JPS6087788A - 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が組
み込れている組換えＤＮＡ 、該組換えＤＮＡを有する
細菌及び該細菌を用いるアミノ酸の製造法に関する。
み込れている組換えＤＮＡ 、該組換えＤＮＡを有する
細菌及び該細菌を用いるアミノ酸の製造法に関する。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（４，１，
１，３１ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：以下ｒ ＰＥＰＣＪと記すン
は、ホスホエノールピルビン酸に１モルの二酸化炭素を
付加しオキザロ酢酸を生成する反応を触媒する酵素であ
シ、アスノやラギン酸の供給にきわめて重要な役割を果
たしていて、したがって、アルパラギン酸よシ生成され
るアミノ酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロイシ
ン、等の生産に重要な役割を来た〔７ている。
１，３１ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：以下ｒ ＰＥＰＣＪと記すン
は、ホスホエノールピルビン酸に１モルの二酸化炭素を
付加しオキザロ酢酸を生成する反応を触媒する酵素であ
シ、アスノやラギン酸の供給にきわめて重要な役割を果
たしていて、したがって、アルパラギン酸よシ生成され
るアミノ酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロイシ
ン、等の生産に重要な役割を来た〔７ている。
また、ホスホエノールピルビン酸に二酸化炭素を付加し
てオキザロ酢酸を生成するのでめるから、ＴＣＡサイク
ル有（ｎ酸から生成されるアミンｔｌ）、すなわちグル
タミン酸、グルタミン、プロリン、アルギニン、ミナル
リン、オルニチン等のアミノ酸の生成に重要な役割を果
している◎ 本発明者等は大量のアミノ酸を生産すること力；知られ
ているコリネ型細菌例えばコリネノぐクチＩＪウム・グ
ルタミン酸、ブレビバクテリウム・フラバムの細胞内で
ＰＥＰＣ遺伝子を増幅せしめることを意図して研究を開
始した。そして、ついにＰＥＰＣをコードする遺伝子が
コリネ型細菌細胞内で増殖し得るプラスミドベクターと
接続されている組換えＤＮＡ及び間組換えＤＮＡを有す
るコリネ壓細菌ヲ得ることに成功した。この様な細菌を
培養すれば、培地中に著凰のアミノ酸が生産される。
てオキザロ酢酸を生成するのでめるから、ＴＣＡサイク
ル有（ｎ酸から生成されるアミンｔｌ）、すなわちグル
タミン酸、グルタミン、プロリン、アルギニン、ミナル
リン、オルニチン等のアミノ酸の生成に重要な役割を果
している◎ 本発明者等は大量のアミノ酸を生産すること力；知られ
ているコリネ型細菌例えばコリネノぐクチＩＪウム・グ
ルタミン酸、ブレビバクテリウム・フラバムの細胞内で
ＰＥＰＣ遺伝子を増幅せしめることを意図して研究を開
始した。そして、ついにＰＥＰＣをコードする遺伝子が
コリネ型細菌細胞内で増殖し得るプラスミドベクターと
接続されている組換えＤＮＡ及び間組換えＤＮＡを有す
るコリネ壓細菌ヲ得ることに成功した。この様な細菌を
培養すれば、培地中に著凰のアミノ酸が生産される。
コリネ型細菌は、好気性、グラム陽性桿菌であシ、非抗
酸性でパーデース・マニュアル・オブ・デターミネイテ
イブノぐクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）に
記載されていて、そのうち特に以下に例示するよりなＬ
−グルタミン酸を大量に生産するものが知られている。
酸性でパーデース・マニュアル・オブ・デターミネイテ
イブノぐクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）に
記載されていて、そのうち特に以下に例示するよりなＬ
−グルタミン酸を大量に生産するものが知られている。
ブレビバクテリウム・デイバリカタム ＡＴＣＣ１４０
２０ブレビバクテリウム・サラカロリティクム ＡＴＣ
Ｃ１４０６６プレビバクテリウム・インマリオフイルム
ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９プレピノ々クテリウム
・ロゼラム ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・
フラバム ＡＴＣＣ１３８２６ブレビノぐクテリウム・
チオグニタリス Ａ、ＴＣＣ１９２４０コリネバクテリ
ウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０コリ
ネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１５８
０６コリネパクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９
１コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０
３２，１３０６０コリネバクテリウム・リリウム ＡＴ
ＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラ Ａ
ＴＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニアフィ
ラム ＡＴＣＣ１５３５４コリネ壓細菌には王妃のよう
なグルタミン酸生産性を有するもののほかに、リジン、
アルギニン等のアミノ酸を生産する変異株も含まれる。
２０ブレビバクテリウム・サラカロリティクム ＡＴＣ
Ｃ１４０６６プレビバクテリウム・インマリオフイルム
ＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９プレピノ々クテリウム
・ロゼラム ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・
フラバム ＡＴＣＣ１３８２６ブレビノぐクテリウム・
チオグニタリス Ａ、ＴＣＣ１９２４０コリネバクテリ
ウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０コリ
ネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１５８
０６コリネパクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９
１コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０
３２，１３０６０コリネバクテリウム・リリウム ＡＴ
ＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラ Ａ
ＴＣＣ１７９６５ミクロバクテリウム・アンモニアフィ
ラム ＡＴＣＣ１５３５４コリネ壓細菌には王妃のよう
なグルタミン酸生産性を有するもののほかに、リジン、
アルギニン等のアミノ酸を生産する変異株も含まれる。
ＰＥＰＣ遺伝子を単ｔｅｌする方法は、コリネ型ｎ’：
ｌＩ ＤＢのうちよシ健全なＰＥＰＣ遺伝子を有してい
る株よシ、まず染色体遺伝子を抽出しく例えばＨ，５ａ
ｉｔｏ ａｎｄＫＪ４ｉｕｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ ７２６１９（１９６３）の方
法が利用できるノ、これを適当々制限酵素で切断する。
ｌＩ ＤＢのうちよシ健全なＰＥＰＣ遺伝子を有してい
る株よシ、まず染色体遺伝子を抽出しく例えばＨ，５ａ
ｉｔｏ ａｎｄＫＪ４ｉｕｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ ７２６１９（１９６３）の方
法が利用できるノ、これを適当々制限酵素で切断する。
ついで、コリネ型細菌で増殖し得るプラスミドベクター
に接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌
のＰＥＰＣ欠損変異株を形質転換せしめ、ＰＥＰＣ主Ｐ
Ｃ性を保有するにいたった１株を単離し、それよシＰＥ
ＰＣ遺伝子を分離できる。
に接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌
のＰＥＰＣ欠損変異株を形質転換せしめ、ＰＥＰＣ主Ｐ
Ｃ性を保有するにいたった１株を単離し、それよシＰＥ
ＰＣ遺伝子を分離できる。
ＰＥＰＣ遺伝子の供与菌としては、よシ望ましくはアス
パラギン酸によるフィードバック阻害が弱められている
様な株が良い。このようなｉｌ１株ハ、７スパラギン酸
拮抗阻害剤に対する耐性株として得られる。
パラギン酸によるフィードバック阻害が弱められている
様な株が良い。このようなｉｌ１株ハ、７スパラギン酸
拮抗阻害剤に対する耐性株として得られる。
染色体遺伝子を、切断するには切断反応時間等を調節し
て、切断の程度を調節すれば巾広い種類の制限酵素が使
用できる。
て、切断の程度を調節すれば巾広い種類の制限酵素が使
用できる。
本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがある
。
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがある
。
（１） ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９参照
（２） ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５参
照（３） ｐＡＪ ６５５ （ａ） 宿主菌：エシェリヒア・コリＡＪ １１８８２
（ＦＥＲＭ−Ｐ６５１７ ＝ＦＥＲＭ−ＩＩＰ１３６な
