JPS63157990A - Ｌ−α−メチルフエニルアラニン類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ミコプラナ属に属する細菌のアミダーゼを使
用し、ＤＬ−α−メチルフェニルアラニンアミド類から
、これに対応するし一α−メチルフェニルアラニン類を
製造する方法に関するものである。

α−メチルフェニルアラニン類のし一体は、薬理作用を
有しており、その代表的な物質としてＬ−３，４−ジヒ
ドロキシ−α−メチルフェニルアラニンが知られている
。この物質は、−船名としてＬ−α−メチルドーパと称
せられ、優れた血圧降下剤である。また、その他のＬ−
α−メチルフェニルアラニン類はその原料物質である。

〔従来技術、発明が解決しようとする問題点〕従来、Ｌ
−α−メチルフェニルアラニン類の製造方法には、α−
メ・チルフェニルアラニン類のラセミ体を光学分割する
方法がある。この方法として、ジアステレオマー法およ
び直接晶析法による物理的方法ならびに微生物などを利
用する生化学的方法が検討されてきた。しかしながら、
これらのいずれの方法も収率が低いなどの理由により製
造コストが高くなり、工業的プロセスとしては満足でき
なかった。

一方、ＤＬ−α−メチルフェニルアラニンアミド類を基
質として、これに微生物が生産するアミダーゼを作用さ
せ、Ｌ−α−メチルフェニルアラニン類を得る方法が知
られている（特開昭５７−１８６４９５号公報）。しか
しながら、この方法では、用いられる微生物菌体が有す
るアミダーゼ活性が工業的生産に使用できる程高くはな
い。

〔問題を解決するだめの手段、作用〕

本発明者らは、ＤＬ−α−メチルフェニルアラニンアミ
ド類を基質として、これらを効率よくＬ−α−メチルフ
ェニルアラニン類に転換する微生物を自然界から探索し
た処、ミコプラナ属に属する細菌のうちで高いアミダー
ゼ活性を示す菌株を発見して、この発見に基づいて本発
明を完成した。

すなわち、本発明は、 一般式　Ｉ （ただし、式中Ｒ１，Ｒ２は互いに同一または異なって
、水素原子、低級アルキル基であるか、または、Ｒ１，
Ｒ２はともにアルキレン基であって、互いに結合して５
〜８員環を形成することもできる）で表されるＤＬ−α
−メチルフェニルアラニンアミド類に、ミコプラナ属に
属する細菌の菌体またはその処理物を作用させてＬ−α
−メチルフェニルアラニンアミド類を不斉加水分解して
、一般式　■ ａ− （ただし、式中１１１Ｊ２は前記の一般式　Ｉにおける
と同様である。） で表されるし一α−メチルフェニルアラニン類を得るこ
とを・特徴とするし一α−メチルフェニルアラニン類の
製造法である。

本発明における基質である前記の一般式　Ｉで表される
ＤＬ−α−メチルフェニルアラニンアミド類の代表例を
挙げるが、本発明の基質はこれに限定されるものではな
い。

エニルアラニンアミド ＝　４− 揚Ｈ２ 細菌の菌体またはその処理物によってこれらの基質を不
斉加水分解して、それぞれの基質に対応するし−α−メ
チルフェニルアラニン類が得られる。

なお、Ｌ−α−メチルドーパは、これらの基質のうち、
ＤＬ−３，４−ジヒドロキシ−α−メチルフェニルアラ
ニンアミドおよびＤＬ−３，４−メチレンジオキシ−α
−メチルフェニルアラニンアミドのそれぞれから得るこ
とがきる。

すなわち、ＤＬ−３，４−ジヒドロキシ−α−メチルフ
ェニルアラニンアミドから本発明の方法により直接り一
α−メチルドーパが得られる。また、ＤＬ−３，４−メ
チレンジオキシ−α−メチルフェニルアラニンアミドを
基質として用いた場合には、本発明により得られたＬ−
３，４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニルアラニ
ンのメチレンジオキシ結合を常法に従って−たとえば、
フェノールの存在下で塩酸のような鉱酸で処理して加水
分解することにより一容易に、＞３．４−ジヒドロキシ
−α−メチルフェニルアラニン（Ｌ−α−メチル°ドー
パ）を得ることができる。

