DE3531966A1 - Verfahren zur langzeit-zuechtung beliebiger endothelzellen, methode zu ihrer identifizierung und charakterisierung und ihre verwendung fuer diagnose und klaerung der aetiopatogenese von krankheitszustaenden - Google Patents
Verfahren zur langzeit-zuechtung beliebiger endothelzellen, methode zu ihrer identifizierung und charakterisierung und ihre verwendung fuer diagnose und klaerung der aetiopatogenese von krankheitszustaendenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Methode zur Langzeit-Züchtung
von beliebigen Endothelzellen, eine Methode zur unzweifel
haften eindeutigen Identifizierung und Charakterisierung der
Endothelzellen, die Verwendung solcher Endothelzellen für
die eindeutige und unzweifelhafte Diagnose und Klärung der
Atiopatogenese von Krankheitszuständen.
Die von E. A. Jaffee et al. (J. Clin. Invest. 52, 2745-2756,
1973a) und M.A. Gimbrone et al. (J. Cell. Biol. 60, 673-684,
1974) entwickelte Methode zur Züchtung von Endothelzellen
hat entscheidende Nachteile: ihre Durchführung durch die
enzymatische Ablösung der Endothelzelle mit Hilfe von Col
lagenase aus den Nabelschnurgefäßen ist hochgradig diffizil
und in der Ausbeute zu gering. Die Nabelschnur enthält 3 Ge
fäße und zahlreiche Vasa-vasorum, wobei die letzteren den
Hauptanteil der Endothelien enthalten. Durch diese Methode
ist es nicht möglich, diese Endothelien zur Züchtung in vi
tro zu gewinnen; außerdem ist sie nur an mittleren und
großen Gefäßen, z.B. Aorta, Vena cava, anwendbar. Der ent
scheidenste Nachteil ist, selbst bei schonendster enzyma
tischer Zellisolierung läßt sich eine Kontamination mit
Smooth-muscle-Zellen und vor allen Sprouting-Zellen nicht
vermeiden. In neuerer Zeit (vgl. A. Ager. et al., Thrombosis
Res. 35, 43-52 (1984)) konnte zwar die unerwünschte Kontami
nation homologer Zellpopulationen mit Smooth Muscle Cells
durch Anwendung der Elektronenmikroskopie und anderer Labo
ratoriumsmethoden verbessert werden, doch ist auch heute
noch in bis zu 30% der Fälle ein Verwerfen der Kulturen
wegen Kontamination mit Smooth Muscle Cells notwendig. Die
Kontamination mit Sprouting Cells ist noch schwerer zu ver
meiden, denn im Gegensatz zu den Smooth Muscle Cells zeigen
sie eine nahezu ultrastrukturell und immunfluoreszenz-iden
tische Morphologie (Faktor VIII, Angiotensin Converting
Encym-Antikörper, Blutgruppenantigene). Außerdem zeigen auch
diese Zellen (ähnlich den Pit-Zellen der Leber) eine
Lipid- und Lipoprotein-Aufnahme. Daraus ist zu ersehen, daß
eine eindeutige Identifizierung selbst bei Anwendung modern
ster Laboratoriumsmethoden extrem problematisch ist.
Ein kleiner Fortschritt wurde in diesem Zusammenhang mit der
Etablierung der Elutriation erzielt (vgl. Maroin L. Meis
trich, Cell Separation, Academic Press, London, Vol 2, S. 33
bis 61). Der Vorteil der Elutriation ist die gleichzeitige
Ausnutzung mehrerer physikalisch-chemischer Eigenschaften
(Zentripetalkraft, Dichte, Fliehkraft, Gravitation, Ge
schwindigkeit und optische Eigenschaften). Bedauerlicher
weise ist diese Methode extrem teuer und aufwendig. Bei An
wendung all dieser Methoden muß trotzdem eine der bedeutend
sten biologischen Eigenschaften der Endothelzelle beachtet
werden: Wachstumspotenz und Wachstumsverhalten. Auch hoch
wertige Wachstumsfaktoren (Endothelial Cell Growth Supple
ment, Multiple Stimulating Activity, Heparin, Insulin und
Fibroblasten-Wachstumsfaktor) beeinflussen Wachstumsverhal
ten und -potenz der Endothelzelle im Vergleich zu Smooth
Muscle Cells und Sprouting Cells nur minimal, da sie leider
auch deren Wachstumsverhalten stimulieren.
