JPS60209174A - 液体試料の成分検出用の試験装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体、殊に体液（ｂｏｄｙ　ｆｈｂｉｄ　）の
成分の分光学的分析に対する改善された分析素子（ｅｌ
ｅｍｅｎｔ　）に関するものである。本発明による分析
素子は凝固法（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓ
ｓ　）により生成される少なくとも１つの非対称性の膜
を有することに特徴がある。

「乾燥した」試薬を用いる液体の成分の測定〔例えば試
験片（ｓｔｒｉｐ　）　〕は殊に臨床的診断において益
々重要になってきている。かくて、尿、血清または血液
のある種の成分、例えばグルコース、ピリルビル、尿素
または蛋白質の検出は試験な 片を用いて行うことが多ζらている。徒来の湿式化学法
と比較して、このタイプの分析はより迅速で、より簡単
で、且つ′よ偵安価である液体試料に通常使用される試
験片におい請求めるアナライト（ａｎａｌｙｔｅ　ｌの
測定に必要な試薬は適当な液体吸収用担体物質中に含ま
れる。液体試料をこの担体に塗布した場合、この液体の
担体（反応空間）中への拡散が起こり、そこで分析され
る試料成分と一緒になって反応試薬、例えば特異的な、
濃度依存性の呈色が生じる。

最初に使用された液体吸収用担体物質は単なる紙であり
、そして次に使用された物は検出試薬を含浸させた化学
的に変性された紙であった。しかしながら、層の厚さ及
び組成に関するその均質性の欠如のために、紙は定量的
測定には十分に適するものではない。

高分子担体物質を適当なコーティング技術により使用す
ることで定量的な試験片を用いる診断に重大な進歩が見
られた。

かくて、透明な支持体、ゼラチン層及び充てん剤を含む
微細孔性酢酸セルロース層からなる多層試験装置がドイ
ツ国特許出願公告（ＤＥ−Ａｓ）第ａ　３３２．７６０
号に記載されている。ゼラチン層は試薬を含み、かくて
反応及び検出ゾーン（ｚｏｈｅ　）として作用する。微
細孔性酢酸セルロースの機能は試料の均一な分配、赤血
球の阻止、及び支持体の側からの測定放射線の入射光の
反射にある。

ゼラチン層を含む試験装置の１つの利点にはその製造に
用いるコーティング技術が写真から公知であり、そして
工業的に十分に発達していたことがある。水に膨潤する
重合体（例えば寒天）を含む他の試験装置と同様に、か
かる系の欠点は検出反応に加えて膨潤工程が起こり、そ
のため長時間反応が停止しないことにある。かくて、迅
速な分析のためには終点測定ではなく、反応の速度論の
みを用いることができる。定量的分析を可能にす　。

るためには、試料を計量導入しなければならない。

更に、ゼラチンはゼラチンの中における生化学的検出試
薬の限られた安定性のため、及び検出反応で生じた呈色
の限られた安定性（−かくて、数日間違れて分析結果を
評価することはできない）のために理想的なものではな
い。加えて、ゼラチンは検出反応に必要な酵素中に不純
物として通常見出されるプロテアーゼに鋭敏である。

体液の構成成分の測定に対する重合体をベースとする他
の試験片系はヨーロッパ特許出願用０．０６４、７１０
号に記載されている。この例において、試薬に使用され
るマトリックス（ｍａｔｒｉｙ、）は膨張剤（例えばシ
リカケ°ル）の存在下でラテックス（例えばポリプロピ
オン酸ビニルの水性分散体）を乾燥することにより生成
される多孔性重合体フィルムである。分析される液体試
料をｐ　Ｖ　Ｃフィルム上に位置する試薬層に直接塗布
する。ある時間後、過剰の試料及び赤血球をふきとり、
そして呈色反応を支持体から離れた面の側から観察する
か、または反射法により測定する。

この系の不満足な（そして試料を試薬層に直接塗布する
系に全く一般的である）特徴はいわゆるブリード（ｂｌ
ｅｅｄｉｎｇ　）にある。このことは試薬層からの検出
試薬、殊に水溶性のもの（例えば酵素）が過剰な試料中
に溶解することができ、次にこれらのものがぬぐう際に
系から除去され、そしてこれにより成績の誤差が生じる
。このため、透明な担体を介しての評価が可能であり、
従って試料のふきとりを省略し得る試験片を開発するこ
とは試料を比較的長時間（例えば２分間）作用させなけ
ればならず、そして特定の、殊に比較的大きい細孔（μ
ｍの範囲）を生成させることが困難なことにある。この
タイプの大孔径の系は高分子量のアナライトの検出に殊
に興味あるものであろう。

本発明の目的は操作が簡単であり、且つ出来る限り定量
的な結果ケ与える、殊に全血（ｗｈｏｌｅｂｌｏｏｃｉ
）中の成分に対する新規な試験剤を開発することである
。殊に試料の量を正確に計量したり或いは決められた時
間後に過剰の試料をふきとることが困難な専門家でない
人達により試験片を用いる診断が益々使用されるために
は簡単な操作が重要である。

一定の品質の試験剤を簡単に製造することができるべき
であり、そして殊に次の特・１生を有すべきであるニ ーアナライトの濃度に依存する呈色反応の再現性；−強
い呈色； −速い反応（終点測定）； 一担体側及び（ふきとり後の）塗布面からの評価ニー全
血の測定が可能； 一呈色及び全系の良好な安定性； 一特定の細孔径の簡単な生成； 一塗布する試料容量に依存しない分析値；−非膨潤性の
重合体マトリックス； −ブリードなし。

