JPS62186795A - アミノ酸の製造法 - Google Patents

アミノ酸の製造法

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JPS62186795A
JPS62186795A JP61028271A JP2827186A JPS62186795A JP S62186795 A JPS62186795 A JP S62186795A JP 61028271 A JP61028271 A JP 61028271A JP 2827186 A JP2827186 A JP 2827186A JP S62186795 A JPS62186795 A JP S62186795A
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JP
Japan
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threonine
brevibacterium
isoleucine
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recombinant dna
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JP61028271A
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Ryoichi Katsumata
勝亦　瞭一
Toru Mizukami
水上　透
Kunikata Kino
邦器 木野
Yasuhiro Kikuchi
泰弘 菊池
Keiko Hotta
堀田　恵子
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KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物のホモセリンデヒドロゲナーゼ（
以下ＨＤと略す）、ホモセリンキナーゼ（以下ＨＫと略
す）およびスレオニンシンターゼ（以下ＴＳと略す）の
合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え
体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物
中にＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを生成蓄積
させ、該培養物からＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイ
シンを採取することを特徴とするし−スレオニンおよび
Ｌ−イソロイシンの製造法に関する。従って、本発明は
バイオインダストリーの産業分野に係り、特に医薬８食
品および飼料工業にふいて有用なＬ−スレオニンおよび
Ｌ−イソロイシンの製造分野に関する。
従来の技術 ］リネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などの微
生物を用いる発酵法によるＬ−スレオニンおよびＬ−イ
ソロイシンの生産方法としては、該菌種の野生株から誘
導された突然変異株を用いる方法が知られている。Ｌ−
スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産性変異株とし
ては、アミノ酸の要求性変異やアミノ酸のアナログに対
する耐性変異あるいはそれらの変異を併有する菌株が知
られており、例えば、特開昭４７−１９０８７や特公昭
５４−３２０７０などに記載されている。
一方、このような突然変異の付与により育種された菌株
とは別に、組換えＤＮＡ技術を用いて育種された菌株に
よるＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの製造法も
知られている。例えば、大腸菌のスレオニン生合成に係
る酵素をコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡをコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に保
有させ、該菌株を用いてＬ−スレオニンまたはＬ−イソ
ロイシンを発酵生産する方法が示されている（特開昭５
８−１２６７８９および特開昭６Ｏ−３０６９３）。
また、ブレビバクテリウム属菌株のＨＤをコードする遺
伝子（以下ＨＤ遺伝子という）を含む組換え体ＤＮＡを
保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種によるＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシン
の製造法も開示されている（特開昭６Ｏ−１２９９５）
。さらには、コリネバクテリウム属菌株のＨＤ遺伝子お
よびＨＫをコードする遺伝子（以下ＨＫ遺伝子という）
を含む組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属菌種によるし−スレオニン
およびＬ−イソロイシンの製造法も開示されている（特
願昭６Ｏ−１２１６７４）。
発明が解決しようとする問題点 Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンに対する需要が
増大するにつれ、これらのアミノ酸の製造法の改良がま
すます望まれている。本発明者は、組換えＤＮＡ技術を
用いてコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム
属菌種のＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産
能力の向上をはかるべく研究を行った。
問題点を解決するための手段 ］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物のＬ−スレオニンの生合成に係る酵素のうち
、ＨＤ、ＨＫおよびＴＳの遺伝情報を担うＤＮＡ断片を
含む組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物に保有させることによ
り、Ｌ−スレオニンおよびＬ−スレオニンを前駆体とし
て生合成されるし一イソロイシンの生産能が著しく向上
することを見出し、本発明を完成するに至った。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
由来の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いるＬ−スレオ
ニンまたはＬ−イソロイシン生産菌としては、前記のよ
うにＨＤ遺伝子またはＨＫ遺伝子を用いた例は記載され
ているが、両遺伝子に加えてＴＳ遺伝子を併用した例は
知られておらず、３種の遺伝子の増幅によりＬ−スレオ
