JPS61219394A - 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法に関す
る。

［従来の技術］ 従来、ヒアルロン酸はウシの眼球のガラス液、ニワトリ
のトサカの他、調帯や関節液などから単離され、蛋白質
や他のムコ多糖および水と結合してゼリー状を保ち、潤
滑剤的な役割、バクテリアの侵入からの保護、水分の保
持などに役立っていることが知られているが、極めて高
価であることが問題点であった。

ストレプトコツカス属の細菌を利用したヒアルロン酸の
製造については、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　％ス
トレプトコッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｅｑｕｉ）　、ストレプトコッカス・エキシミリス（
Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉ
ｓ　）　、ストレプトコッカス・ディスガラクチイエ（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａ
ｅ）およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕ
ｓ　）などの細菌によりヒアルロン酸を比較的安価に製
造できることが知られており、たとえばホルムストレー
ム（Ｂ。

Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ　５Ａｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ　％　１９６７）　、ジエー・ビー・ウールコック（
Ｊ、Ｂ、Ｗｏｏｌｃｏｃｋ、　　８５．３７２〜３７５
、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｓ　１９７４）　
、イー・キエム（Ｅ、ＫｊｅｍＡｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ
、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、５ｃａｎｄ　ｓ　１９７６）ら
によって報告されている。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、これらはいずれも大量生産を目的としたもので
はないので、たとえばグルコース１％、培養時間２４時
間、ｐｔｒ　７．０〜７．６、温度３０〜３７℃などの
通常の培養条件で培養を行っても、ヒアルロン酸の収量
は０．６ｇ／ｌ以下と満足できる水準ではなかった。

本発明者らは簡単で安価な培地でヒアルロン酸を収量よ
く安定に生成せしめることを意図して鋭意研究を続けて
おり、さきに糖成分３％以上を含有する栄養培地上で上
記菌株を培養することを特徴とする醗酵法によるヒアル
ロン酸の製造方法の出願（特開昭５８−５６６９２号公
報）を行った。

この方法はヒアルロン酸を収率よく生成する方法である
が、しかしながら、ロフトごとの生産量が不安定であり
、かつ生産量自体も工業的に実施に移すには、まだ不充
分なものであった。

本発明者らは、かかる問題を解決すべく鋭意研究した結
果、ストレプトコツカス属の突然変異株中からヒアルロ
ン酸をとくに高率で生産する菌株をとり出すことに成功
し、本発明を完成するに至った。

［問題点を解決するための手段］ すなわち、本発明はストレプトコッカス・ズーエピデミ
カスのヒアルロン酸高生産変異株であるストレプトコッ
カス・ズーエピデミカス１０３５　（微工研菌寄第８１
５７号）を培養し、培養物からヒアルロン酸を採取する
ことを特徴とする醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法
である。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明において用いるストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカス１０３５は、ストレプトコッカス・ズーエピデミ
カスを突然変異して得たヒアルロン酸高生産菌株であり
、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８１
５７号として受託されている。

上記ストレプトコッカス・ズーエピデミカス１０３５は
、モルモットの眼粘膜から採取したストレプトコッカス
・ズーエピデミカスを常法により紫外線、Ｎ−メチル−
Ｎ゛−ニトロ　−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＴ
Ｇという）などで処理し、ついでプレインハートインツ
ユジョン寒天培地上に塗布してヒアルロン酸を高率で生
産する変異株を取得することによって得られる（後述実
験例１参照）。

ストレプトコッカス・ズーエピデミカス１０３５の菌学
的性質は、下記の通り、羊血液寒天培地上に透明な粘稠
性を有する集落を形成し、グラム陽性連鎖状球菌であり
、「バージ−のマニュアル・オブ・デタミネイティブ・
バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ　）、第８版、第４９８頁、１９７４年」に記
載されている菌学的性質と同一である。

■グラム染色　　十 ■β−溶血性　　十 ０６０℃、３０分熱抵抗性　　− ０４０％胆汁抵抗性　　− ■６．５％食塩抵抗性　　− ■ｐＨ９，６アルカリ抵抗性　　− ■馬尿酸ソーダ分解性　　− ■エスクリン分解性　　十 ■ゼラチン溶解性　　　− ■バシトラシン感受性　　十 ■糖分解性 グルコース　　＋ マルトース　　士 ラクトース　　± サッカロース　　＋ ソルビトール　　＋ サリシン　　＋ グリセリン　　− マンニット　　− トレハロース　　− （＋陽性　　士擬陽性　　−陰性　） 本発明に係るストレプトコッカス・ズーエピデミカス１
０３５を培養する培地は、炭素源、無機塩およびその他
に必要に応じて有機微量栄養素を含有するものが好まし
い。炭素源としてはたとえば有機酸、脂肪族アルコール
などいろいろあるが、本発明では澱粉加水分解物、グル
コース、蔗糖ガラクトース、フラクトースなどの糖分を
含むものであることが好ましい。窒素源としては硫安、
硝酸ナトリウム、リン酸第ニアンモニウム、肉エキス、
ペプトン、各種アミノ酸混合物、酵母エキスなどの一般
的な材料が用いられる。さらに、これらに加えて、塩化
ナトリウム、あるいはマグネシウム、カリウム、鉄、カ
ルシウムなどのリン酸塩、硫酸塩および炭酸塩、もしく
はビタミンなどが添加され得る。

糖分の添加は、一度に多量添加するよりも、少量に分け
て適時添加するほうがヒアルロン酸の収量が増大する。

培養は、好気的条件が好ましく、たとえば振盪培養法ま
たは通気攪拌培養法を用いて３０〜３７℃の培養温度下
で行うのが一般的である。

さらに培養時に、アルカリ水溶液にてｐＨを５．５〜９
．０に調整するとヒアルロン酸が安定に大量に生産でき
好ましい。アルカリ水溶液としては水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、塩基性アミノ酸、低級アミンなどの通
常用いられるアルカリの一種又は二種以上が使用できる
。

培養後、培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を分離、精
製するにあたっては、従来から公知の多糖類の分離、精
製方法が用いられるが、培地を酸性にしてから処理する
ほうがヒアルロン酸の純度があがって好ましい。

ヒアルロン酸の分離、精製方法の一例を記す。

まず、培養液中の菌体やその他の不溶成分を濾過または
遠心分離などにより分離除去する。次いで、溶液中に混
在する蛋白質をトリクロル酢酸またはクロロホルム−イ
ソアミルアルコール混液により、あるいは活性白土、活
性炭などの吸着剤により、あるいはまたペプシン、パパ
インまたはプロナーゼなどの蛋白質分解酵素などにより
除去、混在する低分子物質を限外濾過、透析または有機
溶媒沈澱法により、あるいはカチオン界面活性剤または
イオン交換樹脂を用いる吸着法などで除去した後、凍結
乾燥、噴霧乾燥または有機溶媒沈澱法などの手法を用い
てヒアルロン酸を得る（後述実施例１参照）。

実験例１ モルモットの眼粘膜から分離したストレプトコッカス・
ズーエピデミカスをプレインハートインツユジョン培地
（栄研製）、３７℃で培養し、対数増殖期の菌体を集め
て低温で遠心を繰り返しつつＭ／２０リン酸緩衝波緩衝
液て無菌的に２回洗浄後、ＮＴＧ１００〜５００Ｐｇ／
−を含むＭ／２０リン酸緩衝波緩衝液中℃にて２０分間
振盪した後、氷冷した。

ついで、Ｍ／２０リン酸緩衝波緩衝液て低温で菌体を２
回洗浄した後、プレインハートインツユジョン培地に接
種して３７℃にて２４時間培養し、プレインハートイン
フェジッン寒天（栄研製）培地上に塗布してヒアルロン
酸高生産変異株を取得した（微工研菌寄第８１５７号）
。

［実施例〕 実施例１ グルコース４％、酵母エキス（オリエンタル酵母株式会
社製）０．５％、ペプトン（大五栄養化学株式会社製）
１．０％、アデカノールＬＧ−８０５（旭電化株式会社
製＞　　ｏ、ｏｏｓ％の組成の培地を３０１のジャーフ
ァーメンタ−に１０１分注し、殺菌後、前培養したスト
レプトコッカス・ズーエピデミカス１０３５を接種し、
水酸化ナトリウムにてｐＨを７．０にコツトロールして
３５℃で２日間通気攪拌培養した。

なお、グルコースは培地とは別に滅菌して添加している
。

培養の時間が経過するとともにヒアルロン酸が生成し、
培養液が粘稠性を帯びてくるので、はぼ最高粘度に達し
た時点（１日〜２日後）で培養を終了した。

培養液を遠心分離にかけて不溶成分を分離除去し、クロ
ロホルム−イソアミルアルコール混液により除去、限外
濾過法で低分子物質を除去した後、凍結乾燥法を用いて
培養液１１より　５．５ｇのヒアルロン酸を得た。

実施例１と同様の培養を３回くり返して行ったが、ヒア
ルロン酸の生産量は常に安定していた。

また、得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタノール、
エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテルなどの
有機溶媒には不溶、無味、無臭の白色繊維状物質であり
、赤外線吸収スペクトル、電気泳動分析、ろ低電気泳動
分析および真菌性ヒアルロニダーゼによる分解実験によ
リヒアルロン酸であることが確認できた。

比較例１ 突然変異処理する以前のストレプトコッカス・ズーエピ
デミカスの培養を実施例１と同様にして３回くり返した
が、得られたヒアルロン酸は、それぞれ１．０ｇ、　　
３．４ｇ、　　２．８ｇであり、生産量は実施例１と比
較して低く、また、ばらついていた。

［効果］ 本発明方法によれば、ヒアルロン酸を高収率でしかも生
産量にばらつきなく安定的に生産することができる。

本発明方法によって製造されるヒアルロン酸は、皮膚に
使用される外用医薬品や化粧品に配合するものとして最
適である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトコッカス・ズーエピデミカス１０３５
   （微工研菌寄第８１５７号）を培養し、培養物からヒア
   ルロン酸を採取することを特徴とする醗酵法によるヒア
   ルロン酸の製造方法。