JPH0479359B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
各種タイプのヒト インターフエロンの中で、
免疫インターフエロン(IFN−γ)は最も特徴付
けされていない。このインターフエロンはリンパ
球をマイトジエン(有糸***誘発因子)または特
異抗原で刺戟することにより生産されるものであ
つて、ウイルス誘発α−およびβ−インターフエ
ロンとはその構造および性質が重大に異なつてい
る。 近年、Yip等はリンパ球をホルボール エステ
ル12−o−テトラデカノイル−ホルボール−13ア
セテート(TPA)およびフイトヘムアグルチニ
ン(植物性血球凝集素)(PHA)の組合せにより
刺戟することにもとづくヒトIFN−γの生産方法
を報告した(1)。その後、Yip等は分取
NaDodSO4/ポリアクリルアミド ゲル電気泳
動によりIFN−γの2種のサブタイプを精製する
ことができた。しかしながら、この工程中に生物
学的活性のほとんど完全な損失が生じた(2,
3)。このサブタイプは20000および25000の見掛
分子質量を有し、これはコマシー ブルー
(Coomassie blue)染色性帯に相当し、そして抗
原的に交差活性化性である。約43000ダルトンの
見掛分子質量を有する第3の少量成分がまた検出
された。 別の研究において、Gray等はヒト IFN−γ
相補性DNAのクローン化および説明を報告して
いる。ヌクレオチド配列はこのIFN−γが146個
のアミノ酸を有する単純ポリヘプチドによりなる
ものであつて、17000ダルトンの計算分子質量を
有することを示した。さらにまた、遺伝子図書館
でしらべても、その他の構造上関連したDNA配
列を見出せなかつた(4)。このデータはIFN−γに
関して1つだけのポリペプチド配列が存在し、そ
して天然IFN−γは部分的に二量体化しているこ
とがあることを示唆していた。 PestkaおよびRubinsteinは以前に、米国特許
第4289690号に、IFN−γを均質にする精製およ
び逆相高性能液クロマトグラフイ(HPLC)によ
る8種の異なるサブタイプの分離を開示している
(5,6,7)。この方法はIFN−γが有機溶剤お
よび低PHに対して不安定であるために、IFN−γ
の精製には適しない。最近利用できるようになつ
たタンパク質の分別に適するイオン交換HPLCカ
ラムはIFN−γ生産物の高分割クロマトグラフイ
を可能にした。 IFN−γの生産、精製および構造研究に関する
最近の科学論文は次のとおりにまとめて示すこと
ができる: (1) Yip,Y.K.,Pang,R.H.L.,Urban,C.お
よびVilcek,J.(1981年):Proc.Natl.Acad.
Sci.,USA78、1601〜1605; (2) Yip,Y.K.,Barrowclough,B.S.,Urban,
C.およびVilcek,J.(1982年):Science215、
411〜413; (3) Yip,Y.K.,Barrowclough,B.S.,Urban,
C.およびVilcek,J.(1982年):Proc.Natl.
Acad.Sci.USA79、1820〜1824; (4) Gray,P.W.,Leung,D.N.,Pennica,D.,
Yelverton,E.,Najarian,R.,Simonsen,
C.C.,Perynck,R.,Sherwood,P.J.,
Wallace,D.M.,Berger,S.L.,Levinson,
A.D.およびGoeddel,D.V.(1982年):Nature
295、503〜508; (5) Rubinstein,M.,Rubinstein,S.,
Familletti,P.C.,Miller,R.S.,Waldman,
A.A.およびPestka,S.(1979年):Proc.Natl.
Acad.Sci.USA76、640〜644; (6) Rubinstein,M.(1979年):Anal.Biochem.
97、1〜7; (7) Rubinstein,M.,Levy,W.P.,Moschera,
J.A.,Lai−C.Y.,Hershberg,R.D.,
Bartlett,R.およびPestka,S.(1981年):
Arch.Biochem.Biophys.210、307〜318。 前記論文のいくつかはヒト免疫インターフエロ
ンを均質に精製したと主張しているが、生物学的
活性のほとんど完全な損失(80〜90%)が認めら
れている。さらにまた。断言できるほど純粋な化
合物の性質も開示されたことはない。 タンパク質の精製に高性能液クロマトグラフイ
を使用することは一般的に当業者に既知である。 本発明はヒト免疫インターフエロンの改善され
た精製方法およびかくして生成された新規な均質
ヒト免疫インターフエロン(IFN−γ)に関す
る。 本発明の改善方法は制御された細孔を有するガ
ラス上におけるクロマトグラフイ、眼外濾過およ
びカチオン交換高性能液クロマトグラフイ工程の
組合せを包含し、IFN−γの効果的な精製を達成
させる。 IFN−γの精製における処理工程として制御さ
れた細孔を有するガラス上でのクロマトグラフイ
を使用することは当技術で既知であつた(前記引
用文献2,3参照)。眼外濾過は以前に、タンパ
ク質の濃縮および脱塩に広く使用されていた。か
なりの場合に、眼外濾過は眼外濾過膜のカツト−
オフ値より小さい分子量を有するペプチドおよび
タンパク質の除去に使用できる。Mono−Sカチ
オン交換HPLCカラムは特にタンパク質の分別用
にPharmacia Fine Chemicalsにより設計され、
市販されているものである。しかしながら、IFN
−γの分別用に、制御された細孔を有するガラス
クロマトグラフイおよび眼外濾過と組合せて、
これらのHPLCカラムは使用されたことはない
か、またはその使用が示唆されたこともない。 IFN−γの国際標準はまだ存在しないので、本
発明の全体にわたつて示されている生物学的活性
はNational Institutes of Health(Bethesda,
Maryland,U.S.A.)により供給されているイン