Für die Langzeit-Züchtung von beliebigen Endothelzellen
lassen sich alle diese Nachteile ausschließen, wenn erfin
dungsgemäß zunächst eine High Endothelial-Zellkultur aus
Retikulo-Histocytärem-Systemgewebe (RHS-Gewebe) in vitro ge
züchtet wird. Die Züchtung erfolgt mit optimalem Ergebnis
durch mehrfaches Waschen des RHS-Gewebes in gepufferter Sa
line oder in Kulturmedium in Gegenwart von Calzium- oder Ma
gnesiumionen und in Gegenwart eines Antibiotikums. Das ge
waschene Gewebe sollte für kurze Zeit (z.B. 10 Minuten) in
einem zellfreundlichen Desinfizienz (z.B. einem Polyvidonjo
did wie Betaisodona, verdünnt in gepufferter Saline im Ver
hältnis 1 : 10, v:v) gebadet werden, nach erneutem Waschen
wird das Gewebe homogenisiert und das Homogenisat erneut
mehrmals gewaschen. Die Homogenisierung erfolgt beispiels
weise durch Zerkleinerung mit Hilfe eines Messers in einem
Mixer, auch alle übrigen Homogenisationsmethoden sind an
wendbar. Die Waschung des Homogenisats erfolgt vorteilhaf
terweise im Kulturmedium (RPMI 1640 + Antibiotikum + L-Glu
tamin und Serum; RPMI 1640 ist im Handel erhältlich). An
schließend wird das Homogenisat zunächst durch Zentrifugie
ren vom Medium befreit und in 0,1 bis 0,2 Gew.-%iger Colla
genase für eine Zeit bis zu 60 Minuten bei 37°C inkubiert.
Vorteilhafterweise wird das inkubierte Homogenisat durch
vorsichtiges Schütteln in Suspension gehalten. Die Suspen
sion wird anschließend filtriert (Filtergröße z.B. 100 µm).
Das Filtrat wird durch mehrmalige kurzzeitige Zentrifugation
(z.B. 5 Minuten) und durch mehrmaliges Waschen mit Kulturme
dium von der Collagenase befreit; der Zentrifugationspellet
wird vorsichtig in Anzuchtmedium resuspendiert (Anzuchtme
dium RPMI 1640 + 20 mMol L-Glutamin + Antibiotikum + 20 bis
30 Vol. % gammaglobulinfreies, inaktiviertes Foetales-Käl
berserum + 20 µg/ml ECGS Medium (Endothelial-Cell-Growth
Supplement) + 100 µg/ml Heparin (Sigma-H-3125) + 20 µg MSA
(Multiple Stimulating Activity, Fa. Sigma) pro ml Medium +
15 µg Humaninsulin pro ml Medium). Die so gereinigten und
isolierten High-Endothelial Cells werden nun einer Zellkul
turanlage, am besten in der Zellkulturanlage der Fa. Bühler,
Tübingen, angezüchtet.