ど）（ｂ） 分子量＝６．６メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第１図参照（ｄ） 性 餡
： Ｉ）ＡＭ ３３０とｐＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ ４１
２１ （１９７８））の複合プラスミド。
（２） ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５参
照（３） ｐＡＪ ６５５ （ａ） 宿主菌：エシェリヒア・コリＡＪ １１８８２
（ＦＥＲＭ−Ｐ６５１７ ＝ＦＥＲＭ−ＩＩＰ１３６な
ど）（ｂ） 分子量＝６．６メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第１図参照（ｄ） 性 餡
： Ｉ）ＡＭ ３３０とｐＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ ４１
２１ （１９７８））の複合プラスミド。
クロラムフェニコール１ｌｉｔ 性Ｋ 与ル。
（４） ｐＡＪ ６１１
（１１） 宿主菌：エシェリヒア・コリＡＪ １１８８
４（ＦＥＲＡ４− Ｐ６５１９ ＝Ｆ”ＥＲＭ −ＢＰ
１３８など少 （ｂ） 分子量＝６６メガダルトン （Ｃ）制限酵素切断地図：第２図参照 （ｄ） 性 質： ｐＡＭ ２８１とｐＩ３Ｒ３２５の
複合プラスミド。
４（ＦＥＲＡ４− Ｐ６５１９ ＝Ｆ”ＥＲＭ −ＢＰ
１３８など少 （ｂ） 分子量＝６６メガダルトン （Ｃ）制限酵素切断地図：第２図参照 （ｄ） 性 質： ｐＡＭ ２８１とｐＩ３Ｒ３２５の
複合プラスミド。
クロラムフェニコール剛性に与る。
（５） ｐＡＪ ４４０
（−） 宿主菌：バチルスズブチリスＡＪ １１９０１
（ＦＥＲＭ −ＢＰ １４０ ＝ＡＴＣＣ３９１３９な
ど） （ｂ） 分子旦：６０メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図二組３図参照 （ｄ） 性 知： ｐＡＭ ３３０とｐＩＪ）３１１０
（Ｊ。
（ＦＥＲＭ −ＢＰ １４０ ＝ＡＴＣＣ３９１３９な
ど） （ｂ） 分子旦：６０メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図二組３図参照 （ｄ） 性 知： ｐＡＭ ３３０とｐＩＪ）３１１０
（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、 １３４３１Ｂ（１９７８）
）の複合プラスミド。
）の複合プラスミド。
カナマイシン耐性に与る。
（６） ｐＡ、ｒ １８４４
（ａ） 宿主菌：エシェリヒア・コリＡＪ １１Ｂ８３
（ＦＥＲＭ−Ｐ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １３７など
） （ｂ）分子量：５．４メガダルトン （ｃ） ｆｌｉ！Ｉ限酵素切断地図：第４図参照（ｄ）
性 質： ｐＨＭ １５１９とｐＢＲ３２５の複合プ
ラスミド。
（ＦＥＲＭ−Ｐ６５１９＝ＦＥＲＭ−ＢＰ １３７など
） （ｂ）分子量：５．４メガダルトン （ｃ） ｆｌｉ！Ｉ限酵素切断地図：第４図参照（ｄ）
性 質： ｐＨＭ １５１９とｐＢＲ３２５の複合プ
ラスミド。
クロラムフェニコール耐性に与ル。
（７） ｐＡＪ ３１４Ｂ
（ａ） 宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミクムＳ
Ｒ８２０３ＡＴＣＣ３９１３７など（ｂ） 分子量：６
．６メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第５０参照（ｄ） 性 質
： ｐＨＭ １５１９とｐＵＢ １１０との板台プラス
ミド。
Ｒ８２０３ＡＴＣＣ３９１３７など（ｂ） 分子量：６
．６メガダルトン （ｃ） 制限酵素切断地図：第５０参照（ｄ） 性 質
： ｐＨＭ １５１９とｐＵＢ １１０との板台プラス
ミド。
カナマイシン耐性に与る。
コリネ型細菌細胞内で均殖可能なシラスミドのその他の
例としてはｐＣＧ １ （特開昭５７−１３４５００．
、ｌ、ＰＣＧ ２ （％開昭５８−３５１９７）、ｐＣ
Ｇ ４ 。
例としてはｐＣＧ １ （特開昭５７−１３４５００．
、ｌ、ＰＣＧ ２ （％開昭５８−３５１９７）、ｐＣ
Ｇ ４ 。
ｐｃＧｌｌ（％開昭５７−１８３７９９）があシ、これ
らはいず九も当然使用可能であろう。
らはいず九も当然使用可能であろう。
ベクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限酵素によ多切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
ｆ：＋＆、続ぜしめて、ついでプラスミドベクターと染
色体ＤＮＡフラグメントとのライダージョン反応に付さ
れる。
れた制限酵素によ多切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
ｆ：＋＆、続ぜしめて、ついでプラスミドベクターと染
色体ＤＮＡフラグメントとのライダージョン反応に付さ
れる。
このようにして得られた、染色体ＤＮＡとベクターグラ
スミドとの組換えＤＮＡをコリネ型組−に属する受容菌
へ導入するには、エシエ１」ヒア・コ１ノに−１２につ
いて報告されている様な（ＭａｎｄｅＬＭ、 ａｎｄ
Ｈｉｇａ＋Ａ、 、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 、５３
．１５９（１９７０） ）受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス
・ズブチリスについて報告されている様に（Ｄｕｎｃａ
ｎ＋Ｃ，Ｈ，Ｊ Ｗｉ １Ｂ０１１６Ｇ、Ａ、ａｎｄ
Ｙ’ｏｕｎｇ、Ｆ、Ｅ、、Ｇｅｎｅ、１． １５３（１
９７７） ン 細ＪｌｉｉがＤＮＡを取シ込み得る様に
なる増殖段階〔いわゆるコンピテントセル〕に導入する
方法により可能で、Ｉｌｂル。あるいは、バチルス・ズ
ブチリス、放綜菌類および酵母について知られている様
に（Ｃｈａｎｇ ａ Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ ＊
ＳＩＮ、 ＋ Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
＋１６８．１１１（１９７９） ： Ｂｉｂｂ、 ｈ’
１．Ｊ、 、 Ｗａｒｄ 、 Ｊ、Ｍ、 ａｎｄＨｏｐ
ｗｏｏｄ 、Ｏ，Ａ、、Ｎａｔｕｒｅ 、−２Ｌ７ト張
−，３９８（１９７８ン：Ｈｉｎｎｅｎ。
スミドとの組換えＤＮＡをコリネ型組−に属する受容菌
へ導入するには、エシエ１」ヒア・コ１ノに−１２につ
いて報告されている様な（ＭａｎｄｅＬＭ、 ａｎｄ
Ｈｉｇａ＋Ａ、 、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 、５３
．１５９（１９７０） ）受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス
・ズブチリスについて報告されている様に（Ｄｕｎｃａ
ｎ＋Ｃ，Ｈ，Ｊ Ｗｉ １Ｂ０１１６Ｇ、Ａ、ａｎｄ
Ｙ’ｏｕｎｇ、Ｆ、Ｅ、、Ｇｅｎｅ、１． １５３（１
９７７） ン 細ＪｌｉｉがＤＮＡを取シ込み得る様に
なる増殖段階〔いわゆるコンピテントセル〕に導入する
方法により可能で、Ｉｌｂル。あるいは、バチルス・ズ
ブチリス、放綜菌類および酵母について知られている様
に（Ｃｈａｎｇ ａ Ｓ、 ａｎｄ Ｃｈｏｅｎ ＊
ＳＩＮ、 ＋ Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
＋１６８．１１１（１９７９） ： Ｂｉｂｂ、 ｈ’
１．Ｊ、 、 Ｗａｒｄ 、 Ｊ、Ｍ、 ａｎｄＨｏｐ
ｗｏｏｄ 、Ｏ，Ａ、、Ｎａｔｕｒｅ 、−２Ｌ７ト張
−，３９８（１９７８ン：Ｈｉｎｎｅｎ。
Ａ、＋ Ｈｉｅ）ｃｓ ｌＪ、Ｂ、 ａｎｄＦｉｎｋ
ｒ Ｇ、Ｒ，ｒ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
ｒ Ｇ、Ｒ，ｒ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｅｔ 、 ｔＪｓＡ 、 Ｊｌｉ１９２９ （１９７
８） ）、ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤＮＡを８易に
取シ込むプロトシラストまたはスフェログラストにして
グラスミドをＤＮＡ受容菌に導入することも可能である
。
８） ）、ＤＮＡ受容菌を、プラスミドＤＮＡを８易に
取シ込むプロトシラストまたはスフェログラストにして
グラスミドをＤＮＡ受容菌に導入することも可能である
。
プロトプラスト法では上記のノ々チルス・ズブチリスに
おいて使用されている方法でも充分高い頻度を得ること
ができるし、％開昭５７−１８３７９９に記載されたコ
リネバクテリウム民またはブレビバクテリウム属のプロ
トプラストにポリエチレングリコールまたはポリビニル
アルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡ ｔと
シ込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコ
ールマタハポリビニルアルコールのかわりに、カルボキ
シメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾル
ロニックＦ６８（セルノ々社）などの添加によってＤＮ
Ａのとり込みを促進させる方法でもＩＨｊＪ Ａ）’、
＝の結果が得られる。
おいて使用されている方法でも充分高い頻度を得ること
ができるし、％開昭５７−１８３７９９に記載されたコ
リネバクテリウム民またはブレビバクテリウム属のプロ
トプラストにポリエチレングリコールまたはポリビニル
アルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡ ｔと
シ込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコ
ールマタハポリビニルアルコールのかわりに、カルボキ
シメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ゾル
ロニックＦ６８（セルノ々社）などの添加によってＤＮ
Ａのとり込みを促進させる方法でもＩＨｊＪ Ａ）’、
＝の結果が得られる。
ＰＥＰＣ欠損株を得るには、ＰＥＰＣを経る経路がＴＣ
Ａサイクル有椋敵代謝の主要な経路であるから、グルタ
ミン酸要求菌を単離すればＰＥＰＣ欠損株が得られる。
Ａサイクル有椋敵代謝の主要な経路であるから、グルタ
ミン酸要求菌を単離すればＰＥＰＣ欠損株が得られる。
よシ具体的には、グルタミン醒要求株の中でビオチン５
ｊ／Ｌ’を含む最少培地で生育できず、ビオチン５００
ｊ／ｌｆｔ含む培地で生育しイむる抹として得られる
。
ｊ／Ｌ’を含む最少培地で生育できず、ビオチン５００
ｊ／ｌｆｔ含む培地で生育しイむる抹として得られる
。
形質転換の後、ＰＥＰＣ生産性を獲得し、または、さら
にグラスミドベクターが有しているマーカーとしての性
質を発現する菌株を所望の形質転換株として分離する。
にグラスミドベクターが有しているマーカーとしての性
質を発現する菌株を所望の形質転換株として分離する。
このような形質転換株は、ＰＥＰＣ遺伝子が組み込まれ
ている組換えＤＮＡを有している。組換えＤＮＡを単離
する方法は、例えば菌体をリゾチームＳＤＳ処理によシ
溶菌させ、フェノール処理法のち、２容のエタノールを
加えてＤＮＡ ’ｔ−沈澱回収する。
ている組換えＤＮＡを有している。組換えＤＮＡを単離
する方法は、例えば菌体をリゾチームＳＤＳ処理によシ
溶菌させ、フェノール処理法のち、２容のエタノールを
加えてＤＮＡ ’ｔ−沈澱回収する。
上記組換えＤＮＡを有するＰＥＰＣ欠損株それ自体が６
稙のアミノは全生産する場合が多いが、より生産性の高
いアミノ酸生産菌を得るには、所望のアミノＪのよシ生
産性の高い山林を用いて組換えＤＮＡによシ形質転換す
れば良い。組換えＤＮＡ受容菌として、例えば、代表的
なものを例示すれはリジン生産菌ｆ、得たい時にはホモ
セリン要求菌、５−（２−アミノエチール〕システィン
耐性株等を用いるアルギニン生産においては２−チアゾ
ールアラニン耐性菌、スレオニン生産においてはαアミ
ノβヒドロキシパレリアン酸耐性株イソロイミン生産に
おいてはαアミノβヒドロキシ／？レリアン酸耐性株、
プロリン生産においては、２−４デヒドロプロリン而」
性株、グルタミン酸生産においては、ケトマレイン酸面
ｊ性株等が用いられる。
稙のアミノは全生産する場合が多いが、より生産性の高
いアミノ酸生産菌を得るには、所望のアミノＪのよシ生
産性の高い山林を用いて組換えＤＮＡによシ形質転換す
れば良い。組換えＤＮＡ受容菌として、例えば、代表的
なものを例示すれはリジン生産菌ｆ、得たい時にはホモ
セリン要求菌、５−（２−アミノエチール〕システィン
耐性株等を用いるアルギニン生産においては２−チアゾ
ールアラニン耐性菌、スレオニン生産においてはαアミ
ノβヒドロキシパレリアン酸耐性株イソロイミン生産に
おいてはαアミノβヒドロキシ／？レリアン酸耐性株、
プロリン生産においては、２−４デヒドロプロリン而」
性株、グルタミン酸生産においては、ケトマレイン酸面
ｊ性株等が用いられる。
得られたＬ−アミノ酸生産山を培養する方法は、従来の
Ｌ−アミノ酸生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有す
る通常のものである。
Ｌ−アミノ酸生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有す
る通常のものである。
炭素臨としては、グルコース、シュクロース、ラクトー
ス等及びこれらを含有する鱗粉加水分解液、ホエイ、糖
蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、
アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。
ス等及びこれらを含有する鱗粉加水分解液、ホエイ、糖
蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、
アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地のｐＨ及びｄＡ度を適宜調節
しつつ、実賀的にＬ−アミノ酸の生菌蓄積が停止するま
で行なわれる。
しつつ、実賀的にＬ−アミノ酸の生菌蓄積が停止するま
で行なわれる。
かくして培養液中には著蓋のＬ−アミノ酸が化１１Ｘ、
蓄積される。培養液よシム−アミノ酸を採取するには、
通常の方法が適用できる。
蓄積される。培養液よシム−アミノ酸を採取するには、
通常の方法が適用できる。
実施例
（１） ｐｇｐｃ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの詞製ブレ
ビバクテリウムＯラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９をＩ Ａ （Ｄ ＣＭＧ培地（ペットｙ １ ！／
Ａｌ、酵母エキスｘｔｖｔｔｔ、グルコース０．５１／
ｄｌ、及びＮａＣｔｏ、 ５１１／ｄｉを含み、ｐＨ７
，２に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時間振盪
培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体を
リゾチーム・ＳＤＲで溶菌させたのち、通常のフェノー
ル処理法によシ、染色体ＤＮＡを抽出８製し、最終的に
３．５ｍｇのＤＮＡを得た。
ビバクテリウムＯラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９をＩ Ａ （Ｄ ＣＭＧ培地（ペットｙ １ ！／
Ａｌ、酵母エキスｘｔｖｔｔｔ、グルコース０．５１／
ｄｌ、及びＮａＣｔｏ、 ５１１／ｄｉを含み、ｐＨ７
，２に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時間振盪
培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体を
リゾチーム・ＳＤＲで溶菌させたのち、通常のフェノー
ル処理法によシ、染色体ＤＮＡを抽出８製し、最終的に
３．５ｍｇのＤＮＡを得た。
（２） ベクターＤＮＡの調製
ベクターとしてｐＡＪ・４３（分子量３．４メガダルト
ン）を用い、そのＤＮＡ全ｐＡＪ ６５５及びｐＢＲ３
２５から次の様にして調製した。
ン）を用い、そのＤＮＡ全ｐＡＪ ６５５及びｐＢＲ３
２５から次の様にして調製した。
ｐＡＭ ３３０は次のようにして得た。
蒸留水１！おたシペプトン１０１１粉末酵母エキス１０
．９．塩化ナトリウム５Ｉ、グルコース５ｇを含むＣＭ
Ｇ培地（ｐｔｉ７．２）ＩＪ中に温度３０℃でブレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９
を対数増殖期後期まで培養し、自体を集めた。得られた
菌体を、リゾチームとＳＤＳによシ溶菌させるｆｈｉ便
法によシ溶菌せしめた後、３０．０００ｘりで３０分間
遠心分離し６４鑓の上澄液２得た。上澄液中のプラスミ
ドＤＮＡは、上澄液にポリエチレングリコール（最終１
；：ｔ ＢＥ １０％）を添加し沈降させた後、１０ゴ
のＴＥＮ緩ｉｄ＋７液に溶解した。
．９．塩化ナトリウム５Ｉ、グルコース５ｇを含むＣＭ
Ｇ培地（ｐｔｉ７．２）ＩＪ中に温度３０℃でブレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９
を対数増殖期後期まで培養し、自体を集めた。得られた
菌体を、リゾチームとＳＤＳによシ溶菌させるｆｈｉ便
法によシ溶菌せしめた後、３０．０００ｘりで３０分間
遠心分離し６４鑓の上澄液２得た。上澄液中のプラスミ
ドＤＮＡは、上澄液にポリエチレングリコール（最終１
；：ｔ ＢＥ １０％）を添加し沈降させた後、１０ゴ
のＴＥＮ緩ｉｄ＋７液に溶解した。
ＤＮＡ ”ｆりはヌクレアーゼで処理した彼（リボヌク
レアーゼ１５０１ｔ１１．Ｉｎｌで３７℃、３０分間反
応）、フェノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを
加え一２０℃でＤＮＡ ｆ：沈澱させ、沈澱ｔ １ ｒ
ｉｄ：のＴＥＮ緩衝液に溶解した。このＤＮＡ沼液をア
ガロースダル電気泳動にかけ、グルから約７４μｓの純
粋なシラスミドＤＮＡを分離した。
レアーゼ１５０１ｔ１１．Ｉｎｌで３７℃、３０分間反
応）、フェノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを
加え一２０℃でＤＮＡ ｆ：沈澱させ、沈澱ｔ １ ｒ
ｉｄ：のＴＥＮ緩衝液に溶解した。このＤＮＡ沼液をア
ガロースダル電気泳動にかけ、グルから約７４μｓの純
粋なシラスミドＤＮＡを分離した。
ｐＡＪ ６５５を仄のように調製した。
シラスミドｐＢＲ３２５（Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｆ’５Ｇ
ａｎｅ ＋４ ＋１２１ （１９７８）、ペセスダリサ
ーチラ１ｔラトリーよシ購入〕０．２μｇに１ユニツト
の制限酵素Ｂａｍ）Ｉ Ｉ（ＢＲＬから購入）を３７℃
で６００分間反応せ、ＤＭを充分分解した。
ａｎｅ ＋４ ＋１２１ （１９７８）、ペセスダリサ
ーチラ１ｔラトリーよシ購入〕０．２μｇに１ユニツト
の制限酵素Ｂａｍ）Ｉ Ｉ（ＢＲＬから購入）を３７℃
で６００分間反応せ、ＤＭを充分分解した。
グラスミドｐＡＭ ３３０ （１，２８ｇ ）に０．２
ユニツトの制限酵素Ｍｂｏ Ｉを３７℃で１５分間反応
