JPH0630603B2 - Hyaluronic acid manufacturing method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ 本発明は、ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」という）の製造
法に関し、更に詳しくは、ＨＡ産生菌を糖質含有培地で
培養し、培養物からＨＡを採取するＨＡの製造法に関す
る。TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing hyaluronic acid (hereinafter referred to as “HA”), and more specifically, culturing HA-producing bacteria in a sugar-containing medium, The present invention relates to a method for producing HA for collecting HA.

［従来の技術及びその問題点］ ＨＡは、ウシの硝子体、ヒトの臍帯、関節液、皮膚、ニ
ワトリのトサカ等、動物の結合組織中に広く存在する直
鎖状の高分子物質で酸性ムコ多糖と称せられる物質群の
一種である。[Prior Art and its Problems] HA is a linear high molecular substance widely present in connective tissues of animals such as bovine vitreous, human umbilical cord, synovial fluid, skin, chicken gooseberry, etc. It is a kind of substance group called polysaccharide.

ＨＡの水溶液は強い保水性、粘弾性を示し、生体内では
細胞間隙に水を保持したり、細胞内でジェリー様のマト
リックスを形成し、細胞を保持したり、細胞間物質の移
動を制御したり、更には外からの機械的侵襲や細菌感染
に対する防禦に役立っている。An aqueous solution of HA exhibits strong water retention and viscoelasticity, and retains water in the intercellular spaces in the living body, forms a jelly-like matrix in the cells, retains the cells, and controls the movement of intercellular substances. It also helps protect against external mechanical invasion and bacterial infections.

ＨＡの利用としては、眼科領域（網膜剥離）に関して
は、例えばモダン・プロブレムズ・イン・オプタルモロ
ジー（Modern Problems in Ophthalmology），第１２
巻，３７０〜３７７頁（１９７４年）に、整形外科領域
（関節炎）に関しては、例えばアクタ・ベテリナリア・
スカンジナビア（Acta Veterinaria Scandinavia），第
１７巻，３７９〜３９４頁（１９７６年）に、皮膚科領
域（皮膚炎）に関しては、例えばオスペダリ・イタリア
・チルギア（Ospedali D′italia chirurgia），第１９
巻，１７３〜１８８頁（１９６８年）にその使用が報告
され、優れた治療効果が認められており、ＨＡの医薬品
としての用途の期待は大きい。Regarding the use of HA, regarding ophthalmologic regions (retinal detachment), for example, Modern Problems in Ophthalmology, No. 12
Vol. 370-377 (1974), in the area of orthopedic surgery (arthritis), see, for example, Acta Veterinaria.
Scandinavia (Acta Veterinaria Scandinavia), Vol. 17, 379-394 (1976), regarding the dermatological field (dermatitis), for example, Ospedali D'italia chirurgia, 19th.
Volume, pp. 173-188 (1968), the use thereof was reported, and an excellent therapeutic effect was recognized, and the use of HA as a pharmaceutical is highly expected.

このようなＨＡの原料としては、安価かつ大量に供給で
きるものが好ましく、主にニワトリのトサカ等の動物由
来のものが利用されているが、動物由来のものは生産・
供給が一定せず、生産管理の容易な微生物由来のものが
強く望まれている。As a raw material of such HA, it is preferable to inexpensively supply a large amount, and animal-derived ones such as chicken mackerel are mainly used.
There is a strong demand for a microorganism-derived product whose supply is not constant and whose production control is easy.

微生物由来のＨＡは古くからよく知られるところであ
り、例えばジェー・エス・ブリマコンビー（J.S.Brimac
ombe）及びジェー・エム・ウェッバー（J.M.Webber）共
著による１９６４年出版（Elsevier社，アムステルダ
ム）のムコポリサッカライド（Mucopolysaccharide）４
３頁には、エアロバクター・エアロゲネス（Aerobacter
aerogenes）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Stre
ptococcus pyogenes）等の連鎖球菌、シュードモナス・
エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）で代表される
菌類のＨＡ産生能について記載されている。HA derived from microorganisms has been well known since ancient times. For example, JSBrimac
ombe) and JM Webber (Mucopolysaccharide) 4 published in 1964 (Elsevier, Amsterdam).
On page three, Aerobacter
aerogenes), Streptococcus pyogenes (Stre
ptococcus pyogenes) and other Pseudomonas
The HA-producing ability of fungi represented by Pseudomonas aeruginosa has been described.

