JPS5978692A - バクテリオフア−ジからバクテリアを保護する方法 - Google Patents
バクテリオフア−ジからバクテリアを保護する方法Info
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- JPS5978692A JPS5978692A JP58162487A JP16248783A JPS5978692A JP S5978692 A JPS5978692 A JP S5978692A JP 58162487 A JP58162487 A JP 58162487A JP 16248783 A JP16248783 A JP 16248783A JP S5978692 A JPS5978692 A JP S5978692A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、自然界に存在するバクテリオファージからバ
クテリア(細菌)を保護する方法、およびこの方法に使
用するクローニングベクター並びに形質転換体に関する
。 組換えJ) N Aを含有する細菌培養体の大規模なフ
ァージ感染という問題k 解決できるという理由で、本
発明は特に重要である。このことが有利である理由は、
目的生産物を暗号化
クテリア(細菌)を保護する方法、およびこの方法に使
用するクローニングベクター並びに形質転換体に関する
。 組換えJ) N Aを含有する細菌培養体の大規模なフ
ァージ感染という問題k 解決できるという理由で、本
発明は特に重要である。このことが有利である理由は、
目的生産物を暗号化
【7た組換えJ)NAが宿主細胞に
導入された後、この宿主細胞がバクテリオファージ感染
から保護ンΣれることか、必須ではないにせよ、望まし
いからである。形質転換培養体がバクテリオファージに
感染され易いということは周知であり、感染すれば全個
体が溶菌することから、このような保護は極めて重要と
なる。生産物の遺伝子(による発現iTj、目的とする
生合成が実行されるに十分な期間生存し得る宿主細胞に
依存するのであるから、感染を受けた培養体の生産能は
低下する。 微生物のファージ感染は周知の現象である。バクテリア
に感染した場合のウィルス、即ちバクテリオファージは
、通常、宿主の細胞膜に接触し、吸着し、これと反応す
る。吸着することによりファージの染色体または遺伝物
質は宿主細胞に入り込み、宿主の細胞機構が服従する、
新しいファージの生産にのみ陸用される工程が開始され
る。宿主細胞は成熟したファージで満たされ、次いで溶
菌するが、これは通常、最初の感染から約30分以内に
起る。この新しいファージは感染性であり。 利用できる宿主細胞が全て破壊されるまで、このす・1
り)しが繰り返される。 E、 C01iの大規模発酵による組換えD N A技
術の応用Qユ、これまで前記のようなファージ感染の問
題によって妨げられてきた。′4f実、種/2のバクテ
リオファージフローラが関係している感染が、目的生産
物の生合成を阻み、不可能にする主要な因子である1、
この問題は、大規模発酵の際には極めて重大となり、E
、colj形質転換個体の多額なかつ決定的な損失をも
たらすことになる。 本発明は、天然におけるバクテリオファージ感染からバ
クテリア形質転換体を保護するだめの安価で効果的な手
段を提供することにより、このバクテリオファージの問
題を解決するものである。 これは、1−(ha11部位を含有する外来性D 、N
Aを消化する制限系を、宿主細胞に供給することG′
こよってなされる。このJIha U部位は、天然に存
在するほとんどのウィルスに見いだされており、故に本
発明は広範囲の厄介なバクテリオファージに対して有効
である。即ち、ファージI) N Aが本発明に係る宿
主細胞の適所に入ると、l1ha IJ制限エンドヌク
レアーゼが、このI)NAをHha 11部位で消化し
、ファージを非機能性かつ無害なものとする。 このようにして宿主細胞のバクテリアに天然に存在する
バクテリオファージから保護され、培養体の生産性が確
保されるのである。この方法は、有利である&Jかりて
なく、本技術分野における著しい進歩をなすものである
。 E、co」i および曲のバクテリアの大規模発酵に
併うバクテリオファージの問題3七解決する方法は、他
にはほとんど無い。事実、バクテリオファージ感染は極
めて無菌の条件下でも起こり、一度感染すれば、これを
除くのは極めて困難であることが知られている。かかる
除去は可能でにあるが、それ(1非常に繁雑で、しかも
時間および損失生産物の点&c:l−・いて高価につく
。 以F″に訛載−rる本発明の理解を助けるために、以下
に用語を定義する。 機能的ポリプチド:回収可能な、生物学的に活t’Jユ
な、全゛C外来性のポリペプチド−11:J、I−前駆
体;外来1(!:ポリベグチドと内性ポリペプチドの一
部または全てからなる、回収可能な生物学的に活性なポ
リペプチド;特異的に開裂ijJ能な、生物学的(・こ
不活性化する内性(固有の)ポリペプチドおまひ外来性
ポリペプチドからなる、回収+iJ能な生物学的に不活
性な融合ポリペプチド;もしくは酵素機能を有するポリ
ペプチド。 融合遺伝子生産物:内性ポリペプチドの全部斗たは1部
と融合した回収可能な外来性ポリペプチド。 マーカー:染色体上または組換え1) N Aクローニ
ングベクター上の位置および機能が既知の遺伝子または
それらの組合せ。 形質転換体;形質転換を受けだ受容菌宿主細胞。 感受性バクテリア:ファージ存在下で増殖すると感染を
受けるバクテリア。 制限フラグメント:1またはそれ以」二の制限酵素の作
用によって生成した、プラスミド、他のベクター捷たは
染色体DNAのあらゆる線状部分まだはその全体。 挿入異性体:1個のJ) N Aフラグメントが、受容
体1) N Aの2またはそれ以上の適合部位のうち0
1箇所に挿入されて生成する、2捷たはそれ以1−の用
油な組換えl) N A分子のうちの1個。 It −、M系:制限:Iチ・よび修飾系。 AlI3− アンピノリン酬性表現型。 A11l11” アンピシリン感受性表現型。 +p、シ11.テトラリーイクリン耐性耐性型現型I+
01; 9 、テトラザイクリン感受性表現型。 具体的には、本発明は、組換えD N Aクローニング
ベクターによりバクテリアを形質転換させることからな
る 天然に存在するバクテリオファージから該バクテリ
アを保護する方法に関するものであり、かかるベクター
に、 1)該バクテリアに制限活性および同起源(Cogna
te)△ よび、 3)該バクテリアにおいて機能的ポリペプチドを発現す
る遺伝子、 含有することを特徴とするものである (/こだし、1
)」二重の天然に存在するバクテリオファージに、該バ
クテリアに伺与された制限部1’l:と同じ特異性の制
限部位を有する二重らぜん(2本鎖)IINAを含み、 2)該修飾活性に、該バクテリアにおいて、制限活性に
先)′/Xつて発現される)。 特異的活性の制限部位を有する二重らせんI) NAを
持った天然のバクテリオファージから、ノくクチリアを
保護する方法Uこ有用7に組換えクロ−ユニ・グベクタ
ーは、 1) a)同起源の修飾活性、および b)該制限部位と同じ特異性の制限活性、を、調和よく
、かつ連続的C・ζ発現する遺伝子を含む1) N A
セグメント、 2)該バクテリアにおいて機能する複製単位(レプリコ
ン)、および、 3)該バクテリアにおいて機能的ポリペプチドを発現す
る遺伝子、 を、結紮(寸たは結合) (Iiga、be)すること
により調製される。 さらに本発明に、前記方法に使用されるクローニングベ
クターおよび形質転換体に関し、本発明は、組換え1.