ターフエロン−α参照標準G−023−901−527を
基準にし、ヒトWISH細胞(American Type
Culture Collection Cat.NO.CCL−23)および水
胞性口内炎ウイルスをウイルス細胞変性作用の阻
止に基づく分析に使用した。その他のセルライ
ン、その他のウイルス、およびその他の標準の使
用が非常に広範囲の比活性値を与えうることは当
業者にとつて一般に既知である。もう1つの変数
には種々の方法で測定できるタンパク質含有量が
ある。本発明におけるタンパク質含有量は絶対方
法として広く受容されているアミノ酸分析に基づ
いて測定した。 粗製IFN−γ製剤に対して制御された細孔を有
するガラス クロマトグラフイを使用すると、約
4倍の精製が達成される。すなわち、この工程に
より生成されたIFN−γは約2×105単位/mgの
比活性を有する。制御された細孔を有するガラス
(CPG)処理には、次の方法を使用できる。 CPGビーズをポリプロピレン遠心用ビン中の
IFN−γ含有培養物上澄液(3000〜16000単位/
ml;8〜20×104単位/mg)に1:100(容量/容
量)の比率で加える。混合物を4℃で3時間攪拌
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、次
いでビーズをシリコン化ガラス カラムに詰め
る。このカラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩
衝塩類溶液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテ
トラメチルアンモニウム クロリド(PH7)によ
り溶出する。 テトラメチルアンモニウム クロリドによる
CPGからの溶出により得られた、生成する精製
インターフエロンは約2×105単位/mgの比活性
を示し、回収率は約50〜100%である。CPG−ク
ロマトグラフイからのIFN−γ活性を含有するフ
ラクシヨンを集め、PM−10膜(Amicon)上で
の眼外濾過により塩を除去する。保持フラクシヨ
ンを数容量の2mMリン酸ナトリウム(PH7.4)で
洗浄し、元の培養物容量の約0.5%まで濃縮する。
不溶出タンパク質を遠心分離により除去し、清明
な上澄液を使用時まで+4℃で保存する。眼外濾
過により得られた生成するインターフエロン濃縮
物は9×105単位/mgの比活性を示し、回収率は
約60〜100%である。 眼外濾過により生成されたインターフエロン濃
縮物をさらに精製するために、このインターフエ
ロンを高分割能を有するカチオン交換高圧液クロ
マトグラフイ(HPLC)工程に1回または2回通
す。この液クロマトグラフイ工程では、スルホア
ルキル基が結合している単分散有機重合体系マト
リツクスを含有するカラムを使用する。これらの
カラムは順次的に、およびPH勾配およびイオン強
度勾配の変化する条件下におよびエチレングリコ
ールのような種々の安定化剤の存在下に使用でき
るものであつて、ヒト免疫インターフエロンをナ
トリウム−硫酸ドデシル(SDS)ポリアクリルア
ミド ゲル電気泳動における単一吸収帯、および
活性およびタンパク質レベルについてスーパーイ
ンポーズできるHPLCでの一定の比活性および単
一ピークを得ることにより測定して、均質に精製
できる。 本発明を実施する際に使用する有機マトリツク
ス カチオン−交換HPLCカラムは市販物品であ
る。適当なカラムはPharmacia Fina Chemicals
(Uppsala,Sweden)により生産され、市販され
ているMono−Sである。前記カラムを使用する
高圧液クロマトグラフイ系はPharmacia,
Varian,Beckman,Waters Perkin Elmars等
のような多くの製造業者から入手できる。 本発明において、HPLCカラムからのインター
フエロン−γの溶出に好適な緩衝系はPH7.0の
10mMリン酸ナトリウム−20%(容量/容量)エ
チレングリコールである。処理は約10〜約
1000PSIの中圧で行なう。標準5×50mmカラムに
使用する流速は0.1〜1.0ml/分であり、処理は−
10℃〜+30℃の温度範囲で実施できる。インター
フエロン−γ(0.1mg〜10mgタンパク質)はこのカ
ラムに吸着させ、次いで増大する塩濃度勾配を使
用して選択的様式で順次溶出する。この目的に適
する塩としては、Nacl、Kcl、Mgcl2、MgSO4、
テトラメチルアンモニウム クロリド等を包含す
る。分離は約PH5〜約PH8.5で変化するPH値範囲
のいづれかで達成できる。別法として、塩濃度を
一定に保持し、PHをPH5〜PH10の間で増加勾配に
して変えることもできる。同じカラムにおいて前
記で概述した中で同じ条件または異なる条件のど
ちらかで2回または3回以上連続分別することに
よりさらに精製することができる。 溶出液の分別は210〜280nmの範囲、好ましく
は210nmまたは280nmの波長で作動する紫外線検
知器のようなタンパク質監視器により、分別中の
タンパク質含有量を付随監視するそれ自体既知の
方法でフラクシヨン採集器を使用して行なう。 シリカおよびガラスに対する吸着によるIFN−
γの損失が可能であるので、本発明で使用する全
ての管、容器および試験管はテフロン、ポリプロ
ピレンまたはポリエチレンのいづれかから作る。 高度に精製された生成物はポリプロピレン試験
管で20%(容量/容量)エチレングリコールの存
在下に+4℃で保存した場合に最も安定である。
生物学的活性の有意の損失が反復凍結−解凍サイ
クルで検出される。 0.15、0.20、0.25および0.26モルのNacl濃度で
溶出して(PH7.0)、生物学的活性の4つの主要ピ
ークが20〜40%の総回収率で得られる。この分離
は非変性条件下に行なわれるので、各ピークは
Hu IFN−γの異なるサブタイプを示している。
β−メルカプトエタノールの存在または不存在の
どちらかでNaDodSO4−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析すると、0.25Mおよび
0.26M Naclで溶出するピークは26000(26K)お
よび21000(21K)の見掛分子質量をそれぞれ有す
る単一タンパク質吸収帯を含有することが判り、
他方、0.15Mおよび0.20Mのピークは純度が低
い。26Kおよび21Kの両サブタイプの比活性は7
×106単位/mgであつた。粗製またはいづれかの
精製IFN−γサブタイプを非変性条件下に
Ultrogel AcA 54カラムでゲル濾過により分析
すると、45000ダルトンの分子質量に相当する比
活性のピークが得られる。サブタイプ26Kおよび
21Kのアミノ酸分析はGray等により開示されて
いる(前記文献4)cDNAクローンの順序から計
算した理論値と一般的類似を示した。しかしなが
ら、プロリン、グリシンおよびパニルアラニンの
レベルにおける有意の差違が見られた。サブタイ
プ26Kおよび21Kはほとんど同一のアミノ酸組成
およびペプチドマツプを示した。 インターフエロン−γは抗ウイルス活性、抗細
胞活性、天然および抗体依存キラー細胞(killer
cell)活性に対抗する能力、或る種のHLA表面
マーカー抗原を誘発させる能力を示した。これら
の活性は多くの生物学的活性リンホカインを含有
する比較的粗製の製剤によつても得られている。
本発明の精製された均質ヒト免疫インターフエロ
ンはIFN−γ固有に属するこれらの活性の同定に
使用できる。本発明の精製IFN−γを含有する製
剤は種々のウイルス性および腫瘍性病気における
それらの有用性を評価するための臨床研究に使用
できる。 本発明の方法および生成物を次例によりさらに
説明する。 例 1 ヒトIFN−γの生産 単核細胞をFicoll−Hypaque勾配(gradient)
上での遠心分離(400×g;30分)により野牛皮
(buffy coats)から単離する。血清を含有しない
RPM1−1640メジユウム中の単核細胞の培養物
(5×106/ml)に12−o−テトラデカノイル ホ
ルボール−13−アセテート(5μg/ml)および
精製フイトヘムアグリチニン(5μg/ml)を添
加することによりIFN−γを産生させる。37℃お
よび5%CO2雰囲気で24時間インキユベーシヨン
した後に、細胞を塩心分離により除去し、培養物
上澄液を採取し、+4℃で保存する。 例 2 制御された細孔を有するガラス上におけるクロ
マトグラフイおよび眼外濾過 CPGビーズをポリプロピレン遠心用管中の
IFN−γ含有培養物上澄液(3000〜16000単位/
ml;8〜20×104単位/ml)に1:100(容量/容
量)の比率で加える。混合物を4℃で3時間保持
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、ビ
ーズをシリコン化ガラス カラムに詰める。この
カラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶
液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテトラメチ
ル アンモニウム クロリド(PH7)により溶出
する。CPG−クロマトグラフイからIFN−γ活
性を含有するフラクシヨンを集め、塩をPM−10
膜(Amicon)上での眼外濾過により除去する。
保持フラクシヨンを数容量の2mMリン酸ナトリ
ウム(PH7.4)で洗浄し、次いで元の培養物容量
の約0.5%に濃縮する。不溶性タンパク質を遠心
分離により除去し、清明な上澄液を使用時まで+
4℃で保存する。 例 3 高速液体クロマトグラフイ(HPLC) HPLCはAltex Model 330液クロマトグラフ
(Beckman Instruments)上で行なう。Mono−
SHPLC カチオン−交換カラム(5×50mm)を
10mMリン酸ナトリウム(PH7.0)−20%(容量/
容量)エチレン−グリコール(緩衝剤A)で平衡
にする。前記工程からのIFN−γ生成物を0.5
ml/分の流速で加える。カラムを次いで緩衝剤A
で30分間、次いで緩衝剤A中にNaclを直線勾配
(0〜400mM)で含有する液で60分間洗浄する。
各フラクシヨン(1ml)を次いでタンパク質標準
として仔牛血清アルブミンを使用して、IFN−γ
活性およびタンパク質含有量について分析する。
エチレン グリコールが溶出緩衝剤中に含まれて
いる場合にだけ高度の分割が達成された。
0.15M、0.20M、0.25Mおよび0.26MのNacl濃度
で溶出する生物学的活性の数ピークが連続的に得
られる。通常、0.25Mにおけるピークが最も支配
的である。0.25Mおよび0.26Mにおける生物学的
活性のピークは2種の異なるタンパク質ピークを
付随し、種々の生成物におけるそれらの比活性は
7×106単位/mgであつた。低い方のNacl濃度
(0.15Mおよび0.20M)における生物学的活性の
ピークは比活性がさらに低く、分離したタンパク
質ピークを付随しない。生物学的活性の総回収率
は最後の工程で主として損失が生じて、20〜40%
であつた。 例 4 NaDodSO4−ポリアクリルアミド ゲル電気
泳動およびアミノ酸分析 タンパク質資料を先ず2mMリン酸ナトリウム
(PH7.4)に対して透析し、Speedvac
Concentrator(Savant)中で乾燥させ、2%β−
メルカプトエタノールを含有する新たに製造した
試料緩衝液に溶解し、100℃で5分間加熱する。
15%ポリアクリルアミドのスラブ ゲルを使用す
る。電気泳動の後に、タンパク質吸収帯が
Coomassie blueまたは銀染色のどちらかにより
目に見える。0.26M塩で溶出するフラクシヨンは
21000ダルトンの見掛分子質量を有する単一タン
パク質吸収帯を示した(サブタイプ21K)。
0.25M塩で溶出するフラクシヨンは26000の見掛
分子質量を有する主要タンパク質吸収帯を示す
が、非常に低い分子質量の若干の少量吸収帯が場
合により見られる(サブタイプ26K)。このフラ
クシヨンを同じHPLCカラム上で再クロマトグラ
フイ処理すると、これらの汚染物を除去できる。
低い塩濃度(0.15〜0.20M)で溶出する生物学的
活性のピークはMr26000に相当する吸収帯を含む
数個の主要タンパク質吸収帯を示した。ピーク
21Kおよび26Kの見掛分子質量はゲル電気泳動前
のβ−メルカプトエタノールによる処理により影
響されない。 アミノ酸分析: Mono−SカラムからのIFN−γ含有)10〜
30μg)試料にアセトン(4〜5容量)を加え
る。混合物を−20℃で3〜16時間放置し、回転処
理し(13000×g;5分間)、沈殿を減圧で乾燥さ
せる。アミノ酸分析は加水分解(6NHCl;110
℃;24時間)の後にDurrum500分析機で行なつ
た。セリンまたはセレオニンについての補正は行
なわない。サブタイプ21Kおよび26Kの両サブタ
イプのアミノ酸分析は遺伝子の配列から計算され
たものと全く類似の結果を与えた。グリシンの高
い含有量は多分、汚染物質および加水分解中のそ
の他のアミノ酸の分解によるものである。 【表】 例 5 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
26Kを含有する非経口投与形剤 7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒト免
疫インターフエロン サブタイプ26K総量10mgを
正常血清アルブミン(ヒト)USP35mlに溶解す
る。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して2〜3
変化させて透析して低分子量汚染物質を除去し、
次いで細菌学的フイルターに通す。濾過した溶液
を140のバイアル中に吸引により分配する。各バ
イアルは非経口投与に適する純粋インターフエロ
ン5×105単位を含有する。これらのバイアルは
使用前は冷所(−20〜−70℃)で保存すると好ま
しい。 例 6 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
21Kを含有する非経口投与形剤 7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒト免
疫インターフエロン サブタイプ21K総量10mgを
正常血清アルブミン(ヒト)USP35mlに溶解す
る。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して2〜3
変化させて透析し、低分子量汚染物質を除去し、
次いで細菌学的フイルターに通す。濾過した溶液
を140のバイアルに吸引により分配する。各バイ
アルは非経口投与に適する純粋インターフエロン
5×105単位を含有する。これらのバイアルは使
用前は、冷所(−20℃〜−70℃)で保存すると好
ましい。 例 7 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
26Kおよび21Kを含有する非経口投与形剤 両方共に7×106単位/mgの比活性を有する均
質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ21K5
mgおよび均質ヒト免疫インターフエロン サブタ
イプ26K5mgの組合せを正常血清アルブミン(ヒ
ト)USP35mlに溶解する。溶液をリン酸塩緩衝
塩類溶液に対して2〜3変化させて透析して、低
分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フイル
ターに通す。濾過した溶液を140のバイアルに吸
引により分配する。各バイアルは非経口投与に適
する純粋インターフエロン5×105単位を含有す
る。これらのバイアルは使用前は冷所(−20℃〜
−70℃)で保存すると好ましい。
免疫インターフエロン(IFN−γ)は最も特徴付
けされていない。このインターフエロンはリンパ
球をマイトジエン(有糸***誘発因子)または特
異抗原で刺戟することにより生産されるものであ
つて、ウイルス誘発α−およびβ−インターフエ
ロンとはその構造および性質が重大に異なつてい
る。 近年、Yip等はリンパ球をホルボール エステ
ル12−o−テトラデカノイル−ホルボール−13ア
セテート(TPA)およびフイトヘムアグルチニ
ン(植物性血球凝集素)(PHA)の組合せにより
刺戟することにもとづくヒトIFN−γの生産方法
を報告した(1)。その後、Yip等は分取
NaDodSO4/ポリアクリルアミド ゲル電気泳
動によりIFN−γの2種のサブタイプを精製する
ことができた。しかしながら、この工程中に生物
学的活性のほとんど完全な損失が生じた(2,
3)。このサブタイプは20000および25000の見掛
分子質量を有し、これはコマシー ブルー
(Coomassie blue)染色性帯に相当し、そして抗
原的に交差活性化性である。約43000ダルトンの
見掛分子質量を有する第3の少量成分がまた検出
された。 別の研究において、Gray等はヒト IFN−γ
相補性DNAのクローン化および説明を報告して
いる。ヌクレオチド配列はこのIFN−γが146個
のアミノ酸を有する単純ポリヘプチドによりなる
ものであつて、17000ダルトンの計算分子質量を
有することを示した。さらにまた、遺伝子図書館
でしらべても、その他の構造上関連したDNA配
列を見出せなかつた(4)。このデータはIFN−γに
関して1つだけのポリペプチド配列が存在し、そ
して天然IFN−γは部分的に二量体化しているこ
とがあることを示唆していた。 PestkaおよびRubinsteinは以前に、米国特許
第4289690号に、IFN−γを均質にする精製およ
び逆相高性能液クロマトグラフイ(HPLC)によ
る8種の異なるサブタイプの分離を開示している
(5,6,7)。この方法はIFN−γが有機溶剤お
よび低PHに対して不安定であるために、IFN−γ
の精製には適しない。最近利用できるようになつ
たタンパク質の分別に適するイオン交換HPLCカ
ラムはIFN−γ生産物の高分割クロマトグラフイ
を可能にした。 IFN−γの生産、精製および構造研究に関する
最近の科学論文は次のとおりにまとめて示すこと
ができる: (1) Yip,Y.K.,Pang,R.H.L.,Urban,C.お
よびVilcek,J.(1981年):Proc.Natl.Acad.
Sci.,USA78、1601〜1605; (2) Yip,Y.K.,Barrowclough,B.S.,Urban,
C.およびVilcek,J.(1982年):Science215、
411〜413; (3) Yip,Y.K.,Barrowclough,B.S.,Urban,
C.およびVilcek,J.(1982年):Proc.Natl.
Acad.Sci.USA79、1820〜1824; (4) Gray,P.W.,Leung,D.N.,Pennica,D.,
Yelverton,E.,Najarian,R.,Simonsen,
C.C.,Perynck,R.,Sherwood,P.J.,
Wallace,D.M.,Berger,S.L.,Levinson,
A.D.およびGoeddel,D.V.(1982年):Nature
295、503〜508; (5) Rubinstein,M.,Rubinstein,S.,
Familletti,P.C.,Miller,R.S.,Waldman,
A.A.およびPestka,S.(1979年):Proc.Natl.
Acad.Sci.USA76、640〜644; (6) Rubinstein,M.(1979年):Anal.Biochem.
97、1〜7; (7) Rubinstein,M.,Levy,W.P.,Moschera,
J.A.,Lai−C.Y.,Hershberg,R.D.,
Bartlett,R.およびPestka,S.(1981年):
Arch.Biochem.Biophys.210、307〜318。 前記論文のいくつかはヒト免疫インターフエロ
ンを均質に精製したと主張しているが、生物学的
活性のほとんど完全な損失(80〜90%)が認めら
れている。さらにまた。断言できるほど純粋な化
合物の性質も開示されたことはない。 タンパク質の精製に高性能液クロマトグラフイ
を使用することは一般的に当業者に既知である。 本発明はヒト免疫インターフエロンの改善され
た精製方法およびかくして生成された新規な均質
ヒト免疫インターフエロン(IFN−γ)に関す
る。 本発明の改善方法は制御された細孔を有するガ
ラス上におけるクロマトグラフイ、眼外濾過およ
びカチオン交換高性能液クロマトグラフイ工程の
組合せを包含し、IFN−γの効果的な精製を達成
させる。 IFN−γの精製における処理工程として制御さ
れた細孔を有するガラス上でのクロマトグラフイ
を使用することは当技術で既知であつた(前記引
用文献2,3参照)。眼外濾過は以前に、タンパ
ク質の濃縮および脱塩に広く使用されていた。か
なりの場合に、眼外濾過は眼外濾過膜のカツト−
オフ値より小さい分子量を有するペプチドおよび
タンパク質の除去に使用できる。Mono−Sカチ
オン交換HPLCカラムは特にタンパク質の分別用
にPharmacia Fine Chemicalsにより設計され、
市販されているものである。しかしながら、IFN
−γの分別用に、制御された細孔を有するガラス
クロマトグラフイおよび眼外濾過と組合せて、
これらのHPLCカラムは使用されたことはない
か、またはその使用が示唆されたこともない。 IFN−γの国際標準はまだ存在しないので、本
発明の全体にわたつて示されている生物学的活性
はNational Institutes of Health(Bethesda,
Maryland,U.S.A.)により供給されているイン
ターフエロン−α参照標準G−023−901−527を
基準にし、ヒトWISH細胞(American Type
Culture Collection Cat.NO.CCL−23)および水
胞性口内炎ウイルスをウイルス細胞変性作用の阻
止に基づく分析に使用した。その他のセルライ
ン、その他のウイルス、およびその他の標準の使
用が非常に広範囲の比活性値を与えうることは当
業者にとつて一般に既知である。もう1つの変数
には種々の方法で測定できるタンパク質含有量が
ある。本発明におけるタンパク質含有量は絶対方
法として広く受容されているアミノ酸分析に基づ
いて測定した。 粗製IFN−γ製剤に対して制御された細孔を有
するガラス クロマトグラフイを使用すると、約
4倍の精製が達成される。すなわち、この工程に
より生成されたIFN−γは約2×105単位/mgの
比活性を有する。制御された細孔を有するガラス
(CPG)処理には、次の方法を使用できる。 CPGビーズをポリプロピレン遠心用ビン中の
IFN−γ含有培養物上澄液(3000〜16000単位/
ml;8〜20×104単位/mg)に1:100(容量/容
量)の比率で加える。混合物を4℃で3時間攪拌
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、次
いでビーズをシリコン化ガラス カラムに詰め
る。このカラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩
衝塩類溶液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテ
トラメチルアンモニウム クロリド(PH7)によ
り溶出する。 テトラメチルアンモニウム クロリドによる
CPGからの溶出により得られた、生成する精製
インターフエロンは約2×105単位/mgの比活性
を示し、回収率は約50〜100%である。CPG−ク
ロマトグラフイからのIFN−γ活性を含有するフ
ラクシヨンを集め、PM−10膜(Amicon)上で
の眼外濾過により塩を除去する。保持フラクシヨ
ンを数容量の2mMリン酸ナトリウム(PH7.4)で
洗浄し、元の培養物容量の約0.5%まで濃縮する。
不溶出タンパク質を遠心分離により除去し、清明
な上澄液を使用時まで+4℃で保存する。眼外濾
過により得られた生成するインターフエロン濃縮
物は9×105単位/mgの比活性を示し、回収率は
