JPH0823992A - Production of hyaluronic acid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce a large amount of hyaluronic acid having high molecular weight in high efficiency at a low cost while preventing the intrusion of hemolytic streptolysin S and O by culturing a specific hyaluronic acid-producing bacterial strain and separating the acid from the cultured liquid. CONSTITUTION:A bacterial strain capable of producing hyaluronic acid, free from productivity of chondroitinase, exhibiting anhemolytic property and belonging to the genus Streptococcus [preferably Streptococcus equi NC93O627 (FERM P-14341)] is cultured in a medium and hyaluronic acid produced and accumulated in the cultured liquid is separated from the liquid by conventional method. The culture of Streptococcus equi NC93O627 is preferably carried out at 30-35 deg.C and pH 7-7.5 using glucose as the carbon source. The Streptococcus equi NC930627 can be produced e.g. by mutating Streptococcus equi ATCC 9527 and mutating again the produced strain free from chondroitinase productivity.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ヒアルロン酸の製造方
法に関する。より詳細には、ヒアルロン酸生産能を有
し、コンドロイチナーゼ非生産性でかつ非溶血性を示す
ストレプトコッカス属に属する細菌を培地に培養して、
溶血素を含まずかつ高分子量のヒアルロン酸を効率よく
製造する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing hyaluronic acid. More specifically, having a hyaluronic acid-producing ability, culturing bacteria belonging to the genus Streptococcus showing chondroitinase non-producing and non-hemolytic properties in a medium,
The present invention relates to a method for efficiently producing high molecular weight hyaluronic acid free of hemolysin.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ヒアルロン酸は生体のあらゆる組織に存
在するムコ多糖である。ヒアルロン酸は生体中で単独あ
るいはタンパク質や、他のムコ多糖類と結合して複合体
を形成し、生体の水の保持、組織構造の維持、潤滑作
用、細菌侵入の防御などの働きをしている。このような
機能を利用してヒアルロン酸は医薬品（眼薬、関節炎治
療薬、創傷治癒剤等）、化粧品等に使用されている。工
業的には、鶏の鶏冠やサイ帯等の生体組織から抽出法に
よって得られている。近年、細菌を培養して、その培養
液からヒアルロン酸を得る方法も見られるようになって
いる。Hyaluronic acid is a mucopolysaccharide present in all tissues of the living body. Hyaluronic acid alone or in the living body forms a complex by binding with proteins or other mucopolysaccharides, and acts as a retention of water in the living body, maintenance of tissue structure, lubrication, defense against bacterial invasion, etc. There is. Utilizing such a function, hyaluronic acid is used for medicines (eye drops, arthritis therapeutic agents, wound healing agents, etc.), cosmetics and the like. Industrially, it is obtained from living tissue such as chicken crowns and rhinoceros by an extraction method. In recent years, a method of culturing bacteria and obtaining hyaluronic acid from the culture medium has also been found.

【０００３】しかしながら生体組織からの抽出によるヒ
アルロン酸の製造は、タンパク質、コンドロイチン硫酸
等の夾雑物が大量に存在するため、分離精製が大変煩雑
で、大量生産に不向きであった。そのため、得られたヒ
アルロン酸はきわめて高価なものとなり、ヒアルロン酸
の機能を十分に利用することができない状態である。However, in the production of hyaluronic acid by extraction from living tissues, a large amount of contaminants such as proteins and chondroitin sulfate exist, so separation and purification are very complicated and unsuitable for mass production. Therefore, the obtained hyaluronic acid is extremely expensive, and the function of hyaluronic acid cannot be fully utilized.

【０００４】微生物によるヒアルロン酸の生産について
は、ストレプトコッカス属細菌のうちで、ランスフィー
ルド(Lansfield) 血清群のＡ、Ｃ及びＤ型菌、例えば、
ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocossus pyoge
nes) 、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Strept
ocossus zooepidemicus) 、ストレプトコッカス・エク
イ(Streptocossus equi)、ストレプトコッカス・エクイ
シミリス(Streptocossus equisimils)、ストレプトコッ
カス・ディスガラクティエ(Streptocossus dysgalactia
e)、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida)
等が知られているが、S. pyogenesと、Pasteurella は
ヒトに対する病原菌であるため、ヒアルロン酸の生産に
は不向きである。工業的にはストレプトコッカス属の細
菌を培養して、その培養液からヒアルロン酸を抽出・精
製する方法が、特開昭６３−１４１５９４号等に開示さ
れている。しかしながら、これらの方法は得られるヒア
ルロン酸が低分子量であったり、収率が低いなどの問題
が存在する。Regarding the production of hyaluronic acid by microorganisms, among the bacteria of the genus Streptococcus, A, C and D type bacteria of the Lansfield serogroup, for example,
Streptocossus pyoge
nes), Streptococcus zooepidemicus (Strept
ocossus zooepidemicus), Streptococcus equi (Streptocossus equi), Streptococcus equisimils, Streptocossus dysgalactia
e), Pasteurella multocida
Although S. pyogenes and Pasteurella are pathogenic bacteria to humans, they are not suitable for the production of hyaluronic acid. Industrially, a method of culturing a bacterium of the genus Streptococcus and extracting and purifying hyaluronic acid from the culture solution is disclosed in JP-A-63-141594. However, these methods have problems that the obtained hyaluronic acid has a low molecular weight and the yield is low.

【０００５】一方、細菌のコンドロイチナーゼはヒアル
ロニダーゼ活性を有するエンド−β−ヘキソサミニドエ
リミナーゼであることが知られており [科学と工業 4
9, 11(1975)]、本発明者らはこの知見に着目し、ヒアル
ロン酸を生産するストレプトコッカス属に属する菌株を
コンドロイチナーゼ非生産性とすることにより、高分子
量のヒアルロン酸を生産すると考えた。On the other hand, bacterial chondroitinase is known to be an endo-β-hexosaminide eliminase having hyaluronidase activity [Science and Industry 4
9, 11 (1975)], the present inventors focused on this finding, and thought that a strain belonging to the genus Streptococcus that produces hyaluronic acid produces high molecular weight hyaluronic acid by making it a chondroitinase-non-producing strain. It was

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒア
ルロン酸を生産するストレプトコッカス属に属する菌株
のコンドロイチナーゼ非生産性株を得、これによって高
分子量のヒアルロン酸を大量に効率良く得ることのでき
る製造方法を提供することである。An object of the present invention is to obtain a chondroitinase-non-producing strain of a strain belonging to the genus Streptococcus that produces hyaluronic acid, and thereby efficiently obtain a large amount of high molecular weight hyaluronic acid. It is to provide a manufacturing method capable of

【０００７】[0007]

【課題を達成するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ストレプトコッカ
ス・エクイＡＴＣＣ９５２７株（Streptococcus equi A
TCC9527)から変異処理によって得たコンドロイチナーゼ
非生産株を、再度変異処理することにより、溶血性を欠
如し、高分子ヒアルロン酸の生産性が極めて高い菌株、
ストレプトコッカス・エクイＮＣ９３０６２７（Strept
ococcus equi NC930627)を得、該菌株を培養することに
より、高分子量のヒアルロン酸が製造できることを見い
だし、本発明を完成した。As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that Streptococcus equi ATCC9527 strain (Streptococcus equi A
The chondroitinase non-producing strain obtained by mutation treatment from (TCC9527) is subjected to mutation treatment again, lacking hemolytic activity, and a strain with extremely high productivity of high molecular hyaluronic acid,
Streptococcus equi NC930627 (Strept
ococcus equi NC930627) was obtained and it was found that high molecular weight hyaluronic acid can be produced by culturing the strain, and the present invention was completed.

【０００８】即ち、本発明は、ヒアルロン酸生産能を有
し、コンドロイチナーゼ非生産性でかつ非溶血性を示す
ストレプトコッカス属に属する細菌を培地に培養して、
培養液中にヒアルロン酸を生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法である。That is, according to the present invention, a bacterium belonging to the genus Streptococcus, which has a hyaluronic acid-producing ability, is non-chondroitinase-producing and non-hemolytic, is cultured in a medium,
A method for producing hyaluronic acid, which comprises collecting and collecting hyaluronic acid in a culture solution.

【０００９】以下、本発明を詳しく説明する。The present invention will be described in detail below.

【００１０】（１）変異株の取得 本発明にいうコンドロイチナーゼ非生産性変異株は、ヒ
アルロン酸を生産するストレプトコッカス属に属する菌
株、例えばストレプトコッカス・エクイＡＴＣＣ９５２
７株を紫外線や化学薬品（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニオロソグアニジン（ＮＴＧ）、メチルメタンスル
ホン酸等で変異処理し、この処理菌体をＧＹＰ寒天培地
（グルコース２％、酵母エキス１％、ポリペプトン１
％、リン酸一カリウム０．２％、寒天１．５％、ｐＨ
６．３）に植菌・培養後、生育の良い菌株をさらにコン
ドロイチン硫酸寒天培地（酵母エキス０．２％、ポリペ
プトン０．２％、炭素源としてコンドロイチン硫酸０．
４％、リン酸一カリウム０．１％）に植菌し、生育して
いない菌株として得ることができる。(1) Acquisition of mutant strain The chondroitinase non-producing mutant strain referred to in the present invention is a strain belonging to the genus Streptococcus that produces hyaluronic acid, for example, Streptococcus equi ATCC952.
7 strains were exposed to UV light and chemicals (N-methyl-N'-nitro-
Mutagenized with N-niorosoguanidine (NTG), methylmethanesulfonic acid, etc., and the treated cells were used for GYP agar medium (glucose 2%, yeast extract 1%, polypeptone 1).
%, Monopotassium phosphate 0.2%, agar 1.5%, pH
After inoculating and culturing in 6.3), a strain with good growth was further added to chondroitin sulfate agar medium (yeast extract 0.2%, polypeptone 0.2%, chondroitin sulfate 0.
4%, 0.1% monopotassium phosphate) to obtain a non-growing strain.

【００１１】次に、この菌株を再び常法により変異処理
し、処理菌体をウマ脱繊維素血液寒天培地に植菌・培養
し、非溶血性（ストレプトリシン−ｓ欠落）の変異株を
取得する。本菌株は血液寒天培地に穿刺培養しても溶血
環を生じないことより溶血素の一つであるストレプトリ
シン−ｏの生産能も欠落していると考えられ、より安全
な非溶血性株であると言える。Next, this strain was subjected to mutation treatment again by a conventional method, and the treated bacterial cells were inoculated and cultured in equine defibrinated blood agar medium to obtain a non-hemolytic (streptricin-s deficient) mutant strain. To do. This strain is considered to lack the ability to produce streptolysin-o, which is one of the hemolysins, because it does not produce a hemolytic ring even when it is cultivated on blood agar medium, and it is a safer non-hemolytic strain. It can be said that there is.

【００１２】（２）菌学的性質 （１）で得られたストレプトコッカス・エクイの変異株
（以下、本菌という）は、ブレイン・ハート・インフュ
ージョン寒天培地上で極めて強い粘性を有する透明な集
落を形成し、非溶血性（β−溶血性：陰性）、コンドロ
イチナーゼ非生産性、ランスフィールド血清群Ｃ型に属
する連鎖状球菌である。本菌の菌学的性質は下記の通り
である。(2) Bacteriological Properties The mutant strain of Streptococcus equi obtained in (1) (hereinafter referred to as the present bacterium) is a transparent colony having extremely strong viscosity on Brain Heart Infusion agar medium. , Which is non-hemolytic (β-hemolytic: negative), does not produce chondroitinase, and belongs to the Lancefield serogroup C. The mycological properties of this bacterium are as follows.

【００１３】 （ａ）グラム染色性：陽性 （ｂ）１０℃増殖性：陰性 （ｃ）４５℃増殖性：陰性 （ｄ）０．１％メチレンブルー抵抗性：陰性 （ｅ）６．５％食塩抵抗性：陰性 （ｆ）４０％胆汁酸抵抗性：陰性 （ｇ）バシトラシン抵抗性：陰性 （ｈ）ｐＨ９．６抵抗性：陰性 （ｉ）６０℃、３０分抵抗性：陰性 （ｊ）ゼラチン分解性：陰性 （ｋ）でんぷん分解性：陽性 （ｌ）エスクリン分解性：陰性 （ｍ）糖発酵性：グルコース（＋）、ガラクトース
（−）、シュクロース（＋）、ラクトース（−）、マル
トース（＋）、ソルビトール（−）、サリシン（＋）、
グリセリン（−）、マンニトール（−）、トレハロース
（−） （ｎ）ビタミン要求性：ビタミンＢ₁ （＋）、リボフラ
ビン（＋）、パントテン酸カルシウム（−）、ピリドキ
シン塩酸塩（＋）、ニコチン酸（＋）、ｐ−アミノ安息
香酸（＋）、葉酸（−）、ビオチン（−）、ビタミンＢ
₁₂（−） （ｏ）アミノ酸要求性：ＤＬ−アラニン（−）、Ｌ−ア
ルギニン（−）、ＤＬ−アスパラギン酸（＋）、Ｌ−シ
ステイン（−）、Ｌ−グルタミン酸（−）、グリシン
（＋）、Ｌ−ヒスチジン（＋）、ＤＬ−イソロイシン
（＋）、ＤＬ−ロイシン（＋）、Ｌ−リジン塩酸塩
（−）、ＤＬ−メチオニン（＋）、ＤＬ−フェニルアラ
ニン（−）、Ｌ−プロリン（＋）、ＤＬ−セリン
（−）、ＤＬ−スレオニン（＋）、ＤＬ−トリプトファ
ン（＋）、Ｌ−チロシン（−）、ＤＬ−バリン（＋） 本菌は平成６年５月２７日付けで工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭＰ−１４３４１として寄託されて
いる。(A) Gram stainability: positive (b) 10 ° C growth: negative (c) 45 ° C growth: negative (d) 0.1% methylene blue resistance: negative (e) 6.5% salt resistance Sex: Negative (f) 40% Bile acid resistance: Negative (g) Bacitracin resistance: Negative (h) pH 9.6 Resistance: Negative (i) 60 ° C, 30 minutes Resistance: Negative (j) Gelatin degrading : Negative (k) Starch degradability: Positive (l) Esculin degradability: Negative (m) Sugar fermentability: Glucose (+), Galactose (-), Sucrose (+), Lactose (-), Maltose (+) , Sorbitol (-), salicin (+),
Glycerin (-), mannitol (-), trehalose (-) (n) Vitamin requirement: vitamin B ₁ (+), riboflavin (+), calcium pantothenate (-), pyridoxine hydrochloride (+), nicotinic acid ( +), P-aminobenzoic acid (+), folic acid (-), biotin (-), vitamin B
₁₂ (-) (o) Amino acid requirement: DL-alanine (-), L-arginine (-), DL-aspartic acid (+), L-cysteine (-), L-glutamic acid (-), glycine (+ ), L-histidine (+), DL-isoleucine (+), DL-leucine (+), L-lysine hydrochloride (-), DL-methionine (+), DL-phenylalanine (-), L-proline ( +), DL-serine (-), DL-threonine (+), DL-tryptophan (+), L-tyrosine (-), DL-valine (+) This strain was industrialized on May 27, 1994. Deposited as FERMP-14341 at Institute of Microbial Technology, Institute of Technology.

【００１４】（３）本菌によるヒアルロン酸の製造 本発明に用いる培地は、通常の培養に用いるものでよ
く、グルコース、フラクトース、ガラクトース、シュク
ロース等の炭素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウ
ム、硫酸マグネシウム、亜硫酸ソーダ、チオ硫酸ソー
ダ、リン酸アンモニウム等の無機塩、ポリペプトン、酵
母エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー等の有
機栄養源の他、各種アミノ酸、ビタミン類等が適宜用い
られる。これらの培地成分は一括仕込み、または分割添
加のいずれに於いてもよい。(3) Production of hyaluronic acid by the present bacterium The medium used in the present invention may be one used for ordinary culture, including carbon sources such as glucose, fructose, galactose, sucrose, monopotassium phosphate and diphosphate. In addition to inorganic salts such as potassium, magnesium sulfate, sodium sulfite, sodium thiosulfate, and ammonium phosphate, organic nutrient sources such as polypeptone, yeast extract, casamino acid, and corn steep liquor, various amino acids, vitamins and the like are appropriately used. These medium components may be added all at once or in divided additions.

【００１５】本発明の培養は、使用する菌は通性嫌気性
菌であることより、通気培養または嫌気培養のいずれで
もよく、培養温度は２５〜４０℃、好ましくは３０〜３
５℃が望ましい。In the culture of the present invention, since the bacterium used is a facultative anaerobic bacterium, either aeration culture or anaerobic culture may be used, and the culture temperature is 25 to 40 ° C., preferably 30 to 3
5 ° C is desirable.

【００１６】培養液のｐＨは菌の生育と共に低下するた
め、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等
の塩基によりｐＨ６．５〜８．５、好ましくはｐＨ７〜
７．５にコントロールする。Since the pH of the culture broth decreases with the growth of the bacterium, the pH of the culture broth is adjusted to 6.5 to 8.5, preferably 7 to 7, with a base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia.
Control to 7.5.

【００１７】本菌は高分子量のヒアルロン酸を極めて高
い収率、生産性で生産する菌株であるが、炭素源として
特にグルコースを用いると良い結果が得られる。糖の添
加量が１％では対糖収率１７％であるが、添加量を増す
に従い対糖収率は減少する。糖の添加を６％以上にする
と、培養液の粘性は３５℃で８０００センチポイズ（ｃ
ｐ）となり、培養液は流動性がなく、攪拌数を増しても
効果はない。培養は、使用している炭素源が培養液中で
完全に消費される時点まで行う。The present bacterium is a strain which produces high molecular weight hyaluronic acid with an extremely high yield and productivity, and particularly when glucose is used as a carbon source, good results can be obtained. When the amount of sugar added is 1%, the yield of sugar is 17%, but the yield of sugar decreases as the amount of sugar added increases. When the addition of sugar is 6% or more, the viscosity of the culture solution is 8,000 centipoise (c) at 35 ° C.
p), the culture fluid is not fluid, and increasing the stirring number has no effect. Culturing is carried out until the carbon source used is completely consumed in the culture solution.

【００１８】培養液中に蓄積されたヒアルロン酸の分
離、精製は容易で、既に公知の分離法を用いればよい。
すなわち、培養終了後、ヒアルロン酸濃度が０．５〜
１．０ｇ／Ｌになるように培養液を希釈し、トリクロロ
酢酸、塩酸、または硫酸等の酸でｐＨを酸性に調整す
る。本操作中に、夾雑する蛋白質と低分子量のヒアルロ
ン酸がムチンクロットと呼ばれる複合体を形成して析出
するので、例えば遠心分離、あるいは精密濾過や活性炭
あるいはセライトを濾過助材とする濾過等による除菌お
よび除蛋白質が可能となり、以後の精製操作を容易なら
しめる。Hyaluronic acid accumulated in the culture medium can be easily separated and purified, and a known separation method may be used.
That is, the hyaluronic acid concentration is 0.5 to
The culture solution is diluted to 1.0 g / L, and the pH is adjusted to acidic with an acid such as trichloroacetic acid, hydrochloric acid, or sulfuric acid. During this operation, contaminating proteins and low-molecular-weight hyaluronic acid form and form a complex called mucin clot, which precipitates.For example, centrifugation or microfiltration or filtration using activated carbon or Celite as a filter aid, etc. Bacteria and deproteinization become possible, facilitating subsequent purification operations.

【００１９】除菌・除蛋白後、透析処理による低分子化
合物の除去、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去を
行った後、ヒアルロン酸含有液にアルコール、アセト
ン、ジオキサンなどの水溶性有機溶媒を添加してヒアル
ロン酸を得るか、あるい凍結乾燥、スプレードライ等で
直接ヒアルロン酸を得る。After sterilization / protein removal, low-molecular compounds are removed by dialysis, and water-insoluble fine particles are removed by microfiltration, and then a hyaluronic acid-containing liquid is treated with a water-soluble organic solvent such as alcohol, acetone, or dioxane. Add hyaluronic acid to obtain hyaluronic acid, or obtain it directly by freeze-drying or spray-drying.

【００２０】このようにして上記培養液から抽出精製し
て得たヒアルロン酸について標品と対比しながら検討し
た結果、得られたものがヒアルロン酸であることを確認
できる。以下にその性質を示す。As a result of examining the hyaluronic acid obtained by extracting and purifying from the above-mentioned culture medium in comparison with the standard product, it can be confirmed that the obtained product is hyaluronic acid. The properties are shown below.

【００２１】（１）酢酸セルロース膜を用いる電気泳動
において標品と同じ位置にバンドを有する。 （２）放線菌ヒアルロニダーゼによって分解される。 （３）Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンがモル比１：１で存在する。 （４）薄膜法による赤外吸収スペクトルは標品と同じで
ある。 （５）極限粘度法による分子量測定（T.C.Laurent et a
l., Biochim. Biophys.Acta, 42, 476-485, 1960)の結
果、１５０万である。(1) Electrophoresis using a cellulose acetate membrane has a band at the same position as the standard. (2) Degraded by actinomycete hyaluronidase. (3) D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine are present in a molar ratio of 1: 1. (4) The infrared absorption spectrum by the thin film method is the same as that of the standard product. (5) Measurement of molecular weight by limiting viscosity method (TCLaurent et a
l., Biochim. Biophys. Acta, 42, 476-485, 1960), resulting in 1.5 million.

【００２２】[0022]

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.

【００２３】〔実施例１〕 （ｉ）変異株の取得 ストレプトコッカス・エクイＡＴＣＣ９５２７株をＧＹ
Ｐ培地中、３０℃で１０時間培養し、対数増殖期の菌体
を遠心分離によって集菌し、５℃で０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．５）を用いて無菌的に洗浄した後、１×
１０⁸ 個／ｍｌの菌濃度になるように同緩衝液に懸濁
し、これにＮＴＧを２００μｇ／ｍｌとなるように添加
し、３０℃にて３０分間振とうした。処理後速やかに遠
心分離機にて集菌し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）で２回洗浄した後、ＧＹＰ培地に植菌して３７
℃、２時間培養し、培養液を希釈後、ＧＹＰ寒天培地に
再度植菌した。３０℃、７２時間培養後、増殖の活発な
コロニーから釣菌し、コンドロイチンを炭素源とする寒
天培地上に再度植菌・同条件で培養し、生育してこない
菌株をコンドロイチナーゼ非生産株として取得した。な
お、上記コンドロイチナーゼ生産・非生産菌の識別法
は、本発明者らの考案によるものである。[Example 1] (i) Acquisition of mutant strain Streptococcus equi ATCC9527 strain was GY
After culturing in P medium at 30 ° C. for 10 hours, cells in the logarithmic growth phase were collected by centrifugation and washed aseptically at 5 ° C. with 0.05 M phosphate buffer (pH 6.5). 1x
The cells were suspended in the same buffer solution so that the bacterial concentration was 10 ⁸ cells / ml, and NTG was added thereto at 200 μg / ml, and the mixture was shaken at 30 ° C. for 30 minutes. Immediately after the treatment, the cells were collected in a centrifuge, and 0.05M phosphate buffer (pH
After washing twice with 6.5), the cells were inoculated in a GYP medium and 37
After culturing at 2 ° C. for 2 hours and diluting the culture solution, the cells were inoculated again on GYP agar medium. After culturing at 30 ° C for 72 hours, bacteria are picked up from actively growing colonies, inoculated again on an agar medium containing chondroitin as a carbon source, and cultivated under the same conditions, and a strain that does not grow is a chondroitinase non-producing strain. Acquired as. The method of identifying the above-mentioned chondroitinase-producing / non-producing bacteria is devised by the present inventors.

【００２４】得られた菌株はβ−溶血性（溶血素：スト
レプトリシン−ｓ）を示していたので、再度上記と同様
に変異処理を行った。処理後、ウマ脱繊維素血液寒天培
地上に植菌・培養し、溶血性を示されない菌株を取得し
た（ストレプトコッカス・エクイＮＣ９３０６２７，Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４３４１）。Since the obtained strain exhibited β-hemolytic property (hemolysin: streptolysin-s), it was subjected to mutation treatment again in the same manner as above. After the treatment, the cells were inoculated / cultured on a horse defibrinated blood agar medium to obtain a strain that did not show hemolytic activity (Streptococcus equi NC930627, F).
ERM P-14341).

【００２５】（ii) 変異株によるヒアルロン酸の製造 グルコース２％、ポリペプトン１．５％、酵母エキス
０．５％、リン酸一カリウム０．２％、硫酸マグネシウ
ム七水塩０．０５％、アデカノールＬＧ−１０９（消泡
剤；旭電化工業製）０．００５％の組成の培地（ｐＨ
７．０）３Ｌを５Ｌ容のジャファーメンターに入れ、滅
菌後、前培養したストレプトコッカス・エクイＮＣ９３
０６２７を１％接種し、６Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液
で培養ｐＨ７に常時コントロールしながら３０℃で４８
時間通気（１ｖｖｍ）攪拌培養した。(Ii) Production of hyaluronic acid by the mutant strain Glucose 2%, polypeptone 1.5%, yeast extract 0.5%, monopotassium phosphate 0.2%, magnesium sulfate heptahydrate 0.05%, adecanol LG-109 (antifoaming agent; manufactured by Asahi Denka Kogyo) 0.005% composition medium (pH
7.0) 3 L was placed in a 5 L Jafermenter, sterilized and pre-cultured Streptococcus equi NC93
0627 was inoculated with 1% and the culture pH was kept constant at 7 with an aqueous 6N-sodium hydroxide solution at 48 at 30 ° C.
The cells were agitated for aeration (1 vvm) for a period of time.

【００２６】グルコースは別に滅菌しておき、培養開始
時に添加するか、培養途中においても、グルコースの残
存量を測定しながら適時添加していき、トータルで６％
を添加した。培養の経過と共にヒアルロン酸が蓄積し、
培養３２時間で培養液の粘性は８０００センチポイズに
達し、攪拌が効かなくなった。培養４８時間後、グルコ
ースが完全に消費されたので培養を終了した。Glucose is sterilized separately and then added at the start of the culture, or even during the culture, the glucose is added at an appropriate time while measuring the remaining amount of glucose.
Was added. Hyaluronic acid accumulates with the progress of culture,
After 32 hours of culturing, the viscosity of the culture reached 8,000 centipoise, and stirring was no longer effective. After 48 hours of culturing, glucose was completely consumed, so the culturing was terminated.

【００２７】ブロスアウトした培養液は高粘度のため水
で１００センチポイズ以下になるように希釈し、トリク
ロロ酢酸でｐＨ４以下に調整した。析出してきたムチン
クロット及びその他の夾雑物を菌体と共にマイクロフィ
ルターモジュール（ＰＷ−１０３旭化成製）で除去し、
更に限外濾過モジュールに通して低分子物質を除去し
た。その後エタノールを添加し、沈殿してきた固形物を
減圧乾燥して３０ｇ（培養液１Ｌ当たり６ｇ）のヒアル
ロン酸を得た。得られたヒアルロン酸は電気泳動におい
て標品と同じ位置にバンドを有し、かつ、赤外線吸収ス
ペクトル、ストレプトミセスのヒアルロニダーゼによる
分解、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンが、モル比で１：１で存在すること等でヒアルロ
ン酸であることが確認された。なお、極限根度法による
分子量測定の結果、１５０万であった。The brothed-out culture broth had a high viscosity, so it was diluted with water to 100 centipoise or less and adjusted to pH 4 or less with trichloroacetic acid. The precipitated mucin clot and other contaminants are removed together with the bacterial cells with a microfilter module (PW-103 Asahi Kasei),
Further, low molecular weight substances were removed by passing through an ultrafiltration module. After that, ethanol was added, and the precipitated solid matter was dried under reduced pressure to obtain 30 g (6 g per 1 L of culture solution) of hyaluronic acid. The obtained hyaluronic acid has a band at the same position as the standard in electrophoresis, and has an infrared absorption spectrum, decomposition of Streptomyces by hyaluronidase, and D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine in a molar ratio. It was confirmed to be hyaluronic acid by virtue of its presence at 1: 1. The molecular weight was 1.5 million as a result of molecular weight measurement by the extreme root degree method.

【発明の効果】本発明によるストレプトコッカス・エク
イ変異株を培養することにより、これまで報告されてい
るストレプトコッカス属細菌を用いたヒアルロン酸の製
造法における収率、収量を上回り、さらに高分子量で、
かつ溶血素として知られているストレプトリシン−ｓお
よびストレプトリシン−ｏの混入のないヒアルロン酸を
安価に得ることができる。このようにして得られたヒア
ルロン酸は化粧品、医薬品原料として使用できる。EFFECT OF THE INVENTION By culturing the Streptococcus equi mutant strain according to the present invention, the yield and yield in the method for producing hyaluronic acid using Streptococcus spp.
In addition, hyaluronic acid, which is known as hemolysin and is free from streptolysin-s and streptolysin-o, can be obtained at low cost. The hyaluronic acid thus obtained can be used as a raw material for cosmetics and pharmaceuticals.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 畠中 芳郎 大阪市東淀川区相川２−11−14 (72)発明者 酒匂 正幸 大阪市西淀川区福町１−８−７ 日精化学 工業株式会社内 (72)発明者 岡部 征七 大阪市西淀川区福町１−８−７ 日精化学 工業株式会社内 (72)発明者 秋風 裕 大阪市西淀川区福町１−８−７ 日精化学 工業株式会社内 (72)発明者 矢田 智昭 大阪市西淀川区福町１−８−７ 日精化学 工業株式会社内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Yoshiro Hatanaka 2-11-14 Aikawa, Higashiyodogawa-ku, Osaka City (72) Inventor Masayuki Sakai 1-8-7 Fukumachi, Nishiyodogawa-ku, Osaka City Nissei Chemical Industry Co., Ltd. (72 ) Inventor Seichika Okabe 1-8-7 Fukumachi, Nishiyodogawa-ku, Osaka City Nissei Chemical Industry Co., Ltd. (72) Inventor Hiroshi Akikaze 1-8-7 Fukumachi, Nishiyodogawa-ku, Osaka City Nissei Chemical Industry Co., Ltd. (72) Inventor Tomoaki Yada 1-8-7 Fukumachi, Nishiyodogawa-ku, Osaka City Nissei Chemical Industry Co., Ltd.

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒアルロン酸生産能を有し、コンドロイ
チナーゼ非生産性でかつ非溶血性を示すストレプトコッ
カス属に属する細菌を培地に培養して、培養液中にヒア
ルロン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするヒアルロン酸の製造法。1. A bacterium belonging to the genus Streptococcus, which has a hyaluronic acid-producing ability, is non-chondroitinase-producing and is non-hemolytic, is cultivated in a medium to produce and accumulate hyaluronic acid in the culture solution. A method for producing hyaluronic acid, which comprises collecting 【請求項２】 ストレプトコッカス属に属する細菌がス
トレプトコッカス・・エクイである特許請求の範囲第１
項記載のヒアルロン酸の製造方法。2. The method according to claim 1, wherein the bacterium belonging to the genus Streptococcus is Streptococcus equi.
The method for producing hyaluronic acid according to the item. 【請求項３】 ストレプトコッカス属に属する細菌がス
トレプトコッカス・エクイＮＣ９３０６２７である特許
請求の範囲第１項もしくは第２項記載のヒアルロン酸の
製造方法。3. The method for producing hyaluronic acid according to claim 1 or 2, wherein the bacterium belonging to the genus Streptococcus is Streptococcus equi NC930627. 【請求項４】 ヒアルロン酸生産能を有し、コンドロイ
チナーゼ非生産性でかつ非溶血性を示すストレプトコッ
カス属に属する変異株。4. A mutant strain belonging to the genus Streptococcus having hyaluronic acid-producing ability, non-chondroitinase-producing and non-hemolytic property. 【請求項５】 ストレプトコッカス属に属する変異株
が、ストレプトコッカス・エクイＮＣ９３０６２７であ
る請求項４記載の変異株。5. The mutant strain according to claim 4, wherein the mutant strain belonging to the genus Streptococcus is Streptococcus equi NC930627.