Die Endothelzellen werden auf Micro-carriers (z.B. Cyto
dex-III, Fa. Pharmacia Fine Chemicals) angezüchtet. Die Prä
paration der Micro-carriers zur Anzucht der Endothelzellen
erfolgt folgendermaßen: das denaturierte, pulverisierte
Schweincollagen wird in gepufferter Saline für 12 Stunden
aufgeschlämmt, aliquotiert und sterilisiert. Das so präpa
rierte Schweinecollagen wird in definierter Konzentration
(von 0,1 bis 0,5 mg Trockengewicht pro ml Medium) mit den
resuspendierten Zellen gemischt und anschließend in die Bio
reaktoren der Zellkulturanlage eingefüllt. Die Zucht in der
Zellkulturanlage erfolgt bei 37°C unter Rotation. Über 4 bis
10 Tage werden mit Endothelzellen beladene Microcarriers mit
Medium abgesaugt, es wird stets dasselbe Volumen an unbela
denen Microcarriers und Medium zugegeben; auf diese Weise
erhält man einen kontinuierlichen Verlauf, da sich die zuge
gebenen, unbeladenen Microcarriers im Bioreaktor von selbst
beladen.
Die entnommenen beladenen Microcarriers werden durch Zentri
fugation vom Medium getrennt. Das so gewonnene, sogenannte
Conditional Medium wird anschließend eingefroren (z.B. bei
-70°C); die auf dem Microcarrier sitzenden Zellen werden
enzymatisch (z.B. mit Trypsin) abgelöst und durch mehrmalige
Zentrifugation und mehrmaliges Waschen vom Enzym befreit.
Das so gewonnene Conditional Medium dient der Anzucht von
z.B. parenchymatösen Endothelien eines benachbarten Organs;
die geernteten High-Endothelial-Cells können durch Anzucht,
z.B. auf Chamber-Slides, und anschließende Fixierung für die
Diagnostik und Klärung der Ätiopatogenese verschiedener
Krankheitszustände genutzt werden. Die High-Endothelial
Cells lassen sich bei Temperaturen unter -70°C beliebig lang
aufbewahren.
Das eingefrorene, sogenannte Conditioned Medium ermöglicht
bei einem Mischungsverhältnis von einem Teil Conditioned
Medium zu einem Teil frischem Kulturmedium (Serum, ECGS,
MSA, Insulin und Heparin) die in-vitro-Kultivierung jeder
beliebigen Endothelzelle. Dabei ist, will man besonders gute
Ergebnisse erzielen, zu beachten, daß die High Endothelial
Cells (HEC) aus dem RHS-Gewebe stammen sollten, welches dem
Organ, das die gewünschten Endothelien enthält, benachbart
ist. Zur Zucht in der oben beschriebenen Weise kann auch an
stelle des RHS-Gewebes ein beliebiges anderes Gewebe benutzt
werden, z.B. Leber, Niere, Lunge, Zentrales Nervensystem.
Die oben genannten Zusatzfaktoren im Kultur- bzw. Anzuchtme
dium (Serum, ECGS, MSA, Insulin und Heparin) müssen nicht
zugesetzt werden, sie optimieren jedoch auf die Länge der
Zeit gesehen das Ergebnis und erhöhen vor allen Dingen die
Widerstandskraft. Nun ist es endlich möglich geworden belie
bige Endothelzellen unter physiologischen Bedingungen für
kommerzielle Zwecke zu nutzen.
Wissenschaftlich war es notwendig, eine Methode zu finden,
die eine eindeutige spezifische und unzweifelhafte Identifi
zierung der Endothelzellen erlaubt; dies läßt sich erfin
dungsgemäß dadurch erreichen, daß man an den zu identifizie
renden Zellen eine quantitative Immunofluorenszenz mit Hilfe
von monoklonalen Insulin- und Heparinrezeptorantikörpern
durchführt. Dies läßt sich beispielsweise dadurch erreichen,
daß die zu identifizierenden Zellen auf einem Chamber-Slide
kultiviert und fixiert werden: die Zellen werden an
schließend mit einem monoklonalen Insulinrezeptorantikörper
überschichtet (für ca. 30 Minuten), gründlich mit gepuffer
ter Saline gewaschen (3 × 15 Minuten) und mit einem Fluor
eszenz- oder Rhodamin-gekoppelten Antihumanantikörper über
schichtet und erneut gewaschen. Anschließend erfolgt eine
Überschichtung mit einem Heparinrezeptorantikörper (für ca.