本発明に用いられる細菌は、ミコプラナ属に属し、ＤＬ
−α−メチルフェニルアラニンアミド類を不斉加水分解
し、Ｌ−α−メチルフェニルアラニン類を生成する能力
を有する菌株であればよく、特に制限はない。現在の処
、この細菌の代表例としては、ミコプラナ　ディモルフ
ァ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａｄｉｍｏｒｐｈａ　）およびミ
コプラナ　ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａｂｕｌｌａｔａ
）がそれぞれ知られている。これらのうち、ミコプラナ
　ディモルファ　ＡＴＣＣ４２７９（−ＩＦＯ１３２９
１）　、　　ミコプラナ　ディモ）ｌ／７７　ＮＣＩＢ
　９４３９゜ミコプラナ　ディモルファ　ｒＦｏ　１３
２１３．　　ミコプラナ　プラク　ＩＦＯ１３２９０（
−ＡＴＣＣ４２７Ｂ）、　　ミーｔプラナ　ブラタＮＣ
ＩＢ　９４４０．　　ミコプラナ　ブラタ　ＩＦＯ１３
２６７およびミコプラｆ　　ｓｐ　ＩＦＯ１３２４０な
どが好ましい。

本細菌（本発明で使用される細菌　以下同様）の培養に
使用される培地は、本細菌が資化し得る炭素源を少なく
とも含有していることを要し、さらに、適量の窒素源お
よび無機塩などを含有する培地であればよく、合成培地
および天然培地のどちらでもよく、特別な培地を必要と
しない。

−’ｌ　　− 炭素源としては、本細菌が資化し得る炭素源であれば特
に制限はなく、たとえば、糖蜜、ペプトン、肉エキスお
よびコーンステイープ・リカーなどの天然物ならびにグ
ルコース、フラクトース。

シュクロース、ソルビトール５　グリセリンおよびマン
ニトールなどの糖類、エタノールおよびｎ　−プロパツ
ールなどのアルコール類、酢酸、くえん酸、こはく酸な
どの有機酸などを用いることができる。

窒素源としては、たとえば、アンモニウム塩、硝酸塩な
どの無機窒素化合物および／または、たとえば、尿素、
アミド類、コーンステイープ・リカー、カゼイン、ペプ
トン、酵母エキスなどの有機性窒素含有物質が用いられ
る。アミド類としては、たとえば、プロピオンアミド、
アセトアミド。

ブチルアミドおよびバリンアミドなどのような脂肪酸ア
ミドならびにフェニルアラニンアミドなどのようなアミ
ノ酸アミドなどがある。なお、本発明の基質であるアミ
ノ酸アミドが好ましい。また、アミド類は酵素活性の誘
導物質として作用することもある。

無機成分としては、たとえば、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、りん酸塩、マンガ
ン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩
、はう素化合物およびよう素化合物が用いられる。

培養条件は、温度２０〜４２°Ｃ１好ましくは２５〜４
゜’Ｃ，ｐｌ＋　５〜９、好ましくは６〜８である。こ
のような条件で好気的に培養を行う。これらの条件をは
ずれて培養した場合には、本細菌の生育、増殖は悪くな
るが、これらの条件をはずして培養することを妨げない
。

本発明において、ミコプラナ属に属する細菌をＤＬ−α
−メチルフェニルアラニンアミド類に作用させるには、
液体培地に微生物を培養して得られた培養液、この培養
液から分離した菌体、または培養液もしくは菌体から分
離した酵素（アミダーゼ）の粗製酵素、精製酵素、酵素
含有抽出物あるいはその濃縮物（以下菌体以外の物を　
処理物と記すこともある）などの状態で作用させる。ま
た、菌体および酵素のそれぞれを担体で固定化して使用
に供することもできる（この固定化物も以下で　処理物
　と記すこともある）。

この固定化に使用される担体としては、たとえば、アル
ギン酸、カラギーナン、コラーゲン、セルロース、アセ
チルセルロース、寒天、セロファン、コロジオンなどの
天然物、または、ポリアクリルアマイド、ポリスチレン
、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール
、ポリウレタン、ポリブタジェンなどの合成高分子物質
などのような通常使用される担体を使用することができ
る。固定化は、常法によって行われるが、アミダーゼ活
性を損なうことのない条件下で行われる。

本発明において、ＤＬ−α−メチルフェニルアラニンア
ミド類に、ミコプラナ属に属する細菌またはその処理物
を作用させて不斉加水分解する反応条件として、反応温
度は２０〜９０°Ｃ１好ましくは３０〜７０°Ｃであり
、反応ｐｉ（は４〜１１、好ましくは７〜゛１０である
。反応時間は、通常は、０．５〜３６時間程度で適当で
あり、１〜２４時間程度が好適である。

反応温度を高めたり、菌体またはその処理物の使用量を
増加させるなどにより、反応時間を短縮させることが可
能である。

本発明において、微生物の使用量は、基質であるＤＬ−
α−メチルフェニルアラニンアミド類に対し、乾燥菌体
として重量比で０．０１〜１の範囲内になるように用い
るのが好ましい。　なお、この範囲外とすることを妨げ
ない。培養液または処理物を使用する場合には、乾燥菌
体の重量に換算してその使用量を決定すればよい。