驚くべきことに、試料塗布用の重合体層を有する試験装
置は重合体溶液の凝固による膜製造の方法により製造す
ることができ、そしてこのものは単独でか、または他の
要素と一緒になって上記の欠点を示さずに臨床診断の要
求のすべてを満たすことが見出された。かくて、特定の
分離を行い、且つ生物学的に劣化しない広範囲にわたる
化学的成分の多数の重合体系（例えば親水性；疎水性；
酸性または塩基性イオン交換体群）が凝固法による膜の
製造に適している。加えて、この製造法を用いて種々の
所定の細孔径及び細孔容積を有する膜を製造することが
可能であり、かくて妨害成分の特定の分離が可能であり
、そしてこの系は自己計量方式（ｓｅｌｆ−ｍｅｔｅｒ
ｉｎｇ　ｆａｓｈｉｏｎ）で作用する。

本発明は液体試料、殊に血液または尿の如き体液中の成
分の検出に対する試験装置に関するものであり、該装置
は担体層、微細孔性重合体層、適当ならば他の層、及び
１つまたはそれ以上の層に配分された測定する成分の検
出用試薬からなる。

本発明は一方では凝固法により生成される膜であり、そ
して非対称性の細孔構造を有し、その細孔が試料の塗布
が行なわれる試験装置の側に向かって狭くなる、微細孔
性重合体層を使用し、他方では好ましくは試験条件下で
は試料に対して不透過性である巨視的に滑らかな担体層
を使用することに特徴がある。

所定の細孔容積及び種々の細孔径を有して製造し得る完
全に合成的な重合体からなる微細孔性フィルムは本発明
に適しており、且つ好ましい。完全に合成的な重合体の
特性は天然または半合成重合体と比較して高い再現性で
製造することができ、そして簡単に品質管理ができるこ
とから重要なものである。

外的圧力を用いて分子混合物を大規模工業的に分離する
際に使用される微細孔性重合体フィルム（膜）はある時
期に既知となり、そして商業的に人手できる。このタイ
プの膜の製造方法は多数あり、いわゆる「転相法Ｊ　（
ｐｈａｓｅ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）が極め
て重要である。これらの技術の基礎に関する情報は例え
ばＨ，Ｓｔｒａｔｈｍαｎｎ。

「Ｔｒｅｎｎｗｎｇｅｎ　ｖｏｎ　ｍｏｌｅｋｗｌａｒ
ｅｎ　Ｍｉ　ｓｃｈｕｎｇｔｔｒｍｉｔ　Ｈｉｌｆｅ　
５ｙｎｔｈｅｔｉｓｃｈｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｎ」（
合成膜を用いる分子混合物の分離）　、Ｓ　ｔｅｉｎｋ
ｏ−ｐｆｖｅｒｌａｇ　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ　（１９７
９）に見られる。

転相法には種々の方法がある。凝固法において、工程は
原理的に、固体担体を均一な厚さく例えば１００μｍ）
の重合体溶液〔キャスティング（ｃａｓｔｉｎｇ　）溶
液〕で被覆し、適当ならば蒸気状態の重合体に対する非
溶媒（好ましくは水）を含む雰囲気に溶液が部分的にか
、または完全にグル化するまで曝露し、次に凝固浴に浸
漬し、そこで非対称性構造を有する微細孔性フィルムを
生成させることからなる。凝固中に膜フィルムが固体担
体に付着したままの場合〔ウェブ（ｗｅｂ）を結合した
特に多孔性の重合体または重合体フィルムを用いる場合
〕、担持された膜が得られる。凝固中に膜フィルムが固
体担体から剥離するようになる場合（例えばガラスを用
いる場合）、非担持の膜が生成される。凝固液の特性は
このものがキャスティング溶液中の溶媒と混和性である
が、重合体に対しては沈殿剤であることである。この方
法の典型的な特徴は凝固（細孔形成）が本質的に凝固液
に浸漬した際にのみ起こり、そして非対称性の膜構造が
生じることにある。これに関し、非対称性とは膜の下側
（担体側）から見て細孔が膜の表面に向って狭くなって
いることを表わす。

一般に、これらの場合における膜の下側の平均細孔直径
の膜の表面のそれに対する比（例えば電子顕微鏡フィル
ムで測定できる）は５：１より犬、好ましくは１０：１
より犬、極めて好ましくは３０：１より大である。明ら
かなように、本発明のこのタイプの膜を使用することに
より生成物を膜の表面に塗布する際に細孔の封鎖（ｂｌ
ｏｃｋａｇｅ　）が防止される利点がある。

商業的に入手し得る膜の大部分はこの方法により製造さ
れる。加工した膜に引き続いて試験試薬　−を含潰させ
ることによねこのタイプの膜を検出系に対する担体マト
リックスとして直接用いることが既に提案されている（
米国特許第３．６０７．０９３号）。しかしながら、商
業的に人手し得る担持された膜は実際に行う際の再現性
の要求を満たしていない。これが巨視的に滑らかでない
例えばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエステ
ルからなるウェブ結合された多孔性担体（ｐｏｒｏｕｓ
ｂｏｎｄｅｄ　ｗｅｂ　５ｕｐｐｏｒｔｓ　）上に膜を
位置させる理由である。従って膜層の厚さ、及びかくて
細孔容積は比較的大きくばらつき、これが検出反応にお
ける変動の原因となる。加えて、結合ウェブ担体の多孔
性の液吸収特性の結果、膜の細孔容積ばかりでなく、毛
管力により液体を吸収する多孔性担体も吸収される液量
に影響を与える。