30 Minuten), gefolgt von einer gründlichen Waschung mit ge
pufferter Saline, danach Überschichtung mit dem kontra
korrespondierenden Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekoppelten
Antihumanantikörper. Diese Überschichtungen können auch in
umgekehrter Reihenfolge erfolgen. Um zu verhindern, daß das
Präparat austrocknet oder die Fluoreszenz verschwindet,
bettet man die fixierten und markierten Zellen in ein Ge
misch aus Glycerin und p-Phenylendiaminderivaten oder
1,4-Diazobicyclo-(2,2)-octanderivaten. Die Auswertung sollte
am besten durch quantitative Fluoreszenzmikroskopie erfol
gen. Die Methode an sich ist nicht endothelzell-spezifisch,
sondern spezifisch ist die Insulin- und Heparin-Rezeptor
dichte pro Membranfläche.
Durch diese Identifikationsmethode ist auch eine alternative
Methode zur Zellisolierung möglich geworden. Ein Organhomo
genisat wird mit Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekoppelten In
sulin- und Heparin-Rezeptorantikörpern markiert, wobei die
Antikörper stets kontrakorrespondierend gekoppelt sein
müssen; die Trennung der Zellen erfolgt dann über Fluor
eszenz-Activated Cell-Sorter (FACS). Anstelle des Organhomo
genisats kann auch das nach der oben beschriebenen Inkuba
tion gereinigte Zellfiltrat eingesetzt werden. Die über FACS
gewonnenen Zellen können anschließend zur Klonierung genutzt
werden.
Die auf geeigneten Unterlagen, z.B. Chamber-Slides, kulti
vierten und fixierten Zellen lassen sich auf folgende Weise
zu diagnostischen Zwecken einsetzen: High Endothelial Cells
für die Diagnose und Klärung der Ätiopathogenese von de
myelinisierenden Erkrankungen und Erkrankungen des rheuma
tischen Formenkreises; Leberendothelien für Hepatopathien,
Nierenendothelien für Rhenopathien; ZNS-Gewebekapillaren für
nicht demyelisierende Erkrankungen des zentralen Nerven
systems. Von entscheidender Bedeutung ist immer die Isolie
rung, Kultivierung und Fixierung organspezifischer Endo
thelien für die Diagnose und Klärung der Atiopathogenese
spezifischer Krankheitsbilder. Um zu einer Diagnose zu
kommen bzw. um die Ätiopathogenese eines spezifischen Krank
heitsbildes zu klären, muß man sich an folgende Versuchsan
ordnung halten: Gesunde Lymphozyten definierter Eigenschaf
ten und Konzentration werden über einen definierten Zeitraum
(z.B. 60 Minuten) mit Patientenserum bei 37°C inkubiert
gleichzeitig mit Vitalfarbstoffen, wie Acridinorange, ange
färbt und mit gepufferter Saline schonend gewaschen. Auf
einem Objektträger werden die für ein Krankheitsbild am
ehesten spezifischen Endothelien fixiert. Dieser fixierte
Objektträger wird mit dem auf die oben beschriebene Weise
behandelten Lymphozyten über einen definierten Zeitraum in
kubiert (z.B. 30 Minuten). Man kann nun durch Lichtmikrosko
pie oder quantitative Mikroskopie das Adhäsions- und Migra
tionsverhalten dieser Lymphozyten messend festhalten. Mit
Hilfe erstellter Standardkurven kann Diagnose, Klärung der
Ätiopathogenese, Verlauf und Stadieneinteilung der Krank
heitsbilder eindeutig und unzweifelhaft erfolgen. Anstelle
von Lymphozyten können auch andere Leukozyten definierter
Konzentration und Eigenschaften benutzt werden.
