JPH0479359B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0479359B2 JPH0479359B2 JP59024943A JP2494384A JPH0479359B2 JP H0479359 B2 JPH0479359 B2 JP H0479359B2 JP 59024943 A JP59024943 A JP 59024943A JP 2494384 A JP2494384 A JP 2494384A JP H0479359 B2 JPH0479359 B2 JP H0479359B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- subtype
- interferon
- fraction
- column
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 claims description 17
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 14
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 13
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000004964 sulfoalkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 102000043557 human IFNG Human genes 0.000 claims 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims 1
- 230000014725 late viral mRNA transcription Effects 0.000 claims 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 28
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 6
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 229940093476 ethylene glycol Drugs 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 3
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1CC2(O)C(C=C(CO)CC3(O)C2C=C(C)C3=O)C4C(C)(C)C14OC(=O)C FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 238000011000 absolute method Methods 0.000 description 1
- 230000002022 anti-cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000051179 human NCKIPSD Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/145—Ultrafiltration
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/18—Apparatus therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2313/00—Details relating to membrane modules or apparatus
- B01D2313/40—Adsorbents within the flow path
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
各種タイプのヒト インターフエロンの中で、
免疫インターフエロン（IFN−γ）は最も特徴付
けされていない。このインターフエロンはリンパ
球をマイトジエン（有糸***誘発因子）または特
異抗原で刺戟することにより生産されるものであ
つて、ウイルス誘発α−およびβ−インターフエ
ロンとはその構造および性質が重大に異なつてい
る。 近年、Yip等はリンパ球をホルボール エステ
ル12−ｏ−テトラデカノイル−ホルボール−13ア
セテート（TPA）およびフイトヘムアグルチニ
ン（植物性血球凝集素）（PHA）の組合せにより
刺戟することにもとづくヒトIFN−γの生産方法
を報告した(1)。その後、Yip等は分取
NaDodSO4／ポリアクリルアミド ゲル電気泳
動によりIFN−γの２種のサブタイプを精製する
ことができた。しかしながら、この工程中に生物
学的活性のほとんど完全な損失が生じた（２，
３）。このサブタイプは20000および25000の見掛
分子質量を有し、これはコマシー ブルー
（Coomassie blue）染色性帯に相当し、そして抗
原的に交差活性化性である。約43000ダルトンの
見掛分子質量を有する第３の少量成分がまた検出
された。 別の研究において、Gray等はヒト IFN−γ
相補性DNAのクローン化および説明を報告して
いる。ヌクレオチド配列はこのIFN−γが146個
のアミノ酸を有する単純ポリヘプチドによりなる
ものであつて、17000ダルトンの計算分子質量を
有することを示した。さらにまた、遺伝子図書館
でしらべても、その他の構造上関連したDNA配
列を見出せなかつた(4)。このデータはIFN−γに
関して１つだけのポリペプチド配列が存在し、そ
して天然IFN−γは部分的に二量体化しているこ
とがあることを示唆していた。 PestkaおよびRubinsteinは以前に、米国特許
第4289690号に、IFN−γを均質にする精製およ
び逆相高性能液クロマトグラフイ（HPLC）によ
る８種の異なるサブタイプの分離を開示している
（５，６，７）。この方法はIFN−γが有機溶剤お
よび低PHに対して不安定であるために、IFN−γ
の精製には適しない。最近利用できるようになつ
たタンパク質の分別に適するイオン交換HPLCカ
ラムはIFN−γ生産物の高分割クロマトグラフイ
を可能にした。 IFN−γの生産、精製および構造研究に関する
最近の科学論文は次のとおりにまとめて示すこと
ができる： (1) Yip，Y.K.，Pang，R.H.L.，Urban，C.お
よびVilcek，J.（1981年）：Proc.Natl.Acad.
Sci.，USA78、1601〜1605； (2) Yip，Y.K.，Barrowclough，B.S.，Urban，
C.およびVilcek，J.（1982年）：Science215、
411〜413； (3) Yip，Y.K.，Barrowclough，B.S.，Urban，
C.およびVilcek，J.（1982年）：Proc.Natl.
Acad.Sci.USA79、1820〜1824； (4) Gray，P.W.，Leung，D.N.，Pennica，D.，
Yelverton，E.，Najarian，R.，Simonsen，
C.C.，Perynck，R.，Sherwood，P.J.，
Wallace，D.M.，Berger，S.L.，Levinson，
A.D.およびGoeddel，D.V.（1982年）：Nature
295、503〜508； (5) Rubinstein，M.，Rubinstein，S.，
Familletti，P.C.，Miller，R.S.，Waldman，
A.A.およびPestka，S.（1979年）：Proc.Natl.
Acad.Sci.USA76、640〜644； (6) Rubinstein，M.（1979年）：Anal.Biochem.
97、１〜７； (7) Rubinstein，M.，Levy，W.P.，Moschera，
J.A.，Lai−C.Y.，Hershberg，R.D.，
Bartlett，R.およびPestka，S.（1981年）：
Arch.Biochem.Biophys.210、307〜318。 前記論文のいくつかはヒト免疫インターフエロ
ンを均質に精製したと主張しているが、生物学的
活性のほとんど完全な損失（80〜90％）が認めら
れている。さらにまた。断言できるほど純粋な化
合物の性質も開示されたことはない。 タンパク質の精製に高性能液クロマトグラフイ