させ、ＤＮＡを部分分解した。
ユニツトの制限酵素Ｍｂｏ Ｉを３７℃で１５分間反応
させ、ＤＮＡを部分分解した。
得られたＤＮＡ断片を混合し制限酵素を不活化するため
６５℃で１０分間熱処理した後、ＡＴＰとジチオスレイ
トール存在下２２℃で２時間０．０１ユニツトのＴ ４
ＤＮＡリガーゼを作用させた。Ｔ４ＤＮＡ ＩＪ ２
７− セを６５℃、１ｏ分間の処理で不活化し、２倍量
のエタノールを加えた後、１５，０００１１１５分間の
遠心分離によｆｉ ＤＮＡを回収した。このようにして
得た複合シラスミドをトランスフォーメイションに使用
した。
６５℃で１０分間熱処理した後、ＡＴＰとジチオスレイ
トール存在下２２℃で２時間０．０１ユニツトのＴ ４
ＤＮＡリガーゼを作用させた。Ｔ４ＤＮＡ ＩＪ ２
７− セを６５℃、１ｏ分間の処理で不活化し、２倍量
のエタノールを加えた後、１５，０００１１１５分間の
遠心分離によｆｉ ＤＮＡを回収した。このようにして
得た複合シラスミドをトランスフォーメイションに使用
した。
エッシェリヒア・コリＣ−６００（ｔｈｒ−。
１ｅｕ−、ｔｈｉａｍｉｎｅ−ａ ｒ−＋ ｍ−） （
Ｍｅｓｅｌｓｏｎ ＋Ｍ、 ａｎｄ Ｙｕａｎ ａ Ｒ
，Ｎａｔｕｒｅ ＊ ２１７ ｒ １１１０（１９６Ｂ
） ） ｔ’２０ｄのＣＭＧ培地に３０℃で対数増殖期
中期まで培養し、菌体を集めた。Ｋｕｓｈｎｅｒ等（”
ＧｅｎｅｔｅｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ’ ＃ ｐ
ｅ １７ （１９７８） ａ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／ Ｎ
ｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ Ｂｌｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐ
ｒｅｓｓ）の方法に従って−得られたＤＮＡ’を用いて
Ｃ−６００を形質転換した。
Ｍｅｓｅｌｓｏｎ ＋Ｍ、 ａｎｄ Ｙｕａｎ ａ Ｒ
，Ｎａｔｕｒｅ ＊ ２１７ ｒ １１１０（１９６Ｂ
） ） ｔ’２０ｄのＣＭＧ培地に３０℃で対数増殖期
中期まで培養し、菌体を集めた。Ｋｕｓｈｎｅｒ等（”
ＧｅｎｅｔｅｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ’ ＃ ｐ
ｅ １７ （１９７８） ａ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／ Ｎ
ｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ Ｂｌｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐ
ｒｅｓｓ）の方法に従って−得られたＤＮＡ’を用いて
Ｃ−６００を形質転換した。
形質転換株は２０μ９／ｆｎｌのクロラムフェニコール
を含むＣＭＧ培地で３７℃、２４時間培養し選択した。
を含むＣＭＧ培地で３７℃、２４時間培養し選択した。
形質転換株の中からＡＪ １１８８２ （ＦＥＲＭ −
ＢＰ１３６）を選択し、次の実＃ＬＫ用いた。
ＢＰ１３６）を選択し、次の実＃ＬＫ用いた。
得られた複合プラスミドｐＡＪ ６５５は、次のような
方法によシＡＪ １１８８２の溶菌液から分離した。
方法によシＡＪ １１８８２の溶菌液から分離した。
ＡＪ １１８８２ ’ｉ ＣＭＧ培地で培養後、簡便法
（Ｔａｎａｋａｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、 １２１ 、３５４（１９７５） ）によシ溶
菌せしめ、溶菌′ｇｊ、をアガロースゲルにかけ、電気
泳動にかけた（ ５ｂａｒｐ ａｔ ａｌ、 ｒ Ｉｌ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２．３０５５（１９７３ン〕
。分子址マーカーとの比較にヨＦ）、プラスミドの分子
ＨＩ′ｉ６．６ Ｍａ トｔｉｉすれた。グラスミドの
制限酵素切断地図を第１図に示した。プラスミドはｐＢ
Ｒ３２５とｐＡＭ ３３０の７ラグメントから成ること
ｋ、Ｋ、Ｊ、 Ｄａｎｎ’ａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５ ｒ ４４９ ｒ
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｑｇ（１９８０月により確認し
た。
（Ｔａｎａｋａｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、 １２１ 、３５４（１９７５） ）によシ溶
菌せしめ、溶菌′ｇｊ、をアガロースゲルにかけ、電気
泳動にかけた（ ５ｂａｒｐ ａｔ ａｌ、 ｒ Ｉｌ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２．３０５５（１９７３ン〕
。分子址マーカーとの比較にヨＦ）、プラスミドの分子
ＨＩ′ｉ６．６ Ｍａ トｔｉｉすれた。グラスミドの
制限酵素切断地図を第１図に示した。プラスミドはｐＢ
Ｒ３２５とｐＡＭ ３３０の７ラグメントから成ること
ｋ、Ｋ、Ｊ、 Ｄａｎｎ’ａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５ ｒ ４４９ ｒ
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｑｇ（１９８０月により確認し
た。
ｐＡＪ ６５５よシ次のようにしてｐＡＪ ４３を造成
した。
した。
ｐＡＪ ６５５ ｔ−保持するブレビバクテリウム・ラ
クトフェルメンタムＡ６４はクロラムフェニコール１０
０μｂ何を含むＣＭＧ寒天培地（ペゾトン１０Ｓμ、酵
母エキス１０９／Ｉ！、 、ダルコース５Ｉβ、ＮａＣ
６５ｇ／Ａ ｓ 寒天２０９／ｊｋ ’ｔ”含、５ｘｐ
）１７．２に調製したもの）上で生育不可能であるが、
本菌をＣＭＧ培地で培養し、クロラムフェニコール１０
０μφ化含むＣＭＧ液体培地に３０℃で一晩培養後、同
濃度のクロラムフェニコールを含むＣＭＧ培地に適当量
塗布し３０℃１〜２日間培養することによシクロラムフ
ェニコール１００μシーに耐性を示す株を１採得た。本
株のクロラムフェニコール耐性度をＣＭＧ培地で調べた
ところ２００μル曾まで耐性を示した。
クトフェルメンタムＡ６４はクロラムフェニコール１０
０μｂ何を含むＣＭＧ寒天培地（ペゾトン１０Ｓμ、酵
母エキス１０９／Ｉ！、 、ダルコース５Ｉβ、ＮａＣ
６５ｇ／Ａ ｓ 寒天２０９／ｊｋ ’ｔ”含、５ｘｐ
）１７．２に調製したもの）上で生育不可能であるが、
本菌をＣＭＧ培地で培養し、クロラムフェニコール１０
０μφ化含むＣＭＧ液体培地に３０℃で一晩培養後、同
濃度のクロラムフェニコールを含むＣＭＧ培地に適当量
塗布し３０℃１〜２日間培養することによシクロラムフ
ェニコール１００μシーに耐性を示す株を１採得た。本
株のクロラムフェニコール耐性度をＣＭＧ培地で調べた
ところ２００μル曾まで耐性を示した。
上記の結果、得られたりμラムフェニコール高濃度耐性
株からｐＡ、ｙ ４３ ’ｋ ＤＮＡ次のようにして調
製した。まず本株をクロラムフェニコールを１０μし佃
含む１４（１）ＣＭＧ液体培地に接種し、３０℃で対数
増殖期後期まで培養し、集菌した。常法によシリゾチー
ムとＳＤＳによシ溶菌せしめた後、３０．０００ｘｊｌ
、３０分の超遠心によシ上清を得た。これＩｃ ／リエ
チレングリコールＣ１ＭＫ冬濃度１０チ〕を添加してＤ
ＮＡ ’ｔ’沈赦せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリ
ス・ＥＤＴＡ−ＮａＣｔバッファー（ｐＨ８，０） １
０ｍｌに溶解した。ＤＮＡ ｉリボヌクレアーゼで処理
（リボヌクレアーゼ１５０μｇＡｌで３７℃、３００分
間反応後、フェノール抽出し、ついで２倍量のエタノー
ルを加え一２０℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱物を１ｄの
トリス・ＥＤＴＡ−Ｎａ（４バツフアーに溶解した。こ
のＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動法（電圧グル１
ｃＩｒＬ当、り５Ｖ、１５時間ンによりて最終１５０μ
ｙの純粋なｐＡＪ４３シラスミドＤＮＡを分画線取した
。
株からｐＡ、ｙ ４３ ’ｋ ＤＮＡ次のようにして調
製した。まず本株をクロラムフェニコールを１０μし佃
含む１４（１）ＣＭＧ液体培地に接種し、３０℃で対数
増殖期後期まで培養し、集菌した。常法によシリゾチー
ムとＳＤＳによシ溶菌せしめた後、３０．０００ｘｊｌ
、３０分の超遠心によシ上清を得た。これＩｃ ／リエ
チレングリコールＣ１ＭＫ冬濃度１０チ〕を添加してＤ
ＮＡ ’ｔ’沈赦せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリ
ス・ＥＤＴＡ−ＮａＣｔバッファー（ｐＨ８，０） １
０ｍｌに溶解した。ＤＮＡ ｉリボヌクレアーゼで処理
（リボヌクレアーゼ１５０μｇＡｌで３７℃、３００分
間反応後、フェノール抽出し、ついで２倍量のエタノー
ルを加え一２０℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱物を１ｄの
トリス・ＥＤＴＡ−Ｎａ（４バツフアーに溶解した。こ
のＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動法（電圧グル１
ｃＩｒＬ当、り５Ｖ、１５時間ンによりて最終１５０μ
ｙの純粋なｐＡＪ４３シラスミドＤＮＡを分画線取した
。
ｐＡＪ ４３ ＤＮＡの性質は次のとおりである。
ｐＡＪ ４３０分子創、の決定はアガロースゲル電気泳
動によった。
動によった。
アガロースゲル電気激動はシャープ（Ｐ、Ａ。