、) N Aにより暗号化された生産物を生産する微生
物の大規模発酵の成功計確実C・てするだめに、重要で
ある。制限および修li系が存在しないと、多くの培養
体はバクテリオファージの感染を受け、そのために目的
生産物の生物学的生帝は低下する。 本発明を例示する為に、lIaemophi]、us
haemolyticusのl1ha1.1制限−修飾
系を使用する。1(11a、 II且−A1系を含む遺
伝T−は密接に連結しており、1lha I+制限工/
ドヌクレアーゼおよび同起源の酵素メチラーゼを合成す
る。I:IhaLl制限酵素は、(3A N T C−
とCi’ N A U いう配列を持つ/ξ二重らせんl) N A (以下、
との配列を1.11−+a、 I−1リ−イトと呼称す
る)を認識、開裂[7、一方、同起d・;1の修飾系は
、前述の配列を含むヌクレオチドをメチル化する。メチ
ラーゼ酵素修飾系は、1.’、Iba II制限酵素が
生合成される前に発現されねば、ならないことに、当業
著には理解されるであろう。この」:うにして、Hha
11 1t −M系を含む組節[11+a、 11消
化から保護されるが、1lhallザイトを含む非修飾
外来性二重らせん1) N A Ii、その消化を受け
ることになる。こうした理由で、11)〕a111、(
、−M系は本発明を例示するという目的にとつ−C理想
的な系となる。 さらに、詳細には、本発明は、プラスミドpl)Jl
0+7)〜2.7 kb 、Pst I 制限7 ラク
メ71・kインシュリンA鎖のプラスミドpJ、A 7
、\4△1にクローンすることで例示される。プラス
ミドp、IA7△4へ1に、■弓、 coli のトリ
プトファンプロモーター、抗生物質耐性マーカー、およ
びヒトインシュリンのAポリペプチド鎖、L:融合した
E、 CO’1.i K 12trpl!+蛋白質の一
部分′2含む融合遺伝子生産物を発現する遺伝子を含有
している。プラスミドpIA7△4へ1の制限サイトお
よび機能地図を・、添1・1の第1図に示す。 ブラスミ1.pI)11 Qの〜2.7 kb I’s
l; Iフラク゛メン) i−,1:、I(ha [1
に対して特異的な制限および修飾遺伝子を含む。グラス
ミ191月10 im、J: 、NorthernI&
gional l&5earch 1.aborato
ry (1’eoria、、 111i、nOi、s在
)に寄託され、永久ストックカルチャー コレク/ヨン
の一部とな壬)ている菌株、l’;、 co:+、j
K 12 294/ pυ+10から分#/−rること
がてきる。これはグラスミド’ pl)l l Oの空
寸しい供給源および保存源Jニジて、受理番号”150
97の一口で、誰でも人T′−1jf能である。 取り決めについて述べると、符号1ΔJは除去を意味す
る。例えば、1△イ1係o H,l −Xb’a、 I
」という符合が後に記載されているプラスミド&’−
1、”co It lおよびXba、 I制限酵素サイ
トの間のヌクレオチド配列が、これらの酵素の消化によ
り除去さ7′1.たプラスミドを表わす1.捕便のため
、ある神の除去は番号で表わすこととする。即ち、親プ
ラスミ)> pJut 322におけるテトラザイクリ
ン面1姓遺伝でに先行するr’jcO1口認識サイトの
最初の塩基対(1−bp、I ) J:り始まって、1
−△1」は、bpl〜30の除去(即ち△’?JCOI
ローJ jj、n d III )、およびその結果と
してテトラサイクリンプロモーター/オペレーター系が
作動できなくなることを意味する。1へ2」は、bpl
〜375の除去(即ちAEcmJロー13am月1)、
およびその結果として起こるテI・ラリーイクリングヮ
モーター/オペレーターおよびテI・ラザイクリン耐1
住を暗号化している構造遺伝子の一部分、の両者の除去
を意味する。 そして「△4」は、trpオペロンノラグメノトがらt
rpDボリペグチドの構造遺伝子を取り除くbp〜90
0−〜150oの除六を意味する。 グラスミドpDIIoの〜2.7 kb I’st l
、IlhallR−M遺伝子含有制限フラグメントの
ゲラスミうなバクテリアを、天然に存在するバクテリオ
ファージ感物から守る。プラ、スミドp I’ 1.t
26とppH・27の各々の制限サイト地図を、誰何
の第2図((示す。 さらに本発明を例示説明するため((、新規プラスミド
p、P 1t2 BおよびpJ’R1228を組み立こ
ることもできる。プラスミドp P It23とpPJ
171228は、プラスミドpD110の〜2.7 k
l)Pst i 1.Ihal(・−へ1遺伝子含有制
限フラグメノトをグラスミドp 、1. B 7Δ4へ
1に挿入する結果生成する。プラスミドp 1. J3
7△4△1ば、E、 coli のトリプトファンプ
ロモーター、抗−生物質耐性マーカー、およびヒトイン
ンユリンのI3ポリペプチド鎖と融合した1°:、 c
ojj K 12 trp l>蛋白質の一部分を含
む融合遺伝子生産物を発現する遺伝子を含有している。 プラスミドp P It2 BおよびpPILI 22
8も壕だ、例えば種/7のE’、 co]、i菌株のよ
うなバクテリア応天然G・こ存在−j−るバクテリオフ
ァージから保護する。 グラスミドp i B 7へ4へ1およびプラスミド1
.+ 1坩28と1〕門J228の各々の制限サイト並
びに機能地図を、それぞれ添何の第3図すよひ第4図に
示す。 プラスミドpI’ 1t27の6.2 kb Ava
l −13g’L 1111ha II ”・−M遺伝