を使用することは一般的に当業者に既知である。 本発明はヒト免疫インターフエロンの改善され
た精製方法およびかくして生成された新規な均質
ヒト免疫インターフエロン（IFN−γ）に関す
る。 本発明の改善方法は制御された細孔を有するガ
ラス上におけるクロマトグラフイ、眼外濾過およ
びカチオン交換高性能液クロマトグラフイ工程の
組合せを包含し、IFN−γの効果的な精製を達成
させる。 IFN−γの精製における処理工程として制御さ
れた細孔を有するガラス上でのクロマトグラフイ
を使用することは当技術で既知であつた（前記引
用文献２，３参照）。眼外濾過は以前に、タンパ
ク質の濃縮および脱塩に広く使用されていた。か
なりの場合に、眼外濾過は眼外濾過膜のカツト−
オフ値より小さい分子量を有するペプチドおよび
タンパク質の除去に使用できる。Mono−Ｓカチ
オン交換HPLCカラムは特にタンパク質の分別用
にPharmacia Fine Chemicalsにより設計され、
市販されているものである。しかしながら、IFN
−γの分別用に、制御された細孔を有するガラス
クロマトグラフイおよび眼外濾過と組合せて、
これらのHPLCカラムは使用されたことはない
か、またはその使用が示唆されたこともない。 IFN−γの国際標準はまだ存在しないので、本
発明の全体にわたつて示されている生物学的活性
はNational Institutes of Health（Bethesda，
Maryland，U.S.A.）により供給されているイン
ターフエロン−α参照標準Ｇ−023−901−527を
基準にし、ヒトWISH細胞（American Type
Culture Collection Cat.NO.CCL−23）および水
胞性口内炎ウイルスをウイルス細胞変性作用の阻
止に基づく分析に使用した。その他のセルライ
ン、その他のウイルス、およびその他の標準の使
用が非常に広範囲の比活性値を与えうることは当
業者にとつて一般に既知である。もう１つの変数
には種々の方法で測定できるタンパク質含有量が
ある。本発明におけるタンパク質含有量は絶対方
法として広く受容されているアミノ酸分析に基づ
いて測定した。 粗製IFN−γ製剤に対して制御された細孔を有
するガラス クロマトグラフイを使用すると、約
４倍の精製が達成される。すなわち、この工程に
より生成されたIFN−γは約２×105単位／mgの
比活性を有する。制御された細孔を有するガラス
（CPG）処理には、次の方法を使用できる。 CPGビーズをポリプロピレン遠心用ビン中の
IFN−γ含有培養物上澄液（3000〜16000単位／
ml；８〜20×104単位／mg）に１：100（容量／容
量）の比率で加える。混合物を４℃で３時間攪拌
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、次
いでビーズをシリコン化ガラス カラムに詰め
る。このカラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩
衝塩類溶液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテ
トラメチルアンモニウム クロリド（PH７）によ
り溶出する。 テトラメチルアンモニウム クロリドによる
CPGからの溶出により得られた、生成する精製
インターフエロンは約２×105単位／mgの比活性
を示し、回収率は約50〜100％である。CPG−ク
ロマトグラフイからのIFN−γ活性を含有するフ
ラクシヨンを集め、PM−10膜（Amicon）上で
の眼外濾過により塩を除去する。保持フラクシヨ
ンを数容量の2mMリン酸ナトリウム（PH7.4）で
洗浄し、元の培養物容量の約0.5％まで濃縮する。
不溶出タンパク質を遠心分離により除去し、清明
な上澄液を使用時まで＋４℃で保存する。眼外濾
過により得られた生成するインターフエロン濃縮
物は９×105単位／mgの比活性を示し、回収率は
約60〜100％である。 眼外濾過により生成されたインターフエロン濃
縮物をさらに精製するために、このインターフエ
ロンを高分割能を有するカチオン交換高圧液クロ
マトグラフイ（HPLC）工程に１回または２回通
す。この液クロマトグラフイ工程では、スルホア
ルキル基が結合している単分散有機重合体系マト
リツクスを含有するカラムを使用する。これらの
カラムは順次的に、およびPH勾配およびイオン強
度勾配の変化する条件下におよびエチレングリコ
ールのような種々の安定化剤の存在下に使用でき
るものであつて、ヒト免疫インターフエロンをナ
トリウム−硫酸ドデシル（SDS）ポリアクリルア
ミド ゲル電気泳動における単一吸収帯、および
活性およびタンパク質レベルについてスーパーイ
ンポーズできるHPLCでの一定の比活性および単
一ピークを得ることにより測定して、均質に精製
できる。 本発明を実施する際に使用する有機マトリツク
ス カチオン−交換HPLCカラムは市販物品であ
る。適当なカラムはPharmacia Fina Chemicals
（Uppsala，Sweden）により生産され、市販され
ているMono−Ｓである。前記カラムを使用する
高圧液クロマトグラフイ系はPharmacia，
Varian，Beckman，Waters Perkin Elmars等
のような多くの製造業者から入手できる。 本発明において、HPLCカラムからのインター
フエロン−γの溶出に好適な緩衝系はPH7.0の
10mMリン酸ナトリウム−20％（容量／容量）エ
チレングリコールである。処理は約10〜約
1000PSIの中圧で行なう。標準５×50mmカラムに
使用する流速は0.1〜1.0ml／分であり、処理は−
10℃〜＋30℃の温度範囲で実施できる。インター
フエロン−γ（0.1mg〜10mgタンパク質）はこのカ
ラムに吸着させ、次いで増大する塩濃度勾配を使
用して選択的様式で順次溶出する。この目的に適
する塩としては、Nacl、Kcl、Mgcl2、MgSO4、
テトラメチルアンモニウム クロリド等を包含す
る。分離は約PH５〜約PH8.5で変化するPH値範囲
のいづれかで達成できる。別法として、塩濃度を
一定に保持し、PHをPH５〜PH10の間で増加勾配に
して変えることもできる。同じカラムにおいて前
記で概述した中で同じ条件または異なる条件のど
ちらかで２回または３回以上連続分別することに
よりさらに精製することができる。 溶出液の分別は210〜280nmの範囲、好ましく
は210nmまたは280nmの波長で作動する紫外線検
知器のようなタンパク質監視器により、分別中の
タンパク質含有量を付随監視するそれ自体既知の
方法でフラクシヨン採集器を使用して行なう。 シリカおよびガラスに対する吸着によるIFN−
γの損失が可能であるので、本発明で使用する全
ての管、容器および試験管はテフロン、ポリプロ
ピレンまたはポリエチレンのいづれかから作る。 高度に精製された生成物はポリプロピレン試験
管で20％（容量／容量）エチレングリコールの存
在下に＋４℃で保存した場合に最も安定である。
生物学的活性の有意の損失が反復凍結−解凍サイ
クルで検出される。 0.15、0.20、0.25および0.26モルのNacl濃度で
溶出して（PH7.0）、生物学的活性の４つの主要ピ
ークが20〜40％の総回収率で得られる。この分離
は非変性条件下に行なわれるので、各ピークは
Hu IFN−γの異なるサブタイプを示している。
β−メルカプトエタノールの存在または不存在の
どちらかでNaDodSO4−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析すると、0.25Mおよび
0.26M Naclで溶出するピークは26000（26K）お
よび21000（21K）の見掛分子質量をそれぞれ有す
る単一タンパク質吸収帯を含有することが判り、
他方、0.15Mおよび0.20Mのピークは純度が低
い。26Kおよび21Kの両サブタイプの比活性は７
×106単位／mgであつた。粗製またはいづれかの
精製IFN−γサブタイプを非変性条件下に
Ultrogel AcA 54カラムでゲル濾過により分析
すると、45000ダルトンの分子質量に相当する比
活性のピークが得られる。サブタイプ26Kおよび
21Kのアミノ酸分析はGray等により開示されて
いる（前記文献４）cDNAクローンの順序から計
算した理論値と一般的類似を示した。しかしなが
ら、プロリン、グリシンおよびパニルアラニンの
レベルにおける有意の差違が見られた。サブタイ
プ26Kおよび21Kはほとんど同一のアミノ酸組成
およびペプチドマツプを示した。 インターフエロン−γは抗ウイルス活性、抗細
