JPS61219394A - 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents
醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法Info
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- JPS61219394A JPS61219394A JP6017785A JP6017785A JPS61219394A JP S61219394 A JPS61219394 A JP S61219394A JP 6017785 A JP6017785 A JP 6017785A JP 6017785 A JP6017785 A JP 6017785A JP S61219394 A JPS61219394 A JP S61219394A
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- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法に関す
る。
る。
[従来の技術]
従来、ヒアルロン酸はウシの眼球のガラス液、ニワトリ
のトサカの他、調帯や関節液などから単離され、蛋白質
や他のムコ多糖および水と結合してゼリー状を保ち、潤
滑剤的な役割、バクテリアの侵入からの保護、水分の保
持などに役立っていることが知られているが、極めて高
価であることが問題点であった。
のトサカの他、調帯や関節液などから単離され、蛋白質
や他のムコ多糖および水と結合してゼリー状を保ち、潤
滑剤的な役割、バクテリアの侵入からの保護、水分の保
持などに役立っていることが知られているが、極めて高
価であることが問題点であった。
ストレプトコツカス属の細菌を利用したヒアルロン酸の
製造については、ストレプトコッカス・ピオゲネス(S
treptococcus pyogenes) %ス
トレプトコッカス・エキ(Streptococcus
equi) 、ストレプトコッカス・エキシミリス(
S trep tococcusequisimili
s ) 、ストレプトコッカス・ディスガラクチイエ(
Streptococcus dysgalactia
e)およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス(S
treptococcus zooepidemicu
s )などの細菌によりヒアルロン酸を比較的安価に製
造できることが知られており、たとえばホルムストレー
ム(B。
製造については、ストレプトコッカス・ピオゲネス(S
treptococcus pyogenes) %ス
トレプトコッカス・エキ(Streptococcus
equi) 、ストレプトコッカス・エキシミリス(
S trep tococcusequisimili
s ) 、ストレプトコッカス・ディスガラクチイエ(
Streptococcus dysgalactia
e)およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス(S
treptococcus zooepidemicu
s )などの細菌によりヒアルロン酸を比較的安価に製
造できることが知られており、たとえばホルムストレー
ム(B。
Holmstrom 5App1. Microbia
l % 1967) 、ジエー・ビー・ウールコック(
J、B、Woolcock、 85.372〜375
、J、Gen、Microbial s 1974)
、イー・キエム(E、KjemActa Pathol
、Microbial、5cand s 1976)ら
によって報告されている。
l % 1967) 、ジエー・ビー・ウールコック(
J、B、Woolcock、 85.372〜375
、J、Gen、Microbial s 1974)
、イー・キエム(E、KjemActa Pathol
、Microbial、5cand s 1976)ら
によって報告されている。
[発明が解決しようとする問題点]
しかし、これらはいずれも大量生産を目的としたもので
はないので、たとえばグルコース1%、培養時間24時
間、ptr 7.0〜7.6、温度30〜37℃などの
通常の培養条件で培養を行っても、ヒアルロン酸の収量
は0.6g/l以下と満足できる水準ではなかった。
はないので、たとえばグルコース1%、培養時間24時
間、ptr 7.0〜7.6、温度30〜37℃などの