連鎖球菌由来のＨＡは、古くはジャーナル・オブ・ゼネ
ラル・マイクロバイオロジー（Journal of General Mic
robiology），第１４巻，１３４〜１４２頁（１９５６
年）にＡ群、Ｃ群合わせて数株についてＨＡ産生量とＨ
Ａ分解酵素（ヒアルロニダーゼ）産生能を調べた結果が
報告されており、ＨＡ産生量は培地１００ｍ当り１０
〜２０mgでＨＡ産生と同時にヒアルロニダーゼを産生す
る株では一度産生したＨＡが消失することが指摘されて
いる。HA derived from streptococcus has long been known as the Journal of General Microbiology.
robiology), 14: 134-142 (1956)
Year), HA production and H of several strains including Group A and Group C
The results of examining the ability to produce A-degrading enzyme (hyaluronidase) have been reported, and the amount of HA produced was 10 per 100 m of the medium.
It has been pointed out that HA produced once disappears in the strain that produces hyaluronidase at the same time as HA production at -20 mg.

ＨＡ産生増強のための培養法に関する報告はほとんどな
されておらず、わずかにグルコース添加量について検討
した結果が報告されているにすぎない。即ち、アプライ
ド・マイクロバイオロジー（Applied Microbiology），
第１５巻，１４０９〜１４１３頁（１９６７年）にはＡ
群の連鎖球菌を用いてヴィール・インヒュージョン培地
によりグルコース１％までの影響を、醗酵工学雑誌，第
５３巻，６４８〜６５７頁（１９７５年）にはアウレオ
バシデューム・プルランス（Aureobasidium pullulan
s）を用いて酵母エキスと各種塩類からなる培地により
グルコース１０％までの影響をそれぞれ検討しており、
いずれもグルコース添加量に応じて産生量が増大すると
報告している。Few reports have been made on culture methods for enhancing HA production, and only the results of studies on the amount of glucose added have been reported. That is, Applied Microbiology,
Volume 15, pp. 1409-1413 (1967)
The effect of glucose up to 1% by the Vill infusion medium using Streptococcus of Streptococcus was described in Fermentation Engineering Journal, 53, 648-657 (1975), Aureobasidium pullulan (Aureobasidium pullulan).
s) is used to examine the effects of up to 10% glucose on a medium consisting of yeast extract and various salts,
Both reports that the production increases according to the amount of glucose added.

本発明者らは、ＨＡ産生量を増大せしめる添加成分につ
いて鋭意研究を重ねた結果、グルコサミン、ピルビン
酸、アセトインを培地に含有させることによりＨＡ産生
量が増大することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。The present inventors have conducted intensive studies on additive components that increase HA production, and as a result, found that HA production is increased by adding glucosamine, pyruvic acid, and acetoin to the medium, and complete the present invention. Came to.

［発明の構成］ 本発明は、ＨＡ産生菌を糖質含有培地で培養し、培養物
からＨＡを採取するＨＡの製造法において、該培地中に
グルコサミン又はその塩、ピルビン酸又はその塩及びア
セトインからなる群から選ばれる少なくとも１種を添加
することを特徴とするＨＡの製造法に関するものであ
る。[Structure of the Invention] The present invention relates to a method for producing HA in which HA-producing bacteria are cultured in a sugar-containing medium and HA is collected from the culture, and glucosamine or a salt thereof, pyruvic acid or a salt thereof, and acetoin are added to the medium. The present invention relates to a method for producing HA, which comprises adding at least one selected from the group consisting of

本発明に用いる微生物としては、ＨＡ産生能を有する菌
類であれば如何なるものでもよい。かかるＨＡ産生菌と
しては、例えば、ストレプトコッカス属に属するストレ
プトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooe
pidemicus；このうち、NO.６０００１株及びNO.６００
１９株は、それぞれ微工研菌寄第８６７３号及び同第８
６７４号として通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所（以下「微工研」という）に寄託されている。）、
ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus eqi；ＩＩ
Ｄ６７９号として東京大学医科学研究所に寄託されてい
る。）、ストレプトコッカス・エキシミリス（Streptoc
ocuus eqisimilis；ＩＩＤ ６８１として東京大学医科
学研究所に寄託されている。）、ストレプトコッカス・
ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae；Ｉ
ＩＤ ６７８号として東京大学医科学研究所に寄託され
ている。）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Strept
ococcus pyogenes；ＩＩＤ ７１５号として東京大学医
科学研究所に寄託されている。）；シュードモナス属に
属するシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas ae
ruginosa；ＩＡＭ １０９５号として東京大学応用微生
物研究所に寄託されている。）；パスツレラ属に属する
パスツレラ・ムルトシーダ（Pasteurella multocida；
ＮＩＡＨ １１７９号として農林水産省家畜衛生試験所
に寄託されている。）等が挙げられる。As the microorganism used in the present invention, any microorganism can be used as long as it is a fungus capable of producing HA. Such HA-producing bacteria include, for example, Streptococcus zooeidemicus (Streptococcus zooe) belonging to the genus Streptococcus.
pidemicus; Of these, NO.60001 strain and NO.600
The 19 strains are Microbiology Research Institute No. 8673 and No. 8
No. 674 has been deposited with the Institute of Microbial Engineering, Ministry of International Trade and Industry (hereinafter referred to as “Micro-Institute”). ),
Streptococcus eqi; II
It has been deposited at the Institute of Medical Science, University of Tokyo as D679. ), Streptococcus excimilis
ocuus eqisimilis; deposited at the Institute of Medical Science, University of Tokyo as IID 681. ), Streptococcus
Streptococcus dysgalactiae; I
It has been deposited with the Institute of Medical Science, University of Tokyo as ID 678. ), Streptococcus pyogenes (Strept
ococcus pyogenes; IID 715 has been deposited at the Institute of Medical Science, University of Tokyo. ); Pseudomonas ae belonging to the genus Pseudomonas
ruginosa; IAM 1095 has been deposited with the Institute for Applied Microbiology, University of Tokyo. ); Pasteurella multocida belonging to the genus Pasteurella;
NIAH No. 1179 has been deposited at the Animal Health Laboratory of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries. ) And the like.

前述の微生物のうち、特に安全性の面から取扱い易い、
ランスフィールド（Lancefield）の血清学的分類でＣ群
に属する連鎖球菌（ストレプトコッカス（Streptococcu
s）属細菌）のヒアルロニダーゼ非産生株、例えばスト
レプトコッカス・ズーエピデミカス６０００１株、同６
００１９株、ストレプトコッカス・エキＩＩＤ６７９株
を用いることが好ましい。Of the above-mentioned microorganisms, it is especially easy to handle from the viewpoint of safety,
Streptococcus (Streptococcu) belonging to group C in the serological classification of Lancefield
s) Genus bacteria) non-hyaluronidase-producing strains such as Streptococcus zooepidemicus 60001 strain, 6
It is preferable to use 0019 strain and Streptococcus equi 679 strain.

本発明において、培地としては炭素源として糖質を含有
する培地を用いる。該培地には、通常の窒素源及び無機
塩類を適宜添加する。In the present invention, a medium containing a sugar as a carbon source is used as the medium. An ordinary nitrogen source and inorganic salts are appropriately added to the medium.

糖質としては、グルコースが最も好ましいが、デンプン
加水分解物、廃糖蜜、水飴、ショ糖、乳糖、果糖等を用
いてもよい。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、心臓エキス等の一般的原料を用いることがで
きる。無機塩類としては、ナトリウム、カリウム、カル
シウム等のリン酸塩、炭酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩等
を必要に応じて添加する。Glucose is most preferable as the sugar, but starch hydrolyzate, molasses, starch syrup, sucrose, lactose, fructose and the like may be used. As a nitrogen source, yeast extract, peptone,
Common raw materials such as meat extract and heart extract can be used. As inorganic salts, phosphates such as sodium, potassium and calcium, carbonates, sulfites, thiosulfates and the like are added as necessary.

