JPS6030294B2 - 人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白質を含有する分画の加熱処理方法 - Google Patents
人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白質を含有する分画の加熱処理方法Info
- Publication number
- JPS6030294B2 JPS6030294B2 JP53118203A JP11820378A JPS6030294B2 JP S6030294 B2 JPS6030294 B2 JP S6030294B2 JP 53118203 A JP53118203 A JP 53118203A JP 11820378 A JP11820378 A JP 11820378A JP S6030294 B2 JPS6030294 B2 JP S6030294B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hgigp
- fraction
- virus
- solution
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、健康な人の尿から分離されたところの人骨髄
中の骨髄細胞に作用してこの細胞の額粒球への分化増殖
を促進する糖蛋白質（以下ＨＧＩＧＰと記載する）を含
有する分画を濃縮し、蛋白質含量を１の【当り少なくと
も７０の９に調整し、５０〜７０００の温度で８〜３加
持間加熱処理し、該分画の中に混入することが危Ｉ倶さ
れるウイルスを不活化することを特徴とするＨＧにＰを
含有する分画の加熱処理方法に関する。
中の骨髄細胞に作用してこの細胞の額粒球への分化増殖
を促進する糖蛋白質（以下ＨＧＩＧＰと記載する）を含
有する分画を濃縮し、蛋白質含量を１の【当り少なくと
も７０の９に調整し、５０〜７０００の温度で８〜３加
持間加熱処理し、該分画の中に混入することが危Ｉ倶さ
れるウイルスを不活化することを特徴とするＨＧにＰを
含有する分画の加熱処理方法に関する。
ＨＧＩＧＰは、人尿中に微量に存在する物質であり、人
の骨髄細胞に作用して類粒状のみを分化増殖せしめる機
能（以下生物活性と記載する）を有する。
の骨髄細胞に作用して類粒状のみを分化増殖せしめる機
能（以下生物活性と記載する）を有する。
この物質は先に本発明の共同研究者が人尿から純粋に分
離精製し、その物質の特定を行い、再現性ある製法によ
る製造を可能とし、人の白血球減少症治療剤としての用
途を見出し特許出願した（特願昭５３−３１９９９。以
下先願１と記載する）。しかし人尿中には、肝炎、風土
病等のウイルスが存在していることが知られており、人
尿から製造した医薬品をウイルスの除去又は不活化処理
を施さないまま医薬として人に投与した場合、ウイルス
感染症に羅患するおそれがあり、前記先願１のＨＧＩＧ
Ｐの製造法においてもそのおそれがある。このような危
険を回避するため、通常は免疫学的測定法で予めウイル
スを測定し、高濃度にウイルスを含有する原料を除外す
ることによりある程度のウイルス感染症の防止効果をあ
げている。しかしこの方法は数万人分の尿を一度に取扱
う工業的製法においては採用できない。一方、皿凝を分
画して得られる個別の人血清蛋白製剤についてもウイル
ス感染症の問題は包含されている。
離精製し、その物質の特定を行い、再現性ある製法によ
る製造を可能とし、人の白血球減少症治療剤としての用
途を見出し特許出願した（特願昭５３−３１９９９。以
下先願１と記載する）。しかし人尿中には、肝炎、風土
病等のウイルスが存在していることが知られており、人
尿から製造した医薬品をウイルスの除去又は不活化処理
を施さないまま医薬として人に投与した場合、ウイルス
感染症に羅患するおそれがあり、前記先願１のＨＧＩＧ
Ｐの製造法においてもそのおそれがある。このような危
険を回避するため、通常は免疫学的測定法で予めウイル
スを測定し、高濃度にウイルスを含有する原料を除外す
ることによりある程度のウイルス感染症の防止効果をあ
げている。しかしこの方法は数万人分の尿を一度に取扱
う工業的製法においては採用できない。一方、皿凝を分
画して得られる個別の人血清蛋白製剤についてもウイル
ス感染症の問題は包含されている。
そして従来特にアルブミン製剤について６０ｏｏ、１慨
時間の加熱処理を施すことにより、アルブミンを変質さ
せることなくウイルス感染症を阻止し得ることが見出さ
れ、その後アルブミン製剤にはこの加熱処理が施され、
安全に臨床使用されている。このように６０ｏｏ、１餌
時間加熱処理を施した製剤が投与後ウイルス感染症の防
止に有効であることが判明して以来、この方法は他の人
血清蛋白製剤に応用されている。６０こ０、１脚寺間の
加熱処理の方法を応用できる物質は、この処理に対して
物質自体が安定でなければならない。
時間の加熱処理を施すことにより、アルブミンを変質さ
せることなくウイルス感染症を阻止し得ることが見出さ
れ、その後アルブミン製剤にはこの加熱処理が施され、
安全に臨床使用されている。このように６０ｏｏ、１餌
時間加熱処理を施した製剤が投与後ウイルス感染症の防
止に有効であることが判明して以来、この方法は他の人
血清蛋白製剤に応用されている。６０こ０、１脚寺間の
加熱処理の方法を応用できる物質は、この処理に対して
物質自体が安定でなければならない。
そこでこの加熱処理を可能とするために各種の安定化剤
が見出され、安定化剤なしでは加熱処理に耐え得ないが
、安定化剤の存在下では加熱処理を可能となし得る物質
がある。一般に人血清蛋白の安定化剤としてはアミノ酸
や糖類などが生理的等張或はそれ以下の濃度で用いられ
ている。ＨＧＩＧＰを含有する製剤の場合にもこの６０
℃、１畑寺間の加熱処理を行うことはウイルスを不活化
するために望ましいことではあるが、この処理を行うこ
とによりＨＧＩＧＰの生物活性をも低下させる。本発明
者らは、ＨＧＩＧＰの加熱安定性を高めるための研究を
重ねてその処理条件を検討した結果、精製されたＨＧＩ
ＧＰは人血アルブミン又は人胎盤アルブミンを加えるこ
とにより加熱安定性が高められることを発見し、特許出
願した（特顔昭５３−８０６９５。以下先願２と記載す
る。）しかしながら先願２の加熱処理方法は、一度精製
したＨＧＩＧＰにアルブミンを加えて加熱するので、望
ましい方法とはいえない。そこで本発明者らは人尿中に
含まれている尿蛋白質がアルブミンと同様ＨＧＩＧＰの
加熱安定性を高めるのではないかと考え、研究を重ね、
７０の９′の‘以上の濃度で人尿蛋白質が存在するいわ
ば半精製の状態でＨＧＩＧＰを含有する分画を加熱する
ことにより、加熱によるＨＧＩＧＰの生物活性の失活を
ほぼ完全に防止し得ることを見出した。本発明の目的は
、何らの添加物をも加えることなく加熱処理し、ウイル
スを不宿化するＨＧＩＧＰを含有する分画の加熱処理方
法を提供することにある。次に本発明の方法について詳
述する。
が見出され、安定化剤なしでは加熱処理に耐え得ないが
、安定化剤の存在下では加熱処理を可能となし得る物質
がある。一般に人血清蛋白の安定化剤としてはアミノ酸
や糖類などが生理的等張或はそれ以下の濃度で用いられ
ている。ＨＧＩＧＰを含有する製剤の場合にもこの６０
℃、１畑寺間の加熱処理を行うことはウイルスを不活化
するために望ましいことではあるが、この処理を行うこ
とによりＨＧＩＧＰの生物活性をも低下させる。本発明
者らは、ＨＧＩＧＰの加熱安定性を高めるための研究を
重ねてその処理条件を検討した結果、精製されたＨＧＩ
ＧＰは人血アルブミン又は人胎盤アルブミンを加えるこ
とにより加熱安定性が高められることを発見し、特許出
願した（特顔昭５３−８０６９５。以下先願２と記載す
る。）しかしながら先願２の加熱処理方法は、一度精製
したＨＧＩＧＰにアルブミンを加えて加熱するので、望
ましい方法とはいえない。そこで本発明者らは人尿中に
含まれている尿蛋白質がアルブミンと同様ＨＧＩＧＰの
加熱安定性を高めるのではないかと考え、研究を重ね、
７０の９′の‘以上の濃度で人尿蛋白質が存在するいわ
ば半精製の状態でＨＧＩＧＰを含有する分画を加熱する
ことにより、加熱によるＨＧＩＧＰの生物活性の失活を
ほぼ完全に防止し得ることを見出した。本発明の目的は
、何らの添加物をも加えることなく加熱処理し、ウイル
スを不宿化するＨＧＩＧＰを含有する分画の加熱処理方
法を提供することにある。次に本発明の方法について詳
述する。
健康な人から集めた新鮮な尿１そ中には通常３０〜５０
ｍｇの蛋白質が含まれている。
ｍｇの蛋白質が含まれている。
この人尿を公知のウルトラフィルトレーション法、イオ
ン交換体吸着法、シリカゲル吸着法、塩析法、脱塩法等
あるいはこれらの方法の組合せにより処理し、人尿中に
含まれている蛋白質について濃縮し尿中の蛋白質ととも
濃縮されるＨＧＩＧＰを含有する分画を分離し、この分
画を減圧濃縮し、蛋白質含量を１の‘当り少なくとも７
０の９、望ましくは１００〜１５０の９に調整する。Ｈ
ＧＩＧＰ含有分画の蛋白質含量が１の【当り７０の９禾
満の場合、後述する実験１から明らかなように加熱によ
るＨＧにＰの生物活性の失活が大きく望ましくない。次
に調整されたＨＧＩＧＰ含有分画を５０〜７０℃、望ま
しくは５５〜６５ｏｏの温度で８〜３餌時間、望ましく
は８〜１２時間加熱し、ウイルスを失活させる。
ン交換体吸着法、シリカゲル吸着法、塩析法、脱塩法等
あるいはこれらの方法の組合せにより処理し、人尿中に
含まれている蛋白質について濃縮し尿中の蛋白質ととも
濃縮されるＨＧＩＧＰを含有する分画を分離し、この分
画を減圧濃縮し、蛋白質含量を１の‘当り少なくとも７
０の９、望ましくは１００〜１５０の９に調整する。Ｈ
ＧＩＧＰ含有分画の蛋白質含量が１の【当り７０の９禾
満の場合、後述する実験１から明らかなように加熱によ
るＨＧにＰの生物活性の失活が大きく望ましくない。次
に調整されたＨＧＩＧＰ含有分画を５０〜７０℃、望ま
しくは５５〜６５ｏｏの温度で８〜３餌時間、望ましく
は８〜１２時間加熱し、ウイルスを失活させる。
このようにして得られたＨＧにＰを含有する分画を精製
し、活性ウイルスが存在しないより精製されたＨＧＩＧ
Ｐを製造することができる。次に本発明の実施態様を記
載する。
し、活性ウイルスが存在しないより精製されたＨＧＩＧ
Ｐを製造することができる。次に本発明の実施態様を記
載する。
‘１｝ 本発明の１つの態様は、次のとおりである。
健康な人から集めた新鮮な尿に希薄な酸又はアルカリの
水溶液を加え、ｐＨを６〜９好ましくは７〜８に調整し
、次いで遠心分離して尿中に含まれている不熔物を除去
する。ここに得られる尿の上情をケイ素を含有する吸着
剤、例えばシリカゲル、シリカゲルーケィ酸マグネシウ
ム、珪藻±、シリカガラス、ベントナィトなどに接触さ
せ、吸着成分を溶出させる。溶出は、好ましくはＰＨ９
以上のアルカリ水溶液で行う。溶出に用いるアルカリ水
溶液は特に限定されるものではないが、好ましくは水酸
化アンモニウム、水酸化ナトリウムなどの０．３〜１．
８Ｍ濃度の水溶液を使用する。この様にして得られた溶
出液のＰＨを７〜８に調整し、中性塩例えば硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和に加えて有効物質を塩析し、ＨＧＩ
ＧＰを含む分画を得る。この分画を水に熔解する際に熔
解する水の量を調節することによって水溶液中の蛋白濃
度を少なくとも７０の９′似に調整する。次いでこの水
溶液を５０〜７０００、望ましくは５５〜６５００の加
熱温度で８〜３餌時間、望ましくは８〜１幼時間加熱し
、ウイルスを失活させる。この加熱処理した分画からの
ＨＧＩＧＰの精製は次のようにして行なわれる。
水溶液を加え、ｐＨを６〜９好ましくは７〜８に調整し
、次いで遠心分離して尿中に含まれている不熔物を除去
する。ここに得られる尿の上情をケイ素を含有する吸着
剤、例えばシリカゲル、シリカゲルーケィ酸マグネシウ
ム、珪藻±、シリカガラス、ベントナィトなどに接触さ
せ、吸着成分を溶出させる。溶出は、好ましくはＰＨ９
以上のアルカリ水溶液で行う。溶出に用いるアルカリ水
溶液は特に限定されるものではないが、好ましくは水酸
化アンモニウム、水酸化ナトリウムなどの０．３〜１．
８Ｍ濃度の水溶液を使用する。この様にして得られた溶
出液のＰＨを７〜８に調整し、中性塩例えば硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和に加えて有効物質を塩析し、ＨＧＩ
ＧＰを含む分画を得る。この分画を水に熔解する際に熔
解する水の量を調節することによって水溶液中の蛋白濃
度を少なくとも７０の９′似に調整する。次いでこの水
溶液を５０〜７０００、望ましくは５５〜６５００の加
熱温度で８〜３餌時間、望ましくは８〜１幼時間加熱し
、ウイルスを失活させる。この加熱処理した分画からの
ＨＧＩＧＰの精製は次のようにして行なわれる。
加熱処理した水溶液を分子分別フィルターで分子量１０
０００以下の低分子成分を除去し、陽イオン交換体（例
えば、カルボキシメチル交換基結含デキストラン、カル
ボキシメチルセルロース、ホスフオセルロース）と接触
させ、溶液中に含まれている不純物を吸着せしめ除去す
る。
０００以下の低分子成分を除去し、陽イオン交換体（例
えば、カルボキシメチル交換基結含デキストラン、カル
ボキシメチルセルロース、ホスフオセルロース）と接触
させ、溶液中に含まれている不純物を吸着せしめ除去す
る。
接触はほぼ中性において行なわれ、ＨＧＩＧＰ含有分画
及びイオン交換体は、ｐＨ６〜８に好ましくは０．０１
〜０．１９ Ｍの無機塩緩衝液によって平衡化される。
この際ＨＧＩＧＰの大部分は通過する。これを濃縮して
からｐＨ６〜８の希薄な緩衝液と平衡させ、平衡化した
陰イオン交換体（例えばＤＥＡＥ セルロース）と接
触させ、ＨＧＩＣＰを吸着させ、０．１〜０．３Ｍの無
機塩例えば塩化ナトリウム溶液を用いて塩濃度を変化さ
せ、所謂直線濃度勾配溶出法により溶出させる。この際
ＨＯＩＧＰは０．１Ｍ以上の塩濃度で溶出するが、完全
な分離は困難である。この０．１〜０．３ Ｍの塩濃度
による熔出分画を集め、要すれば脱塩及び濃縮する。尚
、この塩濃度を変化させて溶出させる工程の前に、ＨＧ
ＩＧＰを陰イオン交換体に吸着せしめ、０．１〜０．３
Ｍの塩濃度の水溶液で溶出させ、精製してもよい。
及びイオン交換体は、ｐＨ６〜８に好ましくは０．０１
〜０．１９ Ｍの無機塩緩衝液によって平衡化される。
この際ＨＧＩＧＰの大部分は通過する。これを濃縮して
からｐＨ６〜８の希薄な緩衝液と平衡させ、平衡化した
陰イオン交換体（例えばＤＥＡＥ セルロース）と接
触させ、ＨＧＩＣＰを吸着させ、０．１〜０．３Ｍの無
機塩例えば塩化ナトリウム溶液を用いて塩濃度を変化さ
せ、所謂直線濃度勾配溶出法により溶出させる。この際
ＨＯＩＧＰは０．１Ｍ以上の塩濃度で溶出するが、完全
な分離は困難である。この０．１〜０．３ Ｍの塩濃度
による熔出分画を集め、要すれば脱塩及び濃縮する。尚
、この塩濃度を変化させて溶出させる工程の前に、ＨＧ
ＩＧＰを陰イオン交換体に吸着せしめ、０．１〜０．３
Ｍの塩濃度の水溶液で溶出させ、精製してもよい。
次に前記分画を分子節クロマトグラフィーの目的で、１
０〜２０の【／夕の水吸収度を有する高架橋度重合ゲル
、例えばセフアデックスＧ−１５０、バイオゲルＰ−１
００を充填したカラムに通液して分画中の有効物質を０
．０５〜０．１モルの塩類緩衝液にて展開せしめ、相対
熔出液量が１．１１〜１．６０、望ましくは１．１１〜
１．４５である分画を分別し、有効成分を集め、更に脱
塩し濃縮又は凍結乾燥を行う（上記の方法を以後Ａ法と
言う。
０〜２０の【／夕の水吸収度を有する高架橋度重合ゲル
、例えばセフアデックスＧ−１５０、バイオゲルＰ−１
００を充填したカラムに通液して分画中の有効物質を０
．０５〜０．１モルの塩類緩衝液にて展開せしめ、相対
熔出液量が１．１１〜１．６０、望ましくは１．１１〜
１．４５である分画を分別し、有効成分を集め、更に脱
塩し濃縮又は凍結乾燥を行う（上記の方法を以後Ａ法と
言う。
）以上のようにしてＨＧＩＧＰの生物活性が失活せず、
加熱処理され、ウイルスを含まず、より精製されたＨＧ
ＩＧＰ含有量が得られる。｛２） 本発明の他の態様は
、次のとおりである。健康な人から集めた新鮮な尿に希
薄な酸又はアルカリの水溶液を加え、ｐＨを６〜９好ま
し〈は７〜８１こ調整し、次いで遠心分離して尿中に含
まれている不溶物を除去する。ここに得られる尿の上清
をケイ素を含有する吸着剤、例えばシリカゲル、シリカ
ゲルーケイ酸マグネシウム、珪藻±、シリカガラス、ベ
ントナイトなどに接触させ、吸着成分を港三‐巳させる
。溶出は、好ましくはｐＨ９以上のアルカリ水溶液で行
う。溶出に用いるアルカリ水溶液は特に限定されるもの
ではないが、好ましくは水酸化アンモニウム、水酸化ナ
トリウムなどの０．３〜１．８の濃度の水溶液を使用す
る。この様にして得られた溶出液のｐＨを７〜８に調整
し、中性塩例えば硫酸アンモニウムを７０％飽和に加え
て有効物質を塩折しＨＧＩＧＰを含む粗分画を得る。次
にこの相分画を少量の水に溶解し、分子分別フィルター
で分子量１００００以下の低分子成分を除去し陽イオン
交換体（例えばカルボキシメチル交換基結合デキストラ
ン、力ルボキシメチルセルロ‐‐ス、ホスフオセル。
加熱処理され、ウイルスを含まず、より精製されたＨＧ
ＩＧＰ含有量が得られる。｛２） 本発明の他の態様は
、次のとおりである。健康な人から集めた新鮮な尿に希
薄な酸又はアルカリの水溶液を加え、ｐＨを６〜９好ま
し〈は７〜８１こ調整し、次いで遠心分離して尿中に含
まれている不溶物を除去する。ここに得られる尿の上清
をケイ素を含有する吸着剤、例えばシリカゲル、シリカ
ゲルーケイ酸マグネシウム、珪藻±、シリカガラス、ベ
ントナイトなどに接触させ、吸着成分を港三‐巳させる
。溶出は、好ましくはｐＨ９以上のアルカリ水溶液で行
う。溶出に用いるアルカリ水溶液は特に限定されるもの
ではないが、好ましくは水酸化アンモニウム、水酸化ナ
トリウムなどの０．３〜１．８の濃度の水溶液を使用す
る。この様にして得られた溶出液のｐＨを７〜８に調整
し、中性塩例えば硫酸アンモニウムを７０％飽和に加え
て有効物質を塩折しＨＧＩＧＰを含む粗分画を得る。次
にこの相分画を少量の水に溶解し、分子分別フィルター
で分子量１００００以下の低分子成分を除去し陽イオン
交換体（例えばカルボキシメチル交換基結合デキストラ
ン、力ルボキシメチルセルロ‐‐ス、ホスフオセル。
ース）と接触させ、溶液中に含まれている不純物を吸着
せしめ除去する。接触はほぼ中性において行なわれ、Ｈ
ＧＩＧＰ含有分画及びイオン交換体は、ｐＨ６〜８に好
ましくは０．０１〜０．１５Ｍの無機塩緩衝液によって
平衡化される。この際ＨＧＩＧＰの大部分は通過する。
この通過したＨＧＩＧＰを含有する溶液を濃縮し、蛋白
濃度を少なくとも７０の９／叫に調整し、５０〜７００
０、望ましくは５５〜６５００の加熱温度で８〜３解時
間、望ましくは８〜１幼時間加熱し、ウイルスを失活さ
せる。この加熱処理した分画からのＨＧＩＧＰの精製は
次のようにして行なわれる。加熱処理した分画をｐＨ６
〜８の希薄な緩衝液と平衡させ、平衡化した陰イオン交
換体（例えばＤＥＡＥセルロース）と接触させ、以下Ａ
法と同様に処理する（この方法を以後Ｂ法と言う。
せしめ除去する。接触はほぼ中性において行なわれ、Ｈ
ＧＩＧＰ含有分画及びイオン交換体は、ｐＨ６〜８に好
ましくは０．０１〜０．１５Ｍの無機塩緩衝液によって
平衡化される。この際ＨＧＩＧＰの大部分は通過する。
この通過したＨＧＩＧＰを含有する溶液を濃縮し、蛋白
濃度を少なくとも７０の９／叫に調整し、５０〜７００
０、望ましくは５５〜６５００の加熱温度で８〜３解時
間、望ましくは８〜１幼時間加熱し、ウイルスを失活さ
せる。この加熱処理した分画からのＨＧＩＧＰの精製は
次のようにして行なわれる。加熱処理した分画をｐＨ６
〜８の希薄な緩衝液と平衡させ、平衡化した陰イオン交
換体（例えばＤＥＡＥセルロース）と接触させ、以下Ａ
法と同様に処理する（この方法を以後Ｂ法と言う。
）。このＢ法によっても前記Ａ法と同等のより精製され
たＨＧＩＧＰ含有物が得られる。｛３’更に本発明の他
の態様は、次のとおりである。健康な人から集めた新鮮
な尿に希薄な酸又はアルカリの水溶液を加え、ｐＨを６
〜９好ましくは７〜８に調整し、次いで遠心分離して尿
中に含まれている不溶物を除去する。ここに得られる尿
の上情をケイ素を含有する吸着剤、例えばシリカゲル、
シリカゲルーケィ酸マグネシウム、珪藻士、シリカガラ
ス、ベントナィトなどに後蝕させ、吸着成分を溶出させ
る。溶出は、好ましくはｐＨ９以上のアルカリ水溶液で
行う。溶出に用いるアルカリ水溶液は特に限定されるも
のではないが、好ましくは水酸化アンモニウム、水酸化
ナトリウムなどの０．３〜１．８Ｍ濃度の水溶液を使用
する。この様にして得られた溶出液のｐＨを７〜８に調
整し、中性塩例えば硫酸アンモニウムを７０％飽和に加
えて有効物質を塩析しＨＧＩＧＰを含む分画を得る。次
にこの分画を少量の水に熔解し、分子分別フィルターで
分子量１００００以下の低分子成分を除去し陽イオン交
換体（例えば、カルポキシメチル交換基結合デキストラ
ン、カルボキシメチルセルロース、ホスフオセルロース
）と接触させ、溶液中に含まれている不純物を吸着せし
め除去する。
たＨＧＩＧＰ含有物が得られる。｛３’更に本発明の他
の態様は、次のとおりである。健康な人から集めた新鮮
な尿に希薄な酸又はアルカリの水溶液を加え、ｐＨを６
〜９好ましくは７〜８に調整し、次いで遠心分離して尿
中に含まれている不溶物を除去する。ここに得られる尿
の上情をケイ素を含有する吸着剤、例えばシリカゲル、
シリカゲルーケィ酸マグネシウム、珪藻士、シリカガラ
ス、ベントナィトなどに後蝕させ、吸着成分を溶出させ
る。溶出は、好ましくはｐＨ９以上のアルカリ水溶液で
行う。溶出に用いるアルカリ水溶液は特に限定されるも
のではないが、好ましくは水酸化アンモニウム、水酸化
ナトリウムなどの０．３〜１．８Ｍ濃度の水溶液を使用
する。この様にして得られた溶出液のｐＨを７〜８に調
整し、中性塩例えば硫酸アンモニウムを７０％飽和に加
えて有効物質を塩析しＨＧＩＧＰを含む分画を得る。次
にこの分画を少量の水に熔解し、分子分別フィルターで
分子量１００００以下の低分子成分を除去し陽イオン交
換体（例えば、カルポキシメチル交換基結合デキストラ
ン、カルボキシメチルセルロース、ホスフオセルロース
）と接触させ、溶液中に含まれている不純物を吸着せし
め除去する。
接触はほぼ中性において行なわれ、ＨＧＩＧＰ含有分画
及びイオン交換体は、餌６〜８に好ましくは０．０１〜
０．１９Ｋの無機塩緩衝液によって平衡化される。この
際ＨＧＩＧＰの大部分は通過する。これを濃縮してから
ｐＨ６〜８の希薄な緩衝液と平衡させ、平衡化した陰イ
オン交換体（例えばＤＥＡＥ セルロース）と接触させ
、ＨＧＩＧＰを吸着させ、０．１〜０．３ Ｍの無機塩
例えば塩化ナトリウム溶液を用いて塩濃度を変化させ、
所謂直線濃度勾配熔出法により溶出させる。この際ＨＧ
ＩＧＰは０．１Ｍ以上の塩濃度で溶出するが、完全な分
離は困難である。この０．１〜０．弧４の塩濃度による
溶出分画を集める。溶出した分画を濃縮し、蛋白濃度を
少なくとも７０の９／机に調整し、５０〜７０ｑｏ、望
ましくは５５〜６５℃の加熱温度で８〜３畑時間、望ま
しくは８〜１２時間加熱し、ウイルスを失活させる。こ
の加熱処理した分画からのＨＧＩＧＰの精製は次のよう
にして行なわれる。加熱処理した分画を分子筋クロマト
グラフィーの目的で１０〜２０叫′夕の水吸収度を有す
る高架橋度ゲルを充填したカルムに通液し、以下Ａ法と
同様に処理する（上前方法を以後Ｃ法と言う。
及びイオン交換体は、餌６〜８に好ましくは０．０１〜
０．１９Ｋの無機塩緩衝液によって平衡化される。この
際ＨＧＩＧＰの大部分は通過する。これを濃縮してから
ｐＨ６〜８の希薄な緩衝液と平衡させ、平衡化した陰イ
オン交換体（例えばＤＥＡＥ セルロース）と接触させ
、ＨＧＩＧＰを吸着させ、０．１〜０．３ Ｍの無機塩
例えば塩化ナトリウム溶液を用いて塩濃度を変化させ、
所謂直線濃度勾配熔出法により溶出させる。この際ＨＧ
ＩＧＰは０．１Ｍ以上の塩濃度で溶出するが、完全な分
離は困難である。この０．１〜０．弧４の塩濃度による
溶出分画を集める。溶出した分画を濃縮し、蛋白濃度を
少なくとも７０の９／机に調整し、５０〜７０ｑｏ、望
ましくは５５〜６５℃の加熱温度で８〜３畑時間、望ま
しくは８〜１２時間加熱し、ウイルスを失活させる。こ
の加熱処理した分画からのＨＧＩＧＰの精製は次のよう
にして行なわれる。加熱処理した分画を分子筋クロマト
グラフィーの目的で１０〜２０叫′夕の水吸収度を有す
る高架橋度ゲルを充填したカルムに通液し、以下Ａ法と
同様に処理する（上前方法を以後Ｃ法と言う。
）。このＣ法によっても前記Ａ及びＢ法と同等のより精
製されたＨＧＩＧＰ含有物が得られる。（４ー 更に本
発明の他の態様は次のとおりである。
製されたＨＧＩＧＰ含有物が得られる。（４ー 更に本
発明の他の態様は次のとおりである。
健康な人から集めた新鮮な尿を遠心分離して不熔物を除
去し、ウルトラフィルトレーションにより分子量１００
０氏未満の分画を除去し、得られた濃縮尿を減圧濃縮し
、蛋白質含量を１凧【当り少なくとも７０爪９に調整す
る。次いでこのＨＧＩＧＰ含有分画を５０〜７０ｏｏ、
望ましくは５５〜６５ｄｏの加熱温度で８〜３畑時間、
望ましくは８〜１幼時間加熱し、ウイルスを失活させる
。この加熱処理した分画からのＨＧＩＧＰの精製は、前
記Ｂ法と同様にして行なわれる（この方法を以後Ｄ法と
言う。）。このＤ法によっても前記Ａ、Ｂ及びＣ法と同
等のより精製されたＨＧＩＧＰ含有物が得られる。
去し、ウルトラフィルトレーションにより分子量１００
０氏未満の分画を除去し、得られた濃縮尿を減圧濃縮し
、蛋白質含量を１凧【当り少なくとも７０爪９に調整す
る。次いでこのＨＧＩＧＰ含有分画を５０〜７０ｏｏ、
望ましくは５５〜６５ｄｏの加熱温度で８〜３畑時間、
望ましくは８〜１幼時間加熱し、ウイルスを失活させる
。この加熱処理した分画からのＨＧＩＧＰの精製は、前
記Ｂ法と同様にして行なわれる（この方法を以後Ｄ法と
言う。）。このＤ法によっても前記Ａ、Ｂ及びＣ法と同
等のより精製されたＨＧＩＧＰ含有物が得られる。
尚、前記Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ法において相対溶出液量とは
、Ｖｅ／Ｖｏで表わされる数値であり、Ｖｅはカラム内
の物質を溶出するに必要な溶媒の液量を示し、Ｖｏはカ
ラム内のゲル粒子外部の溶媒の液量を示す。
、Ｖｅ／Ｖｏで表わされる数値であり、Ｖｅはカラム内
の物質を溶出するに必要な溶媒の液量を示し、Ｖｏはカ
ラム内のゲル粒子外部の溶媒の液量を示す。
本発明の方法により得られた加熱処理分画を凍結乾燥し
た粉末状の物質は粉末１夕当り蛋白質６００〜８００の
９、ＨＧＩＧＰ３〜５雌を含有している。
た粉末状の物質は粉末１夕当り蛋白質６００〜８００の
９、ＨＧＩＧＰ３〜５雌を含有している。
この粉末状の物質を医薬として使用するにあたっては、
滅菌生理食塩水、滅菌水、無菌の注射用等張液等を加え
て溶解し、静脈注射、筋注射、皮下注射により白血球減
少症患者に投与される。有効投与量は１日体重ｌｋ９当
りＨＧＩＧＰとして０．７５の９以上、望ましくは０．
７５〜２．２４の９である。このＨＧＩＧＰを含有する
物質は、活性なウイルスが爽雑する危煤がないので、人
尿から得られた医薬品としてウイルス感染症の心配のな
い安全な白血球減少症治療剤として使用される。前記Ａ
、Ｂ、Ｃ及びＤ法によって得られたＨＧＩＧＰ含有物を
更に精製するには、この粗製物を、１．０〜２．０Ｍ塩
を含有する希薄な緩衝液例えばリン酸塩緩衝液ｐＨ６．
０〜８．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．０に溶解させ
、あらかじめ該緩衝液で平衡化させた糖親和性吸着体例
えばコンカナバリンＡーセフアロース燈（ファイン ケ
ミカルラボラトリー社製）にＨＧＩＧＰを吸着せしめ、
ついで２０ｍＭから１００ｍＭの健類、例えばＱ−メチ
ル−Ｄ−グルコシドなどを含む１．０〜２．０Ｍ塩添加
緩衝液ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．０〜７
．０で溶出させＨＯＩＧＰ分画を集め、必要により脱塩
し濃縮又は凍結乾燥を行なう。
滅菌生理食塩水、滅菌水、無菌の注射用等張液等を加え
て溶解し、静脈注射、筋注射、皮下注射により白血球減
少症患者に投与される。有効投与量は１日体重ｌｋ９当
りＨＧＩＧＰとして０．７５の９以上、望ましくは０．
７５〜２．２４の９である。このＨＧＩＧＰを含有する
物質は、活性なウイルスが爽雑する危煤がないので、人
尿から得られた医薬品としてウイルス感染症の心配のな
い安全な白血球減少症治療剤として使用される。前記Ａ
、Ｂ、Ｃ及びＤ法によって得られたＨＧＩＧＰ含有物を
更に精製するには、この粗製物を、１．０〜２．０Ｍ塩
を含有する希薄な緩衝液例えばリン酸塩緩衝液ｐＨ６．
０〜８．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．０に溶解させ
、あらかじめ該緩衝液で平衡化させた糖親和性吸着体例
えばコンカナバリンＡーセフアロース燈（ファイン ケ
ミカルラボラトリー社製）にＨＧＩＧＰを吸着せしめ、
ついで２０ｍＭから１００ｍＭの健類、例えばＱ−メチ
ル−Ｄ−グルコシドなどを含む１．０〜２．０Ｍ塩添加
緩衝液ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．０〜７
．０で溶出させＨＯＩＧＰ分画を集め、必要により脱塩
し濃縮又は凍結乾燥を行なう。
−更に、ここに得られた分画を蟹気泳動的に純化する目
的で、支持体として例えばアクリルアミドゲル、寒天ゲ
ルｐＨ７．０〜９．０を用いる調整用ゾーン電気滋動に
かけ、冷却下で希薄塩溶液により支持体からＨＧＩＧＰ
を回収し、脱塩し濃縮又は凍結乾燥を行なうこともでき
る。
的で、支持体として例えばアクリルアミドゲル、寒天ゲ
ルｐＨ７．０〜９．０を用いる調整用ゾーン電気滋動に
かけ、冷却下で希薄塩溶液により支持体からＨＧＩＧＰ
を回収し、脱塩し濃縮又は凍結乾燥を行なうこともでき
る。
前記Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ法により得られた
ＨＧＩＧＰ含有物を後述する参考例５の方法により更に
精製して得られたＨＧＩＧＰは、いずれも白色乃至はか
すかに褐色を呈し、無味、無臭であり、僅かに吸湿性を
示す粉末であって、次に記載する理化学的特徴を有し、
先願１の物質と同一であった。
精製して得られたＨＧＩＧＰは、いずれも白色乃至はか
すかに褐色を呈し、無味、無臭であり、僅かに吸湿性を
示す粉末であって、次に記載する理化学的特徴を有し、
先願１の物質と同一であった。
【１ー 分子量
本発明の方法により処理されたＨＧＩＧＰをドデシル硫
酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気隊敷法によ
り、分子量を測定したところ、約８５０００であった。
酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気隊敷法によ
り、分子量を測定したところ、約８５０００であった。
又、セファデックスＧ−１５０によるゲル炉過の結果で
は、ＨＧＩＧＰの分子量は７５０００〜９００００であ
った。従ってＨＧＩＧＰの分子量を７５０００〜９００
００とすることが最も信頼度の高い範囲と思われる。【
２｝ 溶解性 ＨＧＩＧＰの各種溶剤に対する溶解性は、第１表の通り
である。
は、ＨＧＩＧＰの分子量は７５０００〜９００００であ
った。従ってＨＧＩＧＰの分子量を７５０００〜９００
００とすることが最も信頼度の高い範囲と思われる。【
２｝ 溶解性 ＨＧＩＧＰの各種溶剤に対する溶解性は、第１表の通り
である。
第１表
この他、希薄な塩溶液、例えばリン酸塩溶液、トリスア
ミノメタン溶液に容易に溶解し、希薄塩類溶液のｐＨＩ
〜１２の範囲で溶解する。
ミノメタン溶液に容易に溶解し、希薄塩類溶液のｐＨＩ
〜１２の範囲で溶解する。
（３｝ ｐＨＨＧＩＧＰＩ％水溶液のｐＨ‘ま５．０〜
６．０であり、酸性を示す。
６．０であり、酸性を示す。
｛４１ 比旋光度
ＨＧＩＧＰの０．２５％水溶液を用いて２０００で旋光
度を測定し、比旋光度〔ｄ〕色ｏを求めた結果、０〜±
４０の範囲であった。
度を測定し、比旋光度〔ｄ〕色ｏを求めた結果、０〜±
４０の範囲であった。
‘５）赤外線吸収スペクトル
ＨＧＩＧＰのＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトル
は第１図に示す如くである。
は第１図に示す如くである。
ＨＧＩＧＰは第２表に示すように特徴的な吸収値を有す
る。第２表｛６｝ 等蚤点 ポリアクリルァミドゲル等電点電気決動法ｐｏｌ蛇ｃｒ
ｙｉａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｉｓｏｅｌｅｃｍｃ 位ｒｃ
聡ｓｉｎｇ）によりＨＧＩＧＰの等雷点を測定した結果
、等雷点はｐＨ４．７土０．２であった。
る。第２表｛６｝ 等蚤点 ポリアクリルァミドゲル等電点電気決動法ｐｏｌ蛇ｃｒ
ｙｉａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｉｓｏｅｌｅｃｍｃ 位ｒｃ
聡ｓｉｎｇ）によりＨＧＩＧＰの等雷点を測定した結果
、等雷点はｐＨ４．７土０．２であった。
の 呈色反応ＨＧＩＧＰを水に溶解したものについて呈
色反応を試験した結果を第３表に示す。
色反応を試験した結果を第３表に示す。
第３表
脚 温度安定性
ＨＧＩＧＰを１％（重量）の濃度で水に溶解し、６００
０±０．５ｑＣ、３０分間加熱したところ、その生物活
性は完全に失なわれた。
０±０．５ｑＣ、３０分間加熱したところ、その生物活
性は完全に失なわれた。
【９｝ 蛋白質部分の構成アミノ酸
ＨＧＩＧＰを常法により加水分解し、その蛋白質部分の
アミノ酸組成をアミノ酸自動分析装置を用いて分析した
。
アミノ酸組成をアミノ酸自動分析装置を用いて分析した
。
その結果を第４表に示す。第４表第４表より〜ＨＧＩＧ
Ｐの蛋白質部分は１万蓮のアミノ酸から構成され、酸性
アミノ酸と中性アミノ酸が多量に存在し、塩基性アミノ
酸は極めて少量である。
Ｐの蛋白質部分は１万蓮のアミノ酸から構成され、酸性
アミノ酸と中性アミノ酸が多量に存在し、塩基性アミノ
酸は極めて少量である。
またアスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン
酸、グリシン「アラニン、バリンならびにロィシンの直
鎖状アミノ酸が全アミノ酸の７０％以上を占めることも
特徴である。‘１０｝ 電気孫動 仏ｅｍ血の方法（Ｎａｔｍｅ、２２７巻、６８０頁、１
９７位王）に従い、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアク
リルアミドゲルを用いた露気泳動により、相対移動度０
．２５の位置に単一バンドを示す。
酸、グリシン「アラニン、バリンならびにロィシンの直
鎖状アミノ酸が全アミノ酸の７０％以上を占めることも
特徴である。‘１０｝ 電気孫動 仏ｅｍ血の方法（Ｎａｔｍｅ、２２７巻、６８０頁、１
９７位王）に従い、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアク
リルアミドゲルを用いた露気泳動により、相対移動度０
．２５の位置に単一バンドを示す。
ＨＧＩＧＰ、トリプシンィンヒビタ‐（分子量２１５０
０）、オボアルプミン（分子量４３０００）、人血清ァ
ルブミン単量体（分子量６５０００）及び人血清アルブ
ミン２量体（分子量１３００００）を同時に泳敷させ、
これらの分子量既知の物質の相対移動度とＨＧＩＧＰの
それとからＨＧＩＧＰの分子量を求めた結果的約８５０
００であった（第２図）。第２図においてａ，ｂ，ｃ，
ｄはそれぞれトリプシンィンヒビタ一、オボアルブミン
、人血清アルブミン単量体及び人血清アルブミン２量体
を示し、矢印はＨＧＩＧＰを示す。（１１）紫外線吸収 ＨＧＩＧＰの０．１％水溶液を１肌のセルで測定した紫
外線吸収スペクトルは第３図に示すとおりであり、２８
触れに極大吸収を示し、２５肌の以下の波長で末端吸収
を示した。
０）、オボアルプミン（分子量４３０００）、人血清ァ
ルブミン単量体（分子量６５０００）及び人血清アルブ
ミン２量体（分子量１３００００）を同時に泳敷させ、
これらの分子量既知の物質の相対移動度とＨＧＩＧＰの
それとからＨＧＩＧＰの分子量を求めた結果的約８５０
００であった（第２図）。第２図においてａ，ｂ，ｃ，
ｄはそれぞれトリプシンィンヒビタ一、オボアルブミン
、人血清アルブミン単量体及び人血清アルブミン２量体
を示し、矢印はＨＧＩＧＰを示す。（１１）紫外線吸収 ＨＧＩＧＰの０．１％水溶液を１肌のセルで測定した紫
外線吸収スペクトルは第３図に示すとおりであり、２８
触れに極大吸収を示し、２５肌の以下の波長で末端吸収
を示した。
又ＨＧＩＧＰの２８仇似こおける吸光値（Ｅ鰍）は３‐
８であった。（１２）健質部分の構成糖 中性糖をフェノール硫酸法、シアル酸を Ｗａｒｒｅｎのチオバルビッール酸法（Ｊｏｍ雌ｌｏｆ
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３４巻、
１９７１頁、１９５９年）、ア ミ ノ 糖をＥ１ｓｏ
ｎ− Ｍｏｒｇａｎ法（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＩ Ｊｏ
ｎｒ岬１、２７巻、１８２４頁、１９３３年）により定
着した。
８であった。（１２）健質部分の構成糖 中性糖をフェノール硫酸法、シアル酸を Ｗａｒｒｅｎのチオバルビッール酸法（Ｊｏｍ雌ｌｏｆ
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３４巻、
１９７１頁、１９５９年）、ア ミ ノ 糖をＥ１ｓｏ
ｎ− Ｍｏｒｇａｎ法（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＩ Ｊｏ
ｎｒ岬１、２７巻、１８２４頁、１９３３年）により定
着した。
そして中性糖の量は、グルコース換算量として表わした
。その結果、中性糖１０．０〜１３．０％、シアル酸３
．０〜７．０％、アミノ糖１．０％以下であり、合計の
糖質量は、１３．０％〜２０．０％であった。（１３）
蛋白質と糖質の構成比率蛋白質をセミミクロケールダー
ル法により定量した結果７５〜８５％であり、前記（１
２）記載のように糖質の量は１３．０％〜２０．０％で
ある。
。その結果、中性糖１０．０〜１３．０％、シアル酸３
．０〜７．０％、アミノ糖１．０％以下であり、合計の
糖質量は、１３．０％〜２０．０％であった。（１３）
蛋白質と糖質の構成比率蛋白質をセミミクロケールダー
ル法により定量した結果７５〜８５％であり、前記（１
２）記載のように糖質の量は１３．０％〜２０．０％で
ある。
（１心 元素分析元素分析の結果は次のとおりである。
炭 素 ４２．３〜４７．３％
水 素 ５．７〜７．８％窒
素 ９．６〜１４．３％酸
素 ３４．４〜３９．４％ィ
オウ ０．２％以下次に本発
明の方法を試験例及び実施例を示して更に詳述する。
炭 素 ４２．３〜４７．３％
水 素 ５．７〜７．８％窒
素 ９．６〜１４．３％酸
素 ３４．４〜３９．４％ィ
オウ ０．２％以下次に本発
明の方法を試験例及び実施例を示して更に詳述する。
ただし、本発明の方法により得られたＨＧＩＧＰ含有分
画中のＨＧＩＧＰの含量は極めて低く、そのままでは試
験に供されないので、それぞれ参考例として後記する方
法により精製したＨＧＩＧＰ含有量を用いて効果の試験
を行なった。〔実験１〕水溶液中の蛋白濃度による加熱
処理の影響を次のようにして試験した。
画中のＨＧＩＧＰの含量は極めて低く、そのままでは試
験に供されないので、それぞれ参考例として後記する方
法により精製したＨＧＩＧＰ含有量を用いて効果の試験
を行なった。〔実験１〕水溶液中の蛋白濃度による加熱
処理の影響を次のようにして試験した。
ｍ 試料
‘ａー 試験試料
実施例１と同様の方法により人尿をシリカゲルカラムに
通液し、溶出液に粉末硫酸アンモニウムを加えて７０％
飽和となし、生成した沈殿を得た。
通液し、溶出液に粉末硫酸アンモニウムを加えて７０％
飽和となし、生成した沈殿を得た。
この沈殿を１Ｍ当り１０、５０、６０、７０、８０、１
００、１５０、２００の９の割合で水に熔解し、０．１
Ｍトリス−塩酸緩衝液を加え、ｐＨ７．０に調製した。
次いでこの水溶液を６０℃で１餌時間加熱し、のち直ち
に氷水で冷却し、以下参考例１と同様の方法で処理し、
凍結乾燥粉末を得た（試料Ｎｏ．９〜１６）。｛ｂ｝
対照試料 加熱処理を行なわずに前記試験試料と同一の方法で製造
した粉末（試料Ｎｏ．１〜８）。
００、１５０、２００の９の割合で水に熔解し、０．１
Ｍトリス−塩酸緩衝液を加え、ｐＨ７．０に調製した。
次いでこの水溶液を６０℃で１餌時間加熱し、のち直ち
に氷水で冷却し、以下参考例１と同様の方法で処理し、
凍結乾燥粉末を得た（試料Ｎｏ．９〜１６）。｛ｂ｝
対照試料 加熱処理を行なわずに前記試験試料と同一の方法で製造
した粉末（試料Ｎｏ．１〜８）。
（ｃ｝ 精製試料前記対照試料と同一の方法で製造した
粉末を参考例５の方法により精製した試料（試料Ｎｏ．
１７〜２４）。
粉末を参考例５の方法により精製した試料（試料Ｎｏ．
１７〜２４）。
剛 加熱精製試料
前記先願１の実施例１と同一の方法で製造した精製ＨＧ
ＩＧＰ粉末を１の上当り、１０、５０、６０、７０、８
０、１００、１５０及び２００双９の割合で水に溶解し
、６０００で１脚時間加熱し、氷冷し、凍結乾燥した粉
末（試料Ｎｏ．２５〜３２）。
ＩＧＰ粉末を１の上当り、１０、５０、６０、７０、８
０、１００、１５０及び２００双９の割合で水に溶解し
、６０００で１脚時間加熱し、氷冷し、凍結乾燥した粉
末（試料Ｎｏ．２５〜３２）。
以上の３２童の試料の生成活性を次のようにして測定し
た。‘２）生物活性の測定 ｉｎｖｉｔｒｏにおけるマウス骨髄細胞の顎粒球のコロ
ニー形成をパラメーターとして行なった。
た。‘２）生物活性の測定 ｉｎｖｉｔｒｏにおけるマウス骨髄細胞の顎粒球のコロ
ニー形成をパラメーターとして行なった。
すなわち直径３５肌のプラスチック培養皿にて２０％牛
脂胎児血清、ＨＧＩＧＰ濃度が同一になるよう調整した
０．１舷の試料、０．３％寒天及び７．５×１Ｍ固のマ
ウス骨髄細胞を含むＭｃＣｏｙ′ｓ船培地を加え、全量
を１の‘に調整し、７日間５％Ｃ０２を含む湿潤した空
気中で培養した。培養後、倒立顕微鏡下で検鏡し、５の
固以上の細胞集塊をコロニー数として計測した。尚、同
一蛋白濃度の対照試料の額粒球コロニー数に対する試験
試料のそれの百分率を算出し、生物活性回収率とした。
脂胎児血清、ＨＧＩＧＰ濃度が同一になるよう調整した
０．１舷の試料、０．３％寒天及び７．５×１Ｍ固のマ
ウス骨髄細胞を含むＭｃＣｏｙ′ｓ船培地を加え、全量
を１の‘に調整し、７日間５％Ｃ０２を含む湿潤した空
気中で培養した。培養後、倒立顕微鏡下で検鏡し、５の
固以上の細胞集塊をコロニー数として計測した。尚、同
一蛋白濃度の対照試料の額粒球コロニー数に対する試験
試料のそれの百分率を算出し、生物活性回収率とした。
その結果を第５表に示す。第５表第５表から明らかなよ
うに、試験試料群において蛋白濃度が７０の９／肌以上
のとき生物活性回収率が８５％以上を示し、この濃度未
満のとき生物活性回収率が劣る。
うに、試験試料群において蛋白濃度が７０の９／肌以上
のとき生物活性回収率が８５％以上を示し、この濃度未
満のとき生物活性回収率が劣る。
従って本発明の方法により人尿からＨＧＩＧＰを製造す
るあたり、加熱処理を行なうとき水溶液中の蛋白濃度を
少なくとも７０の９／地としなければならない。一方精
製されたＨＧＩＧＰにおいてはいずれの濃度においても
加熱により生物灘は茅化減少した。尚、Ｂ法（実施例２
）、Ｃ法（実施例３）及び○法（実施例４）により得ら
れた製品も前記実験１と同様の生物活性を有していた。
るあたり、加熱処理を行なうとき水溶液中の蛋白濃度を
少なくとも７０の９／地としなければならない。一方精
製されたＨＧＩＧＰにおいてはいずれの濃度においても
加熱により生物灘は茅化減少した。尚、Ｂ法（実施例２
）、Ｃ法（実施例３）及び○法（実施例４）により得ら
れた製品も前記実験１と同様の生物活性を有していた。
（実験２）
加熱処理によるウイルスの不活化について次の試験を行
なった。
なった。
実施例１と同様の方法により人尿１００〆をシリカゲル
カラムに通液し、溶出液に粉末硫酸アンモニウムを加え
て７０％飽和となし、約４０夕の沈殿を得た。
カラムに通液し、溶出液に粉末硫酸アンモニウムを加え
て７０％飽和となし、約４０夕の沈殿を得た。
得られた沈殿を１０夕ずつ４等分し、各５０私の水に溶
解し、更に蒸留水を加えて全量を１００肌に調整した（
溶液Ｋの蛋白濃度は１００の９′のと）。そしてこれら
の溶液に痘燈ウイルス、おたふくかぜウイルス、はしか
ウイルス、水泡性口内炎ウイルス、チクングニアウィル
ス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス
、コクサツキーウルス・ｎ‐ウルスを各々語のウイ肌浮
遊液（１×１び〜１×１ぴ／０．２泌のウイルス感染価
を有する：測定法は後記）として加えた。
解し、更に蒸留水を加えて全量を１００肌に調整した（
溶液Ｋの蛋白濃度は１００の９′のと）。そしてこれら
の溶液に痘燈ウイルス、おたふくかぜウイルス、はしか
ウイルス、水泡性口内炎ウイルス、チクングニアウィル
ス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス
、コクサツキーウルス・ｎ‐ウルスを各々語のウイ肌浮
遊液（１×１び〜１×１ぴ／０．２泌のウイルス感染価
を有する：測定法は後記）として加えた。
次いで２つの溶液を加熱せずに、そして他の２つの溶液
を６０００で１斑時間加熱し、氷冷し、以下参考例１と
同様の方法で処理し、ＨＣＩＧＰ含有粉末を調製した。
これらの各粉末についてウイルスの感染価を測定し、加
熱によるウイルスの不ご舌性を試験した。ウイルスの感
染価は、次の細胞を用いて測定した。痘燈ウイルスはＨ
ｅＬａ細胞で継代し、同細胞でフオーカス形成単位（Ｆ
ＯＣＵＳめｒｍｉｎｇｒｎｉｔ：Ｖｉｍｌｏｇｙ、３母
萱、１７４〜１７９頁、１９６群王）を測定した。おた
ふくかぜウイルス、はしかウイルス、日本脳炎ウイルス
の継代にはＶＥＲＯ細胞を、そしてポリオウイルス、コ
クサツキーウイルス、エコーウイルスの継代にはＨｅＬ
ａ細胞を用い、これらの感染性は、それぞれの細胞を用
いウイルスによる細胞変性を目安に５０％組織培養感染
価（５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉ
ｖｅｄｏｓｅ：国立予防衛生研究所学友会編「ウイルス
実験学ハ丸善、１９６７年）を求めた。この場合観察は
いずれも１０日間行なった。
を６０００で１斑時間加熱し、氷冷し、以下参考例１と
同様の方法で処理し、ＨＣＩＧＰ含有粉末を調製した。
これらの各粉末についてウイルスの感染価を測定し、加
熱によるウイルスの不ご舌性を試験した。ウイルスの感
染価は、次の細胞を用いて測定した。痘燈ウイルスはＨ
ｅＬａ細胞で継代し、同細胞でフオーカス形成単位（Ｆ
ＯＣＵＳめｒｍｉｎｇｒｎｉｔ：Ｖｉｍｌｏｇｙ、３母
萱、１７４〜１７９頁、１９６群王）を測定した。おた
ふくかぜウイルス、はしかウイルス、日本脳炎ウイルス
の継代にはＶＥＲＯ細胞を、そしてポリオウイルス、コ
クサツキーウイルス、エコーウイルスの継代にはＨｅＬ
ａ細胞を用い、これらの感染性は、それぞれの細胞を用
いウイルスによる細胞変性を目安に５０％組織培養感染
価（５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉ
ｖｅｄｏｓｅ：国立予防衛生研究所学友会編「ウイルス
実験学ハ丸善、１９６７年）を求めた。この場合観察は
いずれも１０日間行なった。
水泡性口内炎ウイルスはＦＬ細胞、チクングニアウィル
スＶＥＲＯ細胞を用いて継代し、感染価はそれぞれの細
胞を用いてブラック形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍ
ｌ唯ｕｎｉｔ：前記「ウイルス実験学」）を測定した。
スＶＥＲＯ細胞を用いて継代し、感染価はそれぞれの細
胞を用いてブラック形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍ
ｌ唯ｕｎｉｔ：前記「ウイルス実験学」）を測定した。
風疹ウイルスはＢＨＫ−２１細胞で継代し、ｖＥＲＯ細
胞を用いてブランク形成単位を測定した。
胞を用いてブランク形成単位を測定した。
，その結果、加熱処理をしなかった２試料では、ウイル
ス感染性が認められたのに対し、加熱処理した２試料に
おいては、ウイルス感染性が完全に失われ、本発明の方
法により、ウイルスが不活化されることが判明した。こ
の結果は本発明の方法により、この実験に用いたウイル
ス以外のウイルスの感染性も失活させうることを示唆す
るものである。実施例 １健康な人から集めた新規な尿
ｌｏｏ０れこ１０％水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨ‘
こ８を調整し、０℃に冷却しながら１５００仇．ｐ．ｍ
．で連続遠心分離機で遠心し、不落物を除去し、上清を
得た。
ス感染性が認められたのに対し、加熱処理した２試料に
おいては、ウイルス感染性が完全に失われ、本発明の方
法により、ウイルスが不活化されることが判明した。こ
の結果は本発明の方法により、この実験に用いたウイル
ス以外のウイルスの感染性も失活させうることを示唆す
るものである。実施例 １健康な人から集めた新規な尿
ｌｏｏ０れこ１０％水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨ‘
こ８を調整し、０℃に冷却しながら１５００仇．ｐ．ｍ
．で連続遠心分離機で遠心し、不落物を除去し、上清を
得た。
次にこの上情を１０％塩酸でｐＨを７とし、シリカゲル
を充填したカラム（１０×８０肌）に通液し、シリカゲ
ルに吸着された成分を５％アンモニア水４０そでカラム
から溶出した。
を充填したカラム（１０×８０肌）に通液し、シリカゲ
ルに吸着された成分を５％アンモニア水４０そでカラム
から溶出した。
このようにして得られた溶出液を１規定の硫酸でｐＨを
７．５に調整し、これに粉末硫酸アンモニウムを加えて
７０％飽和となし、０℃で一夜放置し、生成した約４０
夕の沈殿を炉則した。
７．５に調整し、これに粉末硫酸アンモニウムを加えて
７０％飽和となし、０℃で一夜放置し、生成した約４０
夕の沈殿を炉則した。
この沈殿物を水２００叫に溶解し、更に蒸留水を加えて
全量を４００の上に調整し、蛋白濃度を１００の９′机
上に調整した。この溶液を６０００で１加持間加熱し、
のち氷冷し、加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分画を得た。
参考例 １ 前記実施例１により得た加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分
画の生成した不溶物を除去し、透析チューブ（ピスキン
グ社製）に入れ、０．０９のリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．
５）に対して充分透析し、透析内液に該緩衝液を加えて
全量を１０のこ調整し、あらかじめ０．０８Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させたＣＭセフアデック
スＣ−５０イオン交換カラム（４．０×４０伽）に通液
し、爽雑物を該イオン交換樹脂に吸着せしめ、通過液を
得た。
全量を４００の上に調整し、蛋白濃度を１００の９′机
上に調整した。この溶液を６０００で１加持間加熱し、
のち氷冷し、加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分画を得た。
参考例 １ 前記実施例１により得た加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分
画の生成した不溶物を除去し、透析チューブ（ピスキン
グ社製）に入れ、０．０９のリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．
５）に対して充分透析し、透析内液に該緩衝液を加えて
全量を１０のこ調整し、あらかじめ０．０８Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させたＣＭセフアデック
スＣ−５０イオン交換カラム（４．０×４０伽）に通液
し、爽雑物を該イオン交換樹脂に吸着せしめ、通過液を
得た。
この通過液１０そをダイアフローホローフアィバー濃縮
装置（ァミコン社製、ＤＣ−３個型）で濃縮し、前記と
同様に濃縮液を０．１ＭトＩＪス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に対し、一晩５℃で透析し、この透析内液に該緩
衝液を加えて３れこ調整した。
装置（ァミコン社製、ＤＣ−３個型）で濃縮し、前記と
同様に濃縮液を０．１ＭトＩＪス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に対し、一晩５℃で透析し、この透析内液に該緩
衝液を加えて３れこ調整した。
この溶液をあらかじめ該緩衝液で平衡、活性化したＤＥ
ＡＥセルロースカラム（４．０×４０ｃの）に通液し、
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを
充分洗浄した後、０．３Ｍの食塩を含む０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出を行なった。そして
溶出液を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
対して透析し、透析内液を得た。この透析内液を再び該
緩衝液で平衡、活性化させたＤＥＡＥセルロースカラム
（４．０×４０弧）に通液し、０．１Ｍから０．３Ｍの
食塩の直線濃度勾配溶出法により溶出させ、額粒球の分
化増殖促進効果を有する分画を集め、この分画を蒸留水
に対して透析し、凍結乾燥し、この粉末を少量の０．１
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、該緩衝
液に対して透析し、透析内液を得た。
ＡＥセルロースカラム（４．０×４０ｃの）に通液し、
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを
充分洗浄した後、０．３Ｍの食塩を含む０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出を行なった。そして
溶出液を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
対して透析し、透析内液を得た。この透析内液を再び該
緩衝液で平衡、活性化させたＤＥＡＥセルロースカラム
（４．０×４０弧）に通液し、０．１Ｍから０．３Ｍの
食塩の直線濃度勾配溶出法により溶出させ、額粒球の分
化増殖促進効果を有する分画を集め、この分画を蒸留水
に対して透析し、凍結乾燥し、この粉末を少量の０．１
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、該緩衝
液に対して透析し、透析内液を得た。
次にこの透析内液２０泌を、あらかじめ０．１Ｍトリス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフアデック
スＧ−１５０カラム（４．０×６０仇）で展開させ、相
対溶出液量１．１１一１．４５の分画を集め、この分画
を蒸留水に対して充分透析し、透析内液を凍結乾燥し、
約１５の３のＨＧＩＧＰを含有する粉末約１夕を得た。
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフアデック
スＧ−１５０カラム（４．０×６０仇）で展開させ、相
対溶出液量１．１１一１．４５の分画を集め、この分画
を蒸留水に対して充分透析し、透析内液を凍結乾燥し、
約１５の３のＨＧＩＧＰを含有する粉末約１夕を得た。
この粉末について前記実験１及び２と同様の方法により
、生物活性及びウイルスの活性を試験した。その結果、
生物活性は加熱処理しないものとほぼ同等であり、何ら
かのウイルスの活性も検出されなかった。実施例 ２ 健康な人から集めた新鮮な尿４００のこ１０％水酸化ナ
トリウムを加えてｐＨを８に調整し０℃に冷却しながら
１５００仇．ｐ．ｍ．で連続遠心分離機で遠心し不落物
を除去し、上清を得た。
、生物活性及びウイルスの活性を試験した。その結果、
生物活性は加熱処理しないものとほぼ同等であり、何ら
かのウイルスの活性も検出されなかった。実施例 ２ 健康な人から集めた新鮮な尿４００のこ１０％水酸化ナ
トリウムを加えてｐＨを８に調整し０℃に冷却しながら
１５００仇．ｐ．ｍ．で連続遠心分離機で遠心し不落物
を除去し、上清を得た。
次にこの上清を１０％塩酸でｐＨを７とし、シリカゲル
を充填したカラム（１０×８０弧）に通液し、シリカゲ
ルに吸着された成分を５％アンモニア水４０そでカラム
から溶出した。
を充填したカラム（１０×８０弧）に通液し、シリカゲ
ルに吸着された成分を５％アンモニア水４０そでカラム
から溶出した。
このようにして得られた漆出液を１規定の硫酸でｐＨを
７．５に調整し、これに粉末硫酸アンモニウムを加えて
７０％飽和となし、０℃で一夜放置し、生成した沈殿を
炉別した。
７．５に調整し、これに粉末硫酸アンモニウムを加えて
７０％飽和となし、０℃で一夜放置し、生成した沈殿を
炉別した。
この沈殿物を５％アンモニア水２そに溶解し、透析チュ
ーブ（ビスキング社製）に入れ、０．０９Ｍリン酸塩衛
液（ｐＨ６．５）に対して充分透析し、透析内液に該緩
衝液を加えて全量を１０そに調整し、あらかじめ０．０
８Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させたＣＭ
セフアデックスＣ−５０イオン交換カラム（４０×４０
肌）に通液し、爽雑物を該イオン交予期樹脂に吸着せし
め、通過液を得た。
ーブ（ビスキング社製）に入れ、０．０９Ｍリン酸塩衛
液（ｐＨ６．５）に対して充分透析し、透析内液に該緩
衝液を加えて全量を１０そに調整し、あらかじめ０．０
８Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させたＣＭ
セフアデックスＣ−５０イオン交換カラム（４０×４０
肌）に通液し、爽雑物を該イオン交予期樹脂に吸着せし
め、通過液を得た。
この通過液１０〆をダイアフローホローフアィバ−濃縮
装置（アミコン社製、ＤＣ−３頂型）で濃縮し、蛋白濃
度を７０の９′叫に調整した。
装置（アミコン社製、ＤＣ−３頂型）で濃縮し、蛋白濃
度を７０の９′叫に調整した。
次いでこの濃縮液を６０こ０で１独特間加熱し、氷冷し
、加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分画を得た。参考例 ２ 前記実施例２により得た加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分
画の生成した不溶物を除去し、透析チューブ（ビスキン
グ社製）に入れ、０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に対し一晩５℃で透析し、この透析内液に該緩衝
液を加えて１そに調整した。
、加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分画を得た。参考例 ２ 前記実施例２により得た加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分
画の生成した不溶物を除去し、透析チューブ（ビスキン
グ社製）に入れ、０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に対し一晩５℃で透析し、この透析内液に該緩衝
液を加えて１そに調整した。
この溶液をあらかじめ該緩衝液で平衡、活性化したＤＥ
ＡＥセルロースカラム（４．０×４０弧）通液し、０．
１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを充分
洗浄した後、０．３Ｍの食塩を含む０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出を行なった。そして溶出
液を０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対し
て透析し、透析内液を得た。この透析内液を再び該緩衝
液で平衡、活性化させたＤＥＡＥセルロースカラム（４
．０×４０弧）に通液し、０．１Ｍから０．＄Ｍの食塩
の直線濃度勾配溶出法により港出させ、額粒球の分化増
殖促進効果を有する分画を進め、この分画に粉末硫酸ア
ンモニウムを加えて７０％飽和となし、沈殿物を集め、
この沈殿を少量の０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に溶解し、該緩衝液に対して透析し、透析内液を
得た。
ＡＥセルロースカラム（４．０×４０弧）通液し、０．
１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを充分
洗浄した後、０．３Ｍの食塩を含む０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出を行なった。そして溶出
液を０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対し
て透析し、透析内液を得た。この透析内液を再び該緩衝
液で平衡、活性化させたＤＥＡＥセルロースカラム（４
．０×４０弧）に通液し、０．１Ｍから０．＄Ｍの食塩
の直線濃度勾配溶出法により港出させ、額粒球の分化増
殖促進効果を有する分画を進め、この分画に粉末硫酸ア
ンモニウムを加えて７０％飽和となし、沈殿物を集め、
この沈殿を少量の０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に溶解し、該緩衝液に対して透析し、透析内液を
得た。
次にこの透析内液２０Ｍを、あらかじめ０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフアデツク
スＧ−１５０カラム（４．０×６０弧）で展開させ、相
対溶出液量１．１１−１．４５の分画を集め、この分画
を蒸留水に対して充分透析し、透析内液を凍血乾燥し、
約１３．５雌のＨＧＩＧＰを含有する粉末約４５０の夕
を得た。
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフアデツク
スＧ−１５０カラム（４．０×６０弧）で展開させ、相
対溶出液量１．１１−１．４５の分画を集め、この分画
を蒸留水に対して充分透析し、透析内液を凍血乾燥し、
約１３．５雌のＨＧＩＧＰを含有する粉末約４５０の夕
を得た。
この粉末について前記実験１及び２と同様の方法により
、生物活性及びウイルスの活性を試験した。
、生物活性及びウイルスの活性を試験した。
その結果、生物活性は加熱処理しないものとほぼ同等で
あり、何らのウイルスの活性も検出されなかった。実施
例 ３ 健康な人から集めた新鮮な尿４００夕に１０％水酸化ナ
トリウムを加えてｐＨを８に調整し０℃に冷却しながら
１５００仇．ｐ．ｍ．で連続遠心分離機で遠心し、不溶
物を除去し、上蒲を得た。
あり、何らのウイルスの活性も検出されなかった。実施
例 ３ 健康な人から集めた新鮮な尿４００夕に１０％水酸化ナ
トリウムを加えてｐＨを８に調整し０℃に冷却しながら
１５００仇．ｐ．ｍ．で連続遠心分離機で遠心し、不溶
物を除去し、上蒲を得た。
次に、この上溝を１０％塩酸でｐＨを７とし、シリカゲ
ルを充填したカラム（１０×８０肌）に通液し、シリカ
ゲルに吸着された成分を５％アンモニア水４０そでカラ
ムから溶出した。
ルを充填したカラム（１０×８０肌）に通液し、シリカ
ゲルに吸着された成分を５％アンモニア水４０そでカラ
ムから溶出した。
このようにして得られた溶出液を１規定の硫酸でｐＨを
７．５に調整し、これに粉末硫酸アンモニウムを加えて
７０％飽和となし、０℃で一夜放置し、生成した沈殿を
炉別した。
７．５に調整し、これに粉末硫酸アンモニウムを加えて
７０％飽和となし、０℃で一夜放置し、生成した沈殿を
炉別した。
この沈殿物を５％アンモニア水２そに溶解し、透析チュ
ーブ（ビスキング社製）に入れ、０．０５Ｍリン酸塩緩
衝液（ｐＨ６．５）に対して充分透析し、透析内液に該
緩衝液を加えて全量を１０夕に調整し、あらかじめ０．
０５Ｍリン酸塩緩衝液（柵６．５）で平衡化させたＣＭ
セフアデックスＣ−５０イオン交換カラム（４．０×４
０弧）に通液し、爽雑物を該イオン交換樹脂に吸着せし
め、通過液を得た。
ーブ（ビスキング社製）に入れ、０．０５Ｍリン酸塩緩
衝液（ｐＨ６．５）に対して充分透析し、透析内液に該
緩衝液を加えて全量を１０夕に調整し、あらかじめ０．
０５Ｍリン酸塩緩衝液（柵６．５）で平衡化させたＣＭ
セフアデックスＣ−５０イオン交換カラム（４．０×４
０弧）に通液し、爽雑物を該イオン交換樹脂に吸着せし
め、通過液を得た。
この通過液１０〆をダイアフローホローフアィバー濃縮
装置（アミコン社製、ＤＣ−３頂型）で濃縮し、前記と
同様に濃縮液を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に対し一晩５℃で透析し、この透析内液に該緩衝液
を加えて１のこ調整した。この溶液をあらかじめ該緩衝
液で平衡、活性化したＤＥＡＥセルロースカラム（４．
０×４０伽）に通液し、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７．０）でカラムを充分洗浄した後、０．３Ｍの食
塩を含む０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
熔出を行なった。そして熔出液を０．１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、透析内液を得た
。この透析内液を再び該緩衝液で平衡、活性化させたＤ
ＥＡＥセルロースカラム（４．０×４０伽）に通液し、
０．１Ｍから０．３Ｍの食塩の直線濃度勾配溶出法によ
り熔出させ、顎粒球の分化増殖促進効果を有する分国を
集め、この分画に粉末硫酸アンモニウムを加えて７０％
飽和となし、沈殿物を集め、この沈殿を０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、蛋白濃度を１５
０の夕／机に調整した。次いでこの溶液を６０００で１
加持間加熱し、氷冷し、加熱処理したＨＣＩＧＰ含有分
画を得た。参考例 ３ 前記実施例３により得た加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分
画の生成した不獲物を除去し、０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、透析内液を得た。
装置（アミコン社製、ＤＣ−３頂型）で濃縮し、前記と
同様に濃縮液を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に対し一晩５℃で透析し、この透析内液に該緩衝液
を加えて１のこ調整した。この溶液をあらかじめ該緩衝
液で平衡、活性化したＤＥＡＥセルロースカラム（４．
０×４０伽）に通液し、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７．０）でカラムを充分洗浄した後、０．３Ｍの食
塩を含む０．１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
熔出を行なった。そして熔出液を０．１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、透析内液を得た
。この透析内液を再び該緩衝液で平衡、活性化させたＤ
ＥＡＥセルロースカラム（４．０×４０伽）に通液し、
０．１Ｍから０．３Ｍの食塩の直線濃度勾配溶出法によ
り熔出させ、顎粒球の分化増殖促進効果を有する分国を
集め、この分画に粉末硫酸アンモニウムを加えて７０％
飽和となし、沈殿物を集め、この沈殿を０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、蛋白濃度を１５
０の夕／机に調整した。次いでこの溶液を６０００で１
加持間加熱し、氷冷し、加熱処理したＨＣＩＧＰ含有分
画を得た。参考例 ３ 前記実施例３により得た加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分
画の生成した不獲物を除去し、０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、透析内液を得た。
次にこの透析内液２０私を、あらかじめ０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフアデツク
スＧ−１５０カラム（４．０×６０肌）で展開させ、相
対溶出液量１．１１一１．４５の分画を集め、この分画
を蒸留水に対して充分透析し、透析内液を凍結乾燥し、
約１５雌のＨＧＩＧＰを含有する粉末約５００雌を得た
。この粉末について前記実験１及び２と同様の方法によ
り生物活性及びウイルスの活性を試験した。その結果生
物活性は加熱処理しないものとほぼ同等であり、何らの
ウイルスの活性も検出されなかった。実施例 ４ 健康な人から集めた新鮮な尿５０のこ１０％水酸化ナト
リリゥム水溶液を加えて中性となし、冷却連続遠心分離
機（１０００仇．ｐ．ｍ．）で遠心分離して不溶物を除
去し、上清を直ちにダイアフローホ。
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフアデツク
スＧ−１５０カラム（４．０×６０肌）で展開させ、相
対溶出液量１．１１一１．４５の分画を集め、この分画
を蒸留水に対して充分透析し、透析内液を凍結乾燥し、
約１５雌のＨＧＩＧＰを含有する粉末約５００雌を得た
。この粉末について前記実験１及び２と同様の方法によ
り生物活性及びウイルスの活性を試験した。その結果生
物活性は加熱処理しないものとほぼ同等であり、何らの
ウイルスの活性も検出されなかった。実施例 ４ 健康な人から集めた新鮮な尿５０のこ１０％水酸化ナト
リリゥム水溶液を加えて中性となし、冷却連続遠心分離
機（１０００仇．ｐ．ｍ．）で遠心分離して不溶物を除
去し、上清を直ちにダイアフローホ。
−ファイバー濃縮装置（アミコン社製、ＤＣ−３０型、
分子量１万以下通過膜を装着）により１ぴ音‘こ濃縮し
、水を加えて再び５０そとし、再度濃縮し、３その濃縮
尿を得た。次いで、該濃縮尿を回転式真空濃縮装置にて
濃縮し、蛋白質含有量が７０の９／仇との濃縮物約５０
の‘を得た。そして該濃縮物を６０００±０．５の温度
で１餌時間湯浴中で加熱し、直ちに冷却し、加熱処理し
たＨＧＩＧＰ含有分画を得た。参考例 ４前記実施例４
により得た加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分画の生成した
不溶物を除去し、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）を加えて全量を５そとし、あらかじめ０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ
セルロースカラム（４．０×４０伽）へ通液して、ＨＧ
ＩＧＰをＤＥＡＥセルロースに吸着させた後、０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを充分洗浄
後、０．３Ｍの食塩を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で港出を行なつた。
分子量１万以下通過膜を装着）により１ぴ音‘こ濃縮し
、水を加えて再び５０そとし、再度濃縮し、３その濃縮
尿を得た。次いで、該濃縮尿を回転式真空濃縮装置にて
濃縮し、蛋白質含有量が７０の９／仇との濃縮物約５０
の‘を得た。そして該濃縮物を６０００±０．５の温度
で１餌時間湯浴中で加熱し、直ちに冷却し、加熱処理し
たＨＧＩＧＰ含有分画を得た。参考例 ４前記実施例４
により得た加熱処理したＨＧＩＧＰ含有分画の生成した
不溶物を除去し、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
．０）を加えて全量を５そとし、あらかじめ０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ
セルロースカラム（４．０×４０伽）へ通液して、ＨＧ
ＩＧＰをＤＥＡＥセルロースに吸着させた後、０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを充分洗浄
後、０．３Ｍの食塩を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で港出を行なつた。
以下参考例１と同様にしてＨＧＩＧＰを含有する粉末約
６２の夕を得た。
６２の夕を得た。
この粉末について前記実験１及び２と同様の方法により
生物活性及びウイルス活性を試験した。
生物活性及びウイルス活性を試験した。
その結果生物活性は加熱処理しないものとほぼ同等であ
り、何らのウイルスの活性も検出されなかつた。参考例
５ 前記参考例１により得た粉末２００の９を１．０Ｍ食塩
を含む０．０２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、あらかじめ該緩衝液で平衡化したコンカナパリンＡ
−セファロース姫１００Ｍを含むカラムに通液し、１．
０Ｍ食塩を含む０．０２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０
）でカラムを充分洗浄し、のち５０ｍＭＱーメチルーＤ
ーグルコシド及び１．０Ｍ食塩を含む０。
り、何らのウイルスの活性も検出されなかつた。参考例
５ 前記参考例１により得た粉末２００の９を１．０Ｍ食塩
を含む０．０２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、あらかじめ該緩衝液で平衡化したコンカナパリンＡ
−セファロース姫１００Ｍを含むカラムに通液し、１．
０Ｍ食塩を含む０．０２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０
）でカラムを充分洗浄し、のち５０ｍＭＱーメチルーＤ
ーグルコシド及び１．０Ｍ食塩を含む０。
０２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出させ、後述
する方法で測定して額粒球の分化増殖効果を有する分画
を集め、これを蒸留水に対して透析し、透析内液を凍結
乾燥した。
する方法で測定して額粒球の分化増殖効果を有する分画
を集め、これを蒸留水に対して透析し、透析内液を凍結
乾燥した。
更に、ここに得られた凍結乾燥粉末約５０の９を、１０
％グリセリンを含む０．１２９Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ６．８）、１の‘に溶解し、８％アクリルアミドゲ
ル（ｐＨ８．９、２山肌×２５側）を用いた調製用電気
泳動装置（富士理研、フジカラバ−Ｏ型）により、冷却
水通水下、１０ｍＡの電流を通電し、泳動させ、相対移
動度０．４６の分画を０．０２９Ｍトリス−グリシン緩
衝液（ｐＨ８．３）で回収し、蒸留水に対して透析し、
透析内液を凍結乾燥し、ＨＧＩＧＰ約１０の９を得た。
％グリセリンを含む０．１２９Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ６．８）、１の‘に溶解し、８％アクリルアミドゲ
ル（ｐＨ８．９、２山肌×２５側）を用いた調製用電気
泳動装置（富士理研、フジカラバ−Ｏ型）により、冷却
水通水下、１０ｍＡの電流を通電し、泳動させ、相対移
動度０．４６の分画を０．０２９Ｍトリス−グリシン緩
衝液（ｐＨ８．３）で回収し、蒸留水に対して透析し、
透析内液を凍結乾燥し、ＨＧＩＧＰ約１０の９を得た。
図面の簡単な説明図面は本発明により得られたウイルス
不活性処理をしたＨＧＩＧＰ画分より精製したＨＧＩＧ
Ｐの確認のための理学的測定結果の一部を示し、第１図
は赤外線吸収スペクトル、第２図は露気泳動法による移
動度と分子量との関係および第３図は紫外線吸収スペク
トルをそれぞれ示す。
不活性処理をしたＨＧＩＧＰ画分より精製したＨＧＩＧ
Ｐの確認のための理学的測定結果の一部を示し、第１図
は赤外線吸収スペクトル、第２図は露気泳動法による移
動度と分子量との関係および第３図は紫外線吸収スペク
トルをそれぞれ示す。
第１図
第２図
第３図
Claims (1)
- １ 人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白質を含有する
人尿の分画を濃縮し、蛋白質含量を１ｍｌ当り少なくと
も７０ｍｇに調整し、５０〜７０℃の温度で８〜３０時
間加熱し、該分画中に存在するウイルスを不活性化する
ことを特徴とする人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白
質を含有する分画の加熱処理方法。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53118203A JPS6030294B2 (ja) | 1978-09-26 | 1978-09-26 | 人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白質を含有する分画の加熱処理方法 |
| AU45197/79A AU523077B2 (en) | 1978-03-20 | 1979-03-16 | Hgi glycoprotein |
| SE7902372A SE451844B (sv) | 1978-03-20 | 1979-03-16 | Glykoprotein, forfarande for framstellning derav samt terapeutiskt medel innehallande nemnda glykoprotein |
| CH254879A CH640865A5 (de) | 1978-03-20 | 1979-03-19 | Glykoproteid des menschlichen urins, verfahren zu seiner herstellung und mittel zur bekaempfung von leukozytopenie. |
| DE19792910745 DE2910745A1 (de) | 1978-03-20 | 1979-03-19 | Glykoproteid aus menschlichem urin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung bei der bekaempfung von leukozytopenie |
| GB7909494A GB2016477B (en) | 1978-03-20 | 1979-03-19 | -glycoprotein and isolation thereof |
| FR7906887A FR2420541A1 (fr) | 1978-03-20 | 1979-03-19 | Glycoproteine-hgi capable de stimuler la proliferation et la differentiation des granulocytes humains, sa preparation et medicaments de la leucopenie en contenant |
| AT208479A AT362392B (de) | 1978-03-20 | 1979-03-20 | Verfahren zur gewinnung eines glykprotieds aus menschlichem urin |
| NL7902178A NL190759C (nl) | 1978-03-20 | 1979-03-20 | Glycoproteine, therapeutisch middel voor de behandeling van leukopenie en werkwijze voor het bereiden van een glycoproteine. |
| US06/037,515 US4230697A (en) | 1978-07-03 | 1979-05-09 | Virus-inactivated HGI-glycoprotein capable of stimulating proliferation and differentiation of human granulocyte, process for preparing same and leukopenia curative containing same |
| CA000327566A CA1142431A (en) | 1978-07-03 | 1979-05-14 | Virus-inactivated hgi-glycoprotein capable of stimulating proliferation and differentiation of human granulocyte, for preparing same and leukopenia curative containing same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53118203A JPS6030294B2 (ja) | 1978-09-26 | 1978-09-26 | 人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白質を含有する分画の加熱処理方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5545618A JPS5545618A (en) | 1980-03-31 |
| JPS6030294B2 true JPS6030294B2 (ja) | 1985-07-16 |
Family
ID=14730732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53118203A Expired JPS6030294B2 (ja) | 1978-03-20 | 1978-09-26 | 人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白質を含有する分画の加熱処理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6030294B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6043465A (ja) * | 1983-08-19 | 1985-03-08 | Nippon Kokan Kk <Nkk> | 低温靭性に優れた熱延クラツド鋼板およびその製造方法 |
| JPS61272348A (ja) * | 1985-05-27 | 1986-12-02 | Kobe Steel Ltd | 高靭性大入熱溶接用鋼 |
| JPS6259034A (ja) * | 1985-05-29 | 1987-03-14 | 新日本製鐵株式会社 | 加工性および耐食性の優れたステンレスクラッド鋼板 |
-
1978
- 1978-09-26 JP JP53118203A patent/JPS6030294B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5545618A (en) | 1980-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4230697A (en) | Virus-inactivated HGI-glycoprotein capable of stimulating proliferation and differentiation of human granulocyte, process for preparing same and leukopenia curative containing same | |
| JPS6030291B2 (ja) | 人顆粒球の分化増殖を促進するｈｇｉ糖蛋白質、ｈｇｉ糖蛋白質の製造法及びｈｇｉ糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤 | |
| JP4211894B2 (ja) | 血漿から得られるフィブリノーゲン濃縮物及びその製法 | |
| US4342828A (en) | Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells | |
| US5099003A (en) | Method of preparing a sterile plasma-protein solution containing fibrinogen and factor xiii | |
| JPH02198561A (ja) | 疎水相互作用クロマトグラフィーを用いて不安定な生体物質混合物から加工用化学物質を除去する方法 | |
| CN107163138B (zh) | 一种人血浆蛋白α1-抗胰蛋白酶的分离纯化方法 | |
| JPH05306236A (ja) | Ｃ１不活性化剤を含有する医薬の調製方法 | |
| JPS59137417A (ja) | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 | |
| JPS6147187A (ja) | 狂犬病ウイルスの精製方法 | |
| JPH06321994A (ja) | アンチトロンビン調製物およびその調製方法 | |
| JPS63165328A (ja) | 組織タンパクｐｐ４含有医薬 | |
| US4075197A (en) | Serum albumin production | |
| EP0011739B1 (en) | Process for obtaining blood coagulation factor xiii derived from human placenta | |
| WO2006043062A1 (en) | Method for the isolation of haptoglobin | |
| JPS6236326A (ja) | 造血器疾患治療剤 | |
| JPS6030294B2 (ja) | 人顆粒球の分化増殖を促進する糖蛋白質を含有する分画の加熱処理方法 | |
| JPS6281327A (ja) | 人トロンビン製剤の加熱処理方法 | |
| JPH0579649B2 (ja) | ||
| JPH0479359B2 (ja) | ||
| JPS6159610B2 (ja) | ||
| JPS6030292B2 (ja) | 人顆粒球の分化増殖を促進する加熱処理ｈｇｉｇｐ及びｈｇｉｇｐの加熱処理法 | |
| DE2910745C2 (ja) | ||
| JPS6030293B2 (ja) | 人顆粒球の分化増殖を促進する加熱処理ｈｇｉｇｐ及びｈｇｉｇｐの加熱処理方法 | |
| JPH024717A (ja) | アンチトロンビン−３製剤 |