胞活性、天然および抗体依存キラー細胞（killer
cell）活性に対抗する能力、或る種のHLA表面
マーカー抗原を誘発させる能力を示した。これら
の活性は多くの生物学的活性リンホカインを含有
する比較的粗製の製剤によつても得られている。
本発明の精製された均質ヒト免疫インターフエロ
ンはIFN−γ固有に属するこれらの活性の同定に
使用できる。本発明の精製IFN−γを含有する製
剤は種々のウイルス性および腫瘍性病気における
それらの有用性を評価するための臨床研究に使用
できる。 本発明の方法および生成物を次例によりさらに
説明する。 例 １ ヒトIFN−γの生産 単核細胞をFicoll−Hypaque勾配（gradient）
上での遠心分離（400×ｇ；30分）により野牛皮
（buffy coats）から単離する。血清を含有しない
RPM1−1640メジユウム中の単核細胞の培養物
（５×106／ml）に12−ｏ−テトラデカノイル ホ
ルボール−13−アセテート（5μｇ／ml）および
精製フイトヘムアグリチニン（5μｇ／ml）を添
加することによりIFN−γを産生させる。37℃お
よび５％CO2雰囲気で24時間インキユベーシヨン
した後に、細胞を塩心分離により除去し、培養物
上澄液を採取し、＋４℃で保存する。 例 ２ 制御された細孔を有するガラス上におけるクロ
マトグラフイおよび眼外濾過 CPGビーズをポリプロピレン遠心用管中の
IFN−γ含有培養物上澄液（3000〜16000単位／
ml；８〜20×104単位／ml）に１：100（容量／容
量）の比率で加える。混合物を４℃で３時間保持
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、ビ
ーズをシリコン化ガラス カラムに詰める。この
カラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶
液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテトラメチ
ル アンモニウム クロリド（PH７）により溶出
する。CPG−クロマトグラフイからIFN−γ活
性を含有するフラクシヨンを集め、塩をPM−10
膜（Amicon）上での眼外濾過により除去する。
保持フラクシヨンを数容量の2mMリン酸ナトリ
ウム（PH7.4）で洗浄し、次いで元の培養物容量
の約0.5％に濃縮する。不溶性タンパク質を遠心
分離により除去し、清明な上澄液を使用時まで＋
４℃で保存する。 例 ３ 高速液体クロマトグラフイ（HPLC） HPLCはAltex Model 330液クロマトグラフ
（Beckman Instruments）上で行なう。Mono−
SHPLC カチオン−交換カラム（５×50mm）を
10mMリン酸ナトリウム（PH7.0）−20％（容量／
容量）エチレン−グリコール（緩衝剤Ａ）で平衡
にする。前記工程からのIFN−γ生成物を0.5
ml／分の流速で加える。カラムを次いで緩衝剤Ａ
で30分間、次いで緩衝剤Ａ中にNaclを直線勾配
（０〜400mM）で含有する液で60分間洗浄する。
各フラクシヨン（１ml）を次いでタンパク質標準
として仔牛血清アルブミンを使用して、IFN−γ
活性およびタンパク質含有量について分析する。
エチレン グリコールが溶出緩衝剤中に含まれて
いる場合にだけ高度の分割が達成された。
0.15M、0.20M、0.25Mおよび0.26MのNacl濃度
で溶出する生物学的活性の数ピークが連続的に得
られる。通常、0.25Mにおけるピークが最も支配
的である。0.25Mおよび0.26Mにおける生物学的
活性のピークは２種の異なるタンパク質ピークを
付随し、種々の生成物におけるそれらの比活性は
７×106単位／mgであつた。低い方のNacl濃度
（0.15Mおよび0.20M）における生物学的活性の
ピークは比活性がさらに低く、分離したタンパク
質ピークを付随しない。生物学的活性の総回収率
は最後の工程で主として損失が生じて、20〜40％
であつた。 例 ４ NaDodSO4−ポリアクリルアミド ゲル電気
泳動およびアミノ酸分析 タンパク質資料を先ず2mMリン酸ナトリウム
（PH7.4）に対して透析し、Speedvac
Concentrator（Savant）中で乾燥させ、２％β−
メルカプトエタノールを含有する新たに製造した
試料緩衝液に溶解し、100℃で５分間加熱する。
15％ポリアクリルアミドのスラブ ゲルを使用す
る。電気泳動の後に、タンパク質吸収帯が
Coomassie blueまたは銀染色のどちらかにより
目に見える。0.26M塩で溶出するフラクシヨンは
21000ダルトンの見掛分子質量を有する単一タン
パク質吸収帯を示した（サブタイプ21K）。
0.25M塩で溶出するフラクシヨンは26000の見掛
分子質量を有する主要タンパク質吸収帯を示す
が、非常に低い分子質量の若干の少量吸収帯が場
合により見られる（サブタイプ26K）。このフラ
クシヨンを同じHPLCカラム上で再クロマトグラ
フイ処理すると、これらの汚染物を除去できる。
低い塩濃度（0.15〜0.20M）で溶出する生物学的
活性のピークはMr26000に相当する吸収帯を含む
数個の主要タンパク質吸収帯を示した。ピーク
21Kおよび26Kの見掛分子質量はゲル電気泳動前
のβ−メルカプトエタノールによる処理により影
響されない。 アミノ酸分析： Mono−ＳカラムからのIFN−γ含有）10〜
30μｇ）試料にアセトン（４〜５容量）を加え
る。混合物を−20℃で３〜16時間放置し、回転処
理し（13000×ｇ；５分間）、沈殿を減圧で乾燥さ
せる。アミノ酸分析は加水分解（6NHCl；110
℃；24時間）の後にDurrum500分析機で行なつ
た。セリンまたはセレオニンについての補正は行
なわない。サブタイプ21Kおよび26Kの両サブタ
イプのアミノ酸分析は遺伝子の配列から計算され
たものと全く類似の結果を与えた。グリシンの高
い含有量は多分、汚染物質および加水分解中のそ
の他のアミノ酸の分解によるものである。 【表】 例 ５ 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
26Kを含有する非経口投与形剤 ７×106単位／mgの比活性を有する均質ヒト免
疫インターフエロン サブタイプ26K総量10mgを
正常血清アルブミン（ヒト）USP35mlに溶解す
る。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して２〜３
変化させて透析して低分子量汚染物質を除去し、
次いで細菌学的フイルターに通す。濾過した溶液
を140のバイアル中に吸引により分配する。各バ
イアルは非経口投与に適する純粋インターフエロ
ン５×105単位を含有する。これらのバイアルは
使用前は冷所（−20〜−70℃）で保存すると好ま
しい。 例 ６ 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
21Kを含有する非経口投与形剤 ７×106単位／mgの比活性を有する均質ヒト免
疫インターフエロン サブタイプ21K総量10mgを
正常血清アルブミン（ヒト）USP35mlに溶解す
る。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して２〜３
変化させて透析し、低分子量汚染物質を除去し、
次いで細菌学的フイルターに通す。濾過した溶液
を140のバイアルに吸引により分配する。各バイ
アルは非経口投与に適する純粋インターフエロン
５×105単位を含有する。これらのバイアルは使
用前は、冷所（−20℃〜−70℃）で保存すると好
ましい。 例 ７ 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
26Kおよび21Kを含有する非経口投与形剤 両方共に７×106単位／mgの比活性を有する均
質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ21K5
mgおよび均質ヒト免疫インターフエロン サブタ
イプ26K5mgの組合せを正常血清アルブミン（ヒ
ト）USP35mlに溶解する。溶液をリン酸塩緩衝
塩類溶液に対して２〜３変化させて透析して、低
分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フイル
ターに通す。濾過した溶液を140のバイアルに吸
引により分配する。各バイアルは非経口投与に適
する純粋インターフエロン５×105単位を含有す
る。これらのバイアルは使用前は冷所（−20℃〜
−70℃）で保存すると好ましい。
