく生成する方法である
が、しかしながら、ロフトごとの生産量が不安定であり
、かつ生産量自体も工業的に実施に移すには、まだ不充
分なものであった。Although this method produces hyaluronic acid in good yield, the production amount per loft is unstable, and the production amount itself is still insufficient for industrial implementation. Ta.

本発明者らは、かかる問題を解決すべく鋭意研究した結
果、ストレプトコツカス属の突然変異株中からヒアルロ
ン酸をとくに高率で生産する菌株をとり出すことに成功
し、本発明を完成するに至った。As a result of intensive research aimed at solving this problem, the present inventors succeeded in extracting a strain that produces hyaluronic acid at a particularly high rate from mutant strains of the genus Streptococcus, thereby completing the present invention. reached.

［問題点を解決するための手段］ すなわち、本発明はストレプトコッカス・ズーエピデミ
カスのヒアルロン酸高生産変異株であるストレプトコッ
カス・ズーエピデミカス１０３５　（微工研菌寄第８１
５７号）を培養し、培養物からヒアルロン酸を採取する
ことを特徴とする醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法
である。[Means for Solving the Problems] That is, the present invention is directed to Streptococcus zooepidemicus 1035, which is a high-hyaluronan-producing mutant strain of Streptococcus zooepidemicus.
This is a method for producing hyaluronic acid by a fermentation method, which is characterized by culturing hyaluronic acid (No. 57) and collecting hyaluronic acid from the culture.

以下、本発明について具体的に説明する。The present invention will be explained in detail below.

本発明において用いるストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカス１０３５は、ストレプトコッカス・ズーエピデミ
カスを突然変異して得たヒアルロン酸高生産菌株であり
、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８１
５７号として受託されている。Streptococcus zooepidemicus 1035 used in the present invention is a highly hyaluronic acid-producing bacterial strain obtained by mutating Streptococcus zooepidemicus, and is submitted to the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology on the 81st
It has been entrusted as No. 57.

上記ストレプトコッカス・ズーエピデミカス１０３５は
、モルモットの眼粘膜から採取したストレプトコッカス
・ズーエピデミカスを常法により紫外線、Ｎ−メチル−
Ｎ゛−ニトロ　−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＴ
Ｇという）などで処理し、ついでプレインハートインツ
ユジョン寒天培地上に塗布してヒアルロン酸を高率で生
産する変異株を取得することによって得られる（後述実
験例１参照）。The above-mentioned Streptococcus zooepidemicus 1035 was obtained by treating Streptococcus zooepidemicus collected from the ocular mucosa of a guinea pig with ultraviolet rays, N-methyl-
N-nitro-N-nitrosoguanidine (hereinafter referred to as NT
G) and then applied on a plain heart infusion agar medium to obtain a mutant strain that produces hyaluronic acid at a high rate (see Experimental Example 1 below).

ストレプトコッカス・ズーエピデミカス１０３５の菌学
的性質は、下記の通り、羊血液寒天培地上に透明な粘稠
性を有する集落を形成し、グラム陽性連鎖状球菌であり
、「バージ−のマニュアル・オブ・デタミネイティブ・
バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ　）、第８版、第４９８頁、１９７４年」に記
載されている菌学的性質と同一である。The mycological properties of Streptococcus zooepidemicus 1035 are as follows: it forms a transparent viscous colony on a sheep blood agar medium, and is a Gram-positive streptococcus, as described in "Burgee's Manual of Determination". native·
Bacteriology (Bergey's Manual
of Determinative Bacteria
The mycological properties are the same as those described in 1974.