Es ist unbedingt notwendig, von nicht durch pathologische
Stimuli veränderten Leukozyten auszugehen, da im Rahmen der
Homöostase ein biologisches Prinzip stets auf einen Gleich
gewichtszustand zustrebt, d.h. kommt es zu einer Entgleisung
des Gleichgewichts infolge eines aktiven Krankheitsschubs,
wie z.B. bei der Multiplen Sklerose, so vermehrt sich auto
matisch die Zahl der Suppressorzellen bzw. ihre Stoff
wechselaktivität, es werden Hemmsubstanzen gebildet, welche
wieder zur Einstellung des Gleichgewichtes im Sinne einer
Remission führen. Es findet dabei keine Heilung statt, es
stellt sich lediglich ein status quo ein.
Die folgenden Beispiele sollen das Wesen der Erfindung näher
erläutern:
Eine jugendliche Mandel nach Tonsillektomie wird dreimal in
phosphatgepufferter Saline (PBS + Ca2+, Mg2+; Seromed)
mit Calzium- und Magnesiumionen und 20-50 µg Gentamycin pro
100 ml PBS gewaschen und zerkleinert. Nach der Zerkleinerung
wird nochmals 3 mal in PBS und Gentamycin, Ca2+ + Mg2+
(=PBSG + Ca2+ + Mg2+) gewaschen. Es erfolgt ein 10minü
tiges Baden in Betaisodoma (einem Virozid, Fungizid und Bak
terizid), 1 : 10 verdünnt mit PBSG + Ca2+ + Mg2+. Danach
wird durch Zentrifugation und 3-maliges Waschen das Beta
isodona entfernt. Anschließend wird homogenisiert und erneut
3 mal gewaschen mit dem Waschmedium, bestehend aus RPMI 1640
+ 2 bis 5 µg Gentamycin/l ml Medium + 20 mM L-Glutamin und
10 Vol.-% gammaglobulienfreies, inaktiviertes Foetales-Käl
berserum. Danach erfolgt die Inkubation in 0,1 % Collagenase
Typ I für 60 Minuten bei 37°C unter schonendem Schütteln.
Die Filtrierung der Suspension erfolgt über ein 100 µm-Fil
ter, danach wird durch 3-maliges Waschen mit dem gleichen
Waschmedium, wie oben beschrieben, und Zentrifugation für
jeweils 5 Minuten bei 300 g die Collagenase entfernt. Der
Zentrifugationspellet wird schonend im Kulturmedium resus
pendiert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640 + 20 mM
1-Glutamin + 2 bis 5 µg Gentamycin pro 100 ml Medium + 30
Vol.-% γ-globulinfreies inaktiviertes Foetales-Kälberserum
+ 20 µg ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement, Fa. Sigma)
+ 10 µg Heparin (Sigma H 3125) pro ml Medium + 20 µg MSA
(Multiple Stimulating Activity, Fa. Sigma) pro ml Medium +
15 µg Humaninsulin pro ml Medium. Das ECGS, MSA und Insulin
werden erst kurz vor der Resuspension der Zellen zugesetzt.
Die Vitalität wird mit Acridinorange, verdünnt 1 : 20 in PBS,
getestet. Ca. 95% der Zellen sind vital. Kultiviert werden
die Zellen in Primaria-Kulturflaschen (der Fa. Falcon) oder
in der Zellkulturanlage der Fa. Bühler, Tübingen. Die
Flaschenkulturen werden nach 2 Stunden erneut je 3 mal ge
waschen und mit einem Kulturmedium versehen. Nach 24 Stunden
erfolgt erneut Mediumwechsel, hernach jeden 2. Tag. Ab dem
2. bis zum 10. Tag werden die Medien gesammelt und eingefro
ren (-70°C). Nach 8 bis 10 Tagen ist die Kultur konfluent.
Bei Subkultivierung steigt die Verdoppelungszeit von 1 mal
pro Tag auf 1 mal alle 8 Tage.
Verwendet man anstelle der Flaschenkulturen die Zellkultur
anlage der Fa. Bühler, Tübingen, so werden über 4 bis 10
Tage die mit Endothelzellen beladenen Microcarriers mit Me
dium abgesaugt. Es wird stets dasselbe Volumen an unbelade
nen Microcarriers und Medium wieder zugegeben. Die entnom
menen beladenen Microcarriers werden durch Zentrifuation vom
Medium getrennt, das so gewonnene Conditioned Medium wird
bei -70°C eingefroren. Die auf den Microcarriers sitzenden
Zellen werden enzymtisch mit Trpysin-EDTA abgelöst und durch
mehrmalige Zentrifugation und mehrmaliges Waschen von Enzym
gereinigt. Die Verdoppelungszeit ist zu mindestens 1 mal pro
Tag gefunden worden.
Muskelgewebe wird vom Fett befreit, 3 mal in phosphatgepuf
ferter Saline (PBS + Ca2+, Mg2+; Seromed) mit Cal
zium- und Magnesiumionen und 20-50 µg Gentamycin pro 100 ml
PBS gewaschen und zerkleinert. Nach der Zerkleinerung wird
nochmals 3 mal in PBS und Gentamycin, Ca2+ + Mg2+ (=PBSG
+ Ca2+ + Mg2+) gewaschen. Es erfolgt ein 10minütiges
Baden in Betaisodoma (einem Verizid, Fungizid und Bakteri
zid), 1 : 10 verdünnt mit PBSG + Ca2+ + Mg2+. Danach wird
durch Zentrifugation und 3-maliges Waschen das Betaisodona
entfernt. Anschließend wird homogenisiert und erneut 3 mal
gewaschen mit dem Waschmedium, bestehend aus RPMI 1640 + 2
bis 5 µg Gentamycin/1 ml Medium + 20 mM L-Glutamin und
10 Vol.-% gammaglobulienfreies, inaktiviertes Foetales-Käl
berserum. Danach erfolgt die Inkubation in 0,1 % Collagenase
Typ I für 60 Minuten bei 37°C unter schonendem Schütteln.
Die Filtrierung der Suspension erfolgt über ein 100 µm-Fil
ter, danach wird durch 3-maliges Waschen mit dem gleichen
Waschmedium, wie oben beschrieben, und Zentrifugation für
jeweils 5 Minuten bei 300 g die Collagenase entfernt. Der
Zentrifugationspellet wird schonend im Kulturmedium resus
pendiert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640 + 20 mM
1-Glutamin + 2 bis 5 µg Gentamycin pro 100 ml Medium + 30
Vol.-% γ-globulinfreies inaktiviertes Foetales-Kälberserum
+ 20 µg ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement, Fa. Sigma)
+ 10 µg Heparin (Sigma H 3125) pro ml Medium + 20 µg MSA
(Multiple Stimulating Activity, Fa. Sigma) pro ml Medium +
15 µg Humaninsulin pro ml Medium. Das ECGS, MSA und Insulin
werden erst kurz vor der Resuspension der Zellen zugesetzt.
Die Vitalität wird mit Acridinorange, verdünnt 1 : 20 in PBS,
getestet. Ca. 95% der Zellen sind vital. Kultiviert werden
die Zellen in Primaria-Kulturflaschen (der Fa. Falcon) oder
in der Zellkulturanlage der Fa. Bühler, Tübingen. Die
Flaschenkulturen werden nach 2 Stunden erneut je 3 mal ge
waschen und mit einem Kulturmedium versehen. Nach 24 Stunden
erfolgt erneut Mediumwechsel, hernach jeden 2. Tag. Ab dem
2. bis zum 10. Tag werden die Medien gesammelt und eingefro
ren (-70°C). Nach 8 bis 10 Tagen ist die Kultur konfluent.
Bei Subkultivierung steigt die Verdoppelungszeit von 1 mal
pro Tag auf 1 mal alle 8 Tage.
Verwendet man anstelle der Flaschenkulturen die Zellkultur
anlage der Fa. Bühler, Tübingen, werden über 4 bis 10 Tage
die mit Endothelzellen beladenen Microcarriers mit Medium
abgesaugt. Es wird stets dasselbe Volumen an unbeladenen
Microcarriers und Medium wieder zugegeben. Die entnommenen
beladenen Microcarriers werden durch Zentrifuation vom Me
dium getrennt, das so gewonnene Conditioned Medium wird bei
-70°C eingefroren. Die auf den Microcarriers sitzenden Zel
len werden enzymtisch mit Trpysin-EDTA abgelöst und durch
mehrmalige Zentrifugation und mehrmaliges Waschen von Enzym
gereinigt. Die Verdoppelungszeit ist zu mindestes 1 mal pro
Tag gefunden worden.
Die nach den Beispielen 1 und 2 gewonnenen Zellen werden auf
Chamber-Slides kultiviert und fixiert (Methanol 95 Vol.-%, 5
Vol.-% Eisessig), die so präparierten Chamber-Slides werden
überschichtet mit monoklonalen Insulin-Rezeptorantikörpern,
im Verhältnis 1 zu 50 mit PBS verdünnt und bei Raumtempera
tur für 30 Minuten inkubiert. Man wäscht 3 mal für jeweils
15 Minuten mit PBS und überschichtet mit Fluoreszenz- oder
Rhodamin-gekoppelten Antihumanantikörpern. Danach wird noch
mals 3 mal für 15 Minuten gewaschen; man überschichtet das
Präparat mit einem monoklonalen Heparin-Rezeptorantikörper,
es wird wiederum 3 mal mit der obengenannten Waschflüssig
keit gewaschen, mit einem kontrakorrespondierenden Fluor
eszenz- oder Rhodamin-gekoppeltem Antihumanantikörper über
schichtet, erneut 3 mal gewaschen; sodann wird, um zu ver
hindern, daß das Präparat austrocknet und die Fluoreszenz
verschwindet, dasselbe in ein Gemisch aus Glycerin und
p-Phenylendiamin-derivaten oder 1,4-Diazobicyclo(2,2)oktan
derivaten gebettet. Die Auswertung erfolgt über quantitative
Fluoreszenzmikroskopie.
Der Diagnose-Kite besteht aus 10 Objektträgern mit fixierten
High Endothelial Cells und je einem Gefäß enthaltend eine
Lymphozytensuspension in RPMI 1640 (Fa. Gibco); die Suspen
sion zeichnet sich durch eine bestimmte Konzentration und
durch bestimmte Eigenschaften der Lymphozyten aus. Eine Kon
trolle bestehend aus einem physiologischen Leukozytengemisch
gehört mit zu dem Set, desweiteren Standardtabellen passend
zu den jeweiligen Lymphozyten und Leukozyten.
Claims (6)
1. Verfahren zur Langzeit-Züchtung beliebiger Endothelzel
len, dadurch gekennzeichnet, daß eine High-Endothelial-Zell
kultur aus Retikulo-Histocytärem-Systemgewebe in-vitro ge
züchtet wird, die isolierten und gereinigten High-Endothe
lial-Zellen in einer Zellkulturanlage auf Microcarriers an
gezüchtet werden und das dabei gewonnene Medium, gegebenen
falls angereichert mit frischem Kulturmedium, zur in-vitro-
Kultivierung beliebiger Endothelzellen verwendet wird und
die geernteten isolierten und gereinigten High-Endothial-
Zellen zur Diagnose und Klärung der Atiopathogenese ver
schiedener Krankheitszustände verwendet werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
zur Züchtung von High-Endothelial-Zellkulturen aus Reti
kulo-Histocytärem-Systemgewebe zuerst dieses Gewebe mit ge
pufferter Saline oder Kulturmedium in Gegenwart von Kal
zium- und Magnesiumionen und eines Antibiotikums gewaschen
wird, das Gewebe anschließend homogenisiert, das Homogenisat
mit einem Kulturmedium aus RPMI 1640 + Antibiotikum + L-Glu
tamin und Serum gewaschen, das Homogenisat durch Zentrifu
gieren vom Medium befreit, in 0,1 bis 0,2 gew.-%iger Colla
genase bei 37°C inkubiert, die Suspension filtriert, das
Filtrat durch Zentrifugation und Waschen mit dem Kulturmedi
um von der Collagenase befreit und der Zentrifugationspellet
in einem Anzuchtmedium aus RPMI 1640 + 20 mMol L-Glutamin +
Antibiotikum + 20 bis 30 Vol.-% gammaglobulinfreiem, inakti
vierten Foetales-Kälberserum + 20 µg Medium Endothelial-
Cell-Growth-Supplement + 100 µg/ml Heparin + 20 µg Multiple
Stimulating Activity Factor pro 1 ml Medium + 15 µg Humanin
sulin pro 1 ml Medium resuspendiert wird und die so isolier
ten und gereinigten High-Endothelial-Zellen auf Micro
carriers, bestehend aus denaturierten, pulverisierten
Schweincollagen, aufgebracht, die so beladenen Microcarriers
bei 37°C bebrütet werden, wobei über 4 bis 10 Tage die mit
Endothelzellen beladenen Microcarriers mit dem Medium abge
saugt und durch dasselbe Volumen an unbeladenen Micro
carriers und Medium ersetzt werden, die entnommenen belade
nen Microcarriers anschließend durch Zentrifugation vom Me
dium getrennt, das Medium zur Anzüchtung anderer Endothel
zellen bereitgestellt und die auf den Microcarriers sitzen
den Zellen enzymatisch abgelöst und gereinigt werden.
3. Verfahren zur eindeutigen, spezifischen und unzweifelhaf
ten Identifizierung von Endothelzellen, dadurch gekennzeich
net, daß an den zu identifiziernden Zellen eine quantitative
Immunofluoreszenz mit Hilfe von monoklonalen Insulin- und
Heparinrezeptorantikörpern durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
die zu identifizierenden Zellen auf einem Chamber-Slide kul
tiviert und fixiert werden, die Zellen anschließend mit
einem Insulinrezeptorantikörper überschichtet, mit gepuffer
ter Saline gewaschen, mit einem Fluoreszenz- oder Rhodamin
gekoppeltem Antihumanantikörper überschichtet, erneut ge
waschen, mit einem Heparinrezeptorantikörper überschichtet,
erneut mit gepufferter Saline gewaschen, dann mit dem kon
trakorrespondierenden Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekoppelten
Antihumanantikörper überschichtet und, zur Verhinderung der
Austrocknung, mit einem Gemisch aus Glycerin und p-Phenylen
diaminderivaten oder 1,4-Diazobicyclo(2,2)octanderivaten
überschichtet werden, wobei die Auswertung der Insulin- und
Heprain-Rezeptordichte pro Membranfläche durch ein quantita
tives Fluoreszenzmikroskop erfolgen kann.
5. Verfahren zur Zellisolierung, dadurch gekennzeichnet, daß
ein Organhomogenisat mit Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekop
pelten Insulin- und Heparin-Rezeptorantikörpern markiert,
wobei die Antikörper stets kontrakorrespondierend gekoppelt
sein müssen, die markierten Zellen mit Hilfe eines Fluor
eszenz-activated Cell Sorters getrennt und die entsprechen
den Zellen anschließend kloniert werden.
6. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 gewon
nenen Endothelzellen für die eindeutige und unzweifelhafte
Diagnose und Klärung der Ätiopathogenese von Krankheitszu
ständen.
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JP50471786A JPS63501761A (ja) | 1985-09-07 | 1986-09-04 | 内皮細胞の維持培養法及びその同定と特性、及びその診断と病状の病因学的解明への応用 |
EP19860905209 EP0233925A1 (de) | 1985-09-07 | 1986-09-04 | Langzeit-züchtung, identifizierung, charakterisierung und verwendung von endothelzellen |
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