子含有制限フラグメントと、グラスミドpI:+] 7
△l △4の〜2.3 kb AVa、 1.−8g
111制限フラグメントとのリゲー/ヨン(結合)の結
果、新規プラスミドp、PR29が生成する。プラスミ
ドp、1I17Δ4△1は、E、 CO]iのトリグト
フフ′ンブロモー ター、抗生物質耐性マーカー、およ
びヒトのプロインシュリンポリペプチドと融合し生産物
を発現する遺伝子を含有している。プラスミドp I’
It29 IrJ−1制限および修飾活性を付鳥いか
くして例えば種1tの綻cO1i菌株のようなバクテリ
アは、天然に存在するバクテリオファージの感染から守
られる。プラスミドpH17へ4へ1お、l:びpPl
(,2gの制限サイトおよび機能地図は、そ−hぞれ添
イマ]の第5図および第6図に示した。 本発明に極めて多方面!で渡る応用性を有し、ぞの合成
が、組換えD’N Aクローニングベクターを含む1.
) N Aにより規定されるが、ある“いは内性(固有
の)代謝経路により規定されるあらゆる物質の生産に本
発明方法を適用することが1きる。 本発明の説明の目的に好捷しい組換えi) N Aクロ
ーニングベクターはプラスミドであるが、バクテリオフ
ァージ、コスミド、および他のベクターも捷だ使用する
ことができ、それは当業者には明らかであろう。本発明
は、その修飾1幾能が制限機能に先立って整合的(調和
まくり発現される1wす、△ いかなる制限および修飾系のだめの遺伝子も使用できる
。不発萌:ノ)有用I牛(・ゴ、クローニング−ベクタ
ー中にクローンされたマーカー捷/ζは他の遺伝子とt
91−無関係−Cあろので、商業的゛4たは研究的両値
を有する1′i/こQまそれ以−l二の遺伝子−をtt
1つ組換え菌株もしくは他の菌株に対し、本発明を適用
することがIIJ能である。 本究明の好ましい態様(−1、天然に存在する〕くクデ
リAファージからバクテリアを保護rるために11ha
、 II特異性を有するプラスミド担持の制限IL−よ
び修飾遺伝子−を使用することである。さらに、他の特
異性を持ったR −M系遺伝子を使用することもできる
。これらの遺伝子には、例えは]ゝSシlH,−M系(
Wa]der等、 1981 、 Proc、 Nat
l、Aca、d。 HCl、 I’ S A 78(:3) 1503)、
l・:+: (1・l(,1It −M系(+Ia、c
k等、 1980 、 、Fed、Proc、 Fed
、 Am、 8oc、ICxp、 13ioL 39
:1875)、およびTaql tt−M系(La、n
n−11siajn等、 I 982 、 l”ed
era、tionProc、 41 : 5427 )
がある。Taql、 R−M系の遺伝子は、へIann
等による1978,0ene3 : 97に記載の方法
と実質的に同様の方法によって、’rhermus a
quaticus ’1’T−1(Llrock :
t、−よびJ’reeze、 l 959 、 J、
of BacLerjalogy、98 (1):
2 8 9 、 type 5train
A’1’(](’ )I62 5104 )から常法
によりクローンすることができる。l I h all
R−M系と同様、この修飾遺伝子は制限遺伝子より前に
発現されねばならない。rll]a、 11−4だは他
のIt −M系直伝子と別個に、寸た11組み合わぜて
上記遺伝子群を使用すると、天然VC育在するバクテリ
オファージからバクテリアを保護することができ、従っ
てこれらもまた本発明の範囲に属する。 天然に存在するyくクアリオファージからバクテリアを
保護する本発明方法は、■Φ、72の有用な生産物を発
現する遺伝子を有するベクターを含有する宿主細胞に適
用することができる。1(1M遺伝r−は別個のベクタ
ーに保持されCいギもよいが、1(・−A4遺伝)は、
有用な生産物を発現する1貞伝子°i含むプラスミド中
に、同時にクロー ンすることが望ましい。有用なポリ
ペプチド生産物を発現する遺伝子は、天然に存在するも
のであっても非天然のものであってもよく、また一部は
天然のもので一部は合成もしくは非天然のものであって
もよい。 より詳細(C述べると、H,−M系遺伝子は、ヒトのグ
レープロインシュリン、ヒトのグロインンユリン、ヒト
インシュリンA鎖、ヒトインンユリン!3鎖、ヒト成長
ホルモン、ヒト以外の成長ホルモン、牛成長ホルモン、
ヒト以外のインシュリン、ヒトインターフェロン、ヒト
以外のインターフェロン、ウィルス抗原、ウロキナーゼ
、抗生物質耐性e 、f=J1−、するあらゆる酵素、
あらゆるペプチドホルモン、あらゆるペプチド酵素、ま
たは実質的に研究もしくは商業的ffflif直を有す
る他のあらゆるペプチド類を暗号化し、発現する遺伝子
を含むプラスミド中にクローンすることが可能である。 本発明のある実施態様においては、プラスミドの複製お
よびポリペプチド生産物の発現は、それぞJLpM1月
からのpol A遺伝子要求レプリコン(Holva、
r、1979. Lif e Sci、 25
:807〜818に開示されている)およびtrpプロ
モーターによって決定される。他のレプリコンおよびプ
ロモーターも、それらが特定の保護されるべきバクテリ
ア形質転換体中において機能する限り&、U、1史川す
ることができる。当業者に汀、牛1定のバクテリアにと
ってどのレプリコンおよO・ブロモ ターの使用が好ま
しいかは、既知であるか、または容易に決定できるであ
ろう。他のレプリコンの例としては、C011り1.N
