DE3531966A1 - Verfahren zur langzeit-zuechtung beliebiger endothelzellen, methode zu ihrer identifizierung und charakterisierung und ihre verwendung fuer diagnose und klaerung der aetiopatogenese von krankheitszustaenden - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Langzeit-Züchtung von beliebigen Endothelzellen, eine Methode zur unzweifel­ haften eindeutigen Identifizierung und Charakterisierung der Endothelzellen, die Verwendung solcher Endothelzellen für die eindeutige und unzweifelhafte Diagnose und Klärung der Atiopatogenese von Krankheitszuständen.

Die von E. A. Jaffee et al. (J. Clin. Invest. 52, 2745-2756, 1973a) und M.A. Gimbrone et al. (J. Cell. Biol. 60, 673-684, 1974) entwickelte Methode zur Züchtung von Endothelzellen hat entscheidende Nachteile: ihre Durchführung durch die enzymatische Ablösung der Endothelzelle mit Hilfe von Col­ lagenase aus den Nabelschnurgefäßen ist hochgradig diffizil und in der Ausbeute zu gering. Die Nabelschnur enthält 3 Ge­ fäße und zahlreiche Vasa-vasorum, wobei die letzteren den Hauptanteil der Endothelien enthalten. Durch diese Methode ist es nicht möglich, diese Endothelien zur Züchtung in vi­ tro zu gewinnen; außerdem ist sie nur an mittleren und großen Gefäßen, z.B. Aorta, Vena cava, anwendbar. Der ent­ scheidenste Nachteil ist, selbst bei schonendster enzyma­ tischer Zellisolierung läßt sich eine Kontamination mit Smooth-muscle-Zellen und vor allen Sprouting-Zellen nicht vermeiden. In neuerer Zeit (vgl. A. Ager. et al., Thrombosis Res. 35, 43-52 (1984)) konnte zwar die unerwünschte Kontami­ nation homologer Zellpopulationen mit Smooth Muscle Cells durch Anwendung der Elektronenmikroskopie und anderer Labo­ ratoriumsmethoden verbessert werden, doch ist auch heute noch in bis zu 30% der Fälle ein Verwerfen der Kulturen wegen Kontamination mit Smooth Muscle Cells notwendig. Die Kontamination mit Sprouting Cells ist noch schwerer zu ver­ meiden, denn im Gegensatz zu den Smooth Muscle Cells zeigen sie eine nahezu ultrastrukturell und immunfluoreszenz-iden­ tische Morphologie (Faktor VIII, Angiotensin Converting Encym-Antikörper, Blutgruppenantigene). Außerdem zeigen auch diese Zellen (ähnlich den Pit-Zellen der Leber) eine Lipid- und Lipoprotein-Aufnahme. Daraus ist zu ersehen, daß eine eindeutige Identifizierung selbst bei Anwendung modern­ ster Laboratoriumsmethoden extrem problematisch ist.

Ein kleiner Fortschritt wurde in diesem Zusammenhang mit der Etablierung der Elutriation erzielt (vgl. Maroin L. Meis­ trich, Cell Separation, Academic Press, London, Vol 2, S. 33 bis 61). Der Vorteil der Elutriation ist die gleichzeitige Ausnutzung mehrerer physikalisch-chemischer Eigenschaften (Zentripetalkraft, Dichte, Fliehkraft, Gravitation, Ge­ schwindigkeit und optische Eigenschaften). Bedauerlicher­ weise ist diese Methode extrem teuer und aufwendig. Bei An­ wendung all dieser Methoden muß trotzdem eine der bedeutend­ sten biologischen Eigenschaften der Endothelzelle beachtet werden: Wachstumspotenz und Wachstumsverhalten. Auch hoch­ wertige Wachstumsfaktoren (Endothelial Cell Growth Supple­ ment, Multiple Stimulating Activity, Heparin, Insulin und Fibroblasten-Wachstumsfaktor) beeinflussen Wachstumsverhal­ ten und -potenz der Endothelzelle im Vergleich zu Smooth Muscle Cells und Sprouting Cells nur minimal, da sie leider auch deren Wachstumsverhalten stimulieren.