通常の培養条件で培養を行っても、ヒアルロン酸の収量
は0.6g/l以下と満足できる水準ではなかった。
本発明者らは簡単で安価な培地でヒアルロン酸を収量よ
く安定に生成せしめることを意図して鋭意研究を続けて
おり、さきに糖成分3%以上を含有する栄養培地上で上
記菌株を培養することを特徴とする醗酵法によるヒアル
ロン酸の製造方法の出願(特開昭58−56692号公
報)を行った。
く安定に生成せしめることを意図して鋭意研究を続けて
おり、さきに糖成分3%以上を含有する栄養培地上で上
記菌株を培養することを特徴とする醗酵法によるヒアル
ロン酸の製造方法の出願(特開昭58−56692号公
報)を行った。
この方法はヒアルロン酸を収率よく生成する方法である
が、しかしながら、ロフトごとの生産量が不安定であり
、かつ生産量自体も工業的に実施に移すには、まだ不充
分なものであった。
が、しかしながら、ロフトごとの生産量が不安定であり
、かつ生産量自体も工業的に実施に移すには、まだ不充
分なものであった。
本発明者らは、かかる問題を解決すべく鋭意研究した結
果、ストレプトコツカス属の突然変異株中からヒアルロ
ン酸をとくに高率で生産する菌株をとり出すことに成功
し、本発明を完成するに至った。
果、ストレプトコツカス属の突然変異株中からヒアルロ
ン酸をとくに高率で生産する菌株をとり出すことに成功
し、本発明を完成するに至った。
[問題点を解決するための手段]
すなわち、本発明はストレプトコッカス・ズーエピデミ
カスのヒアルロン酸高生産変異株であるストレプトコッ
カス・ズーエピデミカス1035 (微工研菌寄第81
57号)を培養し、培養物からヒアルロン酸を採取する
ことを特徴とする醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法
である。
カスのヒアルロン酸高生産変異株であるストレプトコッ
カス・ズーエピデミカス1035 (微工研菌寄第81
57号)を培養し、培養物からヒアルロン酸を採取する
ことを特徴とする醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法
である。
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明において用いるストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカス1035は、ストレプトコッカス・ズーエピデミ
カスを突然変異して得たヒアルロン酸高生産菌株であり
、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第81
57号として受託されている。
ミカス1035は、ストレプトコッカス・ズーエピデミ
カスを突然変異して得たヒアルロン酸高生産菌株であり
、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第81
57号として受託されている。
上記ストレプトコッカス・ズーエピデミカス1035は
、モルモットの眼粘膜から採取したストレプトコッカス
・ズーエピデミカスを常法により紫外線、N−メチル−
N゛−ニトロ −N−ニトロソグアニジン(以下、NT
Gという)などで処理し、ついでプレインハートインツ
ユジョン寒天培地上に塗布してヒアルロン酸を高率で生
産する変異株を取得することによって得られる(後述実
験例1参照)。
、モルモットの眼粘膜から採取したストレプトコッカス
・ズーエピデミカスを常法により紫外線、N−メチル−
N゛−ニトロ −N−ニトロソグアニジン(以下、NT
Gという)などで処理し、ついでプレインハートインツ
ユジョン寒天培地上に塗布してヒアルロン酸を高率で生
産する変異株を取得することによって得られる(後述実
験例1参照)。
ストレプトコッカス・ズーエピデミカス1035の菌学
的性質は、下記の通り、羊血液寒天培地上に透明な粘稠
性を有する集落を形成し、グラム陽性連鎖状球菌であり
、「バージ−のマニュアル・オブ・デタミネイティブ・
バクテリオロジー(Bergey’s Manual
of Determinative Bacterio
logy )、第8版、第498頁、1974年」に記
載されている菌学的性質と同一である。
的性質は、下記の通り、羊血液寒天培地上に透明な粘稠
性を有する集落を形成し、グラム陽性連鎖状球菌であり
、「バージ−のマニュアル・オブ・デタミネイティブ・
バクテリオロジー(Bergey’s Manual
of Determinative Bacterio
logy )、第8版、第498頁、1974年」に記
載されている菌学的性質と同一である。
■グラム染色 十
■β−溶血性 十
060℃、30分熱抵抗性 −
040%胆汁抵抗性 −
■6.5%食塩抵抗性 −
■pH9,6アルカリ抵抗性 −
■馬尿酸ソーダ分解性 −
■エスクリン分解性 十
■ゼラチン溶解性 −
■バシトラシン感受性 十
■糖分解性
グルコース +
マルトース 士
ラクトース ±
サッカロース +
ソルビトール +
サリシン +
グリセリン −
マンニット −
トレハロース −
(+陽性 士擬陽性 −陰性 )
本発明に係るストレプトコッカス・ズーエピデミカス1
035を培養する培地は、炭素源、無機塩およびその他
に必要に応じて有機微量栄養素を含有するものが好まし
い。炭素源としてはたとえば有機酸、脂肪族アルコール
などいろいろあるが、本発明では澱粉加水分解物、グル
コース、蔗糖ガラクトース、フラクトースなどの糖分を
含むものであることが好ましい。窒素源としては硫安、
硝酸ナトリウム、リン酸第ニアンモニウム、肉エキス、
ペプトン、各種アミノ酸混合物、酵母エキスなどの一般
的な材料が用いられる。さらに、これらに加えて、塩化
ナトリウム、あるいはマグネシウム、カリウム、鉄、カ
ルシウムなどのリン酸塩、硫酸塩および炭酸塩、もしく
はビタミンなどが添加され得る。
035を培養する培地は、炭素源、無機塩およびその他
に必要に応じて有機微量栄養素を含有するものが好まし
い。炭素源としてはたとえば有機酸、脂肪族アルコール
などいろいろあるが、本発明では澱粉加水分解物、グル
コース、蔗糖ガラクトース、フラクトースなどの糖分を
含むものであることが好ましい。窒素源としては硫安、
硝酸ナトリウム、リン酸第ニアンモニウム、肉エキス、
ペプトン、各種アミノ酸混合物、酵母エキスなどの一般
的な材料が用いられる。さらに、これらに加えて、塩化
ナトリウム、あるいはマグネシウム、カリウム、鉄、カ
ルシウムなどのリン酸塩、硫酸塩および炭酸塩、もしく
はビタミンなどが添加され得る。
糖分の添加は、一度に多量添加するよりも、少量に分け
て適時添加するほうがヒアルロン酸の収量が増大する。
て適時添加するほうがヒアルロン酸の収量が増大する。
培養は、好気的条件が好ましく、たとえば振盪培養法ま
たは通気攪拌培養法を用いて30〜37℃の培養温度下
で行うのが一般的である。
たは通気攪拌培養法を用いて30〜37℃の培養温度下
で行うのが一般的である。
さらに培養時に、アルカリ水溶液にてpHを5.5〜9
.0に調整するとヒアルロン酸が安定に大量に生産でき
好ましい。アルカリ水溶液としては水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、塩基性アミノ酸、低級アミンなどの通
常用いられるアルカリの一種又は二種以上が使用できる
。
.0に調整するとヒアルロン酸が安定に大量に生産でき
好ましい。アルカリ水溶液としては水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、塩基性アミノ酸、低級アミンなどの通
常用いられるアルカリの一種又は二種以上が使用できる
。
培養後、培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を分離、精
製するにあたっては、従来から公知の多糖類の分離、精
製方法が用いられるが、培地を酸性にしてから処理する
ほうがヒアルロン酸の純度があがって好ましい。
製するにあたっては、従来から公知の多糖類の分離、精
製方法が用いられるが、培地を酸性にしてから処理する
ほうがヒアルロン酸の純度があがって好ましい。
ヒアルロン酸の分離、精製方法の一例を記す。
まず、培養液中の菌体やその他の不溶成分を濾過または
遠心分離などにより分離除去する。次いで、溶液中に混
在する蛋白質をトリクロル酢酸またはクロロホルム−イ
ソアミルアルコール混液により、あるいは活性白土、活
性炭などの吸着剤により、あるいはまたペプシン、パパ
インまたはプロナーゼなどの蛋白質分解酵素などにより
除去、混在する低分子物質を限外濾過、透析または有機
溶媒沈澱法により、あるいはカチオン界面活性剤または
イオン交換樹脂を用いる吸着法などで除去した後、凍結
乾燥、噴霧乾燥または有機溶媒沈澱法などの手法を用い
てヒアルロン酸を得る(後述実施例1参照)。
遠心分離などにより分離除去する。次いで、溶液中に混
在する蛋白質をトリクロル酢酸またはクロロホルム−イ
ソアミルアルコール混液により、あるいは活性白土、活
性炭などの吸着剤により、あるいはまたペプシン、パパ
インまたはプロナーゼなどの蛋白質分解酵素などにより
除去、混在する低分子物質を限外濾過、透析または有機
溶媒沈澱法により、あるいはカチオン界面活性剤または
イオン交換樹脂を用いる吸着法などで除去した後、凍結
乾燥、噴霧乾燥または有機溶媒沈澱法などの手法を用い
てヒアルロン酸を得る(後述実施例1参照)。
実験例1
モルモットの眼粘膜から分離したストレプトコッカス・
ズーエピデミカスをプレインハートインツユジョン培地
(栄研製)、37℃で培養し、対数増殖期の菌体を集め
て低温で遠心を繰り返しつつM/20リン酸緩衝波緩衝
液て無菌的に2回洗浄後、NTG100〜500Pg/
−を含むM/20リン酸緩衝波緩衝液中℃にて20分間
振盪した後、氷冷した。
ズーエピデミカスをプレインハートインツユジョン培地
(栄研製)、37℃で培養し、対数増殖期の菌体を集め
て低温で遠心を繰り返しつつM/20リン酸緩衝波緩衝
液て無菌的に2回洗浄後、NTG100〜500Pg/
−を含むM/20リン酸緩衝波緩衝液中℃にて20分間
振盪した後、氷冷した。
ついで、M/20リン酸緩衝波緩衝液て低温で菌体を2
回洗浄した後、プレインハートインツユジョン培地に接
種して37℃にて24時間培養し、プレインハートイン
フェジッン寒天(栄研製)培地上に塗布してヒアルロン
酸高生産変異株を取得した(微工研菌寄第8157号)
。
回洗浄した後、プレインハートインツユジョン培地に接
種して37℃にて24時間培養し、プレインハートイン
フェジッン寒天(栄研製)培地上に塗布してヒアルロン
酸高生産変異株を取得した(微工研菌寄第8157号)
。
[実施例〕
実施例1
グルコース4%、酵母エキス(オリエンタル酵母株式会
社製)0.5%、ペプトン(大五栄養化学株式会社製)
1.0%、アデカノールLG−805(旭電化株式会社
製> o、oos%の組成の培地を301のジャーフ
ァーメンタ−に101分注し、殺菌後、前培養したスト
レプトコッカス・ズーエピデミカス1035を接種し、
水酸化ナトリウムにてpHを7.0にコツトロールして
35℃で2日間通気攪拌培養した。
社製)0.5%、ペプトン(大五栄養化学株式会社製)
1.0%、アデカノールLG−805(旭電化株式会社
製> o、oos%の組成の培地を301のジャーフ
ァーメンタ−に101分注し、殺菌後、前培養したスト
レプトコッカス・ズーエピデミカス1035を接種し、
水酸化ナトリウムにてpHを7.0にコツトロールして
35℃で2日間通気攪拌培養した。
なお、グルコースは培地とは別に滅菌して添加している
。
。
培養の時間が経過するとともにヒアルロン酸が生成し、
培養液が粘稠性を帯びてくるので、はぼ最高粘度に達し
た時点(1日〜2日後)で培養を終了した。
培養液が粘稠性を帯びてくるので、はぼ最高粘度に達し
た時点(1日〜2日後)で培養を終了した。
培養液を遠心分離にかけて不溶成分を分離除去し、クロ
ロホルム−イソアミルアルコール混液により除去、限外
濾過法で低分子物質を除去した後、凍結乾燥法を用いて
培養液11より 5.5gのヒアルロン酸を得た。
ロホルム−イソアミルアルコール混液により除去、限外
濾過法で低分子物質を除去した後、凍結乾燥法を用いて
培養液11より 5.5gのヒアルロン酸を得た。
実施例1と同様の培養を3回くり返して行ったが、ヒア
ルロン酸の生産量は常に安定していた。
ルロン酸の生産量は常に安定していた。
また、得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタノール、
エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテルなどの
有機溶媒には不溶、無味、無臭の白色繊維状物質であり
、赤外線吸収スペクトル、電気泳動分析、ろ低電気泳動
分析および真菌性ヒアルロニダーゼによる分解実験によ
リヒアルロン酸であることが確認できた。
エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテルなどの
有機溶媒には不溶、無味、無臭の白色繊維状物質であり
、赤外線吸収スペクトル、電気泳動分析、ろ低電気泳動
分析および真菌性ヒアルロニダーゼによる分解実験によ
リヒアルロン酸であることが確認できた。
比較例1
突然変異処理する以前のストレプトコッカス・ズーエピ
デミカスの培養を実施例1と同様にして3回くり返した
が、得られたヒアルロン酸は、それぞれ1.0g、
3.4g、 2.8gであり、生産量は実施例1と比
較して低く、また、ばらついていた。
デミカスの培養を実施例1と同様にして3回くり返した
が、得られたヒアルロン酸は、それぞれ1.0g、
3.4g、 2.8gであり、生産量は実施例1と比
較して低く、また、ばらついていた。
[効果]
本発明方法によれば、ヒアルロン酸を高収率でしかも生
産量にばらつきなく安定的に生産することができる。
産量にばらつきなく安定的に生産することができる。
本発明方法によって製造されるヒアルロン酸は、皮膚に
使用される外用医薬品や化粧品に配合するものとして最
適である。
使用される外用医薬品や化粧品に配合するものとして最
適である。
Claims (1)
- (1)ストレプトコッカス・ズーエピデミカス1035
(微工研菌寄第8157号)を培養し、培養物からヒア
ルロン酸を採取することを特徴とする醗酵法によるヒア
ルロン酸の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6017785A JPS61219394A (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6017785A JPS61219394A (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61219394A true JPS61219394A (ja) | 1986-09-29 |
JPH0455675B2 JPH0455675B2 (ja) | 1992-09-04 |
Family
ID=13134609
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6017785A Granted JPS61219394A (ja) | 1985-03-25 | 1985-03-25 | 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61219394A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63156707A (ja) * | 1986-12-19 | 1988-06-29 | Yakult Honsha Co Ltd | ヒアルロン酸含有化粧料 |
FR2617849A1 (fr) * | 1987-07-10 | 1989-01-13 | Pf Medicament | Nouveau procede d'obtention d'acide hyaluronique d'origine bacterienne |
JPH05276972A (ja) * | 1992-10-26 | 1993-10-26 | Chisso Corp | ヒアルロン酸の製造法 |
JP2009112260A (ja) * | 2007-11-07 | 2009-05-28 | Yakult Honsha Co Ltd | ヒアルロン酸の製造方法 |
-
1985
- 1985-03-25 JP JP6017785A patent/JPS61219394A/ja active Granted
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63156707A (ja) * | 1986-12-19 | 1988-06-29 | Yakult Honsha Co Ltd | ヒアルロン酸含有化粧料 |
FR2617849A1 (fr) * | 1987-07-10 | 1989-01-13 | Pf Medicament | Nouveau procede d'obtention d'acide hyaluronique d'origine bacterienne |
JPH05276972A (ja) * | 1992-10-26 | 1993-10-26 | Chisso Corp | ヒアルロン酸の製造法 |
JPH0753117B2 (ja) * | 1992-10-26 | 1995-06-07 | チッソ株式会社 | ヒアルロン酸の製造法 |
JP2009112260A (ja) * | 2007-11-07 | 2009-05-28 | Yakult Honsha Co Ltd | ヒアルロン酸の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0455675B2 (ja) | 1992-09-04 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |