JPH0666807A - タンパク質の糖化割合の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 タンパク質の総量を別途に測定する必要がな
く、汎用的、安価、簡便で、且つ再現性、検量線直線性
などの優れたタンパク質の糖化割合を測定する方法を提
供する。 【構成】 非糖化ヒトヘモグロビンと非酵素的糖化ヒト
ヘモグロビンを４ｇ／ｄｌ水溶液とし、混合して、糖化
ヒトヘモグロビンの割合が１２，２５，３５％である試
料を調製し、各試料をマイクロプレート（固相）の穴に
分注し、ヒトヘモグロビンを物理吸着させる。生理食塩
水で洗浄後、１％牛血製アルブミン水溶液を分注し、牛
血製アルブミンを物理吸着させ、生理食塩水にて洗浄
し、ペルオキシダーゼ標識フェニルボロン酸誘導体溶液
を添加し、反応後洗浄し、ο- フェニレンジアミン溶液
を添加し、反応後、硫酸で反応を停止し、測定波長４９
２ｎｍの吸光度を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質の糖化割合
の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖尿病晩期に発生する合併症は、患者の
予後を決定的に左右するので、その進展の予防は糖尿病
治療上もっとも重要な課題である。

【０００３】糖尿病患者血液中のタンパク質が非酵素的
糖化を受け、健常人と比較して血中非酵素的糖化タンパ
ク質量が増加すると報告され、非酵素的糖化タンパク質
と疾病との関係が詳細に研究されている。（Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.,67,103,(1975),J.Biol.Chem., 254,
702(1979), Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,2393(1982),D
iabetes,31,283(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,291
8(1978), J.Clinical Pahtology,37,841(1984),Annals
of Clinical Biochemistry,21,2(1984) ）。

【０００４】血糖コントロールの指標としては、現時点
での糖代謝状態を反映する空腹時血糖と共に、過去１〜
２ヶ月間の血糖値状態と良好な相関性を示す非酵素的糖
化ヘモグロビンが臨床的に有用であるとして、糖尿病患
者治療の指標として広く採用されている。しかし、空腹
時血糖は日内変動が激しいこと、非酵素的糖化ヘモグロ
ビンは治療の効果が確認されるのに長期間を要するなど
の問題点がある。

【０００５】また、治療効果をより早く知る目的とし
て、過去１〜２週間の血糖状態を反映する血中非酵素的
糖化タンパク質の還元能力であるフルクトサミンが測定
され、糖尿病治療に活用されているが、共存物質、たと
えば、ビリルビンやL-アスコルビン酸などの還元性物質
の影響が問題として残されている（臨床検査 機器・試
薬、第13巻、１号、第87頁(1990)）。また、同様に短期
間の血糖コントロールの指標として、非酵素的糖化アル
ブミンが注目され、その簡便な測定法開発の研究が盛ん
に行われている。

【０００６】さらに、非酵素的糖化タンパク質には、シ
ッフ塩基型（不安定型）とシッフ塩基がアマドリ転移し
て安定化したアマドリ転移物（安定型）があり（臨床検
査第３３巻、８号、第８９３頁（１９８９））、短期間
の血糖値変化に影響を受けず、過去の一定期間の血糖値
状態を良く反映するアマドリ転移物のみを測定すること
も重要になりつつある。

【０００７】従来の糖化タンパク質の測定法としては、
等電点分画電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィ
ー法、分光測定法、比色定量法などに加え、ＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフィー）法、ミニカラム法、ア
フィニティ−クロマトグラフィー法などが挙げられ（ D
iabetologia,31,627-631(1988), 検査と技術、第14巻、
11号、第1155頁(1986)参照）、試料（被検液）中の糖化
タンパク質量測定のために広く臨床に用いられている。

【０００８】しかし、これらの方法は、測定感度、操作
性、検体処理時間などの点を同時に満足する方法とは言
いがたく、実用上改善されなければならない点を有して
いる。

【０００９】よって、共存物質の影響を受けず、簡便な
操作で、短時間にて多検体測定できる方法の確立が要望
されていた。これらの問題点を解決する方法として、免
疫学的測定法の応用が考えられ、糖化タンパク質の糖化
部位の一つであるグリシトールリジン残基に特異的な抗
血清やモノクローナル抗体を取得し、放射免疫測定法
（ＲＩＡ）により糖化タンパク質の測定が可能であるこ
とが報告されている（ J.Clin.Invest.,72,1427(198
3)、臨床病理 第33巻補冊(1985) 第226 頁、糖尿病
第29巻 第581 頁(1986)、Clinica.Chimica.Acta.,153,
293(1986) 、糖尿病 第28巻 第695 頁(1985)参照）。

【００１０】上述の免疫学的測定法は、いずれも糖化タ
ンパク質のアマドリ転移物に対する抗還元型糖化タンパ
ク質抗体を使用しており、糖化タンパク質測定法として
は優れた方法であるが、タンパク質量の測定を別途行う
必要があること、還元反応前に糖とタンパク質を分離す
る前処理が必要となるなどの問題点がある（糖尿病、第
34巻補冊、第96頁（1986年）参照）。

【００１１】温度、ｐＨまたはイオン強度の変動に影響
を受けにくいフェニルボロン酸のアフィニティークロマ
トグラフィー法は、糖化タンパク質の分離法として優れ
た方法であり、アミコン・コーポレーションやピアス・
ケミカル・カンパニーなどが樹脂担体に固定化したフェ
ニルボロン酸を含む臨床使用のためのキットを開発して
いる（英国特許出願公開第2,024,829 号 および米国特
許第4,269,605 号）。しかしながら、これらの方法も試
料量が比較的多く必要であること、タンパク質量測定操
作を別に行う必要がある等の点で簡易性に問題がある。

【００１２】また、固相化したフェニルボロン酸により
糖化タンパク質を分離し、特定のタンパク質に特異的親
和性を有する標識化抗体を用いる方法（特開62-100660
号）が報告されているが、糖化タンパク質の各種類の比
率の変化に影響を受ける点、糖化割合を知るのにタンパ
ク質量を別途測定する必要がある点など実用上の問題が
残されている。

【００１３】これらの問題点を解決する方法として、特
開64-16964号公報には、固相化した抗体によりタンパク
質を分離し、グリシトールリジン、グリシトールバリン
残基などの還元型の糖化部分を特異的に認識するモノク
ローナル抗体にて特定糖化タンパク質量、または特定タ
ンパク質の糖化割合を測定する方法が報告されている。
この方法は、特定タンパク質の総量を測定することなく
糖化割合が測定される点で優れた方法であるが、再現性
や検量線直線性が乏しいこと、認識糖化部位が糖化部位
の一部にすぎないこと、測定時間が５時間以上を要する
ことなどの問題点を有している。

【００１４】抗体を用いる方法は、特定タンパク質を捕
捉するには非常に優れた手段であり、その糖化割合を測
定することにより、糖尿病の病態把握に貴重な情報を提
供すると考えられるが、抗体は通常極めて高価であるこ
とと、特定タンパク質に対する抗体が入手困難な場合も
考えられる。更に、血清タンパク質の平均的な糖化程度
を示すフルクトサミンが臨床応用され、有用な情報を提
供していることを考慮すると、血清タンパク質の平均的
な糖化程度を、共存物質の影響を受けずに簡便に測定す
ることも重要であると言える。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明では、これら従
来法の欠点を解決し、タンパク質の固定に抗体を必要と
せず、別途タンパク質総量などの測定も必要とせず、簡
便で短時間に測定可能で、且つ再現性、検量線直線性な
どの優れたタンパク質の糖化割合を測定する方法を提供
することを目的とする。

【００１６】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
本発明のタンパク質の糖化割合の測定方法は、試料溶液
を固相と接触させ、試料中のタンパク質の一定量を固相
に固定化した後、試料溶液と固相を分離し、タンパク質
の糖化部位に反応性を有する標識化されたジヒドロキシ
ボリル基を含有するボロン酸誘導体の溶液を該固相と接
触させることにより、該固相に固定化されたタンパク質
の糖化部位に標識物を結合させ、次いでこの反応混合物
の固相と液相を分離し、分離された固相または液相の標
識物量を測定することを特徴とする。

【００１７】また、前記測定方法においては、タンパク
質の一定量を固相に固定化する方法が、物理吸着法、共
有結合法、イオン結合法から選ばれた１つ、またはこれ
らの併用であることが好ましい。

【００１８】また、前記測定方法においては、試料が採
取された尿、血液、血漿、血清および血球から選ばれた
１種であることが好ましい。更に、前記測定方法におい
ては、標識化されたボロン酸誘導体が、放射性同位元
素、酵素、補酵素、蛍光色素、化学発光物質または特異
結合タンパク質のいずれかで標識化されたボロン酸誘導
体であることが好ましい。

【００１９】本発明者等は、タンパク質の糖化割合を簡
便に測定すべく鋭意研究を重ねた結果、まず、試料溶液
と固相を接触させることにより、一定量のタンパク質を
物理吸着等にて固相に固定化した後、液相と固相を分離
し、固相に捕らえられたタンパク質の糖化部位に存在す
るシス・ジオール基と親和性を有する標識化されたボロ
ン酸誘導体を反応させることにより、糖化部位に標識物
を結合させ、固相に結合したあるいは結合しなかった標
識物量を測定することによって試料中のタンパク質の糖
化割合を測定できることを見い出し、前記本発明に到達
したものである。

【００２０】本発明によれば、ボロン酸誘導体が糖化タ
ンパク質のうち主にアマドリ転移物（安定型）を捕らえ
るため、試料の前処理によるシッフ塩基型（不安定型）
糖化物の除去を必要としない点に於いても、操作が簡略
化されるメリットを有する（Clin.Chem.,28,10,2088-20
94(1982)）。

【００２１】以上のように、本発明では、試料の中から
タンパク質（具体的には血清タンパク質、ヘモグロビン
など）を分離するため、タンパク質の一定量を物理吸着
等にて固相に固定化し、次に、糖化したタンパク質を測
定するために標識化されたボロン酸誘導体（ボロン酸誘
導体に放射性同位元素や酵素などの標識物を付けたも
の）を用いている。このため、抗体を用いることなし
に、安価に試料中のアマドリ転移物（糖化タンパク質の
シッフ塩基型糖化物がアマドリ転移により安定型となっ
たもの）を測定できる。また、使用する固相の材質、形
状、大きさ、量を一定とすることにより、試料から一定
量のタンパク質が固相に固定化されるので、別途にタン
パク質定量を行う必要が無い。さらに、試料溶液からタ
ンパク質を分離するので、測定の際に共存物質の影響を
受けない。加えて、固相へのタンパク質固定を物理吸着
等にて行うため、あらゆるタンパク質が固定可能であ
り、タンパク質混合試料の平均的な糖化割合の測定も可
能である。さらにまた、タンパク質に対するそれぞれ固
有の抗体を用意する必要がないので、どの様なタンパク
質に対しても本発明の方法を汎用的に適用できる。

【００２２】以下、本発明について詳細に述べるが、下
記に挙げる物質および物質群に限定されるものではな
い。固相の担体形状としては、ビーズ状、テストプレー
ト状、チューブ状、ディスク状、球状、スティック状、
ラテックス状などが例示できる。また、その材質として
は、通常のＥＩＡ（酵素免疫測定法）用担体として用い
られるもの、たとえば、ガラス、多糖類（セルロース、
デキストラン、デンプン、デキストリン）またはその誘
導体、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物、
各種合成樹脂（たとえばプロピレン、塩化ビニル、酢酸
ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリル酸、アクリル酸
エステル、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、スチ
レン、メチルスチレン、ブタジエン、イソプレン、アク
リルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルな
どの重合体もしくは共重合体担体）、またはこれらに公
知の手段によりスルホン基、アミノ基などの反応性官能
基を導入したものなどが挙げられる。

【００２３】測定対象のタンパク質を固相へ固定化する
方法は、例えば、物理的吸着法、共有結合法、イオン結
合法等の固定化酵素における方法を応用すればよい。物
理吸着法は、タンパク質を水不溶性の固相に物理的に吸
着させて固定化する方法であり、例えば、タンパク質溶
液と固相を混和して、室温で１〜２時間静置することに
より行うことができ、極めて簡便な方法の１つである。

【００２４】共有結合法は、アミノ基やカルボキシル基
等を有する固相とタンパク質を、ジアゾ法、ペプチド法
等で結合する方法である。例えば、カルボキシル基を有
する固相にＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−２−モルホリニ
ル−エチルカルボジイミドを反応させ、カルボジイミド
基を有する固相とし、これにタンパク質を作用させるこ
とで行える。

【００２５】また、イオン結合法は、固相のイオン交換
基にタンパク質をイオン的に結合する方法であり、例え
ば、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セルロースにｐ
Ｈ９．０程度のアルカリ性でタンパク質を結合すること
ができる。

【００２６】以上説明したようなタンパク質を固相へ固
定化する方法の詳細は、たとえば、千畑一郎編「固定化
酵素」（昭和50年3 月20日、（株）講談社発行）第9 〜
75頁などの成書または総説を参照できる。

【００２７】ボロン酸誘導体としては、ジヒドロキシボ
リル基を構造上もっていればよく、たとえば、（１−ア
ミノ−２−フェニルエチル）ボロン酸、［３−［（アミ
ノカルボニル）アミノ］フェニル］ボロン酸、（４−ア
ミノフェニル）ボロン酸、［３−（ハイドロオキシ）フ
ェニル］ボロン酸塩酸塩、［２−（ハイドロキシアミ
ノ）フェニル］ボロン酸、［４−（ハイドロオキシアミ
ノ）フェニル］ボロン酸塩酸塩等が挙げられる。特にア
ミノ基を有するボロン酸誘導体が好ましく使用される。

【００２８】ボロン酸誘導体と標識物を結合させて、標
識化されたボロン酸誘導体とするには、たとえば、架橋
試薬として、グルタルアルデヒド、過ヨーソ酸、マレイ
ミド化合物（N-スクシニミジル-2- マレイミドアセテー
ト、N-スクシニミジル-4- マレイミドブチレート、N-ス
クシニミジル-4- （N-マレイミドメチル）- シクロヘキ
サン-1- カルボキシレート、N-スルホスクシニミジル-4
- （N-マレイミドメチル）- シクロヘキサン-1- カルボ
キシレートなど）、ジマレイミド化合物（N,N´- オキ
シジメチレンジマレイミド、N,N´-o- フェニレンジマ
レイミド、など）等が使用できる。

【００２９】ボロン酸誘導体を標識化するための標識物
としては、免疫学的測定法に繁用されているものを用い
ることができる。具体的には、放射性同位元素、酵素
（例えば、β- ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコース-6- リン酸デヒドロゲナーゼ等）、蛍光物質
（例えば、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、
ウンベリフェロン等）、化学発光物質（例えば、ルミノ
ール誘導体、イソルミノール誘導体等）、ビオチン、ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドなどの補酵素・補
欠分子族、特異結合タンパク質（特異結合とは、特定の
化合物とのみ結合する性質を有するもので、例えばアビ
ジン等）など何らかの方法で比較的容易に検出可能なも
のを使用すればよい。

【００３０】放射性同位元素を用いる標識化は、１９８
３年２月２８日金原出版発行の「臨床病理」臨時増刊、
特集５３号 第２４〜２５頁（１９８３）ないしは１９
８８年６月１５日医学書院発行「検査と技術」増刊号Vo
l １６，No. ７第５８１〜５８２頁（１９８８）に準じ
た方法が、また、これ以外の標識化については１９８７
年５月１５日医学書院発行 石川榮治、河上忠、宮井潔
編集「酵素免疫測定法」第３版 第７５〜１５１頁ない
しは千畑一郎編「固定化酵素」（昭和５０年３月２０
日、（株）講談社発行）第９〜７５頁などに準じた方法
が応用できる。

【００３１】標識化されたボロン酸誘導体の溶液濃度
は、測定対象の糖化の程度や標識物の検出方法により、
適当に選択することができる。例えば、標識物をペルオ
キシダーゼとしたボロン酸誘導体を用いる場合、標識化
したペルオキシダーゼ活性にて、０．０１〜２０Ｕ（ユ
ニット）／ｍｌの溶液を用いることができる。臨床検体
の糖化の程度を測定する場合には、ペルオキシダーゼ活
性にて１〜２０Ｕ／ｍｌの濃度が好ましく用いられる。

【００３２】測定対象となる試料（被検液）としては、
糖化タンパク質の測定を必要とするものであれば特に限
定はなく、例えば、尿、血液、血漿、血清、血球などの
糖化タンパク質を含有する生体由来の試料またはタンパ
ク質と糖質（たとえばグルコースやグルコース−６−リ
ン等）の混合物等が挙げられる。糖化タンパク質につい
ては、例えば「臨床検査」Vol ３３，No. ８第８７９〜
８９９頁（１９８９）に説明されている。

【００３３】該試料のタンパク質の糖化割合を測定する
には、固相に一定量のタンパク質が結合しうる濃度以上
でタンパク質を含有するものを用いることが肝要であ
り、好ましくは、タンパク質濃度１ｇ／ｄｌ以上の試料
を用いる。

【００３４】また、標識化されたボロン酸誘導体を糖化
タンパク質の糖化部位に結合させるには、通常ｐＨ８〜
９の範囲の酢酸アンモニウム緩衝液、モルホリン塩酸緩
衝液、２−アミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオ
ール塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（N-(2- ヒドロキシエチ
ル) ピペラジン-N´-2-エタンスルホン酸）緩衝液、ま
たはグリシン水酸化ナトリウム緩衝液などで溶液として
使用するのが好ましい。

【００３５】以下、本発明の理解を容易にするために、
反応をモデル化して図２〜３に簡略モデル図を示す。図
２は、タンパク質と非酵素的に糖化したタンパク質が固
相に固定化されている状態を示している。図３は、固定
されたタンパク質の糖化部位に標識化されたボロン酸誘
導体が結合した状態を示している。図３において、＊は
標識物を示している。

【００３６】

【作用】本発明のタンパク質の糖化割合の測定方法は、
試料溶液を固相と接触させ、試料中のタンパク質の一定
量を固相に固定化した後、試料溶液と固相を分離し、タ
ンパク質の糖化部位に反応性を有する標識化されたジヒ
ドロキシボリル基を含有するボロン酸誘導体の溶液を該
固相と接触させることにより、該固相に固定されたタン
パク質の糖化部位に標識物を結合させ、次いでこの反応
混合物の固相と液相を分離し、分離された固相または液
相の標識物量を測定することにより、固相に固定化され
たタンパク質の糖化割合を、試料中の蛋白質量測定を別
途に行うことなしに測定できる。すなわち、固相に捕ら
えられたタンパク質の糖化部位に存在するシス・ジオー
ル基と親和性を有する標識化されたボロン酸誘導体を反
応させることにより、糖化部位に標識物を結合させ、固
相に結合したあるいは結合しなかった標識物量を測定す
ることによって試料中のタンパク質の糖化割合を測定で
きる。しかも本発明によれば、ボロン酸誘導体が糖化タ
ンパク質のうち主にアマドリ転移物（安定型）を捕らえ
るため、試料の前処理によるシッフ塩基型（不安定型）
糖化物の除去を必要としないので、操作が簡略化でき
る。

【００３７】また、本発明では、試料の中からタンパク
質を直接固相に結合させることにより、タンパク質を分
離することができるため、タンパク質の一定量を物理吸
着等にて固相に固定化し、次に、糖化したタンパク質を
測定するために標識化されたボロン酸誘導体を用いてい
る。このため、抗体を用いることなしに、安価に試料中
のアマドリ転移物（糖化タンパク質のシッフ塩基型糖化
物がアマドリ転移により安定型となったもの）を測定で
きる。また、使用する固相の材質、形状、大きさ、量を
一定とすることにより、試料から一定量のタンパク質が
固相に固定化されるので、別途にタンパク質定量を行う
必要が無い。さらに、試料溶液からタンパク質を分離す
るので、測定の際に共存物質の影響を受けない。加え
て、固相へのタンパク質固定を物理吸着等にて行うた
め、あらゆるタンパク質が固定可能であり、タンパク質
混合試料の平均的な糖化割合の測定も可能である。さら
にまた、タンパク質に対するそれぞれ固有の抗体を用意
する必要がないので、どの様なタンパク質に対しても本
発明の方法を汎用的に適用できる。従って、簡便で短時
間に測定可能で、且つ再現性、検量線直線性などの優れ
たタンパク質の糖化割合の測定方法が提供できる。

【００３８】また、タンパク質の一定量を固相に固定化
する方法が、物理吸着法、共有結合法、イオン結合法か
ら選ばれた１つ、またはこれらの併用である本発明の好
ましい態様とすることにより、試料中のタンパク質の種
類が単一の場合のみならず、複数の場合でも適用が可能
となり、タンパク質混合試料の平均的な糖化割合も測定
可能となる。

【００３９】また、試料が採取された尿、血液、血漿、
血清および血球から選ばれた１種である本発明の好まし
い態様とすることにより、生体のタンパク質の糖化割合
を測定することができる。これにより、高い血糖値（血
液中のグルコース濃度）を特徴とする疾患（例えば糖尿
病）の病状を把握するのに有用な測定法として応用でき
る。

【００４０】更に、本発明に於いて、標識化されたボロ
ン酸誘導体が、放射性同位元素、酵素、補酵素、蛍光色
素、化学発光物質または特異結合タンパク質のいずれか
で標識化されたボロン酸誘導体である本発明の好ましい
態様とすることにより、タンパク質の糖化部位に結合し
たボロン酸誘導体量が比較的簡易な方法で検出可能とな
る。

【００４１】以上、本発明の方法により、試料中のタン
パク質の糖化割合が汎用的、安価、簡便に測定すること
ができる。

【００４２】

【実施例】以下に、ヒトヘモグロビンをタンパク質の例
として、測定に必要なものの調製法や糖化割合の測定方
法をより具体的な実施例を用いて例示するが、本発明は
これに限定されるものではない。

【００４３】実施例１ 非酵素的糖化ヒトヘモグロビンと非糖化ヒトヘモグ
ロビンの調製 ヒトヘモグロビン５０ｍｇ（シグマ社製）とＤ−グルコ
ース５０ｍｇおよび水素化ホウ素ナトリウム４ｍｇを１
０ｍＭ（Ｍは、モル／ｌを示す）リン酸緩衝液ｐＨ８．
０に溶かし、３７℃で１０日間保持する。このヒトヘモ
グロビンをセファデックスＧ−２５（ファルマシア社
製、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体）、溶出液０．
２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．０のゲル濾過ク
ロマトグラフィーにて脱塩後、ｍ−アミノフェニルボロ
ン酸（アルドリッチ社製）を結合させた吸着体を用いた
アフィニティークロマトグラフィーを溶出液 ０．２５
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．０、０．２５Ｍ酢酸
緩衝液ｐＨ４．０として行い、溶出液０．２５Ｍ酢酸ア
ンモニウム緩衝液ｐＨ９．０にて溶出されるヒトヘモグ
ロビンを非糖化ヒトヘモグロビン分画とし、０．２５Ｍ
酢酸緩衝液ｐＨ４．０にて溶出されるヒトヘモグロビン
を非酵素的糖化ヒトヘモグロビン分画として分離・精製
した。

【００４４】ペルオキダーゼ標識フェニルボロン酸誘
導体の調製 西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（シグマ社製）４ｍｇ
を１ｍｌの０．０５Ｍ硼酸緩衝液ｐＨ９．０に溶解し、
０．１ｍｌの０．１Ｍ過よう素酸ナトリウム水溶液を添
加し、室温で２０分間反応させた。さらに、ｍ−アミノ
フェニルボロン酸６ｍｇを０．５Ｍ硼酸緩衝液ｐＨ９．
０に溶解し、添加して、室温で２４時間反応させた。次
ぎに、２ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、室
温、３時間放置した。セファデックスＧ−２５、溶出液
０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．０のゲルろ
過クロマトグラフィーにて脱塩後、で調製した非酵素
的糖化ヒトヘモグロビンを結合した吸着体でアフィニテ
ィークロマトグラフィーを溶出液０．２５Ｍ酢酸アンモ
ニウム緩衝液ｐＨ９．０、０．２５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ
４．０として行い、０．２５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．０に
て溶出してくるペルオキシダーゼ標識フェニルボロン酸
誘導体を分離・精製した。

【００４５】 ヒトヘモグロビンの糖化割合の測定 非糖化ヒトヘモグロビンと非酵素的糖化ヒトヘモグロビ
ンを４ｇ／ｄｌ水溶液とし、混合して、糖化ヒトヘモグ
ロビンの割合が１２，２５，３５％である試料を調製し
た。

【００４６】酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用の９６穴平底
マイクロプレート（ポリスチレン製）を固相として、各
試料の１００μｌをマイクロプレートの穴に分注し、室
温、１時間放置することにより、ヒトヘモグロビンを物
理吸着させた。生理食塩水で洗浄後、１％牛血製アルブ
ミン水溶液の３００μｌを分注し、室温で２０分間放置
して牛血製アルブミンを物理吸着させた。マイクロプレ
ートを生理食塩水にて洗浄し、ペルオキシダーゼ標識フ
ェニルボロン酸誘導体溶液（ペルオキシダーゼ活性８Ｕ
／ｍｌ，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．５、２％
塩化マグネシウム、０．３％牛血製アルブミン、０．０
５％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート含
有）５０μl を添加し、室温、２０分間反応させた。洗
浄液（５ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ８．３、２％塩化マグネシ
ウム、０．０５％ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート含有）３００μｌで５回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌ
ο- フェニレンジアミン溶液（リン酸クエン酸緩衝液
ｐＨ５．８、５ｍＭ過酸化水素含有）５０μｌを添加
し、室温、２０分間反応後、２Ｎ（Ｎは規定度を示す）
硫酸５０μｌで反応を停止し、測定波長４９２ｎｍの吸
光度を測定した。

【００４７】測定の結果を図１に示す。非糖化ヒトヘモ
グロビンの測定値を各試料の測定値から差し引いた値
（ΔＡ492nm ）は、図１に示したとおり、糖化ヒトヘモ
グロビンの割合が増すに従って、吸光度が直線的に増加
した。

【００４８】実施例２ 人血液１００μｌを試験管に秤取し、３ｍｌの生理食塩
水を加えて希釈し、遠心分離（３０００回転／分、１０
分間）して赤血球と液相を分離した後、赤血球に０．５
ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．８（０．０５％ポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート含有）を加
えて溶血試料液とした。溶血試料液の１００μｌを用
い、実施例１と同様の操作により、赤血球の主要タンパ
ク質成分であるヒトヘモグロビンの糖化割合を測定し
た。ヒトヘモグロビンの糖化割合を測定する既存の臨床
検査項目であるヘモグロビンＡ１ｃの測定値が、５．
６，１２．０％である２検体の血液を、本法で測定し、
実施例１の検量線より糖化程度を算出した結果は、４．
４，１２．８％であり、既存の方法とほぼ同様の測定値
を得ることができた。さらに、本発明の方法において、
ＥＩＡ用９６穴平底マイクロプレートを用いることによ
り、従来は１検体当りの測定に７分間程度を要していた
ヒトヘモグロビンの糖化割合の測定が、９６検体／２時
間（１検体あたり７５秒）で測定可能であり、多量の検
体を短時間の内に測定できた。

【００４９】実施例３ 体重３００ｇのウィスター系ラットにＳＴＺ（ストレプ
トゾシン）を６０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与し、糖尿病モ
デルラットを作成した。血液は、経日的にで採取し、実
施例２と同様の操作にてラットヘモグロビンの糖化程度
を測定した。そして、実施例１と同様に作成したラット
ヘモグロビン糖化割合の検量線より糖化程度を算出し
た。測定結果は、表１に示したとおり、血糖値の上昇に
従ってラットヘモグロビンの糖化程度も高くなった。

【００５０】

【表１】

【００５１】実施例４ ０．５ｇ／ｍｌＤ−グルコース水溶液に血清を５％濃度
で混合し、３７℃で一定時間加温した。１時間間隔にて
４回、試料の一部を抜取り、各試料を実施例１と同様に
測定した。また、各試料について、血清タンパク質の糖
化程度を示すフルクトサミン値を、フルクトサミンテス
ト「ロシュ」II（日本ロシュ社製、フルクトサミン測定
キット）を用いて測定した。その結果、以下の表２に示
したとおり、糖化処理時間の延長に伴って、吸光度測定
値およびフルクトサミン値が上昇した。つまり、吸光度
測定値は、血清タンパク質の糖化程度が増すに従って上
昇した。

【００５２】

【表２】

【００５３】

【発明の効果】本発明は、タンパク質の総量を別途に測
定する必要がなく、汎用的、安価、簡便で、且つ再現
性、検量線直線性などの優れたタンパク質の糖化割合を
測定する方法を提供できる。

【００５４】また、タンパク質の一定量を固相に固定化
する方法が、物理吸着法、共有結合法、イオン結合法か
ら選ばれた１つ、またはこれらの併用である本発明の好
ましい態様によれば、試料中のタンパク質の種類が単一
の場合のみならず、複数の場合でも適用が可能となり、
タンパク質混合試料の平均的な糖化割合も測定可能とな
る。

【００５５】また、試料が採取された尿、血液、血漿、
血清および血球から選ばれた１種である本発明の好まし
い態様によれば、生体のタンパク質の糖化割合を測定す
ることができ、高い血糖値（血液中のグルコース濃度）
を特徴とする疾患（例えば糖尿病）の病状を把握するの
に有用な測定法として応用できる。

【００５６】更に、本発明に於いて、標識化されたボロ
ン酸誘導体が、放射性同位元素、酵素、補酵素、蛍光色
素、化学発光物質または特異結合タンパク質のいずれか
で標識化されたボロン酸誘導体である本発明の好ましい
態様によれば、タンパク質の糖化部位に結合したボロン
酸誘導体量が比較的簡易な方法で検出可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例のヒトヘモグロビンの糖化割
合と標識物量測定による吸光度との関係を表した標準曲
線である。

【図２】タンパク質と糖化タンパク質が固相に固定化さ
れた状態を示す簡略モデル図である。

【図３】固相に固定化されたタンパク質の糖化部位に、
標識化されたボロン酸誘導体が結合している状態を示す
簡略モデル図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料溶液を固相と接触させ、試料中のタ
   ンパク質の一定量を固相に固定化した後、試料溶液と固
   相を分離し、タンパク質の糖化部位に反応性を有する標
   識化されたジヒドロキシボリル基を含有するボロン酸誘
   導体の溶液を該固相と接触させることにより、該固相に
   固定化されたタンパク質の糖化部位に標識物を結合さ
   せ、次いでこの反応混合物の固相と液相を分離し、分離
   された固相または液相の標識物量を測定することを特徴
   とするタンパク質の糖化割合の測定方法。
2. 【請求項２】 タンパク質の一定量を固相に固定化する
   方法が、物理吸着法、共有結合法、イオン結合法から選
   ばれた１つ、またはこれらの併用である請求項１に記載
   のタンパク質の糖化割合の測定方法。
3. 【請求項３】 試料が採取された尿、血液、血漿、血清
   および血球から選ばれた１種である請求項１または２に
   記載のタンパク質の糖化割合の測定方法。
4. 【請求項４】 標識化されたボロン酸誘導体が、放射性
   同位元素、酵素、補酵素、蛍光色素、化学発光物質また
   は特異結合タンパク質のいずれかで標識化されたボロン
   酸誘導体である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパ
   ク質の糖化割合の測定方法。