免疫インターフエロン（IFN−γ）は最も特徴付
けされていない。このインターフエロンはリンパ
球をマイトジエン（有糸***誘発因子）または特
異抗原で刺戟することにより生産されるものであ
つて、ウイルス誘発α−およびβ−インターフエ
ロンとはその構造および性質が重大に異なつてい
る。 近年、Yip等はリンパ球をホルボール エステ
ル12−ｏ−テトラデカノイル−ホルボール−13ア
セテート（TPA）およびフイトヘムアグルチニ
ン（植物性血球凝集素）（PHA）の組合せにより
刺戟することにもとづくヒトIFN−γの生産方法
を報告した(1)。その後、Yip等は分取
NaDodSO4／ポリアクリルアミド ゲル電気泳
動によりIFN−γの２種のサブタイプを精製する
ことができた。しかしながら、この工程中に生物
学的活性のほとんど完全な損失が生じた（２，
３）。このサブタイプは20000および25000の見掛
分子質量を有し、これはコマシー ブルー
（Coomassie blue）染色性帯に相当し、そして抗
原的に交差活性化性である。約43000ダルトンの
見掛分子質量を有する第３の少量成分がまた検出
された。 別の研究において、Gray等はヒト IFN−γ
相補性DNAのクローン化および説明を報告して
いる。ヌクレオチド配列はこのIFN−γが146個
のアミノ酸を有する単純ポリヘプチドによりなる
ものであつて、17000ダルトンの計算分子質量を
有することを示した。さらにまた、遺伝子図書館
でしらべても、その他の構造上関連したDNA配
列を見出せなかつた(4)。このデータはIFN−γに
関して１つだけのポリペプチド配列が存在し、そ
して天然IFN−γは部分的に二量体化しているこ
とがあることを示唆していた。 PestkaおよびRubinsteinは以前に、米国特許
第4289690号に、IFN−γを均質にする精製およ
び逆相高性能液クロマトグラフイ（HPLC）によ
る８種の異なるサブタイプの分離を開示している
（５，６，７）。この方法はIFN−γが有機溶剤お
よび低PHに対して不安定であるために、IFN−γ
の精製には適しない。最近利用できるようになつ
たタンパク質の分別に適するイオン交換HPLCカ
ラムはIFN−γ生産物の高分割クロマトグラフイ
を可能にした。 IFN−γの生産、精製および構造研究に関する
最近の科学論文は次のとおりにまとめて示すこと
ができる： (1) Yip，Y.K.，Pang，R.H.L.，Urban，C.お
よびVilcek，J.（1981年）：Proc.Natl.Acad.
Sci.，USA78、1601〜1605； (2) Yip，Y.K.，Barrowclough，B.S.，Urban，
C.およびVilcek，J.（1982年）：Science215、
411〜413； (3) Yip，Y.K.，Barrowclough，B.S.，Urban，
C.およびVilcek，J.（1982年）：Proc.Natl.
Acad.Sci.USA79、1820〜1824； (4) Gray，P.W.，Leung，D.N.，Pennica，D.，
Yelverton，E.，Najarian，R.，Simonsen，
C.C.，Perynck，R.，Sherwood，P.J.，
Wallace，D.M.，Berger，S.L.，Levinson，
A.D.およびGoeddel，D.V.（1982年）：Nature
295、503〜508； (5) Rubinstein，M.，Rubinstein，S.，
Familletti，P.C.，Miller，R.S.，Waldman，
A.A.およびPestka，S.（1979年）：Proc.Natl.
Acad.Sci.USA76、640〜644； (6) Rubinstein，M.（1979年）：Anal.Biochem.
97、１〜７； (7) Rubinstein，M.，Levy，W.P.，Moschera，
J.A.，Lai−C.Y.，Hershberg，R.D.，
Bartlett，R.およびPestka，S.（1981年）：
Arch.Biochem.Biophys.210、307〜318。 前記論文のいくつかはヒト免疫インターフエロ
ンを均質に精製したと主張しているが、生物学的
活性のほとんど完全な損失（80〜90％）が認めら
れている。さらにまた。断言できるほど純粋な化
合物の性質も開示されたことはない。 タンパク質の精製に高性能液クロマトグラフイ
を使用することは一般的に当業者に既知である。 本発明はヒト免疫インターフエロンの改善され
た精製方法およびかくして生成された新規な均質
ヒト免疫インターフエロン（IFN−γ）に関す
る。 本発明の改善方法は制御された細孔を有するガ
ラス上におけるクロマトグラフイ、眼外濾過およ
びカチオン交換高性能液クロマトグラフイ工程の
組合せを包含し、IFN−γの効果的な精製を達成
させる。 IFN−γの精製における処理工程として制御さ
れた細孔を有するガラス上でのクロマトグラフイ
を使用することは当技術で既知であつた（前記引
用文献２，３参照）。眼外濾過は以前に、タンパ
ク質の濃縮および脱塩に広く使用されていた。か
なりの場合に、眼外濾過は眼外濾過膜のカツト−
オフ値より小さい分子量を有するペプチドおよび
タンパク質の除去に使用できる。Mono−Ｓカチ
オン交換HPLCカラムは特にタンパク質の分別用
にPharmacia Fine Chemicalsにより設計され、
市販されているものである。しかしながら、IFN
−γの分別用に、制御された細孔を有するガラス
クロマトグラフイおよび眼外濾過と組合せて、
これらのHPLCカラムは使用されたことはない
か、またはその使用が示唆されたこともない。 IFN−γの国際標準はまだ存在しないので、本
発明の全体にわたつて示されている生物学的活性
はNational Institutes of Health（Bethesda，
Maryland，U.S.A.）により供給されているイン
ターフエロン−α参照標準Ｇ−023−901−527を
基準にし、ヒトWISH細胞（American Type
Culture Collection Cat.NO.CCL−23）および水
胞性口内炎ウイルスをウイルス細胞変性作用の阻
止に基づく分析に使用した。その他のセルライ
ン、その他のウイルス、およびその他の標準の使
用が非常に広範囲の比活性値を与えうることは当
業者にとつて一般に既知である。もう１つの変数
には種々の方法で測定できるタンパク質含有量が
ある。本発明におけるタンパク質含有量は絶対方
法として広く受容されているアミノ酸分析に基づ
いて測定した。 粗製IFN−γ製剤に対して制御された細孔を有
するガラス クロマトグラフイを使用すると、約
４倍の精製が達成される。すなわち、この工程に
より生成されたIFN−γは約２×105単位／mgの
比活性を有する。制御された細孔を有するガラス
（CPG）処理には、次の方法を使用できる。 CPGビーズをポリプロピレン遠心用ビン中の
IFN−γ含有培養物上澄液（3000〜16000単位／
ml；８〜20×104単位／mg）に１：100（容量／容
量）の比率で加える。混合物を４℃で３時間攪拌
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、次
いでビーズをシリコン化ガラス カラムに詰め
る。このカラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩
衝塩類溶液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテ
トラメチルアンモニウム クロリド（PH７）によ
り溶出する。 テトラメチルアンモニウム クロリドによる
CPGからの溶出により得られた、生成する精製
インターフエロンは約２×105単位／mgの比活性
を示し、回収率は約50〜100％である。CPG−ク
ロマトグラフイからのIFN−γ活性を含有するフ
ラクシヨンを集め、PM−10膜（Amicon）上で
の眼外濾過により塩を除去する。保持フラクシヨ
ンを数容量の2mMリン酸ナトリウム（PH7.4）で
洗浄し、元の培養物容量の約0.5％まで濃縮する。
不溶出タンパク質を遠心分離により除去し、清明
な上澄液を使用時まで＋４℃で保存する。眼外濾
過により得られた生成するインターフエロン濃縮
物は９×105単位／mgの比活性を示し、回収率は
約60〜100％である。 眼外濾過により生成されたインターフエロン濃
縮物をさらに精製するために、このインターフエ
ロンを高分割能を有するカチオン交換高圧液クロ
マトグラフイ（HPLC）工程に１回または２回通