非担持の非対称性膜は従来試験装置の製造に対して使用
されなかったか、または提案されなかった。しかしなが
ら、このものは本発明にはあまり好ましくなく、その理
由はこのものは取扱いが困難であり、且つ保護剤を含浸
させた場合にのみ一般に乾燥させ得るからである。かく
て、試験剤の製造において、・他の操作工程、即ち担体
への付着が必要となる。この目的のために接着剤を用い
ることがでメ瓢　これにより更に複雑になり得る（例え
ば膜の部分的溶解；液体の吸収）。

加工した膜中への検出試薬の配合は米国特許第３、６０
７．０９３号に述べられる系を用いて含浸により行われ
る。一般に有機性及び水溶性試薬の両方を配合しなけれ
ばならないため、有機溶液中での含浸及び水溶液中での
含浸の′両方が必要である。

かくて、適当な有機溶媒に耐える膜に対する制限がある
。加えて、検出試薬を単に含浸させるタイプの系にはブ
リードの傾向がある。

転相法による膜製造の他の方法は可溶性で、容易に蒸発
する溶媒及び難溶性で、高沸点の溶媒の混合物中に重合
体を溶解させることをペースとしている。このタイプの
溶液を拡げてフィルムを生成させ、そして加熱した場合
、可溶性の低沸点溶媒が最初に蒸発し、−芳重合体に対
する難溶性溶媒は蓄積し、そして系を凝固させるように
なる。

次に残留する高沸点溶媒を洗浄する必要がある場合、膜
を液体浴に浸漬することもできるが、該浴は上記の沈殿
浴における凝固に比して、本質的には膜の形成に寄与し
ない。

非対称性の構造物はこの方法では得られない。

加えて、実際には可溶性で低沸点の溶媒が存在する重合
体のみを用いることができ、そしてこのことが重合体の
選択を大きく限定する。かくて現在までの実際において
、アセトンが極めて良好な溶媒である半合成セルロース
誘導体（例えば酢酸セルロース、硝酸セルロース）のみ
がこの方法を用いて膜に処理された。例えば、ドイツ国
特許出願公告′第２３３２．７６０号に使用されたゼラ
チン層上忙位置する酢酸セルロースのフィルター層〔「
プラック（ｂｌｔｔｓｈ）重合体層」〕をアセトン／ト
ルエン溶媒系中で製造した。

ドイツ国特許出願公開（ＤＯ５）第４６ｏ４９７５号に
記載されるように、この方法は単一層検出系の生成にも
既に使用され、その際に試薬は重合体溶液中に配合され
る。かくて、この方法を用いて検出試薬を含む多孔性膜
が直接得られた。この試験素子をドイツ国特許出願公開
第２．６０２．９７５号によりガラス板上に生成させ、
乾燥後にこのものから膜を剥離し、そしてプラスチック
フィルムに接着させる。これにより上記の非担持膜の欠
点が生じる。またガラス板を化学的Ｋが、または物理的
゛に用いる溶媒系と反応する特性を必要とする重合体フ
ィルムに代え、膜を担体フィルムと融合させることによ
り検出系を積層基体上に生成させ得ることがドイツ国特
許出願公開第２，６０２゜９７５号に記載されている。

しかしながら、この方法の可能性は極めて少なく、その
理由は溶媒の組成及び蒸発時間を生成させる膜の所望の
多孔度に従って選択しなければならない。従って、担体
に対する効果は微細な細孔または粗い細孔のいずれを用
いて膜を生成させることが望ましいかに依存してその程
度により異なるであろう。一般に、透明な担体の場合、
光に対する透過性は部分的な溶解によって損なわれ、か
くて担体側からの評価は困難である。

加えて、一般に溶媒により攻撃される重合体フィルムは
ここに記述されるタイプの膜生成の場合に、特に溶媒と
高分子担体との間の接゛触が比較的長時間続く場合に、
膨潤、収縮または変形の如き不可逆的変化を行なう。従
って、この方法は試薬担体に対する要求を満たす担持さ
れた微細孔性重合体フィルムの製造には適していない。

本発明に用いられる凝固法ｒよる微細孔性シート状構造
物の製造の詳細は多数の出版物に示されている。かくて
ドイツ国特許第１，１１０，６０７号において、吸湿性
ポリウレタン溶液（このものに用いる溶媒の例にはジメ
チルホルムアミドがある）を適当ならば循環させ、そし
て１０〜３８℃の乾燥温度計の温度で１５〜１００’ｌ
の相対湿度を有する水を含む雰囲気の作用に曝露させる
ことがポリエーテルをペースとするポリウレタンの凝固
に対して提案されている。溶媒の吸湿性の結果としての
水の吸収のために、ポリウレタンは多分微細孔性構造を
予備生成させながら表面の方向から溶液より析出し始め
る。このように予備ｒル化されたフィルムまたはコーテ
ィングを水中に置く場合、吸湿性溶媒は溶液を凝固させ
てフィルムから完全に除去される。

ドイツ国特許出願公開第１．４４４．１６３号にある程
度改良され゛た方法が示されており：ポリウレタン溶液
をこのものが非溶媒中に浸漬させることにより直接、即
ち湿気のある雰囲気中で予備ダル化させずに凝固させる
前に（シート状に拡げた後で）、最初に少量の非溶媒（
例えば水）を加えることにより初期（１ｎｃｉｐｉｅｎ
ｔ　）相分離の状態、即ち分散体に似たやや曇った状態
に転化させる。