基質であるＤＬ−α−メチルフェニルアラニンアミド類
の使用濃度は、原料として使用したＤＬ−α−メチルフ
ェニルアラニンアミド類の飽和濃度以下であれば一般に
制限はないが、好ましくは反応液に対して１ｗｔ％以上
であり、上限は高くとも１０ｗｔχ程度とされる。

本発明では、Ｌ−α−メチルフェニルアラニンアミド類
の加水分解反応がほぼ終了した時点で、可及的速やかに
反応を停止させ、反応生成液から目的物質であるし一α
−メチルフェニルアラニン類と未反応のＤ−α−メチル
フェニルアラニンアミド類とをそれぞれ分離１回収する
。この分離は、分別晶析、溶媒抽出などの操作により容
易に行うことができる。

なお、前記の不斉加水分解の操作において、基質中のＤ
−α−メチルフェニルアラニンアミド類は、菌体または
処理物の作用を受けにくいが、反応時間が過度に長くな
ると、菌体または処理物の作用を受けて、Ｄ−α−メチ
ルフェニルアラニン類を生成することがあるので、Ｌ−
α−メチルフェニルアラニンアミド類の加水分解が終了
した時点で反応を可及的速やかに停止させ、Ｄ−α−メ
チルフェニルアラニン類を極力生成させないことが必要
である。

反応を停止させるには、たとえば、反応生成液から菌体
および処理物を除去する、反応生成液からＤ−α−メチ
ルフェニルアラニンアミド類を除去する、反応生成液の
ｐＨを変化させるおよび／また。は反応生成液の温度を
変化させるなどの常法によることができる。

また、未反応のＤ−α−メチルフェニルアラニンアミド
類を、たとえば、加熱などによりラセミ化して基質とし
て再び使用することができる。

〔実施例〕

実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。本発
明は実施例に限定されるものではない。

実施例１ グリセロール５０ｇ、コーンステイープ・リカー　５０
ｇ　、　（ＮＨ４）２Ｓ０４５ｇ　、ＭｇＳＯ４−７Ｈ
ｚＯ０，２ｇ　、Ｆｅ５Ｏａ・７Ｈｚ００．０５　ｇ　
、ＣａＣＩｚ・２８ｚＯＯ，０２ｇ　、ＭｎＣＩｚ・４
Ｈｚ０２　ｇ　。

ＮａＭｏＯ４・２ＨｚＯ１ｍｇおよびＮａＣ１１ｍｇを
純水１１に溶解し、ｐＨが７．０に調整された培地１０
０　ｍｌを１！容三角フラスコに入れ、１ｋｇ／Ｃｆ１
ｃで２０分間殺菌した培地に、これと同じ培地で前培養
して得られたミコプラナ　ディモルファおよびミコプラ
ナ　ブラタの各菌株の前培養液をそれぞれ１ｍｌづつ植
菌し、３０°Ｃで６５時間振とう培養を行って得られた
培養液を１５０００Ｇで１０分間遠心分離して各菌株の
菌体を得た。

ＤＬ−３，４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニル
アラニンアミド２．５ｇを純水１００ｍ１に溶解した水
溶液に、前記の菌体を乾燥菌体重量換算で］、、２５ｇ
加え、ｐＨを９．０に調整した後、４０″Ｃで４８時間
振とうしつつ反応を行った。反応終了後、反応生成液を
１５０００Ｇで１０分間遠心分離して上澄液を得た。こ
の上澄液を高速液体クロマトグラフィで分析し、生成さ
れたＬ−３，４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニ
ルアラニンの収率を求めた。

また、上澄液中のＤ−３，４−メチレンジオキシ−α−
メチルフェニルアラニンも定量した。結果を第１表に示
す。　　　　　　　　　　（以下余白）第１表 −１５一 実施例２ 実施例１と同様にして、ミコプラナ　ディモルファ　Ａ
ＴＣＣ４２７９およびミコプラナ　ブラタＮＣＩＢ９４
４０を培養して得られた菌体を使用して反応を行った。

基質としてＤＬ−３，４−ジヒドロキシ−α−メチルフ
ェニルアラニンアミド（Ａ’）、ＤＬ−４−ヒドロキシ
−３−メトキシ−α−メチルフェニルアラニンアミド（
Ｂ）およびＤＬ−３，４−ジメトキシ−α−メチルフェ
ニルアラニンアミド（Ｃ）のそれぞれを用い、反応時間
を４８時間とした他は、実施例１と同様にして反応を行
った。結果を第２表に示す。　　　　　　　　　　　　
（以下余白）第２表 目的生成物 実施例３ ＤＬ−３，４−メチレンジオキシ−α〜メチルフェニル
アラニンアミドの不斉加水分解の反応時間を２時間とし
た他は、実施例１と同様にして反応を行った。結果を第
３表に示す。

第３表 目的生成物 なお、この反応生成物から再結晶化を繰り返して得られ
た＞３．４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニルア
ラニンの比旋光度［α］ｚＢ（Ｃ＝１．０．ＩＮ　　塩
酸水溶液）は、２１．５〜２２．５度であった。

実施例４ ＤＬ−３，４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニル
アラニンアミドの不斉加水分解の反応ｐＨヲ７．０とし
、かつ、反応時間を２時間とした他は、実施例１と同様
にして反応を行った。結果を第４表に示す。

第４表 目的生成物 実施例５ 実施例１と同様にして、ミコプラナ　ディモルファＡＴ
ＣＣ４２７９を培養して得られた菌体を使用して、反応
を行った。

ＤＬ−３，４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニル
アラニンアミド２．５ｇを純水１００−に溶解した水溶
液に、前記の菌体を乾燥菌体重量換算で０．２５ｇ加え
、ｐＨを９．０に調整した反応液Ａ、Ｂをそれぞれ準備
した。

反応液Ａおよび反応液Ｂをそれぞれ４０°Ｃおよび２５
°Ｃで反応を行わせて、１時間、２時間、２３時間後に
おけるＬ−３，４−メチレンジオキシ−α−メチルフェ
ニルアラニンの収率を求めた。また、６時間後の反応上
澄液中のＬ体／Ｄ体（モル比）を測定した。結果を第５
表に示す。

第５表 ２０一 実施例６ 実施例１と同様にして、ミコプラナ　ブラタＮＣＩＢ　
９４４０を培養して得られた菌体を使用して反応を行っ
た。

ＤＬ−３，４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニル
アラニンアミド２．５ｇを純水１００−に溶解した水溶
液に、前記の菌体を乾燥菌体重量換算で０．２５ｇ加え
、ｐｌ（を９．０に調整し、４０°Ｃで反応を行わせて
、１時間、５時間、２２時間後におけるＬ−３，４−メ
チレンジオキシ−α−メチルフェニルアラニンの収率を
求めた。また、５時間後の反応上澄液中のＬ体／Ｄ体（
モル比）を測定した。結果を第６表に示す。

第６表 実施例７ グルコース１０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵丹工ギス５ｇ
、　ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、　Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２００，４
ｇ　＋Ｆｅ５Ｏａ−ＩＨ２００，０３ｇ　、　　ＭｎＣ
Ｉｚ４＋１ｚＯ０，０３ｇ　、ＤＬ−ｚ＜リンアミド５
ｇを純水１１に熔解し、ｐＨが７．０に調整された培地
１００ｍ１！を１β容三角フラスコに入れ、１　ｋｇ　
／　ｃｌ、　Ｇで２０分間殺菌した培地に、これと同じ
培地で前培養したミコプラナ　ディモルファＡＴＣＣ４
２７９およびミコプラナ　ブラタＮＣ：ＩＢ　９４４０
の各菌株の前培養液をそれぞれ１ｍｉづつ植菌し、３０
゛Ｃで６５時時間上う培養を行って得られた培養液を１
５０００Ｇで１０分間遠心分離して菌体を得た。

ＤＬ−３，４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニル
アラニンアミド２．５ｇを純水１０ｆＷに溶解した水溶
液に、前記のそれぞれの菌体を乾燥菌体重量換算で０．
２５ｇ加え、ｐ＋＋を９．０に調整した後、４０°Ｃで
反応を行って、１時間、５時間、２０時間後のＬ−３，
４−メチレンジオキシ−α−メチルフェニルアラニンの
収率を求めた。また、５時間後の反応上澄液中のＬ体／
Ｄ体（モル比）を測定した。

結果を第７表に示す。　　　　　　　　（以下余白）第
７表 〔発明の効果〕 本発明によれば、医薬品として使用されている、たとえ
ば、Ｌ−α−メチルドーパのようなＬ−α−メチルフェ
ニルアラニン類を容易に、がっ、安定的に、しかも効率
よく得ることが可能となる。

特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社 代表者長野　和吉

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、式中Ｒ＾１、Ｒ＾２は互いに同一または異な
   って、水素原子、低級アルキル基であるか、または、Ｒ
   ＾１、Ｒ＾２はともにアルキレン基であって、互いに結
   合して５〜８員環を形成することもできる）で表される
   ＤＬ−α−メチルフェニルアラニンアミド類に、ミコプ
   ラナ属に属する細菌の菌体またはその処理物を作用させ
   てＬ−α−メチルフェニルアラニンアミド類を不斉加水
   分解して、 一般式II ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただし、式中Ｒ＾１、Ｒ＾２は前記の一般式 I にお
   けると同様である。） で表されるＬ−α−メチルフェニルアラニン類を得るこ
   とを特徴とするＬ−α−メチルフェニルアラニン類の製
   造法。