約60〜100%である。 眼外濾過により生成されたインターフエロン濃
縮物をさらに精製するために、このインターフエ
ロンを高分割能を有するカチオン交換高圧液クロ
マトグラフイ(HPLC)工程に1回または2回通
す。この液クロマトグラフイ工程では、スルホア
ルキル基が結合している単分散有機重合体系マト
リツクスを含有するカラムを使用する。これらの
カラムは順次的に、およびPH勾配およびイオン強
度勾配の変化する条件下におよびエチレングリコ
ールのような種々の安定化剤の存在下に使用でき
るものであつて、ヒト免疫インターフエロンをナ
トリウム−硫酸ドデシル(SDS)ポリアクリルア
ミド ゲル電気泳動における単一吸収帯、および
活性およびタンパク質レベルについてスーパーイ
ンポーズできるHPLCでの一定の比活性および単
一ピークを得ることにより測定して、均質に精製
できる。 本発明を実施する際に使用する有機マトリツク
ス カチオン−交換HPLCカラムは市販物品であ
る。適当なカラムはPharmacia Fina Chemicals
(Uppsala,Sweden)により生産され、市販され
ているMono−Sである。前記カラムを使用する
高圧液クロマトグラフイ系はPharmacia,
Varian,Beckman,Waters Perkin Elmars等
のような多くの製造業者から入手できる。 本発明において、HPLCカラムからのインター
フエロン−γの溶出に好適な緩衝系はPH7.0の
10mMリン酸ナトリウム−20%(容量/容量)エ
チレングリコールである。処理は約10〜約
1000PSIの中圧で行なう。標準5×50mmカラムに
使用する流速は0.1〜1.0ml/分であり、処理は−
10℃〜+30℃の温度範囲で実施できる。インター
フエロン−γ(0.1mg〜10mgタンパク質)はこのカ
ラムに吸着させ、次いで増大する塩濃度勾配を使
用して選択的様式で順次溶出する。この目的に適
する塩としては、Nacl、Kcl、Mgcl2、MgSO4、
テトラメチルアンモニウム クロリド等を包含す
る。分離は約PH5〜約PH8.5で変化するPH値範囲
のいづれかで達成できる。別法として、塩濃度を
一定に保持し、PHをPH5〜PH10の間で増加勾配に
して変えることもできる。同じカラムにおいて前
記で概述した中で同じ条件または異なる条件のど
ちらかで2回または3回以上連続分別することに
よりさらに精製することができる。 溶出液の分別は210〜280nmの範囲、好ましく
は210nmまたは280nmの波長で作動する紫外線検
知器のようなタンパク質監視器により、分別中の
タンパク質含有量を付随監視するそれ自体既知の
方法でフラクシヨン採集器を使用して行なう。 シリカおよびガラスに対する吸着によるIFN−
γの損失が可能であるので、本発明で使用する全
ての管、容器および試験管はテフロン、ポリプロ
ピレンまたはポリエチレンのいづれかから作る。 高度に精製された生成物はポリプロピレン試験
管で20%(容量/容量)エチレングリコールの存
在下に+4℃で保存した場合に最も安定である。
生物学的活性の有意の損失が反復凍結−解凍サイ
クルで検出される。 0.15、0.20、0.25および0.26モルのNacl濃度で
溶出して(PH7.0)、生物学的活性の4つの主要ピ
ークが20〜40%の総回収率で得られる。この分離
は非変性条件下に行なわれるので、各ピークは
Hu IFN−γの異なるサブタイプを示している。
β−メルカプトエタノールの存在または不存在の
どちらかでNaDodSO4−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析すると、0.25Mおよび
0.26M Naclで溶出するピークは26000(26K)お
よび21000(21K)の見掛分子質量をそれぞれ有す
る単一タンパク質吸収帯を含有することが判り、
他方、0.15Mおよび0.20Mのピークは純度が低
い。26Kおよび21Kの両サブタイプの比活性は7
×106単位/mgであつた。粗製またはいづれかの
精製IFN−γサブタイプを非変性条件下に
Ultrogel AcA 54カラムでゲル濾過により分析
すると、45000ダルトンの分子質量に相当する比
活性のピークが得られる。サブタイプ26Kおよび
21Kのアミノ酸分析はGray等により開示されて
いる(前記文献4)cDNAクローンの順序から計
算した理論値と一般的類似を示した。しかしなが
ら、プロリン、グリシンおよびパニルアラニンの
レベルにおける有意の差違が見られた。サブタイ
プ26Kおよび21Kはほとんど同一のアミノ酸組成
およびペプチドマツプを示した。 インターフエロン−γは抗ウイルス活性、抗細
胞活性、天然および抗体依存キラー細胞(killer
cell)活性に対抗する能力、或る種のHLA表面
マーカー抗原を誘発させる能力を示した。これら
の活性は多くの生物学的活性リンホカインを含有
する比較的粗製の製剤によつても得られている。
本発明の精製された均質ヒト免疫インターフエロ
ンはIFN−γ固有に属するこれらの活性の同定に
使用できる。本発明の精製IFN−γを含有する製
剤は種々のウイルス性および腫瘍性病気における
それらの有用性を評価するための臨床研究に使用
できる。 本発明の方法および生成物を次例によりさらに
説明する。 例 1 ヒトIFN−γの生産 単核細胞をFicoll−Hypaque勾配(gradient)
上での遠心分離(400×g;30分)により野牛皮
(buffy coats)から単離する。血清を含有しない
RPM1−1640メジユウム中の単核細胞の培養物
(5×106/ml)に12−o−テトラデカノイル ホ
ルボール−13−アセテート(5μg/ml)および
精製フイトヘムアグリチニン(5μg/ml)を添
加することによりIFN−γを産生させる。37℃お