５ｈａｒｐ ）らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１２ ｈ ３０５５（１９７３））によシ、０．８チグ
ルを用い、グル長さ園当、ｊｌ＋、５Ｖで１５時間、定
電圧で′泳動じた。
１２ ｈ ３０５５（１９７３））によシ、０．８チグ
ルを用い、グル長さ園当、ｊｌ＋、５Ｖで１５時間、定
電圧で′泳動じた。
分子量はｐＡＪ ４３を１ケ所切断する制限酵素１１ｉ
ｎｄ ｌｌＩ Ｏ，５ユニットをｐＡＪ ４３ 、０．
５１ｄｌに３７℃、１時間反応させ、切断し、直線状に
した後、分子量既知の分子量マーカー、λファージのＨ
ｉｎｄｌｌｌフラグメン）（ＢＲＬから購入）との移動
度の比較によって算出し、３．４Ｍｄと計算された。
ｎｄ ｌｌＩ Ｏ，５ユニットをｐＡＪ ４３ 、０．
５１ｄｌに３７℃、１時間反応させ、切断し、直線状に
した後、分子量既知の分子量マーカー、λファージのＨ
ｉｎｄｌｌｌフラグメン）（ＢＲＬから購入）との移動
度の比較によって算出し、３．４Ｍｄと計算された。
ｐＡＪ ４３ ＤＮＡの制限酵素切断地図の作成制限酵
素はＢＩＬＬの市販品を使用し、制限酵素によるｐＡＪ
４３ ＤＮＡの切断は、少なくとも３倍過剰以上の酵
素を使用して、各酵素毎に指定された条件で行なった。
素はＢＩＬＬの市販品を使用し、制限酵素によるｐＡＪ
４３ ＤＮＡの切断は、少なくとも３倍過剰以上の酵
素を使用して、各酵素毎に指定された条件で行なった。
制限酵素切断地図作成のためにプラスミドＤＮＡ ’ｆ
１種以上の制限酵素で切断する場合には、第１の制限
酵素切断断片を分離用アガロースダルよシタナカらの方
法（Ｔ、 Ｔａｎａｋａ、＊ Ｂ。
１種以上の制限酵素で切断する場合には、第１の制限
酵素切断断片を分離用アガロースダルよシタナカらの方
法（Ｔ、 Ｔａｎａｋａ、＊ Ｂ。
Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｓユ
２１，３５４（１９７５））によシ単離後、エタノール
沈澱により製編し第２の制限酵素で切断した。切断断片
を実施例３の方法によシアガロースグル電気泳動にかけ
、分子量全算出し、制限酵素切断地図第６図を作成した
。
２１，３５４（１９７５））によシ単離後、エタノール
沈澱により製編し第２の制限酵素で切断した。切断断片
を実施例３の方法によシアガロースグル電気泳動にかけ
、分子量全算出し、制限酵素切断地図第６図を作成した
。
この結果からｐＡＪ ４３はｐＡＪ ６５５からｉｎ
ｖｉｖｏでｄｅｌｅｔｉｏｎ によシ生じたｐｎＲ３２
５のクロラムフェニコール耐性遺伝子領域を言む約ＩＭ
ｄとＩ’ＡＭ３３０の復製維持に必須の領域を含む約２
．４ Ｍｄのフラグメントから成る小型プラスミドであ
ることが−Ｉ］」明した。
ｖｉｖｏでｄｅｌｅｔｉｏｎ によシ生じたｐｎＲ３２
５のクロラムフェニコール耐性遺伝子領域を言む約ＩＭ
ｄとＩ’ＡＭ３３０の復製維持に必須の領域を含む約２
．４ Ｍｄのフラグメントから成る小型プラスミドであ
ることが−Ｉ］」明した。
ｐＡＪ ４３のコピー数の測定
ｐＡＪ ４３を保持するブレビバクテリウム・ラクトフ
エルメンタムＡ６４ （ＡＪ １１９９７ 、 ＦＥＲ
Ｍ −Ｐ６８５７）’Ｌジクロムフェニコール１０μシ
飼を含む５ ｍｌｌのＣ魔Ｇ液体培地に接種し３０′Ｃ
で一晩ｊ’ｉｊ 誉後その０．１ｍｌをクロラムフェニ
コール１０μＪｌ／ｆｎｉを含む５ｍ１！のＣＭＺＧ液
体培地に再度接種した。３０℃で対数増殖期の初期まで
培養し１０００μに包になるようにアンピシリンを添加
後さらに２時間培養し、遠心分離によシ菌体を集め１０
ｍｙｆｎｅのリゾチームを含むトリス・ＥＤＴＡ、Ｎ
ａＣｔバッファ ’１．５ ｍｌ Ｋ Ｑ濁し３７℃で
２時間インキュベー） 後、ＳＤＳ （ｂｉｔ終濃度４
％）を添加し６５℃、２０分間浴白した。
エルメンタムＡ６４ （ＡＪ １１９９７ 、 ＦＥＲ
Ｍ −Ｐ６８５７）’Ｌジクロムフェニコール１０μシ
飼を含む５ ｍｌｌのＣ魔Ｇ液体培地に接種し３０′Ｃ
で一晩ｊ’ｉｊ 誉後その０．１ｍｌをクロラムフェニ
コール１０μＪｌ／ｆｎｉを含む５ｍ１！のＣＭＺＧ液
体培地に再度接種した。３０℃で対数増殖期の初期まで
培養し１０００μに包になるようにアンピシリンを添加
後さらに２時間培養し、遠心分離によシ菌体を集め１０
ｍｙｆｎｅのリゾチームを含むトリス・ＥＤＴＡ、Ｎ
ａＣｔバッファ ’１．５ ｍｌ Ｋ Ｑ濁し３７℃で
２時間インキュベー） 後、ＳＤＳ （ｂｉｔ終濃度４
％）を添加し６５℃、２０分間浴白した。
プロトプラストは完全に溶菌したことを確認した後、フ
ェノール抽出し、ついで２倍量のエタノールの加え一２
０℃でＤＮＡ沈妓させ、沈澱物を少量のトリス・ＥＤＴ
Ａ−ＮａＣＬノ々ツフア−にＭ、濁した。このＤＮＡ溶
液をリゾヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼ１５０
Ａ１１Ａｎｌで３７℃、６０分間反応〕後、再度フェ
ノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え一２０
℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・ＥＤＴ
Ａ−ＮａＣｔノ々ツファーに懸濁後０．８チのアガロー
スゲル電気泳動にかけ、泳動ネガフィルムをデンシトメ
ーターにかけ、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの割合
を測定し、染色体ＤＮＡの分子量を３． ＯＸ １０９
ダルトン、ｐＡＪ４３を３．４ Ｘ １０’ダルトンと
して計算によりコピー数をめたところ、染色体あたり２
４コピー存在することが判明した。同様の方法でめたｐ
ＡＪ ６５５のコピー数は１１コピーであシ、小型化す
ることによシコヒー数が倍増したことを認めた。
ェノール抽出し、ついで２倍量のエタノールの加え一２
０℃でＤＮＡ沈妓させ、沈澱物を少量のトリス・ＥＤＴ
Ａ−ＮａＣＬノ々ツフア−にＭ、濁した。このＤＮＡ溶
液をリゾヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼ１５０
Ａ１１Ａｎｌで３７℃、６０分間反応〕後、再度フェ
ノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え一２０
℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・ＥＤＴ
Ａ−ＮａＣｔノ々ツファーに懸濁後０．８チのアガロー
スゲル電気泳動にかけ、泳動ネガフィルムをデンシトメ
ーターにかけ、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの割合
を測定し、染色体ＤＮＡの分子量を３． ＯＸ １０９
ダルトン、ｐＡＪ４３を３．４ Ｘ １０’ダルトンと
して計算によりコピー数をめたところ、染色体あたり２
４コピー存在することが判明した。同様の方法でめたｐ
ＡＪ ６５５のコピー数は１１コピーであシ、小型化す
ることによシコヒー数が倍増したことを認めた。
（３）染色体ＤＮＡ Ｉｔｌ［片のベクターへの挿入（
１）で得た染色体ＤＮＡ ２０μｇと（２）で得たゲラ
スミ）’ ＤＮＡ １０μｙとを制限エンドヌクレアー
ゼＨｉｎｄ Ｉｌｌでそれぞれｔ−３７℃、１時間処理
し、完全に切断した。６５℃、１０分の熱処理後、両反
応液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１０℃。
１）で得た染色体ＤＮＡ ２０μｇと（２）で得たゲラ
スミ）’ ＤＮＡ １０μｙとを制限エンドヌクレアー
ゼＨｉｎｄ Ｉｌｌでそれぞれｔ−３７℃、１時間処理
し、完全に切断した。６５℃、１０分の熱処理後、両反
応液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１０℃。
２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。６５℃。
５分の熱処理後、反応液に２倍答のエタノールを加えて
連結反応終了後のＤＮＡを沈設採取した。
連結反応終了後のＤＮＡを沈設採取した。
（４） ｐｇｐｃ遺伝子のクローニングＰＥＰＣＴＢ性
が５０％に減少したブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム（Ａｔ １２０６１ ） ｅ受容菌として用い
た。
が５０％に減少したブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム（Ａｔ １２０６１ ） ｅ受容菌として用い
た。
形質転換の方法としては、プロトゲラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、白株を５ｍｌのＣＭＧ
液体培地で対数増殖期の初期才で培養し、ペニシリンＧ
を０．６ユニツト／ ｍｌ添加後、さらに１．５時間振
盪培養し、遠心分離によシ菌体を集め、ＥＨｔｔｏ、５
Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸、２０ ｍＭ
Ｑ化マグネシウム、３．５％ペナッセイブロス（Ｄｉｆ
ｃｏ ）からなるＳＭＭＰ培地（ｐ１４６．５）０．５
ｔｄで洗浄した。次いで１０ｍ９／−のリゾチームを含
むｓｍｐ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプラスト
化を図った。６０００Ｘ、９．１０分間遠心分離後、プ
ロトプラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５ ｍｌのＳ局４
ＰＫＭ度懸濁した。この様にして得られたプロトプラス
トと（３）で調製したＤＮＡ １０μｇを５ｍＭｇＤＴ
Ａ存在下で混合し、ポリエチレングリコールｔｉ終濃度
が３０％になる様に添加した後、ＤＮＡをゾロドプラス
トに取シ込ませる為に室温に２分間放１ろ１した。この
プロトプラス） ’ｉ ＳＭＭＰ培地１ｒｎｌで洗浄後
、ＳＭＭＰ培地１ ｍｌに再懸濁し、形質発現の為、３
０℃で２時間培養した。この培養液−＠ ｐＨ７，０の
プロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト
再生培地は蒸留水１！あたシトリス（ヒドロキシメチル
〕アミノメタン１２．９％ＩＣＣｔ Ｏ，５，９、グル
コース１０１ 、 ＭｇＣ２２’６Ｈ２０８，１、！？
、 ＣａＣｌ２’２Ｈ２０２，２ｇ、ペプトン４１１
粉末酵母エキス４１カザミノ＆ （Ｄｉｆｃｏ社）１ｇ
、Ｋ２ＨＰＯ４０，２！ｉ、グルタミン酸１０ ｇ、ビ
オチン５００μ１１ コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒
天８Ｉ及びクロラムフェニコール３μＭｎｌを含む。
ーメーション法を用いた。まず、白株を５ｍｌのＣＭＧ
液体培地で対数増殖期の初期才で培養し、ペニシリンＧ
を０．６ユニツト／ ｍｌ添加後、さらに１．５時間振
盪培養し、遠心分離によシ菌体を集め、ＥＨｔｔｏ、５
Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸、２０ ｍＭ
Ｑ化マグネシウム、３．５％ペナッセイブロス（Ｄｉｆ
ｃｏ ）からなるＳＭＭＰ培地（ｐ１４６．５）０．５
ｔｄで洗浄した。次いで１０ｍ９／−のリゾチームを含
むｓｍｐ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプラスト
化を図った。６０００Ｘ、９．１０分間遠心分離後、プ
ロトプラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５ ｍｌのＳ局４
ＰＫＭ度懸濁した。この様にして得られたプロトプラス
トと（３）で調製したＤＮＡ １０μｇを５ｍＭｇＤＴ
Ａ存在下で混合し、ポリエチレングリコールｔｉ終濃度
が３０％になる様に添加した後、ＤＮＡをゾロドプラス
トに取シ込ませる為に室温に２分間放１ろ１した。この
プロトプラス） ’ｉ ＳＭＭＰ培地１ｒｎｌで洗浄後
、ＳＭＭＰ培地１ ｍｌに再懸濁し、形質発現の為、３
０℃で２時間培養した。この培養液−＠ ｐＨ７，０の
プロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト
再生培地は蒸留水１！あたシトリス（ヒドロキシメチル
〕アミノメタン１２．９％ＩＣＣｔ Ｏ，５，９、グル
コース１０１ 、 ＭｇＣ２２’６Ｈ２０８，１、！？
、 ＣａＣｌ２’２Ｈ２０２，２ｇ、ペプトン４１１
粉末酵母エキス４１カザミノ＆ （Ｄｉｆｃｏ社）１ｇ
、Ｋ２ＨＰＯ４０，２！ｉ、グルタミン酸１０ ｇ、ビ
オチン５００μ１１ コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒
天８Ｉ及びクロラムフェニコール３μＭｎｌを含む。
３０℃で２週間培う後、約５００個のクロラムフェニコ
ール耐性コロニーが出現してきたのでこれをグルタミン
Ｅ＆を含まない培地（Ｇｌｕ欠培地：２係グルコース、
１Ｓｉｆｔｆａアンモニウム、０．２５襲尿素、０．１
φシん酸二水素カリウム、００４チ硫酸マグネシウム７
水塩、２ ｐＰｍ麩（オン、２ ′ｐｐｍマンガンイオ
ン、２００μｉ／Ａサイアミン塩酸塩、５μルｆビオチ
ン、ＰＩ１７０、寒天１８φ〕にレプリカし、クロラム
フェニコール耐性でかつグルタミン酸要求性の消失した
１株を荘た。この株をＡＪ １２０６６ （ＦＥＲＭ７
Ｐ ７１７６ ）と名句けた。。
ール耐性コロニーが出現してきたのでこれをグルタミン
Ｅ＆を含まない培地（Ｇｌｕ欠培地：２係グルコース、
１Ｓｉｆｔｆａアンモニウム、０．２５襲尿素、０．１
φシん酸二水素カリウム、００４チ硫酸マグネシウム７
水塩、２ ｐＰｍ麩（オン、２ ′ｐｐｍマンガンイオ
ン、２００μｉ／Ａサイアミン塩酸塩、５μルｆビオチ
ン、ＰＩ１７０、寒天１８φ〕にレプリカし、クロラム
フェニコール耐性でかつグルタミン酸要求性の消失した
１株を荘た。この株をＡＪ １２０６６ （ＦＥＲＭ７
Ｐ ７１７６ ）と名句けた。。
（５） 形質転換ｌ′にのプラスミド解析ＡＪ １２０
６６ ′ｆｄ：（２）で述べた方法によシ、溶菌液ｆｆ
：調製し、アガロースゲル市、気泳動法によシ、プラス
ミドＤＮＡを検出したところ、ベクターのｐＡ、ｒ ４
３よシも明らかに大きな分子Ｍ１０．５メガダルトンの
シラスミドが検出された。この組換えシラスミドをｐＡ
Ｊ ２００と名付けた。ｐＡＪ ２００の制限酵素切断
地図を第８図に示す。
６６ ′ｆｄ：（２）で述べた方法によシ、溶菌液ｆｆ
：調製し、アガロースゲル市、気泳動法によシ、プラス
ミドＤＮＡを検出したところ、ベクターのｐＡ、ｒ ４
３よシも明らかに大きな分子Ｍ１０．５メガダルトンの
シラスミドが検出された。この組換えシラスミドをｐＡ
Ｊ ２００と名付けた。ｐＡＪ ２００の制限酵素切断
地図を第８図に示す。
（６）再トランスホーメーシ百ン
（５）で検出された７、１メガダルトンのＤＮＡ断片を
含む組換えシラスミド上にＰＥＰＣ遺伝子が存在するこ
とを確認するためこのシラスミドＤＮＡを用いブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０６１を再
度、形質転換した。
含む組換えシラスミド上にＰＥＰＣ遺伝子が存在するこ
とを確認するためこのシラスミドＤＮＡを用いブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０６１を再
度、形質転換した。
生シたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ３０個を釣ｐ上げグルタミン酸要求性をしらべると、
すべてのコロニーについて要求性が回復しておシ、上記
の組換えシラスミド上ＫＰＲＰＣ遺伝子が存在すること
が明らかとなった。
れ３０個を釣ｐ上げグルタミン酸要求性をしらべると、
すべてのコロニーについて要求性が回復しておシ、上記
の組換えシラスミド上ＫＰＲＰＣ遺伝子が存在すること
が明らかとなった。
（７）安定化シラスミド保持株の採取とシラスミド解析
上記シラスミドは、非常に不安定であったので小型化し
た安定なプラスミドを保持する菌株の採取を試みた。
た安定なプラスミドを保持する菌株の採取を試みた。
コリネ型細菌のゾロトゾラスト形質転換では分子量の大
きいシラスミドを菌体内に導入すると、ＤＮＡ鎖の一部
脱落をおこしプラスミドが小型化することがあシ、再形
質転換株１００株のプラスミド検索をおこなった。その
結果、８株中に小型化プラスミドが検出された。これら
小型化プラスミドは、菌株に安定に保持された。そのう
ち１株よりプラスミドを大量に調製し、ｐＡＪ ２０１
と名付けた。ｐＡＪ２０１の制限酵素切断地図を第７図
に示す。
きいシラスミドを菌体内に導入すると、ＤＮＡ鎖の一部
脱落をおこしプラスミドが小型化することがあシ、再形
質転換株１００株のプラスミド検索をおこなった。その
結果、８株中に小型化プラスミドが検出された。これら
小型化プラスミドは、菌株に安定に保持された。そのう
ち１株よりプラスミドを大量に調製し、ｐＡＪ ２０１
と名付けた。ｐＡＪ２０１の制限酵素切断地図を第７図
に示す。
（８）形質転換株のｒｎ素活性
形質転換株ＡＪ １２０６５ （ＦＥＲＭ −Ｐ ７１
７５ ）、受容菌ＡＪ１２０６１そしてこれらの原株で
ある野生株ＡＴＣＣ１３８６９を、グルタミン酸生産培
地（グルコース８１／ｄｌ 、 ＫＨ２ＰＯ４０，１１
／ｄｌｌ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００、１ｉ／ｄｉ
、 ＦｅＳＯ４’ ７Ｈ２００，００１ｇ／ｄｉ 、
Ｍｎ５Ｏ，・４Ｈ２００，００１１／ｄｉ 、尿素０．
４ ｉ／ａｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ／ｌ 、ビ
オチン３μｌ／ｌ 、及び大豆蛋白加水分解液３６ｍ９
７ｄｌｌ（全窒素として）、を含みＰＨ６，ｓに調節し
た培地）で尿素添加法にょ勺ＰＨを調節しつつ４８時間
振盪培養した。有られた菌体を、０．１Ｍ硫酸アンモニ
ウムを含くむｐｉ４７．５のトリスバッファーに懸濁し
、超音波処理した後３２．０００Ｘｇにて３０分間遠心
分離して、上清を得た。この上清を硫安処理し低分子物
質全除去し、この上清について１００ｍＭ）リス塩酸塩
（ｐＨ７，５）。
７５ ）、受容菌ＡＪ１２０６１そしてこれらの原株で
ある野生株ＡＴＣＣ１３８６９を、グルタミン酸生産培
地（グルコース８１／ｄｌ 、 ＫＨ２ＰＯ４０，１１
／ｄｌｌ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００、１ｉ／ｄｉ
、 ＦｅＳＯ４’ ７Ｈ２００，００１ｇ／ｄｉ 、
Ｍｎ５Ｏ，・４Ｈ２００，００１１／ｄｉ 、尿素０．
４ ｉ／ａｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ／ｌ 、ビ
オチン３μｌ／ｌ 、及び大豆蛋白加水分解液３６ｍ９
７ｄｌｌ（全窒素として）、を含みＰＨ６，ｓに調節し
た培地）で尿素添加法にょ勺ＰＨを調節しつつ４８時間
振盪培養した。有られた菌体を、０．１Ｍ硫酸アンモニ
ウムを含くむｐｉ４７．５のトリスバッファーに懸濁し
、超音波処理した後３２．０００Ｘｇにて３０分間遠心
分離して、上清を得た。この上清を硫安処理し低分子物
質全除去し、この上清について１００ｍＭ）リス塩酸塩
（ｐＨ７，５）。
２ｍＭホスホエノールピルビン酸、３．３ｍＭＭｎＳＯ
４゜１０ ｍＭ Ｎａ１ｌＣＯｓ 、０．１−アセチル
ＣｏＡ 、 ０．１５ ｍＭＮＡＤＨ、１０ｌｉｔ！マ
レートデヒドログネースから成る酵素反応液を用い、Ｐ
ＥＰＣ活性を測定した。反応は比色計セル中で行ない
、オキザロ酢酸の増加を３６６ｎｍにおける吸光度を計
測してＮＡＤＨの減少速度を測定することにより定量し
た結果を第１表に示す。
４゜１０ ｍＭ Ｎａ１ｌＣＯｓ 、０．１−アセチル
ＣｏＡ 、 ０．１５ ｍＭＮＡＤＨ、１０ｌｉｔ！マ
レートデヒドログネースから成る酵素反応液を用い、Ｐ
ＥＰＣ活性を測定した。反応は比色計セル中で行ない
、オキザロ酢酸の増加を３６６ｎｍにおける吸光度を計
測してＮＡＤＨの減少速度を測定することにより定量し
た結果を第１表に示す。
第 １ 表
（９）形質転換株のグルタミン酸生産能ｐＡＪ ２０１
ｉ （４）に記載した形質転換法により、ブレビバク
テリウムラクト７アーメンタムＡＴＣＣ１３８６９とコ
リネパクテリウムダルタミカムＡＴＣＣ１３０６０に導
入し、クロラムフェニコール耐性を指標として形質転換
株を選択した。このようにして得られたブレビバクテリ
ウムラクト７アーメンタムＡＴＣＣ１３８６９由来のＡ
Ｊ １２０６２（ＦＥＲＭ−Ｐ７１７３）とコリネパク
テリウムダルタミヵムＡＴＣＣ１３０６０由来のＡＪ
１２０６７ （ＦＥＲＭ−Ｐ ７１７７）を培養し、グ
ルタミン酸生産能をしらべたとこる第２表に示す結果を
得た。培養は、グルコース１０ ｉ／ｄｌｌ 。
ｉ （４）に記載した形質転換法により、ブレビバク
テリウムラクト７アーメンタムＡＴＣＣ１３８６９とコ
リネパクテリウムダルタミカムＡＴＣＣ１３０６０に導
入し、クロラムフェニコール耐性を指標として形質転換
株を選択した。このようにして得られたブレビバクテリ
ウムラクト７アーメンタムＡＴＣＣ１３８６９由来のＡ
Ｊ １２０６２（ＦＥＲＭ−Ｐ７１７３）とコリネパク
テリウムダルタミヵムＡＴＣＣ１３０６０由来のＡＪ
１２０６７ （ＦＥＲＭ−Ｐ ７１７７）を培養し、グ
ルタミン酸生産能をしらべたとこる第２表に示す結果を
得た。培養は、グルコース１０ ｉ／ｄｌｌ 。
ＫＨ２ＰＯ４０，１１１／ｄｌ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２００，１ｇ／ｄｉ 。
２００，１ｇ／ｄｉ 。
Ｆ＊ＳＯ４’ ４Ｈ２００，００１１１／ ｄｉ 、
ＭｎＳＯ４’ ４Ｈ２００，００１１／ｄノ、大豆蛋白
加水分解液３６ｍ９／ｄｌｃ全窒素として）、サイアミ
ン塩酸塩２００μｇ／ｌ 、ビオチン３μｍ１／ｌ 、
（ＮＨ４）２Ｓｏ４４．５ ｇ／ｄｌｌ （２，５１
１／ｄｉ ）、炭酸カルシウム５ ｉ／ｄｉ） 及びク
ロラムフェニコール１０μｍ１／ｌｉｃ形質転換株の場
合に使用）を含み、ｐＨ７，０（ＫＯＨ）にｖ４節した
培ｊｌ１ｍ２０ｄ’ｔ−肩付７５Ｘコに入れ７２時間、
３１．５℃にて揚魚しつつ行りた。培養終了後、培養液
中のグルタミン酸全グルタミン酸オートアナライザーで
定量した。
ＭｎＳＯ４’ ４Ｈ２００，００１１／ｄノ、大豆蛋白
加水分解液３６ｍ９／ｄｌｃ全窒素として）、サイアミ
ン塩酸塩２００μｇ／ｌ 、ビオチン３μｍ１／ｌ 、
（ＮＨ４）２Ｓｏ４４．５ ｇ／ｄｌｌ （２，５１
１／ｄｉ ）、炭酸カルシウム５ ｉ／ｄｉ） 及びク
ロラムフェニコール１０μｍ１／ｌｉｃ形質転換株の場
合に使用）を含み、ｐＨ７，０（ＫＯＨ）にｖ４節した
培ｊｌ１ｍ２０ｄ’ｔ−肩付７５Ｘコに入れ７２時間、
３１．５℃にて揚魚しつつ行りた。培養終了後、培養液
中のグルタミン酸全グルタミン酸オートアナライザーで
定量した。
第２表
α１ 形質転換株のリジン生産能
ＰＡＪ ２０１ ｆ、（４）に記載した形質転換法によ
シ、ブレビバクテリウムラクト７アーメンタムＡＪ １
２０１９（ＮＲＲＬＢ〜１５３４６） （ホモセリン要
求性）に導入し得られた形質転換株ＡＪ １２０７３
（ＦＢＲＩｖｌ−Ｐ ７２０５ ）についてリジン生産
能をしらべた結果を第３表に示す。
シ、ブレビバクテリウムラクト７アーメンタムＡＪ １
２０１９（ＮＲＲＬＢ〜１５３４６） （ホモセリン要
求性）に導入し得られた形質転換株ＡＪ １２０７３
（ＦＢＲＩｖｌ−Ｐ ７２０５ ）についてリジン生産
能をしらべた結果を第３表に示す。
培養はグルコース１０１／／ｄｉ、硫安５．５ Ｉｔ／
ｄｉ 、ＫＨ２ＰＯ４０，１１１／ｄｔ 、 Ｍｇ５Ｏ
，・７１１２００．１１１／ｄｌ 、 ＦｅＳＯ４”４
Ｈ２００、００１１１／ｄｉ −Ｍｎ５Ｏａ ・４ Ｈ
２Ｏ０−００１Ｊｉ’ ／ｄｅ 、サイアミン塩酸塩２
００μシの、ニコチンアミド０．５１７９７ｄｌ 、大
豆蛋白加水分解液１０５ ｔ’９／ｄｔ （全屋素とし
て）及び、炭酸カルシウム５１１／ｄｌを含みｐＨ１３
，０に調節した培地２０ｒＩＬｌを肩（＝ｊフラスコに
入れ７２時間３１．５℃にて振盪しつつ行った。培養終
了後、Ｊ＠養液中のリジンを高速液体クロマトグラフィ
ーで定ｆｉｔ した。
ｄｉ 、ＫＨ２ＰＯ４０，１１１／ｄｔ 、 Ｍｇ５Ｏ
，・７１１２００．１１１／ｄｌ 、 ＦｅＳＯ４”４
Ｈ２００、００１１１／ｄｉ −Ｍｎ５Ｏａ ・４ Ｈ
２Ｏ０−００１Ｊｉ’ ／ｄｅ 、サイアミン塩酸塩２
００μシの、ニコチンアミド０．５１７９７ｄｌ 、大
豆蛋白加水分解液１０５ ｔ’９／ｄｔ （全屋素とし
て）及び、炭酸カルシウム５１１／ｄｌを含みｐＨ１３
，０に調節した培地２０ｒＩＬｌを肩（＝ｊフラスコに
入れ７２時間３１．５℃にて振盪しつつ行った。培養終
了後、Ｊ＠養液中のリジンを高速液体クロマトグラフィ
ーで定ｆｉｔ した。
第３表
０η 形質転換株のグロリン生産能
ｐＡＪ ２０１を（４）に記載した形質転換法により、
ブレビバクテリウムラクトファーメンタムＡＪ１１２２
５（ＦＥＲＭ−Ｐ ４３７０ ）に導入し得られた形質
転換株について（ＡＪ １２０６３ （ＦＥＲＭ−Ｐ
７１７３） ）グロリン生産能をしらべた。（結果を第
４表に示す）。培養はグルコースＬＯｇ／ａｔ、硫酸ア
ンモニウム６９ ／ｄｌ 。
ブレビバクテリウムラクトファーメンタムＡＪ１１２２
５（ＦＥＲＭ−Ｐ ４３７０ ）に導入し得られた形質
転換株について（ＡＪ １２０６３ （ＦＥＲＭ−Ｐ
７１７３） ）グロリン生産能をしらべた。（結果を第
４表に示す）。培養はグルコースＬＯｇ／ａｔ、硫酸ア
ンモニウム６９ ／ｄｌ 。
ＫＨ２ＰＯ４０，１ｇ／ｄｅ２ＭｇＳ０４・７Ｈ２００
，０８ｇ／ｄｅ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１１／
／ｄｔ 、 ＭｎＳＯ４・４Ｈ２００，００１１／ｄｌ
、サイアミン塩敵塩１１η／！、大豆蛋白加水分解液「
味液」０．１％及び炭酸カルシウムを含みｐＨ’７．０
に調節した培地２０ａ／を肩付フラスコに入れ３１．５
℃にて７２時間振盪することによシ行った。培養終了後
、培養液中のグロリンを高速液体クロマドグ２フイーで
定量した。
，０８ｇ／ｄｅ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１１／
／ｄｔ 、 ＭｎＳＯ４・４Ｈ２００，００１１／ｄｌ
、サイアミン塩敵塩１１η／！、大豆蛋白加水分解液「
味液」０．１％及び炭酸カルシウムを含みｐＨ’７．０
に調節した培地２０ａ／を肩付フラスコに入れ３１．５
℃にて７２時間振盪することによシ行った。培養終了後
、培養液中のグロリンを高速液体クロマドグ２フイーで
定量した。
第４表
（６）形質転換株のスレオニン生産能
ｐＡＪ ２０１を（４）に記載した形質転換法により、
ブレビバクテリウムラクトファーメンタムＡＪ１１１８
８（ＦＥＲＭ−Ｐ４１９０ ）に導入し得られた形質転
換株ＡＪ１２０６４ （ＦＥＲＭ−Ｐ７１７４）のスレ
オニン生産能をしらべた。（結果を第５茨に示す）。培
養は、グルコース１０９／ｄ７！、硫安４．５ Ｅｌｌ
ｄｉ 、 Ｉｔ、Ｈ２ＰＯ４０，１９／ｄｉ 。
ブレビバクテリウムラクトファーメンタムＡＪ１１１８
８（ＦＥＲＭ−Ｐ４１９０ ）に導入し得られた形質転
換株ＡＪ１２０６４ （ＦＥＲＭ−Ｐ７１７４）のスレ
オニン生産能をしらべた。（結果を第５茨に示す）。培
養は、グルコース１０９／ｄ７！、硫安４．５ Ｅｌｌ
ｄｉ 、 Ｉｔ、Ｈ２ＰＯ４０，１９／ｄｉ 。
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，１ｇ／ｄｉ 、 ＦｅＳＯ４
・４Ｈ２００，００１１１／ｄｉ 。
・４Ｈ２００，００１１１／ｄｉ 。
ＭｎＳＯ４”４Ｈ２０ｏ、ｏ ０１１／ｄｉ 、 ？
（アミン塩酸塩３００μｇ／！、ビオチン１００μシＬ
、大豆蛋白加水分解液「味液」４５■／ｃｔｅ （全窒
素として）イソロイシン２５η／ｄｉ 、 ｏイラン３
０■／ｃｔｌ 及ヒｋ Ｈカルシウム５ｇ／ｄｅ を含
みｐｉ−１７，２に調節した。ｔｆＮｍ２０ｍｌ！−ｇ
肩付フラスコに入れ７２時１１ＵＪ３１．５℃にて振盪
することによシ行った。培養終了後、培養液中のスレオ
ニンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。
（アミン塩酸塩３００μｇ／！、ビオチン１００μシＬ
、大豆蛋白加水分解液「味液」４５■／ｃｔｅ （全窒
素として）イソロイシン２５η／ｄｉ 、 ｏイラン３
０■／ｃｔｌ 及ヒｋ Ｈカルシウム５ｇ／ｄｅ を含
みｐｉ−１７，２に調節した。ｔｆＮｍ２０ｍｌ！−ｇ
肩付フラスコに入れ７２時１１ＵＪ３１．５℃にて振盪
することによシ行った。培養終了後、培養液中のスレオ
ニンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。
第５表
ブレビパフチリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０
６１は、ブレビパフチリウム・ラクトファーメンタムＡ
ＴＣＣ１３８６９を２，０００μｇ７ｍｉｔのＮ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロングアニジノＫＯ℃にて
２０分間接触せしめて装具処理し、Ｇ７ｕ欠培地で生育
しえずＧＬｕ欠培地にＬ−グルタミン酸１．０１７ｄｌ
を加えた培地で生育しうる菌株として分離したものであ
る。ＡＪ １２０６１ 、 ＡＪ １１２２５ 、ＡＪ
１１１８８及びＡＪ １２０１９は、それぞれＡＪ
１２０６６又はＡＪ１２０６５ 、 ＡＪ １２０６３
． ＡＪ１２０６４及びＡＪ １２０７３よシ宿主細胞
を損うことなく宿主ａｌ胞中の複合グラスミドを除去す
ることによシ容易に得られる。即ち、グラスミドは宿主
よシ自然に失なわれることもあるし、「除去」操作によ
って除くこともできる（ Ｂａｃｔ、 ｎｅｗ、、 ３
６． ｐ３６１−４０５（１９７２））。除去操作の一
例は以下の通シである：宿主の生育を不完全に阻害する
濃度（２−５０μｍ１／ｒｄ ）のアクリジンオレンジ
を含む培地に、１ゴ当シ約１０’細胞程度になる様に少
量の菌株を接種し宿主菌の生育を不完全に阻害してから
２７−３５℃で一夜培養する（ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、 、 ８８．２６１ （１９６４） ）。培養液
を寒天培地に塗布し、２７−４２℃で一夜￥ｊ養する。
６１は、ブレビパフチリウム・ラクトファーメンタムＡ
ＴＣＣ１３８６９を２，０００μｇ７ｍｉｔのＮ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロングアニジノＫＯ℃にて
２０分間接触せしめて装具処理し、Ｇ７ｕ欠培地で生育
しえずＧＬｕ欠培地にＬ−グルタミン酸１．０１７ｄｌ
を加えた培地で生育しうる菌株として分離したものであ
る。ＡＪ １２０６１ 、 ＡＪ １１２２５ 、ＡＪ
１１１８８及びＡＪ １２０１９は、それぞれＡＪ
１２０６６又はＡＪ１２０６５ 、 ＡＪ １２０６３
． ＡＪ１２０６４及びＡＪ １２０７３よシ宿主細胞
を損うことなく宿主ａｌ胞中の複合グラスミドを除去す
ることによシ容易に得られる。即ち、グラスミドは宿主
よシ自然に失なわれることもあるし、「除去」操作によ
って除くこともできる（ Ｂａｃｔ、 ｎｅｗ、、 ３
６． ｐ３６１−４０５（１９７２））。除去操作の一
例は以下の通シである：宿主の生育を不完全に阻害する
濃度（２−５０μｍ１／ｒｄ ）のアクリジンオレンジ
を含む培地に、１ゴ当シ約１０’細胞程度になる様に少
量の菌株を接種し宿主菌の生育を不完全に阻害してから
２７−３５℃で一夜培養する（ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、 、 ８８．２６１ （１９６４） ）。培養液
を寒天培地に塗布し、２７−４２℃で一夜￥ｊ養する。
培地上に出現したコロニーの多くは、グラスミドが除去
されている可能性が高い。
されている可能性が高い。
又ＡＪ １１２２５ （２，４−デヒドロプロリン耐性
）は特公昭５７−２２３１９に、ＡＪ １１１８８ （
α−アミノ−β−ヒドロキシ−吉草酸及びＳ−メチルシ
スティンスルホキサイド耐性、Ｌ−インロイシン及びＬ
−ロイシン安水性）は特公昭５６−３０３８に記載され
ている。
）は特公昭５７−２２３１９に、ＡＪ １１１８８ （
α−アミノ−β−ヒドロキシ−吉草酸及びＳ−メチルシ
スティンスルホキサイド耐性、Ｌ−インロイシン及びＬ
−ロイシン安水性）は特公昭５６−３０３８に記載され
ている。
第１図：複合シラスミドｐＡＪ ６５５の制限酵；！８
切断地図 第２図：複合グラスミドｐＡＪ ６１１の制限酵素切断
地図 第３図：複合！ラスミドｐＡＪ １８４４の制限酵素切
断地図 ８４ 図：＋Ｍ合プラスミドｐＡＪ ４４０の制限酵素
切断地図 第５図：複合シラスミドｐＡＪ ３１４８の制限酵素切
断地図 ｍ６図：ａ合プラスミドｐＡＪ ４３の制限酵素切断地
図 第７図： ｐＡＪ ２００の１ｌｊｌｌ限醇素切断酵素
第８ 図： ｐＡＪ ２０１ ノｉｉｌＪＩＵｅｇ切断
地図特許出願人 味の素株式会社 第 １ 図 寓 禽 第３図 雲℃ 第４図 Ｘ：Ｘｂａ工 第５図 Ｅ ：ＥｃｏＲ工 ■工 ：ｌ１ｉｎｄＴ工 ＩＩ工 ：１ｌｉｎｄエエエ Ｓ ：５ａＣＩ Ｘ ：Ｘｏｒエエ 第６図
切断地図 第２図：複合グラスミドｐＡＪ ６１１の制限酵素切断
地図 第３図：複合！ラスミドｐＡＪ １８４４の制限酵素切
断地図 ８４ 図：＋Ｍ合プラスミドｐＡＪ ４４０の制限酵素
切断地図 第５図：複合シラスミドｐＡＪ ３１４８の制限酵素切
断地図 ｍ６図：ａ合プラスミドｐＡＪ ４３の制限酵素切断地
図 第７図： ｐＡＪ ２００の１ｌｊｌｌ限醇素切断酵素
第８ 図： ｐＡＪ ２０１ ノｉｉｌＪＩＵｅｇ切断
地図特許出願人 味の素株式会社 第 １ 図 寓 禽 第３図 雲℃ 第４図 Ｘ：Ｘｂａ工 第５図 Ｅ ：ＥｃｏＲ工 ■工 ：ｌ１ｉｎｄＴ工 ＩＩ工 ：１ｌｉｎｄエエエ Ｓ ：５ａＣＩ Ｘ ：Ｘｏｒエエ 第６図
Claims (3)
- （１） ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖し得るプ
ラスミドベクターに接続されている組換えＤＮＡ 。 - （２） ホスホエノールビルビン酸カルがキシラーゼを
コードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖し得るプ
ラスミドベクターに接続されている組換えＤＮＡを有す
るコリネ型細菌。 - （３） ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードする遺伝子がコリネ型細蘭細胞内で増殖し得るプ
ラスミドベクターに接続されている組換えＤＮＡを有す
るコリネ型細菌を培養することを特徴とするＬ−アミノ
酸の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58157512A JPH0783714B2 (ja) | 1983-08-29 | 1983-08-29 | 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 |
| DE8484110141T DE3485750D1 (de) | 1983-08-29 | 1984-08-24 | Rekombinante dna mit einem darin insertierten phosphoenol-pyruvat-carboxylase-gen, bakterien, die die genannte rekombinante dna enthalten und ein verfahren zur herstellung von aminosaeuren unter verwendung der genannten bakterien. |
| EP84110141A EP0143195B1 (en) | 1983-08-29 | 1984-08-24 | Recombinant dna having a phosphoenol pyruvate carboxylase gene inserted therein, bacteria carrying said recombinant dna and a process for producing amino acids using said bacteria |
| US06/645,107 US4757009A (en) | 1983-08-29 | 1984-08-28 | Recombinant DNA having a phosphoenol pyruvate carboxylase gene inserted therein, bacteria carrying said recombinant DNA and a process for producing amino acids using said bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58157512A JPH0783714B2 (ja) | 1983-08-29 | 1983-08-29 | 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 |
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|---|---|
| JPS6087788A true JPS6087788A (ja) | 1985-05-17 |
| JPH0783714B2 JPH0783714B2 (ja) | 1995-09-13 |
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ID=15651292
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| EP2559754A2 (en) | 2011-08-18 | 2013-02-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family enterobacteriaceae having enhanced expression of the flagella formation and motility cascade genes |
| EP2818555A2 (en) | 2004-10-07 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a basic substance |
| WO2015041265A1 (ja) | 2013-09-17 | 2015-03-26 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ－アミノ酸の製造方法 |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
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