す。この液クロマトグラフイ工程では、スルホア
ルキル基が結合している単分散有機重合体系マト
リツクスを含有するカラムを使用する。これらの
カラムは順次的に、およびPH勾配およびイオン強
度勾配の変化する条件下におよびエチレングリコ
ールのような種々の安定化剤の存在下に使用でき
るものであつて、ヒト免疫インターフエロンをナ
トリウム−硫酸ドデシル（SDS）ポリアクリルア
ミド ゲル電気泳動における単一吸収帯、および
活性およびタンパク質レベルについてスーパーイ
ンポーズできるHPLCでの一定の比活性および単
一ピークを得ることにより測定して、均質に精製
できる。 本発明を実施する際に使用する有機マトリツク
ス カチオン−交換HPLCカラムは市販物品であ
る。適当なカラムはPharmacia Fina Chemicals
（Uppsala，Sweden）により生産され、市販され
ているMono−Ｓである。前記カラムを使用する
高圧液クロマトグラフイ系はPharmacia，
Varian，Beckman，Waters Perkin Elmars等
のような多くの製造業者から入手できる。 本発明において、HPLCカラムからのインター
フエロン−γの溶出に好適な緩衝系はPH7.0の
10mMリン酸ナトリウム−20％（容量／容量）エ
チレングリコールである。処理は約10〜約
1000PSIの中圧で行なう。標準５×50mmカラムに
使用する流速は0.1〜1.0ml／分であり、処理は−
10℃〜＋30℃の温度範囲で実施できる。インター
フエロン−γ（0.1mg〜10mgタンパク質）はこのカ
ラムに吸着させ、次いで増大する塩濃度勾配を使
用して選択的様式で順次溶出する。この目的に適
する塩としては、Nacl、Kcl、Mgcl2、MgSO4、
テトラメチルアンモニウム クロリド等を包含す
る。分離は約PH５〜約PH8.5で変化するPH値範囲
のいづれかで達成できる。別法として、塩濃度を
一定に保持し、PHをPH５〜PH10の間で増加勾配に
して変えることもできる。同じカラムにおいて前
記で概述した中で同じ条件または異なる条件のど
ちらかで２回または３回以上連続分別することに
よりさらに精製することができる。 溶出液の分別は210〜280nmの範囲、好ましく
は210nmまたは280nmの波長で作動する紫外線検
知器のようなタンパク質監視器により、分別中の
タンパク質含有量を付随監視するそれ自体既知の
方法でフラクシヨン採集器を使用して行なう。 シリカおよびガラスに対する吸着によるIFN−
γの損失が可能であるので、本発明で使用する全
ての管、容器および試験管はテフロン、ポリプロ
ピレンまたはポリエチレンのいづれかから作る。 高度に精製された生成物はポリプロピレン試験
管で20％（容量／容量）エチレングリコールの存
在下に＋４℃で保存した場合に最も安定である。
生物学的活性の有意の損失が反復凍結−解凍サイ
クルで検出される。 0.15、0.20、0.25および0.26モルのNacl濃度で
溶出して（PH7.0）、生物学的活性の４つの主要ピ
ークが20〜40％の総回収率で得られる。この分離
は非変性条件下に行なわれるので、各ピークは
Hu IFN−γの異なるサブタイプを示している。
β−メルカプトエタノールの存在または不存在の
どちらかでNaDodSO4−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析すると、0.25Mおよび
0.26M Naclで溶出するピークは26000（26K）お
よび21000（21K）の見掛分子質量をそれぞれ有す
る単一タンパク質吸収帯を含有することが判り、
他方、0.15Mおよび0.20Mのピークは純度が低
い。26Kおよび21Kの両サブタイプの比活性は７
×106単位／mgであつた。粗製またはいづれかの
精製IFN−γサブタイプを非変性条件下に
Ultrogel AcA 54カラムでゲル濾過により分析
すると、45000ダルトンの分子質量に相当する比
活性のピークが得られる。サブタイプ26Kおよび
21Kのアミノ酸分析はGray等により開示されて
いる（前記文献４）cDNAクローンの順序から計
算した理論値と一般的類似を示した。しかしなが
ら、プロリン、グリシンおよびパニルアラニンの
レベルにおける有意の差違が見られた。サブタイ
プ26Kおよび21Kはほとんど同一のアミノ酸組成
およびペプチドマツプを示した。 インターフエロン−γは抗ウイルス活性、抗細
胞活性、天然および抗体依存キラー細胞（killer
cell）活性に対抗する能力、或る種のHLA表面
マーカー抗原を誘発させる能力を示した。これら
の活性は多くの生物学的活性リンホカインを含有
する比較的粗製の製剤によつても得られている。
本発明の精製された均質ヒト免疫インターフエロ
ンはIFN−γ固有に属するこれらの活性の同定に
使用できる。本発明の精製IFN−γを含有する製
剤は種々のウイルス性および腫瘍性病気における
それらの有用性を評価するための臨床研究に使用
できる。 本発明の方法および生成物を次例によりさらに
説明する。 例 １ ヒトIFN−γの生産 単核細胞をFicoll−Hypaque勾配（gradient）
上での遠心分離（400×ｇ；30分）により野牛皮
（buffy coats）から単離する。血清を含有しない
RPM1−1640メジユウム中の単核細胞の培養物
（５×106／ml）に12−ｏ−テトラデカノイル ホ
ルボール−13−アセテート（5μｇ／ml）および
精製フイトヘムアグリチニン（5μｇ／ml）を添
加することによりIFN−γを産生させる。37℃お
よび５％CO2雰囲気で24時間インキユベーシヨン
した後に、細胞を塩心分離により除去し、培養物
上澄液を採取し、＋４℃で保存する。 例 ２ 制御された細孔を有するガラス上におけるクロ
マトグラフイおよび眼外濾過 CPGビーズをポリプロピレン遠心用管中の
IFN−γ含有培養物上澄液（3000〜16000単位／
ml；８〜20×104単位／ml）に１：100（容量／容
量）の比率で加える。混合物を４℃で３時間保持
し、ビーズを沈降させ、上澄液を吸引除去し、ビ
ーズをシリコン化ガラス カラムに詰める。この
カラムを先ず数カラム容量のリン酸塩緩衝塩類溶
液で洗浄し、次いでIFN−γを0.5Mテトラメチ
ル アンモニウム クロリド（PH７）により溶出
する。CPG−クロマトグラフイからIFN−γ活
性を含有するフラクシヨンを集め、塩をPM−10
膜（Amicon）上での眼外濾過により除去する。
保持フラクシヨンを数容量の2mMリン酸ナトリ
ウム（PH7.4）で洗浄し、次いで元の培養物容量
の約0.5％に濃縮する。不溶性タンパク質を遠心
分離により除去し、清明な上澄液を使用時まで＋
４℃で保存する。 例 ３ 高速液体クロマトグラフイ（HPLC） HPLCはAltex Model 330液クロマトグラフ
（Beckman Instruments）上で行なう。Mono−
SHPLC カチオン−交換カラム（５×50mm）を
10mMリン酸ナトリウム（PH7.0）−20％（容量／
容量）エチレン−グリコール（緩衝剤Ａ）で平衡
にする。前記工程からのIFN−γ生成物を0.5
ml／分の流速で加える。カラムを次いで緩衝剤Ａ
で30分間、次いで緩衝剤Ａ中にNaclを直線勾配
（０〜400mM）で含有する液で60分間洗浄する。
各フラクシヨン（１ml）を次いでタンパク質標準
として仔牛血清アルブミンを使用して、IFN−γ
活性およびタンパク質含有量について分析する。
エチレン グリコールが溶出緩衝剤中に含まれて
いる場合にだけ高度の分割が達成された。
0.15M、0.20M、0.25Mおよび0.26MのNacl濃度
で溶出する生物学的活性の数ピークが連続的に得
られる。通常、0.25Mにおけるピークが最も支配
的である。0.25Mおよび0.26Mにおける生物学的
活性のピークは２種の異なるタンパク質ピークを
付随し、種々の生成物におけるそれらの比活性は
７×106単位／mgであつた。低い方のNacl濃度
（0.15Mおよび0.20M）における生物学的活性の
ピークは比活性がさらに低く、分離したタンパク
質ピークを付随しない。生物学的活性の総回収率
は最後の工程で主として損失が生じて、20〜40％
であつた。 例 ４ NaDodSO4−ポリアクリルアミド ゲル電気
泳動およびアミノ酸分析 タンパク質資料を先ず2mMリン酸ナトリウム
（PH7.4）に対して透析し、Speedvac
Concentrator（Savant）中で乾燥させ、２％β−
メルカプトエタノールを含有する新たに製造した
試料緩衝液に溶解し、100℃で５分間加熱する。
