JPH05296999A

JPH05296999A - グルココルチコイドの効果判定マーカーとしてのヒトリポコルチンｉ及びその定量法

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Publication number: JPH05296999A
Application number: JP13157892A
Authority: JP
Inventors: Taiji Kato; 泰治加藤; Kenji Kamimura; 憲司上村; Shigeki Kimura; 茂樹木村; Kuniyoshi Matsunaga; 國義松永
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 1993-11-12

Abstract

(57)【要約】【目的】グルココルチコイドの効果判定マーカーとして
のヒトリポコルチンＩ及び該ヒトリポコルチンＩを定量
する方法に関する。【構成】体液中のヒトリポコルチンＩを免疫学的方法に
より測定し、その濃度変化を確認し、グルココルチコイ
ドの効果判定マーカーとしてのヒトリポコルチンＩ及び
免疫学的測定によるヒトリポコルチンＩの定量方法に関
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グルココルチコイドの
効果判定マーカーとしてのヒトリポコルチンＩ及び該ヒ
トリポコルチンＩを定量する方法に関する。より詳細に
は、血漿又は血清中のヒトリポコルチンＩを定量し、対
照水準と比較し、濃度変化を確認し、グルココルチコイ
ドの効果判定マーカーとしてのヒトリポコルチンＩ及び
免疫学的測定によるヒトリポコルチンＩの定量方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】グルココルチコイドは副腎皮質ステロイ
ドホルモンであり、その薬理作用としては抗炎症作用、
細胞増殖抑制作用、タンパク同化抑制作用が知られてい
る。とりわけ抗炎症作用は強く、その作用機作はプロス
タグランディンやロイコトリエン等の起炎物質の合成阻
害であり、アラキドン酸カスケードの最初の段階でリン
脂質からアラキドン酸を遊離するホスホリパーゼＡ₂を
阻害する蛋白がグルココルチコイドによって誘導される
ことによると考えられている。

【０００３】この誘導される蛋白はマクロコルチン、リ
ポモジュリン或いはレノコルチンと呼ばれたが、これら
が免疫学的に分離できない点などから共通の前駆体から
由来するものと考えられ、その名称はリポコルチンに統
一された〔（代謝、24巻、３号(1987)〕。

【０００４】そのリポコルチンとしては、最近では塩基
配列レベルでリポコルチンＩやリポコルチンＩＩが知ら
れ、更にリポコルチンＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩが報告
されている。

【０００５】リポコルチンの生物学的作用としては、炎
症、免疫、凝固、細胞増殖・分化に及ぼす作用等、多く
の報告がある。しかし、細胞内での研究が主であり、細
胞外、特に血液中での動態についての報告はされていな
い。

【０００６】また、リポコルチンの定量法はこれまでに
数々報告されている〔バイオケミカルアンドバイオ
フィジカルリサーチコミュニケーションズ（Bioche
m. Biophys. Res. Commun.）１０９巻、２２３頁（１９
８２）、バイオケミカルソサイアティトランザクシ
ョンズ（Biochem. Soc. Trans.）１８巻、１２３０
（１９９０）及びジャーナルオブイムノロジカル
メソッド（J. Immunol.Meth.）１３１巻、１１９頁（１
９９０）〕。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
各測定は、それぞれラット腹腔液やマクロファージ培養
液、ラットの脳下垂体や視床下部組織中及びヒト単球中
のリポコルチンを測定しているのみであり、ヒト血清又
は血漿中のヒトリポコルチン濃度を定量した報告はなさ
れていない。

【０００８】更に、グルココルチコイドの投与によって
誘導されるリポコルチンを血清又は血漿中で測定し、グ
ルココルチコイドの薬理効果と血清又は血漿中での濃度
との関連を見い出した報告はない。

【０００９】グルココルチコイドによる抗炎症作用は、
そのメカニズムにおいてホスホリパーゼＡ₂の阻害作用
がグルココルチコイドの投与により血液中に誘導され、
増加したリポコルチンにより行われると考えられている
ことから、グルココルチコイドによる抗炎症の効果は誘
導されたリポコルチン量に反映されるものと考えられ
る。従って、グルココルチコイド投与後の血液中のリポ
コルチン濃度を測定することによって、投与された患者
におけるグルココルチコイドの効果判定の指標になるも
のと考えられる。

【００１０】発明者らは、ヒトリポコルチンＩをヒト胎
盤より精製し、ヒトリポコルチンＩに対する特異抗体を
作製し、得られた抗体と精製ヒトリポコルチンＩを用い
た免疫測定法の開発により、正確に血清又は血漿中のヒ
トリポコルチンＩ濃度を測定できることを可能にした。

【００１１】更にグルココルチコイド投与患者の血中の
ヒトリポコルチンＩ濃度を測定することにより、グルコ
コルチコイドにより誘導された血中ヒトリポコルチンＩ
量の増加を確認し、グルココルチコイドの効果判定の指
標としてのヒトリポコルチンＩの有用性を見い出し、本
発明を完成した。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は血漿又は血清中
のグルココルチコイドの効果判定マーカーとしてのヒト
リポコルチンＩを検定することにより、グルココルチコ
イドの薬理効果を判定する方法を提供するものである。

【００１３】即ちヒトリポコルチンＩをグルココルチコ
イドの効果判定マーカーとして定量することにより、診
断において投与されたグルココルチコイドの効果判定或
いは患者毎による最適投与量の設定をすることが可能で
ある。

【００１４】本発明の効果判定の対象薬剤としてのグル
ココルチコイドとしては、その作用機作としてフォスフ
ォリパーゼＡ₂阻害作用を有するヒトリポコルチンを誘
導する作用を有する薬剤であるが、具体的には例えば、
コルチゾール（Cortisol）、コルチゾン（Cortison
e）、デキサメサゾン（Dexamethasone）、コルチコステ
ロン（Corticosterone）等が挙げられる。

【００１５】更に本発明は上記に述べたヒトリポコルチ
ンＩの定量法も提供する。例えば、好適な定量法である
ヒトリポコルチンＩに対する特異的抗体を用いる免疫測
定法に関し、その一例を詳細に説明する。

【００１６】ヒトリポコルチンＩは例えば、ヒト胎盤よ
り公知の方法に従って調製できる〔ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）264
巻、６９４８頁（１９８９）〕。

【００１７】調製されたヒトリポコルチンＩを用い、ヒ
トリポコルチンＩ抗体を得ることができる。即ち、ヒト
リポコルチンＩをそのまま若しくは適当なアジュバンド
と混合して動物の皮内、腹腔内などに注射する。この操
作を１〜２週間隔で繰り返して免疫する。免疫した動物
の細胞を骨髄腫細胞と細胞融合しヒトリポコルチンＩ抗
体を産生するハイブリドーマを得ることができる。得ら
れたハイブリドーマの培養液によりモノクローナル抗体
を得ることができる。ポリクローナル抗体は上記と同様
に動物にヒトリポコルチンＩを免疫後、抗体産生の確認
された動物の血清中より得ることができる。

【００１８】使用する抗体は調製したイムノグロブリン
分画そのものでも使用できるが、更にヒトリポコルチン
Ｉとの結合部位のみを分離した F(ab')₂, Fab', Fab な
どの分画として使用することもできる。

【００１９】一方、高度に精製したヒトリポコルチンＩ
又は抗ヒトリポコルチンＩ抗体を用いて、検出可能な標
識物質と結合させた標識ヒトリポコルチンＩ又は抗ヒト
リポコルチンＩ抗体を作成する。検出可能な標識物質と
しては、その検出感度がヒトリポコルチンＩの定量法に
必要とされる検出感度に充分なものを選択する必要があ
る。具体的には各種放射性同位元素、各種酵素、蛍光物
質、金属イオンなどがあり、更に好ましくは ¹²⁵Ｉ、
¹³¹Ｉ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、フルオレセイン、メチ
ルウンベリフェロン、マグネシウムなどがあげられる。

【００２０】これら検出可能な物質とヒトリポコルチン
Ｉ又は抗ヒトリポコルチンＩ抗体との結合は、既知の方
法が用いられる。例えば、放射性同位元素を用いる場合
にはクロラミンＴ、ヨードゲン（ピアス社製・登録商
標）などの試薬が用いられ、酵素の場合には二官能性試
薬によるカップリング法、過沃素酸酸化法などが応用で
きる。

【００２１】このようにして得られた標識ヒトリポコル
チンＩ又は抗ヒトリポコルチンＩ抗体中には、本来目的
とする標識ヒトリポコルチンＩ又は標識抗ヒトリポコル
チンＩ抗体の他に、検出可能な物質とヒトリポコルチン
Ｉとの結合数の異なるもの、検出可能な物質がヒトリポ
コルチンＩ又は抗ヒトリポコルチンＩ抗体への結合操作
中に一部変化し本来の活性を失ったもの、結合反応に関
与しなかった検出可能な物質そのもの、あるいは検出可
能な物質がヒトリポコルチンＩ又は抗ヒトリポコルチン
Ｉ抗体に結合しなかったヒトリポコルチンＩ又は抗ヒト
リポコルチンＩ抗体そのものなどが混入していることが
ある。そこで定量の感度を上げるためには目的とする標
識ヒトリポコルチンＩ又は標識抗ヒトリポコルチンＩ抗
体のみを上記の混合物から分離することが好ましい。こ
のための方法としてはイオン交換クロマトグラフィー、
ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィーなどが利用できる。

【００２２】上記以外にヒトリポコルチンＩの定量に必
要な試薬としては、抗体を直接結合させた水不溶性担体
がある。更に水不溶性担体に不溶化させる抗体に結合す
る因子があり、抗体はイムノグロブリンであるから結合
する因子としては抗イムノグロブリン抗体、即ち第二抗
体を用いることができる。その他イムノグロブリン結合
蛋白質である微生物由来のプロテインＡ、プロテインＧ
なども用いることができる。これら結合する因子は抗体
の結合量を上げるためにアフィニティークロマトグラフ
ィー等の手段により高度に精製しておくことが好まし
い。結合する因子を不溶化するための水不溶性担体とし
ては、各種の多糖ゲル、ポリスチレンなどの合成樹脂で
作られた粒子、ビーズ、試験管、その他の小容器、同様
の形態のガラス、金属などの他、ニトロセルロース、ナ
イロンなどの合成薄膜などが適している。

【００２３】これら水不溶性担体への結合する因子の不
溶化法としては、物理的吸着、共有結合などの化学的結
合が利用できる。例えば物理的吸着法では、一定濃度の
結合する因子の溶液にポリスチレンビーズ等を入れ、一
定時間放置することによりポリスチレンビーズ等に結合
する因子を物理的に不溶化することができる。この際、
不溶化に際して結合する因子の溶液を絶えず動かすこと
により水不溶性担体表面に結合する因子を均一に不溶化
することができる。又、結合する因子の溶液を15〜40℃
に保つことにより短時間に不溶化することができる。化
学的結合法では、各種カップリング用試薬、例えば臭化
シアン、グルタルアルデヒド、過沃素酸ナトリウム、カ
ルボジイミド誘導体、シラン剤、マレイミド誘導体、サ
クシニイミドエステル、オキシラン化合物、トシルクロ
ライド、カルボニルイミダゾール等々が用いられる。

【００２４】このようにして調製された水不溶性担体に
不溶化された該抗体に結合する因子は、ヒトリポコルチ
ンＩの定量に際してそのまま用いるのは好ましくない。
即ち、そのまま用いた場合、水不溶性担体の表面、ある
いは結合する因子の不溶化のために利用された化学的に
活性な反応基が定量に際して反応液成分を非特異的に吸
着結合し測定感度の悪化をもたらすのである。これを防
止するためには、結合する因子を不溶化した後の水不溶
性担体の表面を処理することが好ましい。この処理法と
しては、結合する因子を不溶化した後の水不溶性担体を
十分に洗浄した後、水不溶性担体の表面を不活性化する
方法が好ましい。水不溶性担体の表面を不活性化するた
めには、アルブミン、ゼラチン、その他の蛋白を１種以
上含む溶液、各種アミノ酸、その他のアミノ基を持つ化
合物の溶液、還元剤、酸化剤などが各々単独もしくは組
み合わせて用いることができる。

【００２５】このようにして調製された試薬を用いてヒ
トリポコルチンＩを定量する。まず、血清又は血漿の一
定量と抗体を結合させた水不溶化担体と緩衝液の一定量
を反応させる。この時の全反応液量は50〜1000μlが好
ましい。緩衝液としてはアルブミン、ゼラチンなどの一
種以上の蛋白質を0.01〜１％含むpH４〜pH8.5の緩衝液
が好ましく、反応温度は２℃〜40℃が好ましい。

【００２６】反応時間は測定感度に影響する重要な因子
であり、操作性も考慮すると10分〜４日が好ましい。次
いでこの反応液に検出可能な物質で標識されたヒトリポ
コルチンＩ又は抗ヒトリポコルチン抗体を加え、更に反
応を行う。反応温度及び時間は上と同じく２℃〜40℃、
10分〜４日が好ましい。

【００２７】反応後、水不溶性担体を水又は適当な緩衝
液で洗浄し、水不溶性担体に結合した検出可能な物質を
測定する。上記操作を既知濃度のヒトリポコルチンＩを
含む標準液についても行い、標準液の測定値と生体体液
の測定値を比較することにより血漿又は血清のヒトリポ
コルチンＩの濃度を定量することができる。

【００２８】上記以外の公知の免疫学的測定方法を利用
してヒトリポコルチンＩを定量することも、もちろん可
能である。

【００２９】このようにして定量した生体体液中のヒト
リポコルチンＩ量はヒトにおけるグルココルチコイドの
薬理効果の判定指標又は最適投与量の設定指標として使
用することができる。そのためには臨床的に確立したグ
ルココルチコイドの投与を必要とする患者から採取され
た血清又は血漿試料を本発明の方法で定量し、これらの
測定で得られるヒトリポコルチンＩ濃度を調べる事が必
要である。本発明者らは、グルココルチコイドを投与さ
れた患者の血清又は血漿中のヒトリポコルチンＩの濃度
を測定すると、投与されたグルココルチコイドによって
ヒトリポコルチンＩの濃度が変動することが見いだし
た。従って、グルココルチコイド投与前と投与後の血清
又は血漿中のヒトリポコルチンＩ濃度の比較によりグル
ココルチコイドの効果の判定或いは個々の患者について
の最適投与量の設定を行う判断資料とすることが可能で
ある。

【００３０】さらに、このような検定を行うことによっ
て、グルココルチコイドによるの治療の有効性などの判
断資料とすることが可能であり、副作用の強いステロイ
ド薬剤であるグルココルチコイドの各々の患者に対して
の最適投与量の設定を行うことが可能である。

【００３１】以下、本発明の実施例について更に詳細に
説明する。尚、本発明はこれらに限定されるものではな
い。また、本実施例で用いた抗原及び抗体は以下のよう
にして調製した。

【００３２】抗原ヒトリポコルチンＩはヒト胎盤よ
り〔ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー
（J. Biol. Chem.）264巻、６９４８頁（１９８９）〕
に従って、調製・精製した。

【００３３】抗体ポリクローナル抗体としては、ま
ずヒト胎盤由来リポコルチンＩをウサギの皮下に0.5mg
／headずつ週１回、３週間投与し、最終投与３週間後よ
り毎週耳静脈より採取し、抗血清を得た。

【００３４】次に得られた抗血清を50％飽和硫安塩析，
DEAE−celluloseによるイオン交換クロマトグラフィ
ー、更にCNBr−活性化Sepharose4B（ファルマシア製）
に抗原を結合させたアフィニティーカラムによるクロマ
トグラフィーで精製したものを使用した。

【００３５】モノクローナル抗体としては、ヒト胎盤細
胞由来リポコルチンＩを免疫したマウスから取り出した
脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合して得られたハ
イブリドーマ4E4の培養液を45％を飽和硫安塩析、抗原
結合アフィニティーカラムを用いたクロマトグラフィー
により精製したものを使用した。

【００３６】

【実施例】

実施例１（１）抗体結合固相の作製ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体をpH7.0
のリン酸緩衝液に溶解し、固相としてのポリスチレンビ
ーズを浸漬することにより、その表面に結合させた。

【００３７】（２）各種標識物結合抗体及び標識物結合
ヒトリポコルチンＩの作製抗体又はヒトリポコルチンＩへの標識酵素としては酵素
免疫測定法で一般的に使用されているパーオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ又はアルカリフォスファ
ターゼで標識した。

【００３８】抗体は、IgG，IgGをペプシン処理すること
により得られるF(ab')₂、更にF(ab')₂を還元剤により還
元することにより得られるFab'、IgGをパパイン処理す
ることにより得られるFabを使用した。

【００３９】放射能ラベルの場合は、¹²⁵Ｉをクロラミ
ンＴを用いた方法により抗体又はヒトリポコルチンＩに
標識した。

【００４０】（３）標識酵素活性測定法酵素活性を発色法、蛍光法、発光法につき測定した。用
いた標識酵素及び基質を表１に示した。

【００４１】

【表１】

【００４２】尚、表中でAMPGDは3-(4-Methoxyspiro[1,2
-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.^3,7]decan]-4-yl)phe
nyl-β-glactopyranosideを示し、AMPPDは3-(4-Methoxy
spiro[1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.^3,7]decan]
-4-yl)phenyl-phosphateを示す。

【００４３】（４）免疫測定法免疫測定法はサンドイッチ法と競合法を実施した。サンドイッチ法検体10μｌに抗体結合ポリスチレンビーズ（直径6.5m
m）１ケ、10mMリン酸ナトリウム緩衝液0.5ml（0.1％ B
SA、0.5％ゼラチン、１mM MgCl₂、１％ NaN₃、0.3M
NaCl）を加え、37℃で３時間反応させた。反応終了後、
ビーズを洗浄し、各種標識抗体溶液0.5mlを加え、４℃
で一夜反応させた。

【００４４】反応終了後、ビーズを洗浄し、ビーズ上に
結合した標識物を測定した。酵素活性は37℃で測定し、
発色法は60分、蛍光法は30分、発光法は30秒で測定し
た。放射能は放射活性をシンチレーションカウンターを
用いて測定した。

【００４５】競合法検体10μｌに抗体結合ポリスチレンビーズ（直径6.5m
m）１ケ、各種標識物で標識したヒトリポコルチンＩを
溶解した10mMリン酸ナトリウム緩衝液（0.1％ BSA、0.
5％ゼラチン、１mM MgCl₂、１％ NaN₃、0.3M NaCl）
0.5mlを37℃で３時間反応させた。反応終了後、ビーズ
を洗浄し、ビーズ上に結合した標識物を測定した。酵素
活性は37℃で測定し発色法は60分、蛍光法は30分、発光
法は30秒で測定した。放射能は放射活性をシンチレーシ
ョンカウンターを用いて測定した。

【００４６】（５）標準ヒトリポコルチンＩの測定標準ヒトリポコルチンＩ溶液10μｌにウサギ抗ヒトリポ
コルチンＩポリクローナル抗体F(ab')₂を結合させた直
径6.5mmポリスチレンビーズ１ケ、10mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.0、0.1% BSA、0.5％ゼラチン、0.1M N
aCl）0.5mlを加え、37℃で３時間反応させた。

【００４７】反応終了後、ビーズを洗浄し、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼで標識したマウス抗ヒトリポコルチンＩ
モノクローナル抗体F(ab')₂溶液0.5mlを加えて、４℃、
一夜反応させた。反応後、基質として発色基質はクロロ
フェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液0.
5mlを加え、蛍光基質は４−メチルウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液0.5mlを加えて、それ
ぞれ37℃、１時間及び30分の酵素反応を行い、酵素反応
停止液として発色法は１％ガラクトース溶液２ml、蛍光
法は0.1Mグリシン−NaOH緩衝液（pH10.3）２mlを加えて
酵素反応を停止した。発色法は575nmで吸光度を、蛍光
法は励起波長390nm、測定波長460nmで蛍光強度を測定し
た。標準ヒトリポコルチンＩの測定結果を図１に示し
た。発色法の測定感度は、10ng／Tube、蛍光法は１ng／
Tubeであった。

【００４８】実施例２血清中のヒトリポコルチンＩ量の定量グルココルチコイド投与中の患者の血清中のヒトリポコ
ルチンＩ量を定量した。測定系での血清使用量は10μｌ
で実施例１の（５）と同じ方法で測定し、酵素活性は蛍
光法により測定し、それぞれの検体の蛍光強度を標準線
の蛍光強度から読み取り、ヒトリポコルチンＩ量として
求めた。

【００４９】グルココルチコイド投与後のネフローゼ症
候群患者の血清中においてヒトリポコルチンＩ量の増加
が認められた。その結果を図２に示す。

【００５０】実施例３グルココルチコイド投与の患者の血清中のヒトリポコル
チンＩ量を定量した。測定系での血清使用量は10μｌで
実施例１の（５）と同じ方法で測定し、酵素活性は発色
法により測定し、それぞれの検体の吸光度を標準線の吸
光度から読み取り、ヒトリポコルチンＩ量として求め
た。

【００５１】グルココルチコイド投与患者（患者Ａ〜患
者Ｊ）の血清中においてヒトリポコルチンＩ量の増加が
認められた。その結果を表２に示す。

【００５２】

【表２】

【００５３】

【発明の効果】本発明により、ヒトリポコルチンＩを精
度良く定量することが可能となり、定量された血漿又は
血清のヒトリポコルチンＩ量の変化により投与されたグ
ルココルチコイドの効果判定が可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】標準ヒトリポコルチンＩの検量線を示すもので
あり、図中で黒丸は蛍光法、白丸は発色法の結果を示
す。

【図２】ネフローゼ症候群患者に対するグルココルチコ
イド投与後の血漿中ヒトリポコルチンＩ量の変化を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者松永國義愛知県西春日井郡西春町大字九之坪西城屋敷51 天野製薬株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト血漿又は血清中のヒトリポコルチンＩ
を生体外でグルココルチコイドの効果判定マーカーとし
て定量する方法。
【請求項２】ヒトリポコルチンＩを含む血漿又は血清試
料を、ヒトリポコルチンＩ特異的抗体との交差反応を利
用し、該ヒトリポコルチンＩを生体外で免疫学的に定量
することを特徴とするヒトリポコルチンＩの定量法。
【請求項３】ヒトリポコルチンＩが薬剤により誘導され
たものである請求項２記載の定量法。
【請求項４】対照水準よりグルココルチコイドの投与に
より濃度が変動するヒトリポコルチンＩの存在がグルコ
コルチコイドの薬理効果判定の診断的指示である請求項
２記載の定量法。