R1、H,r< 2.1目(61,S(]101、it
P 1、ltP、4.1゛のレプリコン等があり、E
、 coli K 12中で複製を行なうバクテリオフ
ァージもこれらに含まれるが、これらUこ限定される訳
でidない。他のプロモーターの例としては、バクテリ
オファージλPIJプロモータ 、リボプロティンプロ
モーター、]、a、Cプrjモーター、リボゾーム蛋白
質重たはIt N Aプロモーターなどが含、・tJ−
Lるが、これらに限定される訳で杓なく、事実1−他の
いかなるプロモーターも含寸れる。種々pレプリコンお
よびプロモーターを組み立て、本発明のIt −AI系
遺伝子含有ベクターに使用することができるということ
は、当業者にに1理解できるであろう。 E、 Co11に関しては、遺伝学的および生化学的情
報が豊富であるので、E、coliが本発明目的に沿っ
た簡便で好ましい宿主バクテリアである。さらに、1つ
、coli K l 2は組換えI−) N A技術
による物質の生物学的生産Vことって選り抜きの宿主で
あるから、この微生物の菌株に対して本発明を適用でき
ることは、極めて有利である。既述したように、E、
coljO大規模発酵は、ファージ感染に付随した困1
α1fが伴なう。本発明はこの問題を実質的に解決し、
それ(でより生合成生産物の商業的生産(Ll’tJ’
能にするものである。 本発明方法は1種類の属、種寸だは菌株に限定されるも
のではなく、It −M系遺伝=r−をクローンしイj
jZ)微生物々らj−fいかなるものVこも使用′丈る
ことかできる。例えば、本発明Qま一般に原核生物に適
用でき、さらに詳細Vこは、刷coli、l弓、 co
liK 12.1′J、 coli K l 2 29
4 (0oedd、el等。 1979 、 l’roc、 Nat、 Acad、
Sci、 t18A 76:106に記載)、E、 c
oij−K 12RV 3 Q 3 (M3uer等
1 gB□ 、、1.Ma]、Biol、I 39
: L47に記載)、E、 colj Kl 2 C6
00(Ba+::hman、 I 972゜Bacte
riol、Itev、 36 : 526 K記載)
、1号。 C01i t< 12 C(3Q Q H,に−Mk−
(Cba、ngおよび(’:o b e n 。 1974、Proc、Nat、 Acad、 8cj、
、 USA 7];1030 に記載ン、1す、 c
oコ1K12111稍01(1う011−ver等、1
977.0ene 2ニア5に記載)、■気coli
K12BE827 A’l’CC31911,B、、1
.cill、uS。 Ba、 c j、 ]コus 5ubtilis、
Bacj、1.’1.uS ehuringjenS
j、e。 Bacillue megateriumv 5tap
hylococcus、 8trep1;+〕−coc
cuS、Actinomycetis、5trep+、
omyces、Agrobac−しerium、5er
ratia、 I’seudomona、s% ’i含
むノ(クチリアに適用できるが、これらに限定されるも
のでV′、1なく、バクテリオファージ感染を受は易く
、1(、−M系遺伝子をそれにクローンできる〕くクチ
リアならば、いかなるものも使用可能である。 本発明の打型しいクローニングベクターG1、シラスミ
ドpJ’lL;ビア、p I) JL2 g、および1
)1ゝ1(・29であおよびE、 coli K121
LV3Q8/pl’ll・29が金型れる。これらの、
および他のす−〈ての本発明のm4施態様は、天然に存
在するバクテリオファージ感染からバクテリアを保護す
るという共通の′特徴を分かち持つものであり、故Qc
本発明rよ、ファージ感染、溶菌、およびこれらに併う
生合成能の損失という実際の危険を併うことなく、組換
えI) N A含有微生物の大規模発酵を行なうことを
可能にするものである。 以下の実施例において本発明をより詳細に説明する。本
発明についての説明、ら・まひ本発明5’f構成する具
体的7ン方法を、適宜記載した。 実施例1 プラスミドpD110の分離および調製 プラスミドpl)1.10のDNA約1 /l(1(E
、 coliK12294/pJ)110(”’RL
[3−15097)から、I3a、za r a、
1およびHe1inskj によりJlMOl。 13io1.36 : I 85 (1968)に記載
の分1+jk方法に実質的に従って分離〕を、TIり緩
衝液C] m MのE l) i” A (エチレンジ
アミン四酢酸)と10mMのトリス−11CIopH7
,8)に約20 t’g/nl’の濃度となる様に溶解
する。l!;、C011K 12 294は1乞k M
k 宿主であるので、グラスミドI)NAi、j。 EcoK特異性に従ってメチル化に上り分tent:で
きる。 この溶液約5.ie(約O1μビのJ) N Aを含有
)足、S’SC/IQ(88G−標準食塩クエン酸緩衝
液、S S C/ l Q[NaC115mへ′1およ
びクエン酸ナトリウム(Naa) 1.5mMを含有
、pl+7)E↓す50tte、に希釈−ノ”る。次い
てこの88(−: /10. 1)NA溶液約25 I
I(lt 夙coli r(12C6001(、k−M
k−(IJ)Jンピテント1匠濁液50p(!と混i7
7る。 ”、 COl、Kl 2C5QQ Itk−八+k((
:har+g #’+、ヨヒCohenによる1 97
4 、 Proc、Na、t、 Aca、d、 5ci
USA 71:1030に記載)のコンピテント野ン蜀
液Cat、当業者により常套の方法で調製される。した
かつ−〔、新しい一夜経過した1・−ブロスl]へ4t
ll−er。 1 9 7 2 、 Experiments
j、n Mo1.ecu’、1.a、r Uene
しice。 にO1d Spring l1arbor Lab
ora、t;ory ((:<ld Spr団4(1
1a、rbor、 New York在)による〕中の
培養ヲ・、新しいL−ブロス中で副次培養(1,、/1
0 )L、370で1時間増殖させる。計660.1(
]、 e t、 を単位のt(II l1flJ全収穫
し、100mMのN aC」、 ’;1.5 nleで
洗浄し、150 tn A4の’;a’−’122.5
+mにLj?mL、室+RT 20分間インキュベー1
・する。この細+1i!!を取り、150 In A4
の(,1aC]、 2および10%のグリセロールを含
む溶液051扉に再懸濁し、氷で3〜5分間令囚jし、
次いで凍結させる。この凍結したコンピナンl−細)回
りよ、使用時まで液体窒素中(lこ保存する。保存ない
し貯蔵は、共有結合で閉環した環状プラスミド1) N
A (itl 、J、る形質転換類IWはンlζQよ
生存能力(lζ悪影響を及はさなかった。この細胞懸濁
液を水泡中で溶かし、形質転換用1) N A 1/2
容量と混合する。 この形質転換混合物を氷で20分間冷却し、42Cで1
分間の熱ンヨツクを匂え、氷で10分間冷却し、次いて
1・−ブロス5.7容量で希釈し、最後に:37<yで
90分間インギュベー 1・する。 形質転換体は、デトラザイクリ712.51ig、/l
uiを含有する1・−寒天上で増殖させることにより、
分離する。分雛物のテトラサイクリン耐性およびアンピ
シリ/感受性を試験により確認し、目的とスルE、 c
ol、j K I 2 C600lLk−Mk−/pJ
)I I O形質転換体であることを確認した。Baz
a、raI および適当なコロニーを、共有結合で閉
環した環状IJNAを分離するために使用した。このプ
ラスミドの構造を、制限サイト地図を作成することによ
り確1都した。 実施例2 プラスミドル■へ7ハ4・へ1の組み立CA
、グシスミドpB l(・■1trpの組み立てプラス
ミドp(3八11は、7・1汁: I 413といつ欠
失ヲ有するE、 c 01 iのトリグトファンオペロ
ンを担っており(A’1iozza、ri等、1978
、11. ISacterjo−alog、 14
57〜1466 )、このI’tめt r pリーダ
の最初の6個のアミノ酸と、はぼ最後の1/3のシy−
p1′;ポリペプチドからなる削(合蛋白(以I・、合
せて1・E と記載する)、並びにt]−ρ1)ポリペ
プチドの全体を発現する(こJC1つは全こし]pプロ
モーター−オペレーター系の支配Fにある)。1′:。 colj K12 W31 10 tna2 t
rp△102/pOA4 1 Fl、America
n i’ype Cu1ture CO」−J、ect
ionに寄託さ:hCおI)(ATCC/I63]62
2 )、pUA41 t(K 以下に述べる方法に従っ
て使用のために、この菌株から常套の方法で取得するこ
とができる、上記プラスミド約20/’p;を制限酵素
1.’vulJで消化すると、5個の部位で開裂する。 次にこの遺伝子断片を、l’JcOI口 リンカ−(配
列: pD A T CiA A T i’ CA 1
.” (iを有する自己相補的オリコヌレチドからなる
)と結合し、て、後にl’r 0□ 、1(、Iザ・C
トを有するシラスミドにクローンするだめのI弓Co1
(・1開裂ザイトを供給する。p(3Mlから得られた
この1.) N Aフラグメント20tigを、5′−
リン酸化合成オリゴヌクレオチドp OA T (I
A A i”I” CA i’0200ピコモルの存在
下、T、D N Aリガーゼ緩衝W (20m Mのト
リス(pH7,6)、0.5 In MのA i冒)、
lQmMのへ4gC12,5mMのジチオトレイトール
)中、’I’41)NAリガーゼ10単位で一夜4゛C
で処理する。次いで70°Cで10分間加熱してリゲー
/ヨンを停止さぜる。リンカ−をIりcol(・1消化
により開裂し、Eco几I末端を有するようになつ/ζ
フラグメントを5係ポリアクリルアミドゲル電気泳動く
以下l−1’ A OE Jと呼称する)を用いて分離
する。最も大きな3個Dフラグメントを、まずエチジウ
ムプロミドC・こより染色し、次に紫外線を用いてその
位置を決定し、所望の部位をゲルより切り離すことによ
りゲルから分所1する。 ゲル断片の各々を300μeの、I X i’13Fと
共に透析バッグに入れ5.IX’l’旧゛;緩衝液(1
’ 1目ら緩衝液は水Il中にトリス塩基10: 8、
−m、硼酸5.5gmNa、 2 E 1)”T’ A
、 □g gmを含有する)中で1時間、100■で
電気泳動に付−r。水性溶液を・透析バッグより集め、
フェノール抽出、クロロポルム抽出を行ない、NaC」
について、2Mとする。このl) N A ’?i。 エタノール沈殿後、水中に回」[Vする。得られたEC
□RI粘着末端を有するtrpプロモーター/オペL/
−ター含有遺伝子は、次ぐと述べる方法により同定され
るが、その結果テトラザイクリン感受1′/lプンスミ
ド中にフラグメントが挿入され、このプラスミドはプロ
モーター/オペレーターの挿入りこよりテトラサイクリ
ン耐性となる。以下に述へるJ)NAフラグメントの分
離は全て、上述したJ) A (月・C5およびそれに
続く電気溶離法によって行なわれる。 テトラサイクリン耐性を発現するプラスミドプラスミド
p13H,ll l (Hod、rj、guez等、1
979゜Nuclejc Ac1d、s Re5ea、
rch 6 、3267〜3287)はアンピアリン耐
性を発現する。これはまだ、テトラサイクリン耐性直伝
子をも含有するが、これに関tうするプロモーターを欠
くのでこの面j性を発現しない。よってこのプラスミド
はテトラサ・rクリン感受性である。Ec O” ’ザ
イトにプロモー。 ター/オペレーター系を導入することにより、このグラ
スミドをテトラサイクリン耐性とすることができるン グラスミドpHILl、l 1をEC0It l tl
こより消化する。 この酵素をフェノール抽出、次いでクロロホルム抽出し
て除去し、l) N Aをエタノール沈殿後、水中に回
収する。得られたI) N A分子を、上記実施例2A
で得られた3種のl) N Aフラグメントとそれぞれ
個別に混合し、前述のようにl’41) N A IJ
ガーゼでリゲーションする。反応混合物中シこ存在する
l) N A ′ff:、標準的な技法(flersh
fj、e:ld等。 1974、 l’ro、 Nat、Acad−1’fc
i、 L18A 71 :3455〜3459 参照)
Qこまり、コンビテンl−1“:。 co]1K12を形質転換させるのに使用し、次にこめ
バクテリアを、アンピンリン20 pg、/me −L
−iひテトラサイクリン5 pg/ ml! f含有す
るL H)17−板(Mj、11er、 1972
)に蒔く。 数詞のテトラサイクリン耐柑叡口二一を選択し、そのプ
ラスミド1) N Aを分離してp HR1l l;
rl。 命名した。目的とするフラグメントの存在は、flll
限酵素分析により確認した。グラスミド1.+131L
IItr−pは、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタ
マーゼを発現し、trpプロモーター/オーペレータ−
を含むI) N Aフラグメントを含有する。この1.
) N A 7ラグメントは、trpリーダーの最初の
6個Q)アミノ酸と、trpEポリペグチドの最後の約
1//3ζカ〜融合したものからなる第1の蛋白(1,
+(、!:nl称1−る)、trp1〕ポリペゾチドの
ほぼ前半分&ζ4目・rl−j−る第2の蛋白(D’と
呼称′!る)、およびテトラヅーィクリン1制性遺伝子
Cてよって暗号化される第3の蛋白質を・も暗号化して
い乙。 C,プラスミドp S +’)へ17△2の組み立てグ
ラスミドpI(則l j;rpをEco l(、I制限
酵素で消化し、1′A(目゛:および電気溶削によって
分離することにより得られたフラグメントを、1“CC
010消化7”ラスミドp80M 11 (Jtaku
ra等、1977゜Sci、 198 :1056 、
イギリス国公告特許第2゜007.676 A号参照)
と混合する。混合物を′1゛41) N Aリガーゼを
用いてリゲーションし、得られたI) N Aを前述の
ごとく1弓、coli K12 294に導入する。形
質転換バクテリアをアンピノリン含有平板上で選択し、
得られたアンピアリンit l<)コロニーをコロニー
雑種形成(coコony hybrjdjzaい0rl
) ←0ruensしej−n等 、 1975.1
’roc、 Nat:、Acad。 Sci、’ USA 72:3951〜3965)[
よってスクリ一ングする。 pB’RII ’trp、
’より分離し、次いで1″′で放射活性標識化したtr
、pプロモーター/オペレーター含有フラグメントを上
記の方法における探査手段(プローベ)として[吏用す
る1、数個のコロニーがコロニー雑種形成(こより陽1
′1゛を示したので、これらを選択し/こ。プラスミド
D N A f。 分離し、酵素B g 11Iち・よびHaml、、l
1の二重消化による制限分析により、挿入されたフラグ
メントの方向を決定する。trpプロモーター/オペレ
ーターを適切な方向で含有する目的プラスミドを持った
コロニーヲ、アンピンリン10μg/me f 含有す
ルL 13培地(A4’111er 、 I 972
)上で培養する。目的プラスミドHpSOM7へ2と命
名し、以Fし′こ述べる組み立てに使用した。 】、 13gコ、 1.1およびBCol、(・1制限
ザイ)を暗号鎖の各々5′および3′末端に有する、I
−R;4i リペゾチドの遠1′X′L(端部)領域の
コトノを含む遺伝子フラグメントの組み立て グラスミドpSOM7Δ2を114 nd IIIで消
化、次いで1・1り暗号化領域内の13g]、 If制
限す゛イトを越えて消化するように選択した条件ト−で
ラムダニキノヌクレアーゼ(5から3へのエキソヌクレ
アーゼ)で消化する。111nd III で消化した
980M7 /\2約20Irg’&緩衝液(グリメン
緩衝e 20 m M 、pit96、MgC121r
r+M、β−メルカプトエタノール1mM)に溶Hする
。得られた混合物をラムダエキソヌクセアーヒで室温下
、60分間処理「る。 得られた反応混合物をフェノール抽出し、クロロホルム
抽出し、次いでエタノール沈殿を行なう。 Llり遺伝子フラグメントの遠位末端G′ζ1°Ic(
> It 1残基を作るため、プライマー32 p (
2(じi” 01’ 0 (kA i” OA ’rを
、改良ホスホトリエステル法((!1e6等+ 197
8. proc、 Nat、 Acad、 Sc1.
LI8A75:5765参照)により合成し、ラムダエ
キソヌクレアーゼ処理によって得られたJ、、 E’遺
1へ1フラグメントの1本鎖末端と雑種形成させも。こ
の雑種形成は、水20111!中VcクラスミドpsO
M7△2+7)ラムダエキソヌクレアーゼ処理した[l
i、+1d lit 消化生成物2011gヲ、容解し
、上記の5−リン酸fヒオリゴヌクレオチド約80ピコ
モルを含有する溶液6p(lと混合することによって行
なう。合成フラグメントはL E暗号配列の3′末端と
雑種形成(7,1・訃]フラグメントの残りの1本鎖部
分は、d A i’ l)、Klenow) ポリメ
ラービ1によりこれを満たす。 クレナウボリメラーゼ■は、I) N Aポリメラーゼ
1の蛋白質分解酵素Vこよる開裂Vこよって得もれる。 この酵素iJ:5−)3’のポリメリゼ−/ヨン活性お
よび3 )5のエキンヌクレオリチソク活1’有するが
、親酵素の5→3エキノヌクレオリチツク活性(1持′
つていない(Kornberg、 1974.W、I
I、 1堝。、−man and D(3SFo、 9
8参照9゜反応混合物を50°Cに加熱し7、徐々に1
0°ctて冷却し、その後フレナラ酵素4tteを加え
る。室温で15分間、次いで37°C−c 30分間イ
ンキュベーhLfC後1,25 モルノE l) i、
’ A 5pe’a:添j)n Lで反応を停止させる
。反応混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽出し・
次いでエタノール沈殿する。次いてこのJ)NAを制限
酵素Bgコ、 IJて開裂し、フラグメントをr’ A
OEにより分離する。このゲルから得たオートラジオ
グラムにより、目的とする約470bpの長さの P標
識化フラグメントが得られたことを確認し、これを電気
溶離によって回収し/し概説した様に、このフラグメン
ト1.1り(d)は、13g1. II末端お・よびプ
ライマーの開始点に一致した鈍感末端を有する。 2グラスミドp’l”hrllの組みヴCプラスミドp
′’hrz l if、チモシノ〆11を暗号化rる合
成遺伝fをプラスミドp1.3 R・322に挿入する
ことにより組み守、でる。チモンンσ1を暗号化するI
)N Aは、第7図の両端矢印によって示した16個の
オリゴヌクレオチド< Ill、〜”’+6)の合1ノ
y、とそれに続くリゲ ソヨンVこよって調製し7’j
ON末端に八’I e tコドンであるA i’ <3
を挿入し、5′末端(1,1’+co I(、I ト1
321HI II lによって開裂させンクプラスミド
と結合させ易くするため、1本鎖粘着末端(相補末端)
とする。容易に理)〕子さFしるであろうが、遺伝子中
央部の1<gJ、 Itシーイトは組換えグラスミドの
分析に役立つ。 オリボデオキ/リボヌクレオチド′■゛1〜”’16
id、完全に保護したトリデオキンリボヌクレオヂド構
成ブロックを用いて、ホスホトリエステル変法Vこより
合成する( Jta、kura等、 1977、5cj
ence 198: 1056.およびCrea等、1
978参照) 。Jiri /。 のオリゴデオキシリボヌクレオチドを以下つ表11(示
した。 表 1 チモンンα・1遺伝子のだめの合成オリコヌクレオヂド
イ 上記化合物の合成に、添付の第8図に要約した、フラグ
メンl’ ”’I5を合成する以下(/′C記載した方
法によって代表される。′v15の合[i3:に使用す
る種々のヌクレオチドを、番号を付けてこの図りこ示し
た。使用L *−略語r、I以下のとおりである目)
8 III 、 = 2゜4、6− ) IJ ’I
:/ プロピルベンゼンスルホニルテトラゾール、HS
A−ベンゼ/スルホン酸;TIノ(ニー薄層クロマト
グラフィー; Jl l’ I・(゛−高速液体クロマ
トグラフイー; 1) l’、41” = 4,4−ジ
メナトキシトリチル; CI!1−2−ンアノエチル;
If、 −、−1) −クロロフェニル;BFペンソ
イIし; An=アニノイル;1Bu=イノブチリ/l
/ ; Py=ピリジン;AC(、)II:二酢酸;
Et:+N=I−リエチルアミン。 完全に保護したトリデオキノリボヌクレオチト4 (3
5II+!/ 、 、05+11 mol )および2
(!80〃ly。 、 l m mol、)を、ノロロホルム、/メタノー
ルし一7/3 (V/V) 、それぞれ10および20
1?11〕中、2係Is S AでQ”C,10分間処
牝づ−ることにより、5′−水酸基位を脱保護する。飽
和炭酸水素アンモニウム水(2−)を添加して反応を停
止させ、クロロホルム(25md )で抽出い水&(1
0nψX2回)「ろ。有1.J層を乾燥(硫酸Jグネ/
ウム)し、少量(約57zJ )に濃縮し石油エーテル
(35゜〜60(]留分)を加えて沈殿千゛トせる。無
色の沈殿全遠沈(、で集め、減圧下テンケータ 中−ご
乾燥−J−ると旦および旦か得られ、こIしらC1゛/
リプノゲルII+1、 e (八Ierck 50I’
2!154. クロロ、にルーム/メタノール−9,
,/1.)により、それそIL均一なも・つと#つかっ
た。 Eat:体l オ、1:ヒ3 (2701,7!/、
、15mmol 、b−、+こび145 in!7+
、075 m :n、+1 ) ’fJ:、周囲温IA
Imで25分間トリエチルアミン/ピリジン/水(1:
3:i。 v/v 、 10nte )で処理することにより、各
/、の4ニスホ一ジエステルf本(Aおよび7)に凹i
Q f ;巳1、試薬1−ロータリーエノくボレーンヨ
ンシこより除き、残留物を無水ピリジン(lcDmX3
回)をυ[jえ−この蒸発を反復して乾燥する。三量体
、8 (,05mmo1)および三址体ヱを、無水ピリ
ジン(3nTlり中、l”PSTe (50m9 、.