よび5%CO2雰囲気で24時間インキユベーシヨン
した後に、細胞を塩心分離により除去し、培養物
上澄液を採取し、+4℃で保存する。 例 2 制御された細孔を有するガラス上におけるクロ
マトグラフイおよび眼外濾過 CPGビーズをポリプロピレン遠心用管中の
IFN−γ含有培養物上澄液(3000〜16000単位/
ml;8〜20×104単位/ml)に1:100(容量/容
量)の比率で加える。混合物を4℃で3時間保持
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、ビ
ーズをシリコン化ガラス カラムに詰める。この
カラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶
液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテトラメチ
ル アンモニウム クロリド(PH7)により溶出
する。CPG−クロマトグラフイからIFN−γ活
性を含有するフラクシヨンを集め、塩をPM−10
膜(Amicon)上での眼外濾過により除去する。
保持フラクシヨンを数容量の2mMリン酸ナトリ
ウム(PH7.4)で洗浄し、次いで元の培養物容量
の約0.5%に濃縮する。不溶性タンパク質を遠心
分離により除去し、清明な上澄液を使用時まで+
4℃で保存する。 例 3 高速液体クロマトグラフイ(HPLC) HPLCはAltex Model 330液クロマトグラフ
(Beckman Instruments)上で行なう。Mono−
SHPLC カチオン−交換カラム(5×50mm)を
10mMリン酸ナトリウム(PH7.0)−20%(容量/
容量)エチレン−グリコール(緩衝剤A)で平衡
にする。前記工程からのIFN−γ生成物を0.5
ml/分の流速で加える。カラムを次いで緩衝剤A
で30分間、次いで緩衝剤A中にNaclを直線勾配
(0〜400mM)で含有する液で60分間洗浄する。
各フラクシヨン(1ml)を次いでタンパク質標準
として仔牛血清アルブミンを使用して、IFN−γ
活性およびタンパク質含有量について分析する。
エチレン グリコールが溶出緩衝剤中に含まれて
いる場合にだけ高度の分割が達成された。
0.15M、0.20M、0.25Mおよび0.26MのNacl濃度
で溶出する生物学的活性の数ピークが連続的に得
られる。通常、0.25Mにおけるピークが最も支配
的である。0.25Mおよび0.26Mにおける生物学的
活性のピークは2種の異なるタンパク質ピークを
付随し、種々の生成物におけるそれらの比活性は
7×106単位/mgであつた。低い方のNacl濃度
(0.15Mおよび0.20M)における生物学的活性の
ピークは比活性がさらに低く、分離したタンパク
質ピークを付随しない。生物学的活性の総回収率
は最後の工程で主として損失が生じて、20〜40%
であつた。 例 4 NaDodSO4−ポリアクリルアミド ゲル電気
泳動およびアミノ酸分析 タンパク質資料を先ず2mMリン酸ナトリウム
(PH7.4)に対して透析し、Speedvac
Concentrator(Savant)中で乾燥させ、2%β−
メルカプトエタノールを含有する新たに製造した
試料緩衝液に溶解し、100℃で5分間加熱する。
15%ポリアクリルアミドのスラブ ゲルを使用す
る。電気泳動の後に、タンパク質吸収帯が
Coomassie blueまたは銀染色のどちらかにより
目に見える。0.26M塩で溶出するフラクシヨンは
21000ダルトンの見掛分子質量を有する単一タン
パク質吸収帯を示した(サブタイプ21K)。
0.25M塩で溶出するフラクシヨンは26000の見掛
分子質量を有する主要タンパク質吸収帯を示す
が、非常に低い分子質量の若干の少量吸収帯が場
合により見られる(サブタイプ26K)。このフラ
クシヨンを同じHPLCカラム上で再クロマトグラ
フイ処理すると、これらの汚染物を除去できる。
低い塩濃度(0.15〜0.20M)で溶出する生物学的
活性のピークはMr26000に相当する吸収帯を含む
数個の主要タンパク質吸収帯を示した。ピーク
21Kおよび26Kの見掛分子質量はゲル電気泳動前
のβ−メルカプトエタノールによる処理により影
響されない。 アミノ酸分析: Mono−SカラムからのIFN−γ含有)10〜
30μg)試料にアセトン(4〜5容量)を加え
る。混合物を−20℃で3〜16時間放置し、回転処
理し(13000×g;5分間)、沈殿を減圧で乾燥さ
せる。アミノ酸分析は加水分解(6NHCl;110
℃;24時間)の後にDurrum500分析機で行なつ
た。セリンまたはセレオニンについての補正は行
なわない。サブタイプ21Kおよび26Kの両サブタ
イプのアミノ酸分析は遺伝子の配列から計算され
たものと全く類似の結果を与えた。グリシンの高
い含有量は多分、汚染物質および加水分解中のそ
の他のアミノ酸の分解によるものである。 【表】 例 5 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
26Kを含有する非経口投与形剤 7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒト免
疫インターフエロン サブタイプ26K総量10mgを
正常血清アルブミン(ヒト)USP35mlに溶解す
る。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して2〜3
変化させて透析して低分子量汚染物質を除去し、
次いで細菌学的フイルターに通す。濾過した溶液
を140のバイアル中に吸引により分配する。各バ
イアルは非経口投与に適する純粋インターフエロ
ン5×105単位を含有する。これらのバイアルは
使用前は冷所(−20〜−70℃)で保存すると好ま
しい。 例 6 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
21Kを含有する非経口投与形剤 7×106単位/mgの比活性を有する均質ヒト免
疫インターフエロン サブタイプ21K総量10mgを
正常血清アルブミン(ヒト)USP35mlに溶解す
る。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して2〜3
変化させて透析し、低分子量汚染物質を除去し、
次いで細菌学的フイルターに通す。濾過した溶液
を140のバイアルに吸引により分配する。各バイ
アルは非経口投与に適する純粋インターフエロン
5×105単位を含有する。これらのバイアルは使
用前は、冷所(−20℃〜−70℃)で保存すると好
ましい。 例 7 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
26Kおよび21Kを含有する非経口投与形剤 両方共に7×106単位/mgの比活性を有する均
質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ21K5
mgおよび均質ヒト免疫インターフエロン サブタ
イプ26K5mgの組合せを正常血清アルブミン(ヒ
ト)USP35mlに溶解する。溶液をリン酸塩緩衝
塩類溶液に対して2〜3変化させて透析して、低
分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フイル
ターに通す。濾過した溶液を140のバイアルに吸
引により分配する。各バイアルは非経口投与に適
する純粋インターフエロン5×105単位を含有す
る。これらのバイアルは使用前は冷所(−20℃〜
−70℃)で保存すると好ましい。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 7×106単位/mgの比活性、21000ダルトンの
見掛分子質量及び下記のアミノ酸組成を有する、
生物学的に活性な形態にある、サブタイプ21Kの
ヒトインターフエロンガンマ。 アミノ酸 残留量 Asx 14.6±1.3 Thr 7.9±0.4 Ser 9.1±1.4 Glx 15.6±0.7 Pro 9.7±1.4 Gly 14.4±0.3 Ala 12.0±1.5 Cys 0.6±0.5 Val 7.4±0.7 Met 2.3±1.0 Ile 5.0±0.3 Leu 9.2±0.3 Tyr 2.9±0.4 Phe 4.9±1.0 His 3.5±0.7 Lys 20.3±0.4 Arg 5.7±0.4 2 7×106単位/mgの比活性、21000ダルトンの
見掛分子質量及び下記のアミノ酸組成を有する、
生物学的に活性な形態にある、サブタイプ21Kの
ヒトインターフエロンガンマの製造法であつて、 アミノ酸 残留量 Asx 14.6±1.3 Thr 7.9±0.4 Ser 9.1±1.4 Glx 15.6±0.7 Pro 9.7±1.4 Gly 14.4±0.3 Ala 12.0±1.5 Cys 0.6±0.5 Val 7.4±0.7 Met 2.3±1.0 Ile 5.0±0.3 Leu 9.2±0.3 Tyr 2.9±0.4 Phe 4.9±1.0 His 3.5±0.7 Lys 20.3±0.4 Arg 5.7±0.4 (a) 不純な状態のサブタイプ21Kを含むインター
フエロンガンマの水溶液を制御された細孔を有
するガンマ吸着剤と混合して、その後、この吸
着剤からインターフエロンを溶出し、この溶出
液の選ばれたフラクシヨン中に増大した純度の
状態でインターフエロンを採取し; (b) 工程(a)で選ばれたフラクシヨンを膜上での眼
外濾過により濃縮し、この膜に保持されている
フラクシヨン中におけるさらに高い濃度および
増大した純度の状態でのインターフエロンを採
取し; (c) 工程(b)で得られたフラクシヨンをカチオン交
換マトリツクスに少なくとも1回通し、その
後、このカラムから増加する塩濃度勾配あるい
は増加するPH勾配を用いて適当な圧力下に生物
学的に活性なヒトインターフエロンガンマのタ
ンパク質を含む少なくとも1つのフラクシヨン
を溶出し、この溶出液の選ばれたフラクシヨン
中の数種の異なるピークとして、ヒトインター
フエロンガンマのサブタイプ21Kを均質で生物
学的に活性なタンパク質状態で得る; 工程の組合わせからなる方法。 3 工程(c)をHPLC条件下に実施する、特許請求
の範囲第2項記載の方法。 4 カチオン交換カラムがスルホアルキル基を有
する有機ポリマーからなる、特許請求の範囲第2
項記載の方法。 5 工程(c)において増加する塩濃度勾配によりイ
ンターフエロンを溶出する、特許請求の範囲第2
項記載の方法。 6 工程(c)において増加するPH濃度勾配によりイ
ンターフエロンを溶出する、特許請求の範囲第2
項記載の方法。 7 工程(c)においてエチレングリコールの存在下
にインターフエロンを溶出する、特許請求の範囲
第2項記載の方法。 8 カラムがスルホアルキル基を有する有機ポリ
マーからなるカチオン交換カラムであり、緩衝剤
が20%(容量/容量)エチレン グリコールを含
有する10mMリン酸ナトリウム(PH7.0)であり、
そして勾配が0〜400mMの直線状に増加させた
NaCl濃度の60分である特許請求の範囲第2項〜
第7項のいずれか1項に記載の方法。 9 工程(c)の少なくとも1つのフラクシヨンにお
いて均質なサブタイプ21Kを含むようにサブタイ
プ21Kを溶出してサブタイプ21Kを製造する特許
請求の範囲第2項から第8項のいずれか1項に記
載の方法。 10 工程(b)の膜が約10000ダルトンの分子量カ
ツト−オフ値を有する、特許請求の範囲第2項記
載の方法。
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