15％ポリアクリルアミドのスラブ ゲルを使用す
る。電気泳動の後に、タンパク質吸収帯が
Coomassie blueまたは銀染色のどちらかにより
目に見える。0.26M塩で溶出するフラクシヨンは
21000ダルトンの見掛分子質量を有する単一タン
パク質吸収帯を示した（サブタイプ21K）。
0.25M塩で溶出するフラクシヨンは26000の見掛
分子質量を有する主要タンパク質吸収帯を示す
が、非常に低い分子質量の若干の少量吸収帯が場
合により見られる（サブタイプ26K）。このフラ
クシヨンを同じHPLCカラム上で再クロマトグラ
フイ処理すると、これらの汚染物を除去できる。
低い塩濃度（0.15〜0.20M）で溶出する生物学的
活性のピークはMr26000に相当する吸収帯を含む
数個の主要タンパク質吸収帯を示した。ピーク
21Kおよび26Kの見掛分子質量はゲル電気泳動前
のβ−メルカプトエタノールによる処理により影
響されない。 アミノ酸分析： Mono−ＳカラムからのIFN−γ含有）10〜
30μｇ）試料にアセトン（４〜５容量）を加え
る。混合物を−20℃で３〜16時間放置し、回転処
理し（13000×ｇ；５分間）、沈殿を減圧で乾燥さ
せる。アミノ酸分析は加水分解（6NHCl；110
℃；24時間）の後にDurrum500分析機で行なつ
た。セリンまたはセレオニンについての補正は行
なわない。サブタイプ21Kおよび26Kの両サブタ
イプのアミノ酸分析は遺伝子の配列から計算され
たものと全く類似の結果を与えた。グリシンの高
い含有量は多分、汚染物質および加水分解中のそ
の他のアミノ酸の分解によるものである。 【表】 例 ５ 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
26Kを含有する非経口投与形剤 ７×106単位／mgの比活性を有する均質ヒト免
疫インターフエロン サブタイプ26K総量10mgを
正常血清アルブミン（ヒト）USP35mlに溶解す
る。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して２〜３
変化させて透析して低分子量汚染物質を除去し、
次いで細菌学的フイルターに通す。濾過した溶液
を140のバイアル中に吸引により分配する。各バ
イアルは非経口投与に適する純粋インターフエロ
ン５×105単位を含有する。これらのバイアルは
使用前は冷所（−20〜−70℃）で保存すると好ま
しい。 例 ６ 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
21Kを含有する非経口投与形剤 ７×106単位／mgの比活性を有する均質ヒト免
疫インターフエロン サブタイプ21K総量10mgを
正常血清アルブミン（ヒト）USP35mlに溶解す
る。溶液をリン酸塩緩衝塩類溶液に対して２〜３
変化させて透析し、低分子量汚染物質を除去し、
次いで細菌学的フイルターに通す。濾過した溶液
を140のバイアルに吸引により分配する。各バイ
アルは非経口投与に適する純粋インターフエロン
５×105単位を含有する。これらのバイアルは使
用前は、冷所（−20℃〜−70℃）で保存すると好
ましい。 例 ７ 均質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ
26Kおよび21Kを含有する非経口投与形剤 両方共に７×106単位／mgの比活性を有する均
質ヒト免疫インターフエロン サブタイプ21K5
mgおよび均質ヒト免疫インターフエロン サブタ
イプ26K5mgの組合せを正常血清アルブミン（ヒ
ト）USP35mlに溶解する。溶液をリン酸塩緩衝
塩類溶液に対して２〜３変化させて透析して、低
分子量汚染物質を除去し、次いで細菌学的フイル
ターに通す。濾過した溶液を140のバイアルに吸
引により分配する。各バイアルは非経口投与に適
する純粋インターフエロン５×105単位を含有す
る。これらのバイアルは使用前は冷所（−20℃〜
−70℃）で保存すると好ましい。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ７×106単位／mgの比活性、21000ダルトンの
見掛分子質量及び下記のアミノ酸組成を有する、
生物学的に活性な形態にある、サブタイプ21Kの
ヒトインターフエロンガンマ。 アミノ酸 残留量 Asx 14.6±1.3 Thr 7.9±0.4 Ser 9.1±1.4 Glx 15.6±0.7 Pro 9.7±1.4 Gly 14.4±0.3 Ala 12.0±1.5 Cys 0.6±0.5 Val 7.4±0.7 Met 2.3±1.0 Ile 5.0±0.3 Leu 9.2±0.3 Tyr 2.9±0.4 Phe 4.9±1.0 His 3.5±0.7 Lys 20.3±0.4 Arg 5.7±0.4 ２ ７×106単位／mgの比活性、21000ダルトンの
見掛分子質量及び下記のアミノ酸組成を有する、
生物学的に活性な形態にある、サブタイプ21Kの
ヒトインターフエロンガンマの製造法であつて、 アミノ酸 残留量 Asx 14.6±1.3 Thr 7.9±0.4 Ser 9.1±1.4 Glx 15.6±0.7 Pro 9.7±1.4 Gly 14.4±0.3 Ala 12.0±1.5 Cys 0.6±0.5 Val 7.4±0.7 Met 2.3±1.0 Ile 5.0±0.3 Leu 9.2±0.3 Tyr 2.9±0.4 Phe 4.9±1.0 His 3.5±0.7 Lys 20.3±0.4 Arg 5.7±0.4 (a) 不純な状態のサブタイプ21Kを含むインター
フエロンガンマの水溶液を制御された細孔を有
するガンマ吸着剤と混合して、その後、この吸
着剤からインターフエロンを溶出し、この溶出
液の選ばれたフラクシヨン中に増大した純度の
状態でインターフエロンを採取し； (b) 工程(a)で選ばれたフラクシヨンを膜上での眼
外濾過により濃縮し、この膜に保持されている
フラクシヨン中におけるさらに高い濃度および
増大した純度の状態でのインターフエロンを採
取し； (c) 工程(b)で得られたフラクシヨンをカチオン交
換マトリツクスに少なくとも１回通し、その
後、このカラムから増加する塩濃度勾配あるい
は増加するPH勾配を用いて適当な圧力下に生物
学的に活性なヒトインターフエロンガンマのタ
ンパク質を含む少なくとも１つのフラクシヨン
を溶出し、この溶出液の選ばれたフラクシヨン
中の数種の異なるピークとして、ヒトインター
フエロンガンマのサブタイプ21Kを均質で生物
学的に活性なタンパク質状態で得る； 工程の組合わせからなる方法。 ３ 工程(c)をHPLC条件下に実施する、特許請求
の範囲第２項記載の方法。 ４ カチオン交換カラムがスルホアルキル基を有
する有機ポリマーからなる、特許請求の範囲第２
項記載の方法。 ５ 工程(c)において増加する塩濃度勾配によりイ
ンターフエロンを溶出する、特許請求の範囲第２
項記載の方法。 ６ 工程(c)において増加するPH濃度勾配によりイ
ンターフエロンを溶出する、特許請求の範囲第２
項記載の方法。 ７ 工程(c)においてエチレングリコールの存在下
にインターフエロンを溶出する、特許請求の範囲
第２項記載の方法。 ８ カラムがスルホアルキル基を有する有機ポリ
マーからなるカチオン交換カラムであり、緩衝剤
が20％（容量／容量）エチレン グリコールを含
有する10mMリン酸ナトリウム（PH7.0）であり、
そして勾配が０〜400mMの直線状に増加させた
NaCl濃度の60分である特許請求の範囲第２項〜
第７項のいずれか１項に記載の方法。 ９ 工程(c)の少なくとも１つのフラクシヨンにお
いて均質なサブタイプ21Kを含むようにサブタイ
プ21Kを溶出してサブタイプ21Kを製造する特許
請求の範囲第２項から第８項のいずれか１項に記
載の方法。 １０ 工程(b)の膜が約10000ダルトンの分子量カ
ツト−オフ値を有する、特許請求の範囲第２項記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL67896A IL67896A (en) | 1983-02-13 | 1983-02-13 | Two biologically active human gama interferon subtypes,purification thereof and pharmaceutical compositions containing them |
| IL67896 | 1983-02-13 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3216712A Division JPH0751599B2 (ja) | 1983-02-13 | 1991-03-04 | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ２６ｋ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59231097A JPS59231097A (ja) | 1984-12-25 |
| JPH0479359B2 true JPH0479359B2 (ja) | 1992-12-15 |
Family
ID=11054073
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59024943A Granted JPS59231097A (ja) | 1983-02-13 | 1984-02-13 | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ２１ｋおよびその製造法 |
| JP3216712A Expired - Lifetime JPH0751599B2 (ja) | 1983-02-13 | 1991-03-04 | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ２６ｋ及びその製造法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3216712A Expired - Lifetime JPH0751599B2 (ja) | 1983-02-13 | 1991-03-04 | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ２６ｋ及びその製造法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4617378A (ja) |
| EP (1) | EP0117470B1 (ja) |
| JP (2) | JPS59231097A (ja) |
| AU (1) | AU566137B2 (ja) |
| CA (1) | CA1248448A (ja) |
| DE (2) | DE3465881D1 (ja) |
| IL (1) | IL67896A (ja) |
| ZA (1) | ZA84497B (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986002068A1 (en) * | 1984-09-26 | 1986-04-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Mutual separation of proteins |
| US4946674A (en) * | 1984-10-05 | 1990-08-07 | Bioferon Biochemische Substanzen Gmbh & Co. | Process for treatment of rheumatic diseases |
| IL76591A0 (en) * | 1984-10-05 | 1986-02-28 | Bioferon Biochem Substanz | Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof |
| IL78444A (en) * | 1986-04-08 | 1992-05-25 | Yeda Res & Dev | Human gamma interferon-specific receptor protein,antibody against said protein,and compositions containing said protein and antibody |
| US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
| US4908432A (en) * | 1987-01-09 | 1990-03-13 | New York University | Novel polypeptide having gamma-interferon activity |
| IT1222427B (it) * | 1987-07-31 | 1990-09-05 | Sclavo Spa | Procedimento per la purificazione di interferone |
| IT1240612B (it) * | 1990-03-16 | 1993-12-17 | Sclavo Spa | Procedimento di purificazione del b-interferone umano ricombinante |
| US5434249A (en) * | 1992-05-27 | 1995-07-18 | Viragen Inc. | Method for modulating specific activity of inteferon alpha |
| US6265542B1 (en) * | 1997-10-24 | 2001-07-24 | Genentech, Inc. | Purification of molecules |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5661997A (en) * | 1979-10-12 | 1981-05-27 | Du Pont | Purification of interferon |
| JPS5813397A (ja) * | 1981-04-17 | 1983-01-25 | メロイ・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレイテイド | 免疫インタ−フエロン及びそのｍＲＮＡの製造方法 |
| JPS58159417A (ja) * | 1982-03-01 | 1983-09-21 | エフ・ホフマン・ラ・ロシユ・ウント・コンパニ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 均一なヒトのインタ−フエロン及びその製造方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7605805A (nl) * | 1976-05-28 | 1977-11-30 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| ZA796175B (en) * | 1978-11-24 | 1980-11-26 | Hoffmann La Roche | Purified proteins and process therefor |
| IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| NL7907791A (nl) * | 1979-10-23 | 1981-04-27 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| US4420398A (en) * | 1981-08-13 | 1983-12-13 | American National Red Cross | Filteration method for cell produced antiviral substances |
| US4440675A (en) * | 1981-08-18 | 1984-04-03 | Meloy Laboratories, Inc. | Human immune interferon |
| US4485017A (en) * | 1982-12-22 | 1984-11-27 | Cetus Corporation | Isolation of human interferon by immunosorbent and high performance liquid chromatography |
-
1983
- 1983-02-13 IL IL67896A patent/IL67896A/xx not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-01-18 US US06/571,735 patent/US4617378A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-23 ZA ZA84497A patent/ZA84497B/xx unknown
- 1984-02-08 AU AU24262/84A patent/AU566137B2/en not_active Expired
- 1984-02-10 DE DE8484101404T patent/DE3465881D1/de not_active Expired
- 1984-02-10 CA CA000447171A patent/CA1248448A/en not_active Expired
- 1984-02-10 EP EP84101404A patent/EP0117470B1/en not_active Expired
- 1984-02-10 DE DE198484101404T patent/DE117470T1/de active Pending
- 1984-02-13 JP JP59024943A patent/JPS59231097A/ja active Granted
-
1991
- 1991-03-04 JP JP3216712A patent/JPH0751599B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5661997A (en) * | 1979-10-12 | 1981-05-27 | Du Pont | Purification of interferon |
| JPS5813397A (ja) * | 1981-04-17 | 1983-01-25 | メロイ・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレイテイド | 免疫インタ−フエロン及びそのｍＲＮＡの製造方法 |
| JPS58159417A (ja) * | 1982-03-01 | 1983-09-21 | エフ・ホフマン・ラ・ロシユ・ウント・コンパニ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 均一なヒトのインタ−フエロン及びその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL67896A0 (en) | 1983-06-15 |
| DE3465881D1 (en) | 1987-10-15 |
| AU2426284A (en) | 1984-08-16 |
| JPS59231097A (ja) | 1984-12-25 |
| EP0117470B1 (en) | 1987-09-09 |
| DE117470T1 (de) | 1986-04-10 |
| ZA84497B (en) | 1984-08-29 |
| US4617378A (en) | 1986-10-14 |
| CA1248448A (en) | 1989-01-10 |
| JPH0725898A (ja) | 1995-01-27 |
| EP0117470A1 (en) | 1984-09-05 |
| IL67896A (en) | 1987-03-31 |
| AU566137B2 (en) | 1987-10-08 |
| JPH0751599B2 (ja) | 1995-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yip et al. | Partial purification and characterization of human gamma (immune) interferon. | |
| US6350589B1 (en) | Compositions of highly-purified natural mixtures of type I interferon derived from leukocytes and methods | |
| FI60501B (fi) | Foerfarande foer selektiv separering av interferon fraon interferon-raopreparat | |
| US5196323A (en) | Process for preparing and purifying alpha-interferon | |
| US6433144B1 (en) | Compositions of highly-purified natural mixtures of type I Interferon derived from leukocytes and methods | |
| US4278661A (en) | Purification of interferon | |
| JPS63503352A (ja) | タンパク質の精製 | |
| JPS58201794A (ja) | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 | |
| US4617378A (en) | Purification of biologically active human immune interferon | |
| JPH0586097A (ja) | 上清ｉｖ、特にｉｖ−４またはコーンフラクシヨンｖまたはそれと類似の上清または画分からヒトアルブミンを単離する方法 | |
| NZ203364A (en) | Method for purifying human immune interferon;homogeneous human immune interferon | |
| GB2055384A (en) | Homogeneous fibroblast interferon and method for manufacture thereof | |
| US4908432A (en) | Novel polypeptide having gamma-interferon activity | |
| Grob et al. | Separation of human leukocyte interferon components by concanavalin A-agarose affinity chromatography and their characterization | |
| JPS6261040B2 (ja) | ||
| KR940010024B1 (ko) | α-인터페론의 제조 및 정제 방법 | |
| KR100361894B1 (ko) | 치환크로마토그라피방법및정제된헤모글로빈생성물 | |
| Kenny et al. | [64] Purification of human fibroblast interferon produced in the absence of serum by cibacron blue F3GA-agarose and high-performance liquid chromatography | |
| Rubinstein et al. | [67] Purification and characterization of human leukocyte interferons by high-performance liquid chromatography | |
| KR840001516B1 (ko) | 인체 섬유아세포 인터페론의 제조방법 | |
| Sloane et al. | Studies on an antineoplastic fraction from human urine. Characterization of the major protein in this fraction | |
| JPH0779709B2 (ja) | Ｇｍ‐ｃｓｆの精製 | |
| Herring et al. | Rapid purification of leukocyte interferons by high-performance liquid chromatography | |
| Ferreira | pUICATION OF HUMAN AMNIOTIC MEMBRANE INTERFERON BY | |
| Bodo | 19. Konferenz der Gesellschaft für Biologische Chemie Purification and Chemical Characterization of Interferon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |