JPS6120274B2

JPS6120274B2 -

Info

Publication number: JPS6120274B2
Application number: JP11599078A
Authority: JP
Inventors: Kenkichi Takagi; Minoru Masuda; Akinori Naito
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1978-09-22
Filing date: 1978-09-22
Publication date: 1986-05-21
Also published as: JPS5542550A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物酵素の作用を利用したα−ケト
酸の製造法に関する。必須アミノ酸に対応するα−ケト酸は***な
どの腎臓の機能障害に対して有用な医薬品であ
る。本発明者らはα−ケト酸の製造法について種々
検討した結果、一般式〔式中、Ｒは−CH₂R₁又は

【式】（ここで R₁は−Ｈ、−OH、−COOH、−CH₂COOH、

【式】

【式】−CH₂SCH₃、− CH₂CH₂CH₂NH₂、

【式】

【式】であり、R₂ は−CH₃、C₂H₅である）を示す。〕で表わされるα−アミノ酸のＤ−体又はその塩に
ドリゴノプシス属に属する微生物の培養物、菌体
もしくはそれらの処理物を必要に応じカタラーゼ
の存在下に作用させることにより、上記アミノ酸
が対応するα−ケト酸になること、又、上記アミ
ノ酸のラセミ体にトリゴノプシス属に属する微生
物の培養物、菌体もしくはそれらの処理物及びα
−アミノ酸のＬ−体又はその塩をα−ケト酸に変
換せしめる能力を有する微生物の培養物、菌体も
しくはそれらの処理物を必要に応じ、カタラーゼ
の存在下に作用させることにより、対応するα−
ケト酸になることを見出し本発明を完成した。本発明で用いられる微生物としてはトリゴノプ
シス属に属し、上記アミノ酸を対応するα−ケト
酸にする能力を有するものであれば何れも用いう
るが、好適なものとしてはトリゴノプシス・バリ
アビリス（Trigonopusis variabilis）IFO・755
がある。本発明で用いられる微生物を培養する培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物等をほどよく含有
する培地であれば天然、培地、合成培地のいずれ
でもよい。炭素源としてはグルコース、フラクトース、シ
ユークロース、マルトース、ガラクトース、リボ
ース、糖密、澱粉加水分解物などの炭水化物、ノ
ルマルパラフイン、ケロセンなどの炭化水素、メ
タノール、エタノール、グリセリン、ソルビトー
ルのアルコール類、ピルピン酸、乳酸、酢酸など
の有機酸があげられる。窒素源としては、アンモ
ニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなど
の無機窒素化合物、各種アミノ酸、尿素、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカ
ー、カゼイン、蛋白加水分解物、フイツシユミー
ルなどの窒素含有物があげられる。無機物としては燐酸−カリ、燐酸二カリ、燐酸
一ナトリウム、燐酸二ナトリウムなどの燐酸塩、
マグネシウム、マンガンなどの硫酸塩、塩酸塩が
あげられる。本発明で用いられる微生物の培養条件として
は、温度20〜40℃、PH中性付近の好気的条件下で
１〜５日間培養を行えばよい。こうして得られた培養液、それより集菌した菌
体又はそれを活性化処理したものがα−ケト酸の
生成反応に使用される。ここでいう活性化処理と
は、菌体を物理的あるいは化学的に処理して得ら
れる無細胞抽出液、それから公知の方法で精製し
た酵素、又は、菌体をそのまま活性化処理して得
られる活性化菌体を指す。活性化の方法として
は、例えば超音波処理、フレンチプレス処理、−
10℃以下で凍結次いで融解する方法、エタノー
ル、ｎ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、アセ
トンなどの有機溶剤処理、セチルトリメチルアン
モニウムブロマイド、ナトリウムデスオキシコレ
ート、ナトリウムデシルサルフエート、ソルビタ
ンモノラウレート、ジギトニン、トライトン×
100などの界面活性剤処理、高浸透圧溶液処理な
どがある。これらのうち、操作的に容易で且つ酵
素活性を充分高めうるものは、凍結融解法及びト
ルエン処理法である。本発明を実施する場合、使用菌の培養時にカタ
ラーゼも生成するので、原則としてそれを添加す
る必要はないが、カタラーゼ活性が不十分な場
合、及び菌体から分離された酵素を用いる場合な
どにはカタラーゼを添加する必要がある。なお、カタラーゼを必要とするのは生成したα
−ケト酸の酸化的脱カルボキシ化を阻止するため
である。本発明の反応は通常PH７〜９、温度28〜35℃で