■グラム染色　　十 ■β−溶血性　　十 ０６０℃、３０分熱抵抗性　　− ０４０％胆汁抵抗性　　− ■６．５％食塩抵抗性　　− ■ｐＨ９，６アルカリ抵抗性　　− ■馬尿酸ソーダ分解性　　− ■エスクリン分解性　　十 ■ゼラチン溶解性　　　− ■バシトラシン感受性　　十 ■糖分解性 グルコース　　＋ マルトース　　士 ラクトース　　± サッカロース　　＋ ソルビトール　　＋ サリシン　　＋ グリセリン　　− マンニット　　− トレハロース　　− （＋陽性　　士擬陽性　　−陰性　） 本発明に係るストレプトコッカス・ズーエピデミカス１
０３５を培養する培地は、炭素源、無機塩およびその他
に必要に応じて有機微量栄養素を含有するものが好まし
い。炭素源としてはたとえば有機酸、脂肪族アルコール
などいろいろあるが、本発明では澱粉加水分解物、グル
コース、蔗糖ガラクトース、フラクトースなどの糖分を
含むものであることが好ましい。窒素源としては硫安、
硝酸ナトリウム、リン酸第ニアンモニウム、肉エキス、
ペプトン、各種アミノ酸混合物、酵母エキスなどの一般
的な材料が用いられる。さらに、これらに加えて、塩化
ナトリウム、あるいはマグネシウム、カリウム、鉄、カ
ルシウムなどのリン酸塩、硫酸塩および炭酸塩、もしく
はビタミンなどが添加され得る。■Gram staining 10■β-hemolysis 1060℃, 30 minutes Heat resistance - 040% bile resistance - ■6.5% salt resistance - ■pH9.6 alkali resistance - ■Sodium hippuric acid degradability - ■ Aesculin degradability 10 Gelatin solubility − Bacitracin sensitivity 10 Glycolytic glucose + maltose Lactose + Sorbitol + Salicin + Glycerin − Mannitol − Trehalose − (+ positive False positive − Negative) Streptococcus spp. according to the present invention zooepidemicus 1
The medium for culturing 035 preferably contains a carbon source, an inorganic salt, and other organic micronutrients as necessary. There are various carbon sources such as organic acids and aliphatic alcohols, but in the present invention, carbon sources containing sugars such as starch hydrolysates, glucose, sucrose galactose, and fructose are preferred. As a nitrogen source, ammonium sulfate,
Sodium nitrate, ammonium phosphate, meat extract,
Common ingredients such as peptone, various amino acid mixtures, and yeast extract are used. Furthermore, in addition to these, sodium chloride, phosphates, sulfates, and carbonates such as magnesium, potassium, iron, and calcium, or vitamins may be added.

糖分の添加は、一度に多量添加するよりも、少量に分け
て適時添加するほうがヒアルロン酸の収量が増大する。The yield of hyaluronic acid is increased by adding sugar in small amounts at appropriate times rather than adding a large amount at once.

培養は、好気的条件が好ましく、たとえば振盪培養法ま
たは通気攪拌培養法を用いて３０〜３７℃の培養温度下
で行うのが一般的である。The culture is preferably carried out under aerobic conditions, and is generally carried out at a culture temperature of 30 to 37°C using, for example, a shaking culture method or an aerated agitation culture method.

さらに培養時に、アルカリ水溶液にてｐＨを５．５〜９
．０に調整するとヒアルロン酸が安定に大量に生産でき
好ましい。アルカリ水溶液としては水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、塩基性アミノ酸、低級アミンなどの通
常用いられるアルカリの一種又は二種以上が使用できる
。Furthermore, during culture, adjust the pH to 5.5 to 9 with an alkaline aqueous solution.
．． Adjusting to 0 is preferable because hyaluronic acid can be stably produced in large quantities. As an alkaline aqueous solution, sodium hydroxide,
One or more commonly used alkalis such as potassium hydroxide, basic amino acids, and lower amines can be used.

培養後、培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を分離、精
製するにあたっては、従来から公知の多糖類の分離、精
製方法が用いられるが、培地を酸性にしてから処理する
ほうがヒアルロン酸の純度があがって好ましい。To separate and purify the hyaluronic acid accumulated in the culture medium after culturing, conventionally known polysaccharide separation and purification methods are used, but the purity of hyaluronic acid is improved by acidifying the medium before processing. It's good to go up.

ヒアルロン酸の分離、精製方法の一例を記す。An example of a method for separating and purifying hyaluronic acid will be described.

まず、培養液中の菌体やその他の不溶成分を濾過または
遠心分離などにより分離除去する。次いで、溶液中に混
在する蛋白質をトリクロル酢酸またはクロロホルム−イ
ソアミルアルコール混液により、あるいは活性白土、活
性炭などの吸着剤により、あるいはまたペプシン、パパ
インまたはプロナーゼなどの蛋白質分解酵素などにより
除去、混在する低分子物質を限外濾過、透析または有機
溶媒沈澱法により、あるいはカチオン界面活性剤または
イオン交換樹脂を用いる吸着法などで除去した後、凍結
乾燥、噴霧乾燥または有機溶媒沈澱法などの手法を用い
てヒアルロン酸を得る（後述実施例１参照）。First, bacterial cells and other insoluble components in the culture solution are separated and removed by filtration or centrifugation. Next, proteins mixed in the solution are removed with trichloroacetic acid or a chloroform-isoamyl alcohol mixture, or with an adsorbent such as activated clay or activated carbon, or with a protease such as pepsin, papain, or pronase, and the mixed low molecules are removed. After the substances have been removed, such as by ultrafiltration, dialysis or organic solvent precipitation, or by adsorption methods using cationic surfactants or ion exchange resins, hyaluronan is removed using techniques such as freeze-drying, spray drying or organic solvent precipitation. An acid is obtained (see Example 1 below).

実験例１ モルモットの眼粘膜から分離したストレプトコッカス・
ズーエピデミカスをプレインハートインツユジョン培地
（栄研製）、３７℃で培養し、対数増殖期の菌体を集め
て低温で遠心を繰り返しつつＭ／２０リン酸緩衝波緩衝
液て無菌的に２回洗浄後、ＮＴＧ１００〜５００Ｐｇ／
−を含むＭ／２０リン酸緩衝波緩衝液中℃にて２０分間
振盪した後、氷冷した。Experimental Example 1 Streptococcus isolated from the ocular mucosa of a guinea pig
Zooepidemicus was cultured in plain heart infusion medium (manufactured by Eiken) at 37°C, and the cells in the logarithmic growth phase were collected and washed twice aseptically with M/20 phosphate buffer while repeating centrifugation at low temperature. After, NTG100~500Pg/
The mixture was shaken for 20 minutes at °C in M/20 phosphate buffer containing - and then cooled on ice.

ついで、Ｍ／２０リン酸緩衝波緩衝液て低温で菌体を２
回洗浄した後、プレインハートインツユジョン培地に接
種して３７℃にて２４時間培養し、プレインハートイン
フェジッン寒天（栄研製）培地上に塗布してヒアルロン
酸高生産変異株を取得した（微工研菌寄第８１５７号）
。Next, the bacterial cells were incubated at low temperature with M/20 phosphate buffer.
After washing twice, it was inoculated into Plain Heart Infusion medium, cultured at 37°C for 24 hours, and plated on Plain Heart Infesin Agar (manufactured by Eiken) medium to obtain a high-production mutant strain of hyaluronic acid ( Microtechnology Research Institute No. 8157)
.

［実施例〕 実施例１ グルコース４％、酵母エキス（オリエンタル酵母株式会
社製）０．５％、ペプトン（大五栄養化学株式会社製）
１．０％、アデカノールＬＧ−８０５（旭電化株式会社
製＞　　ｏ、ｏｏｓ％の組成の培地を３０１のジャーフ
ァーメンタ−に１０１分注し、殺菌後、前培養したスト
レプトコッカス・ズーエピデミカス１０３５を接種し、
水酸化ナトリウムにてｐＨを７．０にコツトロールして
３５℃で２日間通気攪拌培養した。[Example] Example 1 Glucose 4%, yeast extract (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) 0.5%, peptone (manufactured by Daigo Nutrient Chemical Co., Ltd.)
A culture medium with a composition of 1.0%, Adekanol LG-805 (Asahi Denka Co., Ltd. > o, oos%) was dispensed into 301 jar fermenters, and after sterilization, precultured Streptococcus zooepidemicus 1035 was inoculated. ,
The pH was adjusted to 7.0 with sodium hydroxide and cultured with aeration at 35° C. for 2 days.

なお、グルコースは培地とは別に滅菌して添加している
。Note that glucose is sterilized and added separately from the medium.

培養の時間が経過するとともにヒアルロン酸が生成し、
培養液が粘稠性を帯びてくるので、はぼ最高粘度に達し
た時点（１日〜２日後）で培養を終了した。As the culture time passes, hyaluronic acid is produced,
Since the culture solution became viscous, the culture was terminated when the maximum viscosity was reached (1 to 2 days later).

培養液を遠心分離にかけて不溶成分を分離除去し、クロ
ロホルム−イソアミルアルコール混液により除去、限外
濾過法で低分子物質を除去した後、凍結乾燥法を用いて
培養液１１より　５．５ｇのヒアルロン酸を得た。The culture solution was centrifuged to separate and remove insoluble components, removed with a chloroform-isoamyl alcohol mixture, and low-molecular substances were removed by ultrafiltration, and then 5.5 g of hyaluronic acid was extracted from culture solution 11 using a freeze-drying method. I got it.

実施例１と同様の培養を３回くり返して行ったが、ヒア
ルロン酸の生産量は常に安定していた。The same culture as in Example 1 was repeated three times, but the production amount of hyaluronic acid was always stable.

また、得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタノール、
エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテルなどの
有機溶媒には不溶、無味、無臭の白色繊維状物質であり
、赤外線吸収スペクトル、電気泳動分析、ろ低電気泳動
分析および真菌性ヒアルロニダーゼによる分解実験によ
リヒアルロン酸であることが確認できた。In addition, the obtained hyaluronic acid is soluble in water, methanol,
It is a white fibrous substance that is insoluble in organic solvents such as ethanol, acetone, chloroform, and ether, tasteless, and odorless. It was confirmed that it was an acid.

比較例１ 突然変異処理する以前のストレプトコッカス・ズーエピ
デミカスの培養を実施例１と同様にして３回くり返した
が、得られたヒアルロン酸は、それぞれ１．０ｇ、　　
３．４ｇ、　　２．８ｇであり、生産量は実施例１と比
較して低く、また、ばらついていた。Comparative Example 1 The culture of Streptococcus zooepidemicus before mutation treatment was repeated three times in the same manner as in Example 1, but the obtained hyaluronic acid was 1.0 g,
The production amounts were 3.4 g and 2.8 g, which was lower than in Example 1, and the production amount was also variable.

［効果］ 本発明方法によれば、ヒアルロン酸を高収率でしかも生
産量にばらつきなく安定的に生産することができる。[Effects] According to the method of the present invention, hyaluronic acid can be stably produced in high yield and without variation in production amount.

本発明方法によって製造されるヒアルロン酸は、皮膚に
使用される外用医薬品や化粧品に配合するものとして最
適である。The hyaluronic acid produced by the method of the present invention is optimal for use in external medicines and cosmetics for use on the skin.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）ストレプトコッカス・ズーエピデミカス１０３５
（微工研菌寄第８１５７号）を培養し、培養物からヒア
ルロン酸を採取することを特徴とする醗酵法によるヒア
ルロン酸の製造方法。(1) Streptococcus zooepidemicus 1035
1. A method for producing hyaluronic acid by a fermentation method, which is characterized by cultivating hyaluronic acid (Feikoken Bacteria No. 8157) and collecting hyaluronic acid from the culture.