Für die Langzeit-Züchtung von beliebigen Endothelzellen lassen sich alle diese Nachteile ausschließen, wenn erfin­ dungsgemäß zunächst eine High Endothelial-Zellkultur aus Retikulo-Histocytärem-Systemgewebe (RHS-Gewebe) in vitro ge­ züchtet wird. Die Züchtung erfolgt mit optimalem Ergebnis durch mehrfaches Waschen des RHS-Gewebes in gepufferter Sa­ line oder in Kulturmedium in Gegenwart von Calzium- oder Ma­ gnesiumionen und in Gegenwart eines Antibiotikums. Das ge­ waschene Gewebe sollte für kurze Zeit (z.B. 10 Minuten) in einem zellfreundlichen Desinfizienz (z.B. einem Polyvidonjo­ did wie Betaisodona, verdünnt in gepufferter Saline im Ver­ hältnis 1 : 10, v:v) gebadet werden, nach erneutem Waschen wird das Gewebe homogenisiert und das Homogenisat erneut mehrmals gewaschen. Die Homogenisierung erfolgt beispiels­ weise durch Zerkleinerung mit Hilfe eines Messers in einem Mixer, auch alle übrigen Homogenisationsmethoden sind an­ wendbar. Die Waschung des Homogenisats erfolgt vorteilhaf­ terweise im Kulturmedium (RPMI 1640 + Antibiotikum + L-Glu­ tamin und Serum; RPMI 1640 ist im Handel erhältlich). An­ schließend wird das Homogenisat zunächst durch Zentrifugie­ ren vom Medium befreit und in 0,1 bis 0,2 Gew.-%iger Colla­ genase für eine Zeit bis zu 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Vorteilhafterweise wird das inkubierte Homogenisat durch vorsichtiges Schütteln in Suspension gehalten. Die Suspen­ sion wird anschließend filtriert (Filtergröße z.B. 100 µm). Das Filtrat wird durch mehrmalige kurzzeitige Zentrifugation (z.B. 5 Minuten) und durch mehrmaliges Waschen mit Kulturme­ dium von der Collagenase befreit; der Zentrifugationspellet wird vorsichtig in Anzuchtmedium resuspendiert (Anzuchtme­ dium RPMI 1640 + 20 mMol L-Glutamin + Antibiotikum + 20 bis 30 Vol. % gammaglobulinfreies, inaktiviertes Foetales-Käl­ berserum + 20 µg/ml ECGS Medium (Endothelial-Cell-Growth Supplement) + 100 µg/ml Heparin (Sigma-H-3125) + 20 µg MSA (Multiple Stimulating Activity, Fa. Sigma) pro ml Medium + 15 µg Humaninsulin pro ml Medium). Die so gereinigten und isolierten High-Endothelial Cells werden nun einer Zellkul­ turanlage, am besten in der Zellkulturanlage der Fa. Bühler, Tübingen, angezüchtet.

Die Endothelzellen werden auf Micro-carriers (z.B. Cyto­ dex-III, Fa. Pharmacia Fine Chemicals) angezüchtet. Die Prä­ paration der Micro-carriers zur Anzucht der Endothelzellen erfolgt folgendermaßen: das denaturierte, pulverisierte Schweincollagen wird in gepufferter Saline für 12 Stunden aufgeschlämmt, aliquotiert und sterilisiert. Das so präpa­ rierte Schweinecollagen wird in definierter Konzentration (von 0,1 bis 0,5 mg Trockengewicht pro ml Medium) mit den resuspendierten Zellen gemischt und anschließend in die Bio­ reaktoren der Zellkulturanlage eingefüllt. Die Zucht in der Zellkulturanlage erfolgt bei 37°C unter Rotation. Über 4 bis 10 Tage werden mit Endothelzellen beladene Microcarriers mit Medium abgesaugt, es wird stets dasselbe Volumen an unbela­ denen Microcarriers und Medium zugegeben; auf diese Weise erhält man einen kontinuierlichen Verlauf, da sich die zuge­ gebenen, unbeladenen Microcarriers im Bioreaktor von selbst beladen.

Die entnommenen beladenen Microcarriers werden durch Zentri­ fugation vom Medium getrennt. Das so gewonnene, sogenannte Conditional Medium wird anschließend eingefroren (z.B. bei -70°C); die auf dem Microcarrier sitzenden Zellen werden enzymatisch (z.B. mit Trypsin) abgelöst und durch mehrmalige Zentrifugation und mehrmaliges Waschen vom Enzym befreit. Das so gewonnene Conditional Medium dient der Anzucht von z.B. parenchymatösen Endothelien eines benachbarten Organs; die geernteten High-Endothelial-Cells können durch Anzucht, z.B. auf Chamber-Slides, und anschließende Fixierung für die Diagnostik und Klärung der Ätiopatogenese verschiedener Krankheitszustände genutzt werden. Die High-Endothelial Cells lassen sich bei Temperaturen unter -70°C beliebig lang aufbewahren.

Das eingefrorene, sogenannte Conditioned Medium ermöglicht bei einem Mischungsverhältnis von einem Teil Conditioned Medium zu einem Teil frischem Kulturmedium (Serum, ECGS, MSA, Insulin und Heparin) die in-vitro-Kultivierung jeder beliebigen Endothelzelle. Dabei ist, will man besonders gute Ergebnisse erzielen, zu beachten, daß die High Endothelial Cells (HEC) aus dem RHS-Gewebe stammen sollten, welches dem Organ, das die gewünschten Endothelien enthält, benachbart ist. Zur Zucht in der oben beschriebenen Weise kann auch an­ stelle des RHS-Gewebes ein beliebiges anderes Gewebe benutzt werden, z.B. Leber, Niere, Lunge, Zentrales Nervensystem.

Die oben genannten Zusatzfaktoren im Kultur- bzw. Anzuchtme­ dium (Serum, ECGS, MSA, Insulin und Heparin) müssen nicht zugesetzt werden, sie optimieren jedoch auf die Länge der Zeit gesehen das Ergebnis und erhöhen vor allen Dingen die Widerstandskraft. Nun ist es endlich möglich geworden belie­ bige Endothelzellen unter physiologischen Bedingungen für kommerzielle Zwecke zu nutzen.

Wissenschaftlich war es notwendig, eine Methode zu finden, die eine eindeutige spezifische und unzweifelhafte Identifi­ zierung der Endothelzellen erlaubt; dies läßt sich erfin­ dungsgemäß dadurch erreichen, daß man an den zu identifizie­ renden Zellen eine quantitative Immunofluorenszenz mit Hilfe von monoklonalen Insulin- und Heparinrezeptorantikörpern durchführt. Dies läßt sich beispielsweise dadurch erreichen, daß die zu identifizierenden Zellen auf einem Chamber-Slide kultiviert und fixiert werden: die Zellen werden an­ schließend mit einem monoklonalen Insulinrezeptorantikörper überschichtet (für ca. 30 Minuten), gründlich mit gepuffer­ ter Saline gewaschen (3 × 15 Minuten) und mit einem Fluor­ eszenz- oder Rhodamin-gekoppelten Antihumanantikörper über­ schichtet und erneut gewaschen. Anschließend erfolgt eine Überschichtung mit einem Heparinrezeptorantikörper (für ca. 30 Minuten), gefolgt von einer gründlichen Waschung mit ge­ pufferter Saline, danach Überschichtung mit dem kontra­ korrespondierenden Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekoppelten Antihumanantikörper. Diese Überschichtungen können auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen. Um zu verhindern, daß das Präparat austrocknet oder die Fluoreszenz verschwindet, bettet man die fixierten und markierten Zellen in ein Ge­ misch aus Glycerin und p-Phenylendiaminderivaten oder 1,4-Diazobicyclo-(2,2)-octanderivaten. Die Auswertung sollte am besten durch quantitative Fluoreszenzmikroskopie erfol­ gen. Die Methode an sich ist nicht endothelzell-spezifisch, sondern spezifisch ist die Insulin- und Heparin-Rezeptor­ dichte pro Membranfläche.

Durch diese Identifikationsmethode ist auch eine alternative Methode zur Zellisolierung möglich geworden. Ein Organhomo­ genisat wird mit Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekoppelten In­ sulin- und Heparin-Rezeptorantikörpern markiert, wobei die Antikörper stets kontrakorrespondierend gekoppelt sein müssen; die Trennung der Zellen erfolgt dann über Fluor­ eszenz-Activated Cell-Sorter (FACS). Anstelle des Organhomo­ genisats kann auch das nach der oben beschriebenen Inkuba­ tion gereinigte Zellfiltrat eingesetzt werden. Die über FACS gewonnenen Zellen können anschließend zur Klonierung genutzt werden.

Die auf geeigneten Unterlagen, z.B. Chamber-Slides, kulti­ vierten und fixierten Zellen lassen sich auf folgende Weise zu diagnostischen Zwecken einsetzen: High Endothelial Cells für die Diagnose und Klärung der Ätiopathogenese von de­ myelinisierenden Erkrankungen und Erkrankungen des rheuma­ tischen Formenkreises; Leberendothelien für Hepatopathien, Nierenendothelien für Rhenopathien; ZNS-Gewebekapillaren für nicht demyelisierende Erkrankungen des zentralen Nerven­ systems. Von entscheidender Bedeutung ist immer die Isolie­ rung, Kultivierung und Fixierung organspezifischer Endo­ thelien für die Diagnose und Klärung der Atiopathogenese spezifischer Krankheitsbilder. Um zu einer Diagnose zu kommen bzw. um die Ätiopathogenese eines spezifischen Krank­ heitsbildes zu klären, muß man sich an folgende Versuchsan­ ordnung halten: Gesunde Lymphozyten definierter Eigenschaf­ ten und Konzentration werden über einen definierten Zeitraum (z.B. 60 Minuten) mit Patientenserum bei 37°C inkubiert gleichzeitig mit Vitalfarbstoffen, wie Acridinorange, ange­ färbt und mit gepufferter Saline schonend gewaschen. Auf einem Objektträger werden die für ein Krankheitsbild am ehesten spezifischen Endothelien fixiert. Dieser fixierte Objektträger wird mit dem auf die oben beschriebene Weise behandelten Lymphozyten über einen definierten Zeitraum in­ kubiert (z.B. 30 Minuten). Man kann nun durch Lichtmikrosko­ pie oder quantitative Mikroskopie das Adhäsions- und Migra­ tionsverhalten dieser Lymphozyten messend festhalten. Mit Hilfe erstellter Standardkurven kann Diagnose, Klärung der Ätiopathogenese, Verlauf und Stadieneinteilung der Krank­ heitsbilder eindeutig und unzweifelhaft erfolgen. Anstelle von Lymphozyten können auch andere Leukozyten definierter Konzentration und Eigenschaften benutzt werden.

Es ist unbedingt notwendig, von nicht durch pathologische Stimuli veränderten Leukozyten auszugehen, da im Rahmen der Homöostase ein biologisches Prinzip stets auf einen Gleich­ gewichtszustand zustrebt, d.h. kommt es zu einer Entgleisung des Gleichgewichts infolge eines aktiven Krankheitsschubs, wie z.B. bei der Multiplen Sklerose, so vermehrt sich auto­ matisch die Zahl der Suppressorzellen bzw. ihre Stoff­ wechselaktivität, es werden Hemmsubstanzen gebildet, welche wieder zur Einstellung des Gleichgewichtes im Sinne einer Remission führen. Es findet dabei keine Heilung statt, es stellt sich lediglich ein status quo ein.

Die folgenden Beispiele sollen das Wesen der Erfindung näher erläutern:

Beispiel 1 High Endothelial Cell-Kultur

Eine jugendliche Mandel nach Tonsillektomie wird dreimal in phosphatgepufferter Saline (PBS + Ca²⁺, Mg²⁺; Seromed) mit Calzium- und Magnesiumionen und 20-50 µg Gentamycin pro 100 ml PBS gewaschen und zerkleinert. Nach der Zerkleinerung wird nochmals 3 mal in PBS und Gentamycin, Ca²⁺ + Mg²⁺ (=PBSG + Ca²⁺ + Mg²⁺) gewaschen. Es erfolgt ein 10minü­ tiges Baden in Betaisodoma (einem Virozid, Fungizid und Bak­ terizid), 1 : 10 verdünnt mit PBSG + Ca²⁺ + Mg²⁺. Danach wird durch Zentrifugation und 3-maliges Waschen das Beta­ isodona entfernt. Anschließend wird homogenisiert und erneut 3 mal gewaschen mit dem Waschmedium, bestehend aus RPMI 1640 + 2 bis 5 µg Gentamycin/l ml Medium + 20 mM L-Glutamin und 10 Vol.-% gammaglobulienfreies, inaktiviertes Foetales-Käl­ berserum. Danach erfolgt die Inkubation in 0,1 % Collagenase Typ I für 60 Minuten bei 37°C unter schonendem Schütteln. Die Filtrierung der Suspension erfolgt über ein 100 µm-Fil­ ter, danach wird durch 3-maliges Waschen mit dem gleichen Waschmedium, wie oben beschrieben, und Zentrifugation für jeweils 5 Minuten bei 300 g die Collagenase entfernt. Der Zentrifugationspellet wird schonend im Kulturmedium resus­ pendiert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640 + 20 mM 1-Glutamin + 2 bis 5 µg Gentamycin pro 100 ml Medium + 30 Vol.-% γ-globulinfreies inaktiviertes Foetales-Kälberserum + 20 µg ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement, Fa. Sigma) + 10 µg Heparin (Sigma H 3125) pro ml Medium + 20 µg MSA (Multiple Stimulating Activity, Fa. Sigma) pro ml Medium + 15 µg Humaninsulin pro ml Medium. Das ECGS, MSA und Insulin werden erst kurz vor der Resuspension der Zellen zugesetzt. Die Vitalität wird mit Acridinorange, verdünnt 1 : 20 in PBS, getestet. Ca. 95% der Zellen sind vital. Kultiviert werden die Zellen in Primaria-Kulturflaschen (der Fa. Falcon) oder in der Zellkulturanlage der Fa. Bühler, Tübingen. Die Flaschenkulturen werden nach 2 Stunden erneut je 3 mal ge­ waschen und mit einem Kulturmedium versehen. Nach 24 Stunden erfolgt erneut Mediumwechsel, hernach jeden 2. Tag. Ab dem 2. bis zum 10. Tag werden die Medien gesammelt und eingefro­ ren (-70°C). Nach 8 bis 10 Tagen ist die Kultur konfluent. Bei Subkultivierung steigt die Verdoppelungszeit von 1 mal pro Tag auf 1 mal alle 8 Tage.

Verwendet man anstelle der Flaschenkulturen die Zellkultur­ anlage der Fa. Bühler, Tübingen, so werden über 4 bis 10 Tage die mit Endothelzellen beladenen Microcarriers mit Me­ dium abgesaugt. Es wird stets dasselbe Volumen an unbelade­ nen Microcarriers und Medium wieder zugegeben. Die entnom­ menen beladenen Microcarriers werden durch Zentrifuation vom Medium getrennt, das so gewonnene Conditioned Medium wird bei -70°C eingefroren. Die auf den Microcarriers sitzenden Zellen werden enzymtisch mit Trpysin-EDTA abgelöst und durch mehrmalige Zentrifugation und mehrmaliges Waschen von Enzym gereinigt. Die Verdoppelungszeit ist zu mindestens 1 mal pro Tag gefunden worden.

Beispiel 2 Kapillarendothelien

Muskelgewebe wird vom Fett befreit, 3 mal in phosphatgepuf­ ferter Saline (PBS + Ca²⁺, Mg²⁺; Seromed) mit Cal­ zium- und Magnesiumionen und 20-50 µg Gentamycin pro 100 ml PBS gewaschen und zerkleinert. Nach der Zerkleinerung wird nochmals 3 mal in PBS und Gentamycin, Ca²⁺ + Mg²⁺ (=PBSG + Ca²⁺ + Mg²⁺) gewaschen. Es erfolgt ein 10minütiges Baden in Betaisodoma (einem Verizid, Fungizid und Bakteri­ zid), 1 : 10 verdünnt mit PBSG + Ca²⁺ + Mg²⁺. Danach wird durch Zentrifugation und 3-maliges Waschen das Betaisodona entfernt. Anschließend wird homogenisiert und erneut 3 mal gewaschen mit dem Waschmedium, bestehend aus RPMI 1640 + 2 bis 5 µg Gentamycin/1 ml Medium + 20 mM L-Glutamin und 10 Vol.-% gammaglobulienfreies, inaktiviertes Foetales-Käl­ berserum. Danach erfolgt die Inkubation in 0,1 % Collagenase Typ I für 60 Minuten bei 37°C unter schonendem Schütteln. Die Filtrierung der Suspension erfolgt über ein 100 µm-Fil­ ter, danach wird durch 3-maliges Waschen mit dem gleichen Waschmedium, wie oben beschrieben, und Zentrifugation für jeweils 5 Minuten bei 300 g die Collagenase entfernt. Der Zentrifugationspellet wird schonend im Kulturmedium resus­ pendiert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640 + 20 mM 1-Glutamin + 2 bis 5 µg Gentamycin pro 100 ml Medium + 30 Vol.-% γ-globulinfreies inaktiviertes Foetales-Kälberserum + 20 µg ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement, Fa. Sigma) + 10 µg Heparin (Sigma H 3125) pro ml Medium + 20 µg MSA (Multiple Stimulating Activity, Fa. Sigma) pro ml Medium + 15 µg Humaninsulin pro ml Medium. Das ECGS, MSA und Insulin werden erst kurz vor der Resuspension der Zellen zugesetzt. Die Vitalität wird mit Acridinorange, verdünnt 1 : 20 in PBS, getestet. Ca. 95% der Zellen sind vital. Kultiviert werden die Zellen in Primaria-Kulturflaschen (der Fa. Falcon) oder in der Zellkulturanlage der Fa. Bühler, Tübingen. Die Flaschenkulturen werden nach 2 Stunden erneut je 3 mal ge­ waschen und mit einem Kulturmedium versehen. Nach 24 Stunden erfolgt erneut Mediumwechsel, hernach jeden 2. Tag. Ab dem 2. bis zum 10. Tag werden die Medien gesammelt und eingefro­ ren (-70°C). Nach 8 bis 10 Tagen ist die Kultur konfluent. Bei Subkultivierung steigt die Verdoppelungszeit von 1 mal pro Tag auf 1 mal alle 8 Tage.

Verwendet man anstelle der Flaschenkulturen die Zellkultur­ anlage der Fa. Bühler, Tübingen, werden über 4 bis 10 Tage die mit Endothelzellen beladenen Microcarriers mit Medium abgesaugt. Es wird stets dasselbe Volumen an unbeladenen Microcarriers und Medium wieder zugegeben. Die entnommenen beladenen Microcarriers werden durch Zentrifuation vom Me­ dium getrennt, das so gewonnene Conditioned Medium wird bei -70°C eingefroren. Die auf den Microcarriers sitzenden Zel­ len werden enzymtisch mit Trpysin-EDTA abgelöst und durch mehrmalige Zentrifugation und mehrmaliges Waschen von Enzym gereinigt. Die Verdoppelungszeit ist zu mindestes 1 mal pro Tag gefunden worden.

Beispiel 3 Endothelzellidentifizierung

Die nach den Beispielen 1 und 2 gewonnenen Zellen werden auf Chamber-Slides kultiviert und fixiert (Methanol 95 Vol.-%, 5 Vol.-% Eisessig), die so präparierten Chamber-Slides werden überschichtet mit monoklonalen Insulin-Rezeptorantikörpern, im Verhältnis 1 zu 50 mit PBS verdünnt und bei Raumtempera­ tur für 30 Minuten inkubiert. Man wäscht 3 mal für jeweils 15 Minuten mit PBS und überschichtet mit Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekoppelten Antihumanantikörpern. Danach wird noch­ mals 3 mal für 15 Minuten gewaschen; man überschichtet das Präparat mit einem monoklonalen Heparin-Rezeptorantikörper, es wird wiederum 3 mal mit der obengenannten Waschflüssig­ keit gewaschen, mit einem kontrakorrespondierenden Fluor­ eszenz- oder Rhodamin-gekoppeltem Antihumanantikörper über­ schichtet, erneut 3 mal gewaschen; sodann wird, um zu ver­ hindern, daß das Präparat austrocknet und die Fluoreszenz verschwindet, dasselbe in ein Gemisch aus Glycerin und p-Phenylendiamin-derivaten oder 1,4-Diazobicyclo(2,2)oktan­ derivaten gebettet. Die Auswertung erfolgt über quantitative Fluoreszenzmikroskopie.

Beispiel 4 Diagnose-Kit für demyelinisierende Erkrankungen

Der Diagnose-Kite besteht aus 10 Objektträgern mit fixierten High Endothelial Cells und je einem Gefäß enthaltend eine Lymphozytensuspension in RPMI 1640 (Fa. Gibco); die Suspen­ sion zeichnet sich durch eine bestimmte Konzentration und durch bestimmte Eigenschaften der Lymphozyten aus. Eine Kon­ trolle bestehend aus einem physiologischen Leukozytengemisch gehört mit zu dem Set, desweiteren Standardtabellen passend zu den jeweiligen Lymphozyten und Leukozyten.

Claims (6)

1. Verfahren zur Langzeit-Züchtung beliebiger Endothelzel­ len, dadurch gekennzeichnet, daß eine High-Endothelial-Zell­ kultur aus Retikulo-Histocytärem-Systemgewebe in-vitro ge­ züchtet wird, die isolierten und gereinigten High-Endothe­ lial-Zellen in einer Zellkulturanlage auf Microcarriers an­ gezüchtet werden und das dabei gewonnene Medium, gegebenen­ falls angereichert mit frischem Kulturmedium, zur in-vitro- Kultivierung beliebiger Endothelzellen verwendet wird und die geernteten isolierten und gereinigten High-Endothial- Zellen zur Diagnose und Klärung der Atiopathogenese ver­ schiedener Krankheitszustände verwendet werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Züchtung von High-Endothelial-Zellkulturen aus Reti­ kulo-Histocytärem-Systemgewebe zuerst dieses Gewebe mit ge­ pufferter Saline oder Kulturmedium in Gegenwart von Kal­ zium- und Magnesiumionen und eines Antibiotikums gewaschen wird, das Gewebe anschließend homogenisiert, das Homogenisat mit einem Kulturmedium aus RPMI 1640 + Antibiotikum + L-Glu­ tamin und Serum gewaschen, das Homogenisat durch Zentrifu­ gieren vom Medium befreit, in 0,1 bis 0,2 gew.-%iger Colla­ genase bei 37°C inkubiert, die Suspension filtriert, das Filtrat durch Zentrifugation und Waschen mit dem Kulturmedi­ um von der Collagenase befreit und der Zentrifugationspellet in einem Anzuchtmedium aus RPMI 1640 + 20 mMol L-Glutamin + Antibiotikum + 20 bis 30 Vol.-% gammaglobulinfreiem, inakti­ vierten Foetales-Kälberserum + 20 µg Medium Endothelial- Cell-Growth-Supplement + 100 µg/ml Heparin + 20 µg Multiple Stimulating Activity Factor pro 1 ml Medium + 15 µg Humanin­ sulin pro 1 ml Medium resuspendiert wird und die so isolier­ ten und gereinigten High-Endothelial-Zellen auf Micro­ carriers, bestehend aus denaturierten, pulverisierten Schweincollagen, aufgebracht, die so beladenen Microcarriers bei 37°C bebrütet werden, wobei über 4 bis 10 Tage die mit Endothelzellen beladenen Microcarriers mit dem Medium abge­ saugt und durch dasselbe Volumen an unbeladenen Micro­ carriers und Medium ersetzt werden, die entnommenen belade­ nen Microcarriers anschließend durch Zentrifugation vom Me­ dium getrennt, das Medium zur Anzüchtung anderer Endothel­ zellen bereitgestellt und die auf den Microcarriers sitzen­ den Zellen enzymatisch abgelöst und gereinigt werden.

3. Verfahren zur eindeutigen, spezifischen und unzweifelhaf­ ten Identifizierung von Endothelzellen, dadurch gekennzeich­ net, daß an den zu identifiziernden Zellen eine quantitative Immunofluoreszenz mit Hilfe von monoklonalen Insulin- und Heparinrezeptorantikörpern durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zu identifizierenden Zellen auf einem Chamber-Slide kul­ tiviert und fixiert werden, die Zellen anschließend mit einem Insulinrezeptorantikörper überschichtet, mit gepuffer­ ter Saline gewaschen, mit einem Fluoreszenz- oder Rhodamin­ gekoppeltem Antihumanantikörper überschichtet, erneut ge­ waschen, mit einem Heparinrezeptorantikörper überschichtet, erneut mit gepufferter Saline gewaschen, dann mit dem kon­ trakorrespondierenden Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekoppelten Antihumanantikörper überschichtet und, zur Verhinderung der Austrocknung, mit einem Gemisch aus Glycerin und p-Phenylen­ diaminderivaten oder 1,4-Diazobicyclo(2,2)octanderivaten überschichtet werden, wobei die Auswertung der Insulin- und Heprain-Rezeptordichte pro Membranfläche durch ein quantita­ tives Fluoreszenzmikroskop erfolgen kann.

5. Verfahren zur Zellisolierung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Organhomogenisat mit Fluoreszenz- oder Rhodamin-gekop­ pelten Insulin- und Heparin-Rezeptorantikörpern markiert, wobei die Antikörper stets kontrakorrespondierend gekoppelt sein müssen, die markierten Zellen mit Hilfe eines Fluor­ eszenz-activated Cell Sorters getrennt und die entsprechen­ den Zellen anschließend kloniert werden.

6. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 gewon­ nenen Endothelzellen für die eindeutige und unzweifelhafte Diagnose und Klärung der Ätiopathogenese von Krankheitszu­ ständen.