前述のように、ＨＡ製造の基本培地としては一般的な細
菌の増殖用培地を用いることができるが、培養物からの
ＨＡの単離・精製を考慮した場合、可能な限り培地中の
蛋白量が少なく、組成が単純でかつＨＡ産生量の高い培
地が好ましい。好ましい基本培地としては、例えば、酵
母エキス０．５０％、ペプトン０．７５％、亜硫酸ナト
リウム０．０２％、グルコース１〜３％、pH７．５から
なる培地が挙げられる。As described above, as a basic medium for HA production, a general bacterial growth medium can be used. However, considering isolation and purification of HA from the culture, the amount of protein in the medium should be as high as possible. A medium having a low content, a simple composition, and a high HA production amount is preferable. As a preferable basal medium, for example, a medium composed of yeast extract 0.50%, peptone 0.75%, sodium sulfite 0.02%, glucose 1 to 3%, pH 7.5 can be mentioned.

本発明においては、増強剤としてグルコサミン又はその
塩、ピルビン酸又はその塩及びアセトインからなる群か
ら選ばれる少なくとも１種を添加する。グルコサミンの
塩としては、例えば塩酸塩、酢酸塩、ギ酸塩等が挙げら
れ、ピルビン酸の塩としては、例えばナトリウム、カリ
ウム、リチウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属
の塩が挙げられる。In the present invention, at least one selected from the group consisting of glucosamine or a salt thereof, pyruvic acid or a salt thereof, and acetoin is added as an enhancer. Examples of the glucosamine salt include hydrochloride, acetate, formate and the like, and examples of the pyruvic acid salt include alkali metal and alkaline earth metal salts such as sodium, potassium and lithium.

前記増強剤の添加割合は、例えばグルコース１〜３％添
加培地を用いた場合、グルコサミン又はその塩では、通
常０．２５〜３．０％、好ましくは０．５〜２．０％で
あり、ピルビン酸又はその塩では、通常０．２５〜３．
０％、好ましくは０．５〜２．０％であり、アセトイン
では、通常０．１２５〜１．０％、好ましくは０．１２
５〜０．５％である。The addition ratio of the enhancer is, for example, 0.25 to 3.0%, preferably 0.5 to 2.0% for glucosamine or a salt thereof when using a glucose 1 to 3% addition medium, In the case of pyruvic acid or its salt, it is usually 0.25-3.
0%, preferably 0.5 to 2.0%, and for acetoin, usually 0.125 to 1.0%, preferably 0.12.
5 to 0.5%.

菌の培養では、通常、予めウマ等の血液加寒天培地にお
いて３０〜３７℃で１晩種培養した菌を適当な液体培地
に２〜３白金耳接種し、時々pHを中性にアルカリ水溶液
で補正しながら８〜１６時間種培養を行う。この培養液
をＨＡ産生培地に対して１〜３％接種し、３０〜３７℃
で培地を中性に保ちながら２０〜４０時間振盪培養する
（生産培養）。ＨＡの産生には通気撹拌による好気的培
養とpH制御が必要である。In culturing the bacterium, usually, 2 to 3 platinum loops of a bacterium, which has been seed-cultured overnight at 30 to 37 ° C. in a blood agar medium such as horse in advance, is inoculated into an appropriate liquid medium, and the pH is sometimes neutralized with an alkaline aqueous solution. Seed culture is performed for 8 to 16 hours with correction. Inoculate 1 to 3% of this culture broth with respect to the HA production medium at 30 to 37 ° C.
While maintaining the medium neutral, the culture is carried out with shaking for 20 to 40 hours (production culture). The production of HA requires aerobic culture and pH control by aeration and stirring.

培地の中和は、通常、濃アルカリ水溶液、例えば水酸化
ナトリウム水溶液を適時滴下したり、粉末の炭酸カルシ
ウムを３〜５％添加することにより行う。Neutralization of the medium is usually carried out by adding a concentrated aqueous alkali solution, for example, an aqueous sodium hydroxide solution, as appropriate, or by adding 3 to 5% of powdered calcium carbonate.

増強剤は、前記培養時において、生産培養開始時又は開
始後３〜４時間後の菌の増殖が始まった頃に、全量を又
は数回に分けて添加することが好ましいが、種培養時に
添加することにより生産培養時に存在せしめることとし
てもよい。The enhancer is preferably added at the start of the production culture or at the start of the bacterial growth 3 to 4 hours after the start of the culture, in the whole amount or in several times, but is added during the seed culture. By doing so, it may be allowed to exist during production culture.

培養液からＨＡを分離・採取するにあたっては、通常の
多糖類の分離・採取法を利用することができる。例え
ば、培養液中の菌体等の不溶物を過又は遠心分離によ
り分別後、この溶液から、例えばエタノール等の溶媒沈
殿剤又は塩化セチルピリジニウム等の沈殿剤を単独で又
は併用することにより精製ＨＡを分取することができ
る。In separating / collecting HA from the culture solution, a usual method for separating / collecting polysaccharides can be used. For example, purified HA is obtained by separating insoluble matter such as bacterial cells in the culture solution by filtration or centrifugation, and then using a solvent precipitant such as ethanol or a precipitant such as cetylpyridinium chloride alone or in combination from this solution. Can be collected.

以上のようにして得られたものについてウロン酸含量を
測定し、またはセルロースアセテート膜を用いる電気泳
動法によってＨＡであることを確認した。The uronic acid content of the thus obtained product was measured, or it was confirmed to be HA by an electrophoresis method using a cellulose acetate membrane.

［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。[Examples of the Invention] Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these Examples do not limit the scope of the present invention.

実施例１ 酵母エキス（極東製薬（株）製；以下同様）０．５０
％、ペプトン（極東製薬（株）製；以下同様）０．７５
％、亜硫酸ナトリウム０．０２％、粉末炭酸カルシウム
５％（pH７．５）にグルコースの添加割合を１〜３％に
変化させた培地についてＨＡ産生に及ぼすグルコサミン
塩酸塩、ピルビン酸ナトリウム、アセトインの各々の添
加割合の影響を検討した。Example 1 Yeast extract (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd .; the same applies hereinafter) 0.50
%, Peptone (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd .; the same applies hereinafter) 0.75
%, Sodium sulfite 0.02%, powdered calcium carbonate 5% (pH 7.5) in which the addition ratio of glucose was changed to 1 to 3%, each of glucosamine hydrochloride, sodium pyruvate, and acetoin on HA production. The effect of the addition ratio of was investigated.

予め８時間種培養したストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカス６００１９株（微工研菌寄第８６７４号）を２％
接種し、３７℃で１７時間振盪培養後、培養液を遠心分
離して得た上清液にエタノールを添加してＨＡを沈殿さ
せた後、沈殿物のＨＡ量を分析した。結果を表１に示
す。2% of Streptococcus zooepidemicus 60019 strain (Microtech Lab. No. 8674) which had been pre-cultured for 8 hours
After inoculation and culturing with shaking at 37 ° C. for 17 hours, ethanol was added to the supernatant liquid obtained by centrifuging the culture liquid to precipitate HA, and then the amount of HA in the precipitate was analyzed. The results are shown in Table 1.

実施例２ ストレプトコッカス・ズーエピデミカス６００１９株
（微工研菌寄第８６７４号）をウマ血液寒天培地（極東
製薬（株）製；以下同様）に接種し、３７℃で１晩培養
した。酵母エキス０．５０％、ペプトン０．７５％、亜
硫酸ナトリウム０．０２％、フェノールレッド０．００
２％（pH７．５）からなる培地の２倍濃縮液５０ｍを
５００ｍ容振盪フラスコに仕込み、１２１℃で１５分
間加圧滅菌後、別に同様にして滅菌した５０％グルコー
ス水溶液及び滅菌水をグルコース終濃度１％、液量１０
０ｍになるように無菌的に加えた後、前記培養菌を２
白金耳接種し、３７℃で８時間振盪培養した。途中、指
示薬（フェノールレッド）の色調を観察しながら３Ｎ水
酸化ナトリウム水溶液で絶えず培地のpHを中性に保っ
た。この前培養液（種）を、前記と同様にしてグルコー
スが２．５％になるように調製した生産培地５５０ｍ
を含む２容振盪フラスコ４本に２％（Ｖ／Ｖ）ずつ無
菌的に接種し、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で絶えず培
地のpHを中性に維持しながら３７℃で１７時間振盪培養
した。途中、３本のフラスコについて、アセトイン並び
に予め水酸化ナトリウム水溶液でpH７．５に調整して
０．４５μメンブランフィルターで無菌過した、グル
コサミン塩酸塩の濃縮液及びピルビン酸ナトリウムの濃
縮液をそれぞれ培地当りの終濃度が０．５％、１．０
％、０．５％になるように培養開始４時間目及びその後
２〜３時間間隔で２回の計３回に分けて添加した。 Example 2 Streptococcus zooepidemicus 60019 strain (Microtechnology Research Institute, No. 8674) was inoculated into horse blood agar medium (Kyokuto Seiyaku Co., Ltd .; hereinafter the same), and cultured overnight at 37 ° C. Yeast extract 0.50%, peptone 0.75%, sodium sulfite 0.02%, phenol red 0.00
50 ml of a 2 × concentrated solution of a medium consisting of 2% (pH 7.5) was placed in a 500 m shake flask and sterilized under pressure at 121 ° C. for 15 minutes. Concentration 1%, liquid volume 10
After aseptically adding it to 0 m, add 2 to the above culture.
A platinum loop was inoculated and cultured at 37 ° C. for 8 hours with shaking. On the way, while observing the color tone of the indicator (phenol red), the pH of the medium was constantly kept neutral with a 3N aqueous sodium hydroxide solution. This preculture solution (seed) was prepared in the same manner as described above so that the glucose content was 2.5%.
2% (V / V) was aseptically inoculated into 4 2-volume shake flasks containing the same, and shake-cultured at 37 ° C. for 17 hours while constantly maintaining the pH of the medium at neutral with 6N aqueous sodium hydroxide solution. On the way, glucosamine hydrochloride concentrate and sodium pyruvate concentrate were sterilized with acetoin and sodium hydroxide aqueous solution to pH 7.5 in advance and sterilized with 0.45μ membrane filter per medium. Final concentration of 0.5%, 1.0
% And 0.5% were added 4 times at the start of the culture and 2 times at an interval of 2 to 3 hours thereafter, so as to be added 3 times in total.

培養終了後、各々の培養液に塩化ナトリウム１モル及び
塩化ベンザルコニウム１０００ppmを添加して殺菌した
後、培養液を過した。液に１．２倍量の９８％エタ
ノールを加え、生じた沈殿物を分取し、エタノールで洗
浄後、乾燥した。乾燥物の収量は、培養液１当り、ア
セトイン、グルコサミン塩酸塩、ピルビン酸ナトリウム
の添加例及び増強剤無添加例（対照）でそれぞれ１．６
ｇ、２．０ｇ、２．１ｇ、１．１ｇであり、カルバゾー
ル硫酸法でウロン酸含量を定量し、ＨＡ含量として算出
したところ、それぞれ９９．２％、１０１．０％、１０
０．２％、１００．８％であった。また、これらの乾燥
物をセルロースアセテート膜電気泳動（０．１５Ｍピリ
ジン−ギ酸，pH３．０，０．５mA／cmの条件で３０分間
泳動；アルシアンブルーで染色）に付したところ、標準
ＨＡと同位置に単一バンドを示し、これらの物質がＨＡ
であることを確認した。After the completion of the culture, 1 mol of sodium chloride and 1000 ppm of benzalkonium chloride were added to each of the culture liquids to sterilize them, and then the culture liquids were passed. 1.2 times the amount of 98% ethanol was added to the liquid, and the generated precipitate was separated, washed with ethanol and dried. The yield of the dried product was 1.6 per broth for acetoin, glucosamine hydrochloride, sodium pyruvate added and no enhancer (control), respectively.
g, 2.0 g, 2.1 g, and 1.1 g, and the uronic acid content was quantified by the carbazole-sulfuric acid method and calculated as the HA content, which were 99.2%, 101.0%, and 10%, respectively.
It was 0.2% and 100.8%. When these dried products were subjected to cellulose acetate membrane electrophoresis (0.15 M pyridine-formic acid, pH 3.0, 0.5 mA / cm for 30 minutes; stained with Alcian blue), they were found to be standard HA. A single band at the same position shows that these substances are HA
Was confirmed.