他の方法がドイツ国特許出願公開第１，４４４，１６５
号に示されており、これによれば予備ケ゛ル化せずに非
溶媒及び溶媒の混合物（例えば１０：９０乃至９５：５
間の混合比のジメチルホルムアミド／Ｈ４０）中で間接
的に凝固させることにより重合体溶液を微細孔性フィル
ムに転化させることができる。

ベルギー国特許第６２４．２５０号に記載の他の方法に
よれば、重合体をケ゛ルとして分別するために十分な非
溶媒を重合体溶液に加える。次に基体上に拡げ、そして
非溶媒（水）を用いて凝固させて微細孔性構造物を生じ
させるのはこのダルのみである。

ドイツ国特許出願公告第１．２３８．２０６号に、被覆
された基体を浴中における沸点の近傍、例えば９５℃の
熱水中で加熱された浴中で凝固させた場合、エラストマ
ー溶液の直接凝固により微細孔性構造が生じることが示
されている。

また予備ダル化を昇温下で行う場合に改善された結果が
得られる。かくて、ドイツ国特許出願公開第２，０２５
，６１６号に、ポリウレタン溶液の薄層を６５℃以上の
温度で少なくとも５０係の相対湿度を有する水蒸気の雰
囲気に曝し、次に大量の溶媒を水性凝固浴中で除去し、
次に乾燥することからなる微細孔性のシート状構造物の
製造方法が記載されている。

ドイツ国特許出願公開第２．１２５．９０８号によれば
、１０１乃至１９０℃間の温度で水蒸気を、層中の有機
溶媒の含有量が５０重重量上り少なく減少し、そして層
が固体の、機械的に安定な微細孔性のシート状構造物に
転化するまでポリウレタン溶液の層上に通す。この方法
は殊に微細孔性の最終生成物が短時間に、且つ簡単な工
程段階でポリウレタン溶液から生じる利点を有する。

上記の方法において凝固性を改善する目的である棟の凝
固補助剤を加えることができる。かくてドイツ国特許出
願公告第１．２７０．２７６号、ドイツ国特許出願公開
第１．６９４．１７１号及び同第１゜７６９、２７７号
にはポリウレタンまたはポリウレアの９０〜７０重量部
及び第四級アンモニウム窒素原子０，５〜２０重量係を
含む本質的に直鎖状の高分子量陽イオン性ポリウレタン
１０〜３０Ｍ量部を適当ならば湿った空気中でグル化さ
せた後に水または水及び溶媒の混合物を用いて凝固させ
ることからなる、水蒸気に対して透過性であるシート状
構造物の製造方法が記載されている。陽イオン性ポリウ
レタンに加えて、これらの溶液は追加の凝固調節剤とし
て陰イオン性なめしく　ｔａｎｎｉｎｇ　）剤を含有す
ることもできる。

ドイツ国特許出願公開第２．４２７．２７４号によれば
、多くの場合において、ある種の陽イオン性もしくは陰
イオン性ポリウレタン／尿素懸濁液を単独でか、または
好ましくは同時に陽イオン性及び陰イオン性ポリウレタ
ン（尿素）を塩の状態で含む凝固されるポリウレタン溶
液により更に改善することができる。満足できる微細孔
度のシート状構造物を生成させる方法により、処理し難
いポリウレタン溶液の凝固でさえも制御することができ
る。

上記の印刷物に記載される方法を用いて、実質的にすべ
ての可溶性重合体から微細孔性の膜を生成させることが
でき、その際に適当ならば数回の予備試験後に種々のノ
セラメータ（例えばキャスティング溶液の濃度、温度、
添加物、凝固液の特性）を用いて特定の細孔径を達成さ
せることができる。

更に、本発明の利点はこれらの可能性から生じる。かく
て、意図する検出系に適する高分子膜の組成及び多孔度
を簡単な方法で調整することができる。

殆んどの場合、凝固を水性凝固浴中で直接、即ち特別の
予備処理をせずに行うことが本発明により好ましい。

本発明による検出素子の特性（呈色反応の均−性及び強
さ、ブリード性、検出系の安定性、赤血球のふきとりの
可能性、並びに検出反応の速度）は用いる重合体系のタ
イプに極めて依存する。

機械による簡単な製造、所定の糸田孔容積及び担体の後
方側からの評価の要求を満たすために、本発明により好
適に使用される１重合体キャスティング溶液は、膜が巨
視的に滑らかな不透過性の担体上に直接生成させ得るよ
うなものである。通常の膜（例えば酢酸セルロースまた
はポリスルホン）のキャスティング溶液を滑らかで、不
透過性のフィルムに塗布する場合、凝固中に生成する固
体フィルムは、担体が溶媒により膜と融合する程に十分
な程度に攻撃されない場合に、担体から剥離する。しか
しながら、これにより測定の結果に変動が生じる。この
問題を避けるために、担持された膜の直接的製造におい
ては、キャスティング溶液が担体に対し高度の親和性を
有しているが、このものを攻撃しない、即ちこのものを
溶解しないようにキャスティング溶液及び担体の系を相
互に適合させることが必要である。

好ましいものとして認められた重合体系はそれ自体公知
の方法でその親水性／疎水性バランスに関して改善され
得るものである。これに関して、イオン性基を有する重
合体が殊に有利であり、そ、してこれらのものは適当な
らば重合体混合物中の成分としても用いることができる
。重合体膜の親水（または疎水）特性は例えば呈色反応
の最適化に対して重要であり得る（重合体がイオン性基
を含有する場合、呈色はしばしばより強くなる）。

本発明による検出要素に適するキャスティング照）、ポ
リエーテルカーボネート（例えばドイツ国特許出願公開
第２，２５１，０６６号参照）、例えばドイツ国特許出
願公開第２．４２７．２７４号及びそこに引用される出
版物に記載されるポリアクリロニトリル及びポリウレタ
ンがある。

上記の重合体の溶液を好ましくはイオン性基を有する、
例えばポリビニル化合物、ビニル共重合体、ポリスチレ
ンスルホン酸、ポリアミドまたはポリウレタンからなる
それ自体公知の水性重合体の分散体と混合する際に好適
なキャスティング溶液が得られる。ポリウレタン溶液と
水性ポリウレタン分散体との混合物からなるキャスティ
ング溶液〔例えばＡｎｇｅｌｌ）、　ＭｃＫｒｏｍｏｌ
、　Ｃ’ｈｅｍ、　９８（１９８１）１３３及び既に挙
げたドイツ国特許出願公開第２．４２７．２７４号並び
にそこに引用される出版物参照〕が極めて殊に適してい
る。ポリウレタン分散体は非イオン性であるか、または
好ましくはイオン性であることができ、その際にイオン
性基は例えば−５０，’−、−Ｃ“００−または−Ｎ＋
Ｒ，基であることができる。

イオン性重合体系が殊に好ましく、その理由は担体フィ
ルムに対する良好な接着性及び検出反応に必要な酵素の
固定化を示すからである。イオン性重合体をペースとす
る本発明による検出系は記述すべき程のブリードを起こ
さずに数時間水ですすぐことができる。

キャスティング溶液の調製に用いる溶媒は特殊な重合体
に対して通常のもの、例えばジメチルホルムアミド、Ｎ
−メチルピロリドンまたはジオキソランであり、その際
に適当ならばキャスティング溶液に可溶性である無機塩
、例えばＬｉＣ’ｌ。

Ｃ’　ａ　Ｃ’　ｌ　２またはＭＯ（Ｃ’　ｌ　Ｏ，）
２を増量剤として加えることができる。また更に添加物
としてキャスティング溶液に不溶性であり、そして充て
ん剤として作用する物質、例えば５ｉｎ２、ＴｉＯ２（
ヨーロッパ特許出願箱０．０７７．５０９号参照）、Ｉ
ＪａＳＯ４ＺｎＯもしくはセルロースまたは適当ならば
その上に生物学的活性物質を固定化する寒天粉末を加え
ることができる。

本発明による担持された微細孔性の（ｍｉｃｒｏ−７ｒ
ｏｒｏｕｓ　）検出素子はこのタイプのキャスティング
溶液を適当な担体に均一に被覆しく層の厚さ約５０〜１
００μｍ）、次に好ましくは直ちにこのものを凝固浴に
浸漬し、そこで微細孔性の担持された重合体フィルムを
生じさせることにより製造する。担体がキャスティング
溶液中の溶媒に攻撃されないように担体のコーティング
と凝固との間の時間はできる限り短時間（約数秒間−）
に保持する。適当な凝固液の例には水または適当ならば
可塑剤例えばグリセリンも含有し得る水性緩衝溶鷹があ
る。

細孔構造は凝固浴の性質により簡単に改質することがで
きる。かくて、膜表面上の細孔径は昇温下で水中にて沈
殿させることにより１つのキャスティング溶液のみから
増大させることができ、このことは室温、４５℃及び６
０℃で凝固した微細孔性重合体フィルムのＳＥＮ写真に
より示すことができる。また水と有機溶媒、例えば水／
ジメチルホルムアミドとの混合物を用いることでも同様
の効果が達成できる。

本発明による検出素子に適する担体は原理的には用いる
重合体系がその上で凝固中並びに乾燥後に良好な接着性
を示し、そして重合体キャスティング溶液により何ら変
化しない巨視的に滑らかな重合体フィルムである。担体
の側を通して呈色反応の評価も行い得る透明な重合体フ
ィルムが殊に好ましい。透明なポリエチレンテレフタレ
ートフィルムが極めて殊に好ましい。

検出反応に必要な試薬を種々の方法で、例えはこのもの
をキャスティング溶液中に攪拌導入するか、順次多孔性
フィルムに含浸させるか、またはこれら２つの方法を併
用することにより微細孔性重合体フィルム中に導入する
ことができる。

好適な方法に従って、それ自体公知であるアナライトの
検出用の酵素含有試薬系を本発明により試験装置中に導
入する。

検出試薬を担持した微細孔性重合体フィルムの簡単な製
造方法は例えば用いる色素原（例えば、３　、３’、　
５　、５’−テトラメチルベンジジン）をキャスティン
グ溶液に溶解させ、そしてこのものを凝固法により処理
して色素原担持微細孔性フィルムを生成させ、次にこの
ものに酵素系（適当ならば緩衝化した）を含浸させるこ
とからなる。

また本発明による試験剤は多層系として設計することが
できる。このことは複数の検出試薬を分離させねばなら
ない場合に有利である。例えば、坦体フィルムに、その
上に前記の凝固法を用いて非対称性膜を次に塗布する重
合体層を与えるか、または別々に製造した、非担持の加
工した膜を積層する。

適当ならば、検出試薬の全部または一部を担体と膜の間
に位置する重合体層中に配合することができ、検出試薬
の他の部分はその上に位置する膜中に位置させる。

検出試薬を適当ならば配合し得る適当な高分子中間層（
試薬層）の例にはそれ自体公知であり、且つビニル化合
物、ビニル共重合体、ポリスチレンスルホン酸、ポリア
ミドまたはポリウレタンに属する水性分散体から誘導さ
れるフィルムがある。

試薬含有層は水に好ましくは可溶性であるが、または少
なくとも膨潤可能であるべきであるため、適当ならば水
に可溶性であるが、または水で膨潤可能である重合体、
例えばポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール
、セルロースエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアク
リル酸またはポリビニルピロリドンと混合されるポリウ
レタン分散体が殊に適している。極めて殊に好ましい試
薬層はイオン性ポリウレタン分散イ本とポリビニルピロ
リドンとの混合物から得られる。

過剰の試料をふきとった後、呈色反応を塗布側（膜表面
）からか、または透明な担体を用いた場合は担体側から
観察でき、この場合は過剰の試料をふきとる必要はない
。後者の場合、色素原を膜と透明担体との間の試薬層中
に位置させることが好ましい。

本発明による検出素子は液体試料中の低分子量及び高分
子量成分の定量的測定、殊に体液の成分、例えばビリル
ビン、ケトン、トリグリセリド、尿素まだはヘモグロビ
ンの定量約分光度測定に適している。次の実施例が示す
如く、本発明による検出系は全血中のグルコースの定量
的検出、グルコースオキシダーゼまたはコリンエステラ
ーゼの如き酵素の検、出、及びビリルビンまたはケトン
体の検出に極めて殊に適している。

実施例において、特記せぬ限り示される量は重量部また
は重量部であることが理解される。

実施例　１ グルコースの検出 高速攪拌機（溶解′＠）を用いて、次の組成のキャステ
ィング溶液を調製したニジスルホイミド−ポリアミド８
．０２　ｆｔ’、　（、’ａ（、’１２２．４０　ｆ、
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４３．０２グ、アスコ
ルビン９０．０１グ、クエン酸ナトリウム０．０１　ｒ
、クエン酸ｏ４０ｖ、３　、３′、　５　、５′−テト
ラメチルベンジジン０．４８　Ｆ、二酸化チタン４５．
４０　？、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ、２１ＴＵ／〜）
０．１３，１．グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ。

１１６　ｕ／ｍｇ）　ｏ、　ｉ３ｙ。

このキャスティング溶液を用い、ドクターナイフ（ｄｏ
ｃｔｏｒ　ｋｎｉｆｅ　）を用いてボ５リエチレンテレ
フタレートフイルムを１００μ兜で拡がる厚さで均一に
被覆した。この担持フィルムを３０チ水性グリセリン浴
中で１０分間凝固させた。かくて生成された固体担持膜
を温風（３５℃）で乾燥し、そして全血（ｗｈａｌｅ　
ｂｌｏｏｄ　）を用いてその機能性を試験した。血液を
膜表面に塗布し、そして１分後にふきとった。ふきとり
約３０秒後に膜表面によるワン−ポット（ｏｎｅ　−ｐ
ｏｔ　）反応で生成される次の重縮合体である： す 実施例　２ グルコースの検出 キャスティング溶液：ポリウレタン１３．７３ｆ。

ジメチルホルムアミド６６．３７ｆ、水ｌＤＭＦ中のポ
リウレタン分散体７．２４ｒ、ナトリウムスルホコハク
酸ジオクチル０．０７ｆ、二酸化チタン１１．０１４，
３．３’、５．５’−テトラメチルベンジジン０．７９
Ｆ、アスコルビンｉ０．７９ｆ。

用いたポリウレタンはアジピン酸、７０モル係エチレン
グリコール及び３０−Ｆニル係１，４−ブタンジオール
のポリエステル（＆Ｆ−４ｏ　ｏ　ｏ　）７５部、アジ
ピン酸及び１，４−ブタンジオールのポリエステル（＆
Ｆ＝２，２５０　）　２５部、１゜４−ブタンジオール
２５部、並びにジメチルメタンジイソシアネート８５部
の反応により得られだ熱可塑性物質であった。

ポリウレタン分散体は凝固助剤（ａｉｄ）として作用し
、そして乳化剤を含まぬ、アジピン酸、フタル酸及ヒエ
チレングリコールのポリエステル（ＭＷ＝１．Ｔ　ＯＯ
）　２００部、トルイレンジイソシアネート１５０部、
Ｎ−メチルジェタノールアミン２０部並びに二塩化ｐ−
キシレン６部の反応生成物の陽イオン性分散体である。

担持された、微細孔性の重合体膜を次の変法を用いて実
施例１の通りに製造した： 担体：ポリエチレンテレフタレートフイルム凝固浴ニラ
クリルスルホン酸Ｈａの１％溶液。

乾燥後、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ５，５）中のｐｏｎ　
（２７ｑＵ／ｍｙ）／Ｇｏｎ　（１１ｓｖ／ｍｉの１幅
溶液を１分間フィルムに含浸させ、そして乾燥した。

全血を用いる試験：試料塗布１０秒後に、膜表面上の過
剰の試料をふきとった後と同様に、透明な担体を通して
均一な青色の呈色が観察された。

０．０５．０．１及び０．５％グルコース溶液を用いて
、均一な青色の呈色が直ち忙生成し、そしてこれらのも
のはグルコース濃度の増加に適して呈色（呈色段階）の
強さが増大することを示した。

従って、段階的な反射値を種々のグルコース濃度の反射
率による評価を基に測定した。加えて、この測定により
２０〜８００ｍｇグルコース／ｄｌ水の範囲で呈色はグ
ルコース濃度に直線的に依存し、そして検出反応の終点
は多くとも４０秒後に達成されることが示された。公知
の試験装置と比較して、これは極めて迅速であると考え
ねばならない。

実施例２に述べた試験片系の電子顕微＠（ＳＥＭ）によ
る試験で、膜は高度に多孔性であり、平均細孔径は０．
５μであることが示された。

実施例　２ａ ビリルビンに対する試験片 ＴＭＢ及びアスコルビン酸以外は実施例２と同様のキャ
スティング溶液及び膜の製造。

重合体膜に蒸留水９ｍｌ中のｐ−トルエンスルホ／酸１
．６８　ｆ、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸の二ナ
トリウム塩０．１８　Ｆ、７−（２，３−ジヒドロキシ
グロビル）テオフィリン２．０Ｏｆ、亜硝酸ナトリウム
０．０６　ｒ及びサポニン０．１　Ｏｆを含浸させた。

含浸された膜から生成した試験片に種々の濃度のビリル
ビン対照血清を塗布した後に異なった強さの褐色の呈色
が現われた。

実施例　２ｂ ケトン体（ｋｅｔｏｎｅ　ｂｏｄｉｅｓ　）の試験片Ｔ
ＭＢ及びアスコルビン酸以外は実施例２と同様のキャス
ティング溶液及び膜の製造。

ｐＨ値を９．４に設定した後、重合体膜に蒸留水１１−
中のニトロプルジッドナトリウム２２及び硫酸マグネシ
ウム８，２ｔを含浸させ、そして乾燥した。

カット試験片をアセト酢酸溶液または尿に浸漬した後、
ケトン体の濃度に依存して種々の強さの紫色の呈色が試
験片に現われた。

実施例　３ グルコースの検出 二層系 Ａ）担持された試薬層の製造 水性ポリウレタン分散体８．４Ｏｆ、ポリビニルピロリ
ドン（ＭＦ３５０，０００　）　３．００グ、テトラメ
チルベンジジン０．５７（酢酸エチル１２に溶解）、グ
ルコースオキシダーゼ（１１６Ｕ　／　ｒｎｇ　）及び
ベルオキシダーセ（２７ＴＵ／ｍｇ）　０．１２　Ｆ並
びにアスコルビン酸を一緒に攪拌し、ポリエステルフィ
ルム上に被覆し、そして温風で乾燥して担持された試薬
層を得た。

ポリウレタン分散体はアジピン酸、ヘキサンジオール及
びネオペンチルグリコールのポリエステル（ＭＷ＝１．
ｔ　ｏ　ｏ　）　ｓ　２部、ヘキサメチレンジインシア
ネート１５部、エチレンジアミンエタノールスルホン酸
Ｎａ２部並びにエチレンジアミン１部の反応生成物の４
０％水性分散体であった。

グルコース水溶液を用い、試料塗布約２０秒後に異なっ
たグルコース濃度で段階的に生じた均一な呈色がこれら
の担持された試薬層に現われた（実施例２参照）。

Ｂ）非対称性移相膜の応用 ａ）試薬層中の全検出試薬 実施例２に記載しだテトラメチルベンジジン及ヒアスコ
ルビン酸を含有しない以外は実施例２に記載のキャステ
ィング溶液を実施例３Ａ）に記載の担持された試薬層上
に被覆し、そしてｉ＜ラウリル硫酸Ｎａ水溶液中で凝固
させた。

温風で乾燥した後、グルコース水溶液及び全血を用いて
試験した。試料塗布約３０秒後に均一な濃度依存性の青
色の呈色が担体側から観察された。

ｂ）種々の層中の試薬 担持された、酵素含有層を実施例３Ａ）と同様に水性ポ
リウレタン分散体（実施例３参照）８、４０　ｆ、ポリ
ビニルピロリドン（ＪｆＦａｓｏ、ｏｏｏ）＆０（１’
並びにグルコースオキシダーゼ（１１６Ｕ／〜）及びペ
ルオキシダーゼ（２２７Ｕ／〜）０１２２から製造した
。このものの上に実施例２に記載のキャスティング溶液
を被覆し、１係ラウリル硫酸Ｎａ溶液中で凝固させ、そ
して乾燥した。

全血を用いて試験した際に、試料を塗布し、そして赤血
球をふきとって約４０秒後に均一な青色の呈色が塗布側
から観察した。異なった濃度のグルコース溶液を用いて
段階的な青色の呈色が現われた。

実施例　４ グルコースの検出 試薬層を有する二層系。

実施例３からのポリウレタン分散体ｓ、　ｏ　ｏ　ｒ、
ポリビニルピロリドン（ＭＷｌｏ、０００　）　１．０
０２、酢酸エチル１０２に溶解したテトラメチルベンジ
ジン０．０５ｆ％水２−に溶解したダルコースオキシダ
ーゼ自１６Ｕ／’１９）　０．１０　？、ヘルオ＃シｆ
−セ（２２７Ｕ／ｍ？＞　０．１０　ｆ及ヒ７ス：＋ル
ピン酸の５係水溶液ｏ、ｏｉ−からなる試薬層用のキャ
スティング溶液を一緒に攪拌し、ポリエチレンテレフタ
レート上に被覆し、そして温風で乾燥した（＝担持され
た試薬層）。

次のキャスティング溶液がら移相法により製造したポリ
アミド膜をこの担持された試薬層に塗布した：ポリアミ
ド（ドイツ国特許出願公開第４７４３、．５１５号によ
るヘキサメチレンジアミン及びインフタル酸の重縮合生
成物）　８．１０　？、Ｃ’ａＣ’ｌ。

２．４Ｏｆ’、　ジメチルホルムアミド４３．００　ｆ
及びｒｉｏ、　４６．００　ｙ。

コーティング厚さ：ｌｏｏμ想 凝固浴：３０％グリセリン水溶液 全血を用いる試験：血液の一滴を膜表面に塗布した。試
料の塗布約１０秒後に透明な担体を通して均一な青色の
呈色が観゛ｉ、された。種々の濃度のグルコース溶液を
用いて段階的な青色の呈色が現われた〈実施例２参照）
。

実施例　５ グルコースの検出 試薬層を有する膜 膜に対するキャスティング溶液：ポリスルポン〔ビスフ
ェノールＡ及びビス（クロロフェニルスルホン）の縮合
生成物；ＵｄｅｌＰ１’ｌＯＯ：Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂ
ｉｄｅの商業的生成物〕２０．００　ｙをＮ−メチルピ
ロリジオン８０．０　Ｏｆに溶解すせた。

キャスティング溶液をドクターを用いてガラス板（１０
０μｍ）に塗布し、そして１０優の水性グリセリン浴中
に凝固させるために浸漬した。この間にフィルムをガラ
ス担体から剥離し、そして未担持の、非対称性膜を得た
。

乾燥後、ポリスルホンの後側（担体上に位置したフィル
ムの側）を実施例４に記載の試薬層で被覆した。

全血を用いる試験：血液の一滴を膜表面に塗布した。試
料の塗布約３０秒間後に均一な青色の呈色が試薬層中に
観察された。種々の濃度のグルコース溶液を用いて段階
的な青色の呈色が現われた。

実施例　６ 酵素検出 実施例２に記載の膜に乾燥した後に１％グルコース／Ｐ
ＯＤ　（２７ＴＵ／り）水溶液を含浸させ、そして乾燥
した。

希釈ＧＯＤ溶液（２０Ｕ／ゴ：４０Ｕ／ｍ６：ｓ　ＯＵ
／ｍｌ：　１２　ｏＵ／ｍｌ；　１６　ｏＵ／１ｎｌ）
を用いる試験において、試料の塗布直後にＧＯＤ濃度に
従って段階的に生じる青色の呈色が膜表面上並びに透明
な担体を通して観察された。

実施例　６ａ コリンエステラーゼ用試験片 ＴＭＢ及びソルビン酸以外は実施例２と同様のキャステ
ィング溶液及び膜の製造。

酢酸エチル５−中の酢酸インドキシル４０ｍｇ及びメタ
ノール５−中の塩化２−メトキシ−４−モルホリノベン
ゼンジアゾニウム・ＺｎＣ１，１２０＋１１ｉ７の溶液
、並びに次に再びトリスＨＣ１緩衝液（０，４Ｍ；　ｐ
Ｈ７，５）を膜に含浸させ、そして乾燥し、次に処理し
て試験片を生成させた。

コリンエステラーゼ溶液及び血清を塗布した後、酵素活
性に依存して異なった割合で青色の呈色が試験片に現わ
れた。この呈色は反射測定装置を用いて定量的に評価ア
ゐＬとができた。

特許出願人　／？イニル・アクチェングゼルシャフト 第１頁の続き ＠発明者　ゲオルク・フランク ［相］発明者　ロルフ・ダイン アメリカ合衆国インディアナ用４６５１４エルクハート
・ピーオーボックス　７０ ドイツ連邦共和国デー４１５０クレーフエルトφデスバ
テイネスシユトラーセ　３０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　担体層、微細孔性重合体層、適当ならば他の層及
   び１つまたはそれ以上の層に配合された測定する成分の
   検出用試薬からなる、液体試料中の成分の検出のだめの
   試験装置であって、該微細孔性重合体層が非対称的細孔
   構造を有し且つ凝固法により生成される膜であり、該細
   孔は試料を塗布する側に向って狭くなっており、そして
   該担体層が巨視的に滑らかであり且つ好ましくは試験条
   件下で試料に対して不透過性であることを特徴とする試
   験装置。 ２　微細孔性重合体層が測定する成分の検出用のすべて
   の試薬を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の試験装置。 ３、微細孔性重合体層が巨視的に滑らかな担体層に直接
   に接した位置にあることを特徴とする特許請求の範囲第
   ２項記載の試験装置。 ４、重合体フィルム（試薬層）が担体層及び微細孔性重
   合体層の間に位置し、そして測定する成分の検出用の一
   部または全部の試薬を含有することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の試験装置。 ５、膜の下側の平均細孔直径の膜表面のそれに対する比
   がｌＯ：１より犬であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１〜４項のいずれかに記載の試験装置。 ６　試薬層として作用する重合体フィルムが水に可溶性
   であるか、または水に膨潤性であることを特徴とする特
   許請求の範囲第４項または５項記載の試験装置。 ７、場合によっては重合体分散体を含み、且つ場合によ
   っては不溶性充てん剤を含む、場合によってはジスルフ
   ィド基を持つポリアミド、ポリエーテルカーゴネート、
   ポリアクリロニトリル及びポリウレタンよりなる群から
   の重合体から膜を合成することを特徴とする特許請求の
   範囲第１〜６項のいずれかに記載の試験装置。 ８、特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の試験
   装置を試料と接触させ、その際に試料が・より狭い細孔
   直径を有する表面で膜内に入るように試料を塗布し、そ
   して検出反応が続いて行われることを特徴とする、液体
   試料中の成分の検出用の分析方法。 ９、試料を膜表面に塗布し、そして検出反応を塗布側か
   ら観察することを特徴とする特許請求の範囲第８項記載
   の方法。 １０、透明な支持層を有する試験装置を用い、そして検
   出反応を担体側から観察することを特徴とする特許請求
   の範囲第８項記載の方法。