ニンおよびＬ−イソロイシンの生産性が一段と向上する
ことは本発明により初めて見出されたものである。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明によれば、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種由来のＨＤ、ＨＫおよびＴＳの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮ
Ａを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ
−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを生成蓄留させ、
該培萎物からＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを
採取することにより、高収率でＬ−スレオニンまたはＬ
−イソロイシンを製造することができる。
宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種としては、コリネ型グルタミン
酸生産菌として知られる微生物は全て用いることができ
るが、好適には下記の菌株が使用される。
コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ３１８３３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ΔＴＣＣ１３８６８ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０ ブレビバクテリウム・テ°イバリカツムＡＴＣＣ１４０
２０ ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０
６８ ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンクムＡＴＣＣｌ
　３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ 宿主微生物としては、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロ
イシン非生産性の菌株を用いることもできるが、好まし
くはＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−リジ
ン生産性を有する菌株を用いる。Ｌ−スレオニン、Ｌ−
イソロイシンまたはＬ−ＩＪジン生産性菌株は、アミノ
酸要求性変異。
アナログ耐性変異またはこれらの変異を組み合わせる公
知の変異誘導法により造成できる〔プレスコツト・アン
ド・ダンズ・インダストリアル・マイクロバイオロジイ
（ＰＲ［１ＳＣＯＴＴ　ａｎｄ　ＤＵＮＮ’Ｓ　ＩＮＤ
ＵＳＴＲＩＡＬＭＩＣＲＯＩ３＋０ＬＯＧＹ　）第４版
Ｇ、　Ｒｅｅｄ鳩、　　Ｔｈｅ　ＡＶＩＰｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｉｎｃ、　Ｃｏｎｎ、　　（
１９８２）　　ＰＰ、７４８−．８０１　　Ｋ、Ｎａｋ
ａｙａｍａ）。
Ｌ−ＩＪジン生産性微生物を宿主としたときは、Ｌ−Ｉ
Ｊリジン生産がＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシン
の生産に転換され、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロイ
シンを著量蓄積する菌株を得ることができる。本発明に
よるＬ　　ＩＪリジン産菌によるＬ−スレオニンまたは
Ｌ−イソロイシンへの著量な代謝転換は、本発明により
初めて見出されたものである。
本発明において、ＨＤ、ＨＫおよびＴＳの各遺伝子の供
給源となる微生物としては、コリネ型グルタミン酸生産
菌でＨＤ、ＨＫおよびＴＳ活性を有するものであればい
かなる微生物でもよく、例えばコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物の野生株ある
いはそれから誘導したＬ−スレオニンまたはＬ−イソロ
イシン生産性変異株を用いることができる。これらの菌
株の染色体ＤＮＡは、本発明者が特開昭５８−１２６７
８９に示したように、培養中にペニシリン処理した菌体
をリゾチームおよび界面活性剤で処理して溶菌した後、
常法で除蛋白し、次いでエタノール沈殿させることによ
り単離できる。
ＨＤ、、ＨＫおよびＴＳ各遺伝子を含むＤＮＡ断片を組
み込むためのベクターとしては、コリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属菌種中で自律複製できるも
のであれば特に限定されないが、例えばｐｃＧｌ（特開
昭５７−１３４５００）。
ｐＣＧ２　（特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４゜ｐ
ｃＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９）。
ｐＣＥ５４．ｐｃＢｌ　０１　（いずれも特開昭５８−
１０５９９９）、ｐｃＥ５１　（特開昭６Ｏ−３４１９
７）およびｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３　（いずれもモレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティクス（Ｍａｔ
、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　１９６．１７５　（１９８
４））などのプラスミドを使用することができる。プラ
スミドベクターは、本発明者が特開昭５７−１３４５０
０あるいは特開昭５７−１８６４８９に示したように、
菌体をリゾチームおよび界面活性剤で溶菌後、クリヤー
ドライゼートを調製し、ポリエチレングリコールでＤＮ
Ａを沈殿させた後に塩化セシウム−臭化エチジウム密度
匂配遠心にかけ、ＣＣＣ−ＤＮＡとし゛て単離精製する
ことができる。
ＴＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクタープラスミドとの
組換え体ＤＮＡは、染色体ＤＮＡとベクタープラスミド
を制限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼで処理するか
、あるいは切断末端をターミナルトランスフェラーゼや
ＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、ＤＮＡ！Ｊガー
ゼを作用させるなどの常法〔メソッヅ・イン・エンチモ
口ジイ（−可ｅｔｈｏｃｌｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）、　６８　（１９７９）　〕により、種々の組換
え体混成物とともに生成させることができる。
コリネバクテリウム名またはブレビバクテリウム属の菌
株から通常の変異操作によって誘導したスレオニン要求
性で、かつホモセリンを分泌生産しないＴＳ欠損変異株
を上記組換え体混成物を用いて形質転換し、スレオニン
非要求性となった形質転換株を選択することにより、Ｔ
Ｓ遺伝子を組み込んだ組換え体ＤＮＡを取得することが
できる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
を形質転換するには、本発明者が開発したプロトプラス
トを用いる方法（特開昭５７−１８６４９２および特開
昭５７−１８６４８９＞により実施できる（具体的には
実施例に示す）。
同様にして、ＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ断片
とベクタープラスミドとの組換え体ＤＮＡを得ることが
できる（特願昭６０＝１２１６７４）。すなわち、染色
体ＤＮＡとベクタープラスミドの組換え体混成物を用い
て、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌株から誘導した、ホモセリン要求性のＨＤ欠損変異株
またはスレオニン要求性でホモセリンを分泌生産するＨ
Ｋ欠損変異株を形質転換して、ホモセリンまたはスレオ
ニン非要求性となった形質転換株からＨＤまたはＨＫ遺
伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを取得できる。こ
のようにして得られた組換え体ＤＮＡの中から、ＨＤお
よびＨＫの両欠損変異をともに復帰させるものを選ぶこ
とにより、）（ＤおよびＨＫ両遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドを得ることができる。
以上のようにして取１暮したＴＳ遺伝子を含むＤＮＡ断
片とＨＤ　−ＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ断片とをさらに
組み換えて３種の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを得るこ
とができる。この組換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入す
ることにより、３種の遺伝子を増幅することができる。
細胞内で共存できる別個のベクタープラスミドに各々の
遺伝子を組み換え、それらの組換え体ＤＮＡを宿主微生
物に共有させても３種の遺伝子を増幅でき、同様なＬ−
スレオニンまたはＬ−イソロイシンの増産効果が得られ
る。
上記の工程において、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属菌種の野生株の染色体ＤＮＡを供与源
とした場合には、野生型のＨＤ。
ＨＫおよびＴＳの各遺伝子を含む組換え体ＤＮＡが得ら
れ、これをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属菌株に保有させ、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソ
ロイシンの生産性を向上させることができる。しかしな
がら、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種において、スレオニン生合成に係るＨＤはスレオ
ニンでフィードバック阻害を受け、スレオニン合成を制
御することが知られている〔アグリカルチュラル・バイ
オロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、）。
逓　（５）、　９９３　（１９７４））ので、この阻害
から解除された変異型のＨＤをコードする遺伝子を有す
る組換え体プラスミドを用いる方がＬ−スレオニンおよ
びＬ−イソロイシンの生産性は高まる。
このような変異型のＨＤ遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドは、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミスト
リ４　（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、　３８
（５）、９９３（１９７４）に記載されているように、
スレオニンのアナログ例えばα−アミノ−β−ヒドロキ
シ吉草酸（以下Ａ）ＩＶと略す）に耐性となった変異株
、すなわちＨＤ活性のスレオニンによる阻害が解除され
た菌株を分離し、その染色体ＤＮＡを供与源として、野
生型の遺伝子から出発したと同様な方法で取得できる。
あるいは野生型の遺伝子を含む組換え体プラスミドを保
有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種を常法通り変異処理し、スレオニンアナログ耐性
を付与することによっても、スレオニンによる阻害を受
けなくなったＨＤ遺伝子を含む組換え体プラスミドを調
製できる。
野生型あるいは変異型のＨＤ、ＨＫおよびＴＳの各遺伝
子を含む組換え体プラスミドは、前記のようなプロトプ
ラストを用いる形質転換法によりコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属微生物に導入できる。これ
らの組換え体プラスミド保有株によるＬ−スレオニンま
たはＬ−イア０イシンの生産は、従来の発酵法によるＬ
−スレオニンまたはＬ−イソロイシン製造に用いられる
培養方法により行うことができる。すなわち、該形質転
換株を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸。
ビタミンなどを含有する通常の培地で、好気的条件下、
温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培養物中に
Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンが生成蓄積する
のでこれを採取する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
？Ｒ粉加水分解物、ＵＪ蜜などの炭水化物、ポリアルコ
ール、ピルビン酸、フマール酸。
乳酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに微生
物の資化性によって、炭化水素、アルコール頚なども用
いることができる。特に廃糖蜜は好適に用いられる。
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。
酢酸アンモニウムなどの各種無段および有機アンモニウ
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペ
プトン、ＮＺ−アミン、肉エキス。
酵母エキス、コーン・スチーブ・リカー、カゼイン加水
分解物、フィツシュミールあるいはその消化物、輛加水
分解物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。
さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、アミ
ノ酸源などは、前記したような他の培地成分によって培
地に供給されれば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培
養期間は通常１〜５日間で培地にＬ−スレオニンおよび
／またはＬ−イソロイシンが蓄積する。培養終了後、菌
体を除去して活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公
知の方法で培養液からＬ−スレオニンおよび／またはＬ
−イソロイシンを回収する。
このようにしてコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物のＨＤ、ＨＫおよびＴ’Ｓの
各遺伝子を含む組換え体プラスミドを保有させたコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属の微生物を
用いることにより、高収率でＬ−スレオニンおよび／ま
たはＬ−イソロイシンを生産することができる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例 （１〕　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
３１８３３の染色体ＤＮＡとベクターｐｃＧ１１および
ｐＣＥ５４の調製 ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを純水
ｉｆに含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）で増殖した
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
の種培養を４０　Ｑｍｌの半合成培地ＳＳＭ　Ｃグルコ
ース２０　ｇ、　（Ｎ　Ｈ＝）２３０．１０ｇ、尿素３
ｇ、酵母エキスＩｇ。
ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、Ｍｇ（１２・６ＨｚＯＯ，４ｇ。
Ｆｅ５０＜７Ｈ２０１０ｍｇ、Ｍｎ５Ｏ＜４〜６　Ｈ２
００，２ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏ−・７Ｈ２００，９ｍｇ、　
Ｃｕ　Ｓ０４　・５　Ｈ２Ｏ０，４ｍｇ、　Ｎ　３２Ｂ
ｎｏｔ’　１０８２０　０．０９ｍｇ、　（ＮＨ４）６
Ｍ　０７０２４　’４Ｈ２００，０４ｎ＋ｇ、ピオチン
　３０ｇおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１１に含み
、ｐＨ７，２に調整した培地〕に接種して３０℃で振盪
培養する。東京光電比色計で６６０１ｍにおける吸光度
（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０．２になった時点で培養液
中０．５単位／ｍｌの濃度となるようにペニシリンＧを
添加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０．６になるま
で生育させた。
培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液Ｃ０，０３Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）、０．００５Ｍ　　ＥＤＴＡ（エチレンジｒミン
四酢酸二ナトリウム）。
０．０５Ｍ　　ＮａＣｊ！、ｐＨ８，０）　で洗浄後、
リゾチーム溶液（２５％シヨ糖、０．ＩＭ　ＮａＣｊ！
。
０、０５　Ｍ　）リス、０．８ｍｇ／ｍｌリゾチーム、
ｐＨ８，０，以下同じ）１０ｍｌに懸濁し、３７℃で４
時間反応を行った。集菌した菌体から斎藤−三浦の方法
Ｃ３ａｉｔｏ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ、　Ｋ、　：
バイオキミカ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、　７２．６１９　（１
９６３）］に従って高分子染色体ＤＮＡを単離した。
ベクターとして用いたｐｃｃｌｌ（特開昭５７−１８３
７９９）は、本発明者が先に開発したコリネバクテリウ
ム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ１（特開昭５７−
１３４５００）とコリネバクテリウム・グルタミクムの
プラスミドｐＣＧ４　（特開昭５７−１８３７９９）由
来のスベクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性形質
をコードするＤＮＡ断片とを連結させたプラスミドであ
る。詳しくはｐｃＧｌのＢｇｊｌ！■切断断片とｐＣＧ
４のスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性形質
をコードするＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片とを両者の同一
粘着末端を利用して連結させたプラスミドである。
ベクターｐＣＥ５４（特開昭５８−１０５９９９）は、
本発明者が先に開発したプラスミドｐＣＧ２（特開昭５
８−３５１９７）とエシエリンア・コリのプラスミドｐ
ＧＡ２２（ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１４０゜４００　（１９７９
））とを各々−カ所しかないＰｓｔｌ切断部位で連結し
たプラスミドである。
これらのベクタープラスミド、ｐｃＧｌｌおよびｐＣＥ
５４は各々を保有するコリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ３９０１９（ＡＴＣＣ３１８３３から誘導し
たりゾチーム感受性変異を有する菌株）の培養菌体から
次の方法て単離した。
該菌株を４００ｍ１ＮＢ培地で３０℃で振盪培養し、○
Ｄ約０．７になるまで生育させた。菌体を集菌しＴＢＳ
緩衝液で洗浄後、リゾチーム溶液１０ｍ１に懸濁し、３
７℃で２時間反応させた。
反応液に５Ｍ　ＮａＣβ２．４ｍｌ、　０．５Ｍ　ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８，５）　０．６ｎ＋ｌ、　　４％ラウリル
硫酸ナトリウムと０，７Ｍ　　ＮａＣ１からなる溶液４
．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから氷水上に
１５時間装いた。溶菌物を遠心管に移し、４℃で６０分
間６９．４００ｘｇの遠心分離にかけ上澄液を回収した
。これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）　６．０００（牛丼化学薬品社製）を加え
、静かに混和して溶解後、氷水上に置いた。１０時間後
、１．５００ｘｇで１０分間遠心分離してペレツトを回
収した。ＴＢＳ緩衝緩衝液５壱ｌえてペレットを静かに
再溶解してから１．５　ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイ
ド２．０ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静
かに溶解し、密度を１．５８０に合わせた。
この溶液を１０５．０００ｘｇ、　　１８℃で４８時間
超遠心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チュ
ーブ下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブの側
面から注射器で抜きとることによってｐｃｃ　１１およ
びｐＣＥ５４プラスミドＤＮＡをそれぞれ分離した。こ
の分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量百
分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ緩衝
液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）〕
で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、し
かる後にＴ　Ｅ　Ｓ　１１衝液に対して透析した。
（２）ＴＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング上記
で調製したｐＣＧ　１１プラスミドＤＮＡ３■を含む制
限酵素Ｂｇβ■用反応液（トリス１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２
６ｍＭ、ＮａＣｊｌ！　　１００ｍＭ、２−メルカプト
エタノール　７　ｍＭ。
ｐＨ７，５）６０誠に６単位のＢｇｊＭ［（宝酒造社製
）を添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分
間加温して反応を停止させた。
一方、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１
８３３の染色体ＤＮＡ８ＪＬｇを含むＢｇｊｆＩＩ用反
応液１４０ｍに４単位のＢｇｌ！Ｕを添加し、３７℃で
６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止
させた。
両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ用緩衝
液（トリｘ５５　ＱｍＭ、ＭｇＣβ２６６ｍＭ、ジチオ
スレイトール１００ｍＭ、ｐＨ７，６）４０ｍ、５ｍＭ
　　ＡＴＰ　　４０ｍ、Ｔ４リガーゼ（全酒造社製、１
単位／ｍ）０．３ｍおよび水１２０ｍを加え、１２℃で
１６時間反応させた。
このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ３１８３３から誘導されたに６０株〔本
菌株はスレオニン要求性（ＴＳ欠損）の変異、ホモセリ
ンを分泌産生じない形質を有している〕の形質転換に供
した。
Ｋ２Ｏ株は昭和６１年１月２４日付で工業技術院微生物
工業技術研究所（微工研）にＦＥＲＭＢＰ−９７３とし
て寄託しである。
形質転換には次のように調製されるプロトプラストを用
いた。Ｋ・６０株の種培養をスレオニン２０Ｌｃｇ／ｍ
ｌを含む３３Ｍ培地に植菌して３０℃で振盪培養し、Ｏ
Ｄが０．２になった時点でペニシリンＧを０．５単位／
ｍｌとなるように添加した。培養を継続し、ＯＤが０．
６になるまで生育させた。
培養液から菌体を集菌し、ＲＣＧＰ培地〔グルコース５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、に２ＨＰＯ
４３，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ。
ＭｇＣｊ！ｚ・６Ｈｚ○　０．４１ｇ、ＦｅＳＯ４・７
Ｈ２０１０ｍｇ、ＭｎＳ○、・４〜６Ｈ６Ｈ２Ｏ２，Ｚ
ｎ５Ｏ，・７Ｈ２００，９ｍｇ、　　（Ｎ）（４）６Ｍ
ＯｔＯｉ＜’４ＨｚＯＯ，０４ｍｇ、ビオチン３０■、
サイアミン塩酸塩２　ｍｇ　＊コハク酸二ナトリウム１
３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１０．０００）
３０ｇを水１１に含む培地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチー
ムを含む溶液（ｐＨ７，６）に約１０９細胞／ｍｌとな
るように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩
やかに振盪反応してプロトプラスト化した。
このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり、
２．５００ｘｇで５分間遠心分離し、７３ＭＣ緩衝液（
ＭｇＣｊ！２　１０ｍＭ、ＣａＣＬ３ＱｍＭ、）リス５
０ｍＭ、　　ショ糖４００ｍＭ。
ｐＨ７，５＞１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ
３ＭＣ緩衝液中ｌに再懸濁した。この菌液に２倍高濃度
の７３ＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１混合液
１００ｍを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に２
０％ＰＥＣ；６．０００を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して
混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）２ｍｌ
を添加し、２．５００ｘｇで５分間遠心分離にかけて上
澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣ
ＧＰ培地に懸濁してから、Ｑ、２ｍｌをスペクチノマイ
シン４００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ
培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７．２）に塗抹し
、３０℃で７日間培養した。
寒天培地上に生育したコロニーをかき集め、生理食塩水
で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍｌにＩｚした。この
菌液をスペクチノマイシン１００■／ｍｌを含有する最
少寒天培地Ｍｌ（グルコースｌＯｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４
１ｇ、Ｋ（１０，２ｇ、　Ｍｇ５ｏ４・’７Ｈ２ｏ　　
Ｏ，２ｇ、Ｆｅ５０゜・７Ｈ２０１０ｍｇ、ＭｎＳ○＜
４〜６８２００．２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＜　・７Ｈ２００，
９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５　Ｈ２００，４ｍｇ、　Ｎ　ａ
２Ｂ４０７・１０Ｈ２００、０９ｍｇ、　（Ｎ　Ｈ４）
６Ｍ　Ｏｔ○２４・４Ｈ，ＯＯ，０４ｍｇ、ビオチン５
０■、ｐ−アミノ安息香酸２．５ｍｇ、サイアミン塩酸
塩１ｍｇおよび寒天１６ｇをＩｆ中に含み、ｐ　Ｈ７，
２に調整した培地〕上に再塗布して３０℃で３日培養し
、スレオニン非要求性でスペクチノマイシンに耐性とな
った形質転換株を選択した。
これらの形質転換株を３３Ｍ培地で培養し、上記と同様
にして、ペニシリンＧ処理をした後、集菌した培養菌体
から、上記（１）でｐｃＧｌｌを単離したのと同様な方
法でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株か
ら得られ、ｐＴＳ８と命名したプラスミドは、各種制限
酵素による切断産物をアガロースゲル電気泳動法で解析
した結果、ｐｃＧｌｌの唯ｌカ所のＢｇｉ切断部位に８
．５キロベース（Ｋｂ）のＥ３ｇβ■ＤＮΔ断片が挿入
された構造を有していることがわかった。このＢｇβ■
切断片は第１図に示すような位置に３カ所のＰｓｔｌ切
断部位と１カ所のＳａｊ！　Ｉ切断部位を有していた。
（３）ＨＤ遺伝子とＨＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクロ
ーニング ＨＤおよびＨＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング
方法はＴＳ遺伝子のクローニングと同様に行った。ベク
ターには上記（１）で調製したｐＣＥ５４プラスミドを
用い、クローニングのための受容菌としてＨＤ欠損株を
用いた。
ｐＣＥ５４プラスミドＤＮＡ３■およびＡＴＣＣ３１８
３３の染色体ＤＮＡ８ｇを含むＳａ１■用反応液（トリ
ス１０ｍＭ、ＭｇＣＬ　　６ｍＭ。
ＮａＣｊ！　　２００ｍＭ、ｐＨ７，５）２００ｍに１
Ｏ単位の５ａｉｌ（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６
０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止さ
せた。
反応物に、ｌＯ倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ緩衝液４０ｍ、
５ｍＭ　　ＡＴＰ４０ＡＩ１．Ｔ４リガーゼ（１単位／
Ａｌ２）０．３ｍおよび水１２０℃を加え、１２℃で１
６時間反応させた。
同リガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタミ
クムΔＴＣＣ３１８３３由来のりゾチーム感受性変異株
から誘導されたに５３株〔ホモセリン要求性（ＨＤ欠損
）、ロイシン要求性、ＦＥＲＭ　　Ｐ−８２５７として
昭和６０年５月２３日付で微工研に寄託〕の形質転換に
供した。すなわち、Ｋ５３株の種培養をＮＢ培地に植菌
して３０℃で振盪培養し、ＯＤが０．６になった時点で
集菌した。菌体を、上記（２）と同様にしてプロトプラ
スト化し、プロトプラスト菌液とりガーゼ反応混合物を
ＰＥＧ処理し、カナマイシフ　３００ｘ／ｍｌを含むＲ
ＣＧＰ寒天培地に塗抹し、培養した。
同培地に生育したコロニーをかき集め、生理食塩水にて
遠心洗浄後、カナマイシン２０■／ｍ１およびロイシン
５０■／ｍｌを含む最少培地Ｍ１に再塗布し、ホモセリ
ン非要求性かつカナマイシン耐性となった形質転換株を
得た。
形質転換株の一株から上記（１）と同様にしてプラスミ
ドＤＮＡを単離した。このプラスミドをｐＣｈｏｍ３と
命名した。同プラスミドはｐＣＥ５４の唯１カ所のＳａ
βＩ切断部位に３．６　Ｋ　ｂのＳａβＩ　　ＤＮＡ断
片が挿入された構造を有していた。３．６　Ｋ　ｂのＳ
ａＩ！Ｉ　　ＤＮＡ断片上には、第１図に示すような位
置に２カ所のＰｓｔＩ切断部位を有していた。
ｐＣｈｏｍ３プラスミド上にＨＤおよび）（Ｋ両遺伝子
が存在することを次のようにして確認した。ｐＣｈｏｍ
３　　ＤＮＡを用い、上記と同様な方法でに５３株およ
びに５４株〔スレオニン要求性でホモセリン生産性のＨ
Ｋ欠損株。
ＦＥＲＭ　　Ｐ−８２５８として昭和６０年５月２３日
付で微工研に寄託〕のプロトプラストを形質転換した。
Ｋ５４株のプロトプラストは前記（２）と同様、ペニシ
リン処理菌体から調製した。
カナマイシン耐性で選択される形質転換株は、同時にホ
モセリンまたはスレオニン非要求性を示し、これらの形
質転換株はｐｃｈｏｍ３と同様な構造を有していた。こ
のことから、ｐＣｈｏｍ３にはＨＤおよびＨＫ両遺伝子
がクローン化されていることがわかる。
同様の試験をｐ’ｒｓ８プラスミドとに５３およびに５
４株、ｐ（ｈｏｍ３プラスミドとに６０株につき行った
ところ、いずれの場合も、要求性の回復が見られなかっ
たところから、ｐＴＳ８プラスミド上にはＨＤおよびＨ
Ｋ遺伝子が、ｐＣｈｏｍ３プラスミド上にはＴＳ遺伝子
が含まれていないことがわかる。
（４，）　　ＨＤ、ＨＫおよびＴＳ遺伝子を併せ持つ組
換え体プラスミドの作成 ｐＴＳ８プラスミドＤＮＡ３μｇおよびｐ（１：ｈｏｍ
３プラスミド３μｇを含む５ａｆｌ用反応液２００４に
６単位のＳａｆ！■を添加し、３７℃で６０分間反応後
、６５℃に加温して反応を停止させた。同反応消化物に
、ｌＯ倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ用緩衝液４０μρ、５ｍ
Ｍ　　ΔＴＰ　　４０μＱ。
Ｔ４リガーゼ０，３単位、水１２０ρを加え、１２℃、
１６時間反応させた。
このリガーゼ反応混合物を用いて、コリネバクテリウム
・グルタミクムに５３株を形質転換した。スペクチノマ
イシン耐性となった形質転換株をカナマイシン２０ｘｒ
／ｍｌを含むＮＢ培地およびロインン５０ｇ／ｍ！、ス
ペクチノマイシン１００μｇ　／ｍｌを含むＭ１最少培
地に塗布した。
スペクチノマイシン耐性、カナマイシン感’！性でホモ
セリン非要求性となった形質転換株の一株から、プラス
ミドを単離精製した。同プラスミドはｐＴｓ８プラスミ
ドの唯１カ所の５ａｆＩ切断部位にｐＣｈｏｍ３由来の
３．６　Ｋ　ｂのＳａｊ！ｌＤＮＡ断片が挿入した構造
を有していた（第１図参照）。同プラスミドをｐＣｔｈ
ｒ３８と命名した。
ｐＣｔｈｒ３８を用い、ＨＤ欠損変異株に５３゜＋（Ｋ
欠損変異株に５４およびＴＳ欠損変異株に６０の形質転
換を行ったところ、スベクチノマイシン耐性となった形
質転換株は同時にホモセリンまたはスレオニン要求性が
回復していた。
このことから、ｐＣｔｈｒ３８プラスミド上には、ＨＤ
、ＨＫおよびＴＳの３遺伝子が含まれていることがわか
る。
（５）　　ｐ　Ｃｈ　ｏ　ｍ　３　、　ｐ　Ｃｔ　ｈ　
ｒ　３８あるいはｐｃｈｏｍ３ならびにｐＴＳ８を保有
する菌株によるスレオニンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９およびリジン生産性変異株ブレビバクテリ
ウム・フラブムＡＴＣＣ２１４７５をｐｃｈｏｍ３およ
びｐＣｔｈｒ３３で形質転換した。プロトプラストは上
記（２）でに６０株のプロトプラストを調製したのと同
様の方法で調製した。即ち、３３Ｍ培地での培養中途で
ペニシリンＧ（０，４５単位／ｍ＋　）を添加して処理
した培養菌体をリゾチーム処理して調製した。プロトプ
ラストをプラスミドＤＮＡ１■を用いて前記と同様の方
法で形質転換し、ＲＣＧＰ寒天培地でカナマイシン耐性
またはスペクチノマイシン耐性の形質転換株を選択した
。形質転換株から上記（２）でに６０株のｐＴＳ８形質
転換株からプラスミドを単離したのと同様の方法で、プ
ラスミドを単離し、各種制限酵素での切断解析により、
形質転換株がｐＣｈｏｍ３あるいはｐＣｔｈｒ３８を保
有することを確認した。
上記で得られたｐＣｈｏｍ３形質転換株を上記と同様に
してさらにｐＴＳ８を用いて形質転換した。カナマイシ
ンかつスペクチノマイシン耐性で選択した形質転換株か
ら、上記と同様にしてプラスミドを単離し、各種制限酵
素による切断解析を行い、各形質転換株がｐＣｈｏｍ３
とｐＴＳ８を共有していることを確認した。
形質転換株と各々の親株のスレオニン生産試験を次のよ
うに行った。ＮＢ培地で３０℃。
１６時間振盪培養した種培養Ｑ、５ｍｌを生産培地〔グ
ルコース１００　ｇ、　（ＮＨ，）２ＳＯ４２０ｇ。
ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ、に２ＨＰ０，０．５ｇ。
Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０１ｇ、　Ｆｅ５ｏ４−７Ｈ２゜１
０ｍｇ、　Ｍｎ　ＳＯ４・４〜６８２０　１０ｍｇ、ビ
オチン１００μｇおよび炭酸カルシウム２０ｇを水ｌβ
に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕５ｍ１の入った
試験管に接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養
後、培養ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ、ニ
ンヒドリン発色による比色定量法を用いてＬ−スレオニ
ン生成量を測定した。結果を第１表に示す。
第　　　　１　　　　表 コリネバクテリウム・グルタミクム　ＡＴＣＣ３，１８
３３０同　　　　　　ＡＴＣＣ３１８３３／Ｉ］Ｃｈｏ
ｍ３　　　　　　　　０．４同　　　　　　ＡＴＣＣ３
１８３３／ｐＣｔｈｒ３８　　　　　　　２．０同　　
　　　　ＡＴＣＣ３１８３３／ｐＣｈｏｍ３．　ｐＴＳ
８　　　　１．８コリネバクテリウム・ハーキュリス　
ＡＴＣＣ１３８６８０同　　　　　　ＡＴＣＣ１３８６
８／ｐｃｈｏｍ３　　　　　　　　０．６同　　　　　
　ＡＴｃｃ１３８６８／ｐＣｔｈｒ３８　　　　　　　
２．５同　　　　　　ＡＴＣＣ１３８６８／ｐｃｈｏｍ
３．ｐＴ３８　　　　２．４ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム　ＡＴＣＣ１３８６９０同　　　　　
　　　　ＡＴＣＣ１３８６９／Ｉ］Ｃｈｏｍ３　　　　
　０．３同　　　　　　　　　＾ＴＣＣ１３８６９／ｐ
ｃｔｈｒ３８　　　　１．８同　　　　　　　　　＾Ｔ
ＣＣ１３８６９／ＰＣｈｏｍ３．Ｉ］ＴＳ８　１７プレ
ビバクテリウム・フラブム　　　ＡＴＣＣ２１４７５０
同　　　　　　ＡＴＣＣ２１４７５／Ｉ］Ｃｈｏｍ３　
　　　　　　　０．３同　　　　　　ＡＴＣＣ２１４７
５／Ｉ］Ｃｔｈｒ３８　　　　　　　２．０同　　　　
　　ＡＴＣＣ２１４７５／ｐｃｈｏｍ３．　ｐＴＳ８　
　　　１．９（６）Ｉ）Ｃｈｏｍ３．ｐ”ｒｓｇ、ｐＣ
ｔｈｒ３８あるいはｐＣｈｏｍ３ならびにｐＴＳ８を保
有する菌株によるインロイシンの生産 上記（５）と同様の方法でブレビバクテリウム。
フラブムΔＴＣＣ１４０６７、インロイシン生産性変異
株コリネバクテリウム・グルタミクムに４０　　ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−４５５（昭和５８年７月２１日付で微工研
に寄託）およびリジン生産性変異株コリネバクテリウム
・グルタミクムＨ−３１４９ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５８（
昭和５７年６月１４日付で微工研に寄託）を形質転換し
、ｐＣｈｏｍ３．ｐＴＳ８およびｐＣｔｈｒ３８の形質
転換株を得た。ただし、コリネバクテリウム・グルタミ
クムＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５８はロイシン要求性変異を
有しているので、３５Ｍ培地にロイシン２００■／ｍｌ
を補って培養、ペニシリンＧ処理を行った。各株から得
られた形質転換株がプラスミドを保有することは前記と
同様にして確認した。各ｐＣｈｏｍ３形質転換株をｐＴ
Ｓ８にてさらに形質転換し、ｐ（：：ｈｏｍ３ならびに
ｐＴＳ８併有株も上記と同様に作成した。
親株と形質転換株のインロイシン生産試験を上記（５）
と同一条件で行った。ただし、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５８およびその形質転
換株には、ロイシン４００μｇ／ｍｌを補った生産培地
を用いた。生産試験の結果を第２表に示す。
第　　　　２　　　　表 コリネバクテリウム・グルタミクム　ＦＥＲＭ　　０Ｐ
−４５５１，２同　　　　　　ＦＥＲＭ　０Ｐ−４５５
／Ｉ］Ｃｈｏｍ３　　　　　２゜６同　　　　　　ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−４５５／ｐＴＳ８　　　　　　１．８同　
　　　　　ＦＥＲＭ　０Ｐ−４５５／ｐＣｔｈｒ３８　
　　　４．２同　　　　　　ＦＡＲＭ　０Ｐ−４５５／
ｐＣｈｏｍ３．　ｐＴｓ８　３．９ブレビバクテリウム
・フラブム　　　ＡＴＣＣ１４０６７０同　　　　　　
ＡＴＣＣ１４０６７／ｐＣｈｏｍ３　　　　　　０．６
同　　　　　　ＡＴＣＣ１４０６７／ｐＣｔｈｒ３８　
　　　　２．２同　　　　　　ＡＴＣＣ１４０６７／ｐ
Ｃｈｏｍ３．Ｉ］ＴＳ８　　　１．９コリネバクテリウ
ム・グルタミクム　Ｆｉｌ：ＲＭ　　ＢＰ−１５８０同
　　　　　　ＦＯＲＭ　ＢＰ−１５８／Ｉ］Ｃｈｏｍ３
　　　　　０．９同　　　　　　ＦＥＲＭ　０Ｐ−１５
８／ｐＣｔｈｒ３８　　　　２．５同　　　　　　ＦＯ
ＲＭ　ＢＰ−１５８／ｐｃｈｏｍ３．　ｐＴＳ８　２．
１発明の効果 本発明によれば、コリネバクテリウム属およびブレビバ
クテリウム属に属する微生物のスレオニン生合成に関与
するＨＤ、ＨＫおよびＴＳの遺伝情報の全てを担う組換
え体ＤＮＡあるいはそれらの遺伝情報が別個に担われて
いる複数の組換え体ＤＮＡを保有させることにより、コ
リネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種に
おけるＬ−スレオニンあるいはそれを前駆体として生合
成されるし一インロイシンの生産性を付与あるいは向上
させることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はｐｃｈｏｍ３．ｐＴｓ８およびｐｃｔｈ＋３８
の制限酵素３ａｊ７１．ＢｇβＩＩ、ＢａｍＨＩおよび
Ｐｓｔｌの切断地図とその作製工程を示す。 プラスミドの大きさはキロベース（Ｋｂ）で表示されて
いる。ｐＣｈｏｍ３の太い実線部分の染色体ＤＮＡ断片
上にはＨＤ、ＨＫ両遺伝子が、ｐＴＳ８の染色体ＤＮＡ
断片由来部分にはＴＳ遺伝子が、ｐＣｔｈｒ３８の染色
体ＤＮＡ断片由来部分にはＨＤ、ＨＫおよびＴＳ遺伝子
が含まれている。 第１図 Ｐｇ↑１　　　ｔ’ｓｖｉ

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物のホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモ
    セリンキナーゼおよびスレオニンシンターゼの合成に関
    与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡ
    を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
    ウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−
    スレオニンまたはＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、該
    培養物からＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを採
    取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
  2. （２）ベクターが、ｐＣＧ１、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐ
    ＣＧ１１、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３、ｐＣ
    Ｅ５４、ｐＣＢ１０１およびそれらから誘導されるプラ
    スミドから選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. （３）該ＤＮＡ断片上の該遺伝情報が、１個の組換え体
    ＤＮＡ中に同時に含まれているか、または別個の組換え
    体ＤＮＡに含まれている特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  4. （４）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物由来のスレオニンシンターゼの合成に
    関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮ
    Ａ。
  5. （５）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物由来のホモセリンデヒドロゲナーゼ、
    ホモセリンキナーゼおよびスレオニンシンターゼの合成
    に関与する遺伝情報の全てを担うＤＮＡ断片を含む組換
    え体ＤＮＡ。
  6. （６）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物由来のスレオニンシンターゼの合成に
    関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮ
    Ａを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
    リウム属に属する微生物。
  7. （７）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物由来のホモセリンデヒドロゲナーゼ、
    ホモセリンキナーゼおよびスレオニンシンターゼの合成
    に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体Ｄ
    ＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバク
    テリウム属に属する微生物。
  8. （８）該ＤＮＡ断片上の該遺伝情報が１個の組換え体Ｄ
    ＮＡ中に同時に含まれているか、または別個の組換え体
    ＤＮＡに含まれている特許請求の範囲第７項記載の微生
    物。
  9. （９）Ｌ−リジンを生産する能力を有するコリネバクテ
    リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に
    コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
    する微生物のホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリン
    キナーゼおよびスレオニンシンターゼの合成に関与する
    遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを導入
    し、得られる形質転換株を培地に培養し、培養物中にＬ
    −スレオニンまたはＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、
    該培養物からＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを
    採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
JP61028271A 1986-02-12 1986-02-12 アミノ酸の製造法 Pending JPS62186795A (ja)

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DE1987101857 DE233581T1 (de) 1986-02-12 1987-02-11 Verfahren zur herstellung von l-threonin oder l-isoleucin.

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