３〜６時間で終了する。又、この反応は好気的条
件下で行なうのがよい。培養液又は反応液中に蓄積した目的物は、強酸
性イオン交換樹脂を用いる方法及び不溶性塩を作
り沈澱せしめる方法を組み合せて容易に、これを
抽出、精製単離することができる。又、本発明において、原料として前述のアミノ
酸のラセミ体を用いた場合には本発明のトリゴノ
プシス属に属する微生物の培養物、菌体もしくは
それらの処理物とともに公知のＬ−α−アミノ酸
をα−ケト酸にする能力を有する微生物の培養
物、菌体もしくはそれらの処理物を同時に存在さ
せて、前述の方法と同様に反応、精製、単離する
ことにより対応するα−ケト酸を得ることができ
る。この方法は原料のα−アミノ酸を光学分割す
る必要がないので工業的価値の非常に高いもので
ある。Ｌ−α−アミノ酸をα−ケト酸にする能力を有
する微生物としては例えばプロテウス・ブルガリ
スハウザー株（Proteus vulgaris Hauser）
IFO・3851、サルシナ・ルテア（Sarcina、
lutea）IFO・3030、アセトバクター・サブオキ
シダンス（Acetobacter suboxydans）IFO・
3172、ノイロスポラ・クラツサ（Neurospora
crassa）などがあげられる。次に実施例により本発明を具体的に説明する。
なお、α−ケト酸は次の方法で定量した。 0.2〜1.5μmolのケト酸を含む検液５mlに１ml
のジニトロフエニルヒドラジン試薬（500μmol
のジニトロフエニルヒドラジンを2N塩酸100mlに
溶解したもの）を加え、30℃で10分間放置し、次
に４mlの水と10mlの2.2N苛性ソーダを加え撹拌
後、420nｍで吸光度を測定する。一方、検液の
かわりに５mlの水を用いて上記と同じ操作を行な
い、ジニトロフエニルヒドラジン由来の吸光度を
測る。いま検波の吸光度をＡ、１μmolのケト酸
による吸光度をｋ、検液中のα−ケト酸のμmol
数をｘ、ジニトロフエニルヒドラジン１μmolに
よる吸光度をｄとすると、Ａ＝kx＋ｄ（5.0−
ｘ）従つてα−ケト酸のμmol数ｘはｘ＝（Ａ−5d）／（ｋ−ｄ）で表わされる。実施例１トリゴノプシス・バリアビリスIFO・755株を
接種したグルコーズ２％、硝酸カリウム0.5％、
リン酸第１カリウム0.4％、硫酸マグネシウム0.4
％、塩化カルシウム0.05％、ビオチン0.000002
％、チアミン塩酸塩0.00001％、DL−アラニン
0.3％を含む培地（殺菌前PH6.0）100mlを500ml容
三角コルベンに仕込み、27℃で48時間振盪培養し
た。一方、グルコース２％、シユークロース２
％、コーンステイープリカー１％、硝酸カリウム
0.5％、リン酸第１カリウム0.4％、硫酸マグネシ
ウム0.4％、塩化カルシウム0.05％、ビチオン
0.00002％、チアミン塩酸塩0.00001％、DL−メ
チオン0.4％（殺菌前PH6.0）からある本培養倍地
100mlを500ml容三角フラスコに仕込んで殺菌し、
これに前記前培養液１mlを接種して27℃で72時間
振盪培養した。この様にして得られた培養液を遠
心分離して集菌し、その菌に1.5mlのトルエンを
加え、30℃で30分間振盪し、次いで２mlの水を加
えて更に１時間振盪した。遠心分離して処理菌体
を回収し、20mlの0.1molピロリン酸バツフアー
（PH8.1）に懸濁し、酵素溶液とした。この酵素溶
液にＤ−ロイシンを２％の濃度になるように加え
（400mg）、30℃で３時間振盪しながら好気的に反
応させると、転換率90％（生成したα−ケト酸の
モル数／仕込んだ原料のα−アミノ酸のモル数）
でα−ケト−γ−メチル吉草酸の生成を認めた。次いで菌体を除去して反応を停止させ、反応液
を強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオンPK208
三菱化成工業（株）製）で処理して未反応のＤ−
ロイシンを吸着除去した後、活性炭（精製白鷺
、武田薬品製）で脱色後、水酸化カルシウムで
PH4.5に調整し、減圧濃縮して析出した白色結晶
を濾取した。得られた結晶の乾燥重量は260mg
（純度100％）、生成収率は81％（得られたα−ケ
ト酸のモル数／生成したα−ケト酸のモル数）で
あつた。実施例２実施例１における、Ｄ−ロイシンの代りにＤ−
アルギニン、Ｄ−リジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−
グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アラニ
ン、Ｄ−バリン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−セリ
ン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フエニルアラニン、Ｄ
−トリプトフアンを用いてそれぞれ実施例１と同
様な反応を行い、下表に示すように、おのおのに
対応するα−ケト酸を得た。

【表】オ酪酸

【表】率
フエニルアラフエニルピルビン酸 88％
ニン
トリプトフアインドールピルビン酸 90％
ン
実施例３ペプトン１％、肉エキス１％、食塩0.5％を含
む培地（殺菌前PH７）を500ml容三角コルベンに
100ml仕込み、120℃で30分間滅菌処理をした後、
プロテウス・ブルガリスHauser株（I.F.
O.3851）を接種し、30℃で24時間振盪倍養し
た。こうして得た培養液に実施例１と同様の方法
で得たトリゴノプシス・バリアビリスIFO・755
株の活性化菌体懸濁液20ml（培養液100ml相当
分）及びDL−ロイシンを終濃度が２％になるよ
うに添し（2.4ｇ）、30℃で３時間で好気的に振盪
しながら反応させると、転換率70％でα−ケト−
γ−メチル吉草酸の生成を認めた。菌体を除去して反応を停止せしめ、反応液から
実施例１と同様の方法で目的物を単離した。得ら
れた白色結晶の乾燥重量は1.5ｇ（純度100％）、
生成収率は80％であつた。実施例４実施例１と同様の方法で得たトリゴノプシス・
バリアビリスIFO・755株の活性化菌体懸濁液20
mlにＤ−ロイシンを２％の濃度になるように加え
（400mg）更に9000^uのカタラーゼを加えて、30℃
で３時間好気的に振盪しながら反応させると、転
換率95％でα−ケト−γ−メチル吉草酸を生成し
た。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式〔式中、Ｒは−CH₂R₁又は【式】（ここで R₁は−Ｈ、−OH、−COOH、−CH₂COOH、
【式】【式】−CH₂SCH₃、− CH₂CH₂CH₂NH₂、【式】【式】【式】であり、R₂は−CH₃、C₂H₅である）を示す。〕で
表わされるα−アミノ酸のＤ−体またはその塩に
トリゴノプシス属に属する微生物の培養物、菌体
もしくはそれらの処理物を必要に応じカタラーゼ
の存在下に作用させることを特徴とする一般式Ｒ−COCOOH （式中Ｒは前記と同じ意味を表わす。）で表わされるα−ケト酸の製造法。２一般式〔式中Ｒは−CH₂R₁または【式】（ここで R₁は−Ｈ、−OH、−COOH、−CH₂COOH、
【式】【式】−CH₂SCH₃、− CH₂CH₂CH₂NH₂、【式】【式】【式】であり、R₂は−CH₃、C₂H₅である。）を示す。〕
で表わされるα−アミノ酸のラセミ体又はその塩
に、トリゴノプシス属に属する微生物の培養物、
菌体もしくはそれらの処理物及びα−アミノ酸の
Ｌ−体又はその塩をα−ケト酸に変換せしめる能
力を有する微生物の培養物、菌体もしくはそれら
の処理物を必要に応じ、カタラーゼの存在下に作
用させることを特徴とする一般式Ｒ−COCOOH （式中Ｒは前記と同じ意味を表わす。）で表わされるα−ケト酸の製造法。