実施例３ ストレプトコッカス・ズーエピデミカス６０００１株
（微工研菌寄第８６７３号）、同６００１９株（微工研
菌寄第８６７４号）及びストレプトコッカス・エキ（Ｉ
ＩＤ６７９号）をそれぞれウマ血液寒天培地に接種し、
３７℃で１晩培養した。これらの菌について実施例２と
同様に種培養を行い、この種を酵母エキス０．５０％、
ペプトン０．７５％、亜硫酸ナリウム０．０２％、グル
コース２．５％、粉末炭酸カルシウム５％（pH７．５）
からなる生産培地１００ｍを含む５００ｍ容振盪フ
ラスコに２％（Ｖ／Ｖ）ずつ無菌的に接種し、３７℃で
２０時間振盪培養した。増強剤は実施例２と同様に調製
し、アセトイン、グルコサミン塩酸塩、ピルビン酸ナト
リウムを各々０．５％、培養開始時に添加した。培養終
了後、培養液を遠心分離して得た上清液に１．２倍量の
９８％エタノールを加え、生じた沈殿物を分取した。沈
殿物のＨＡ含量をカルバゾール硫酸法にて定量し、培養
液当りのＨＡ産生量を算出したところ、表２のとおりで
あった。Example 3 Streptococcus zooepidemicus 60001 strain (Ministry of Industrial Microbiology No. 8673), 60019 strain (Ministry of Microbiology No. 8674) and Streptococcus equi (I)
ID 679) on horse blood agar, respectively,
It was cultured overnight at 37 ° C. Seed culture was performed on these bacteria in the same manner as in Example 2, and the seeds were added to yeast extract 0.50%,
0.75% peptone, 0.02% sodium sulfite, 2.5% glucose, 5% powdered calcium carbonate (pH 7.5)
2% (V / V) was aseptically inoculated into a 500-m volume shake flask containing 100 m of the production medium consisting of 10%, and shake-cultured at 37 ° C. for 20 hours. The enhancer was prepared in the same manner as in Example 2, and 0.5% each of acetoin, glucosamine hydrochloride and sodium pyruvate was added at the start of culture. After the culture was completed, 1.2 times the amount of 98% ethanol was added to the supernatant obtained by centrifuging the culture, and the resulting precipitate was collected. The HA content of the precipitate was quantified by the carbazole sulfate method, and the HA production amount per culture solution was calculated. The results are shown in Table 2.

［発明の効果］ 本発明によれば、微生物由来のＨＡを高収率で製造する
ことができる。 [Effects of the Invention] According to the present invention, HA derived from microorganisms can be produced in high yield.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ヒアルロン酸産生菌を糖質含有培地で培養
し、培養物からヒアルロン酸を採取するヒアルロン酸の
製造法において、該培地中にグルコサミン又はその塩、
ピルビン酸又はその塩及びアセトインからなる群から選
ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とするヒア
ルロン酸の製造法。1. A method for producing hyaluronic acid, comprising culturing a hyaluronic acid-producing bacterium in a sugar-containing medium and collecting hyaluronic acid from the culture, wherein glucosamine or a salt thereof is contained in the medium.
A method for producing hyaluronic acid, which comprises adding at least one selected from the group consisting of pyruvic acid or a salt thereof and acetoin.