15mmol) と合わせ、この反応混合物を周囲温度
、減圧下で2時間放置する。 1冒・C分析ic J: り、95俤の三量体旦が大量
体に変換しCいることが確認された(10%硫酸を噴霧
後60”Cに加熱することによりI) M i’グルー
プを検出−rることにより肉眼観察)。水(1nIe)
を添7Jll t、て反応を鎮め、溶媒を減圧Fて留去
する。 トルエンを加えてピリジンを共弊蒸[+i i′−上・
l 1’j: !A、(ミの六附体全上記三司体Aおよ
び乞に述へ/このと同様にして2%tBA(smg)を
用いで処理し、5′位台で脱保護する1、この生成物(
2)をノリ力ゲル力ラム(〜1erck 60J、I
、 3.5 X 5cm ) &C入1t、クロロホル
ム7./メタノ−ルの段階的勾配溶出(982から95
.5まで。v/v )により精製する。 生成i吻10を含む分画を蒸発乾固−1rる。 同様にし−こ、三星体互を旦と結合させ、完全に保みシ
フ/ξ生成!吻を直接、/り力ゲル上精製−rる。この
生成物を、上記のようにトリエチルアミン/ピリジン/
水により処理して3′末端秀:脱保護し、フラグメント
旦を得る。 最後に、i’PsTe (75mg、 、’225mm
o]−) を縮合剤として用い、六量体−9および1
0を無水ピリジン中で結合させる。反応完結後(4時間
、周囲温度)、混合物をロータリーエ・くボレーターV
こかけ、残留物ff:ソリ力ゲルクロマ(・グラフにか
ける。石油エーテル沈殿Vこよって得られた生成物置(
1601119)i、J:、′I″L (、’ &コ”
s イテ均−T 、り ツit。 ピリジン(,5媚) (1(入れた化合物上」の一部分
(20+1!9 ) ”g)、濃水酸「ヒア/モニウム
処理(7−S、8時間、60°C)により完全に脱保護
し、引へ1跣へ80 % (ζ1酸中て処理(15分間
、周…]温度)−1石。1!11酸を留去後、固体残留
物で4チ水1裳[1ニア/モニウム欠(v/v 、
4 me ) K ’a I管し、エチルエーテル(2
771XS回)で抽出する。水層?C1〜2〃fに濃縮
いその一部を110・Cにかけて上λを精製する。上背
なピーりに相当する分画εブー・°ししく約20.1)
、254 単位)、約57zzd l’こ6型線才る
。最終生5v物12を、Bto −geIP−2(1,
5X 100cm)上、20係水性エタノール(lこよ
り溶出ざげ゛C脱l見11、蒸発乾固し、水(/!OO
/〕e)に再懸濁させ′〔A2S+=IOの溶液ケ得る
。12の配列は二次元配列分析により確認した。 ソマトスタチン(Itakura等、1977)、イン
シュリン((2oedd++−14jj 、 l 97
9 )、および成Jソホルモン(0oeddel 、
1leyneker等、 1979 、 Na、、tu
re281:544)に′ついて詳細に記載された方法
に従い、16の合成オリゴヌクレオチ1から完全なチモ
シンa1遺伝子を組み立てる。オリゴヌクレオチド1゛
2からl1115壕での10 pg、肝を、′I゛4ポ
リヌクレオオチドキナーセ((−3oed、del等、
1979)の存在下で、1−1−” P J −、A
’I” I’ (New Er++!’Jandfヒ Nucl、ear)により定量的リン酸τ行な)と、約
101 、/’??l 1110 ’lの比l舌IIt
を得る。放射線Qこ上り標識したフラグメントを、20
%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルを用いた電気泳動
によって精製1−1溶離したフラグメントの配列を、蛇
jが部分消化(′(二よる一次元電気泳動/ホモクロマ
トグラフィー(、Jay等 、 1974. Nu
Cコet・−、Ac1d:; Hes、 I :3
31)を用いて確認した。フラグメント=111.よび
′r16は、次工程のリゲーノヨン反応の際の望ましく
ないボリメリ化4:最小限に抑えるため、リン酸化31
・せずにおく。これらオリゴヌクレオチド(それぞれ2
μg)は、i’h J) N A リガーゼにより、文
献に記11アの方法(00eaae1等、1979)K
;用いてそ−れそれ4個のフラグメントから成る4個の
グループ(第9 添付の図往企参照)に組み立てる、反応生5V、物i−
I、△ 7Mの尿素を含有する15%ポリアクリルアミドゲル上
のゲル電気泳動(八Iaxa、mおよびg]1bert
。 1977、 ”roc、 N、qt、 Aca、、a、
、 8cj、1.Js、A 71 :3455)により
精製する。4個の単離した生成物・工・リゲ−ンヨ/し
、反応混合物を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(こかけろと、チモノノ71Z1遺伝Pの人きさく90
〜105塩基対)のl) N・〜か電気溶離される。 プラスミドpBH322(057咄)を制限工、/トヌ
クレアーゼBam If I 粋よひl):ctツ1(
、It、 lで処(il 1.、フラグメントをポリア
クリルアミドゲル電気泳動にヨリ分離する。大きいフラ
グメントを電気溶出によりゲルから回収し、組み立てた
合成IJ N Aと結合させる( 0oeddel、
I:1eyneker等、1979)。 この混合物を]気coli Kl 2 294 の形質
転換に使用・する。形質転換した混合物の5%金、アシ
ビンリン20μg/77Tlを含有するL B平板に蒔
く。得られた4個のアンピノリン耐性コロニーFJ−テ
トラザイクリン感受性であり、これにテトラザイクリン
面1性遺伝子への挿入を示唆している。これら4個のコ
ロニーから得られたプラスミドの分析の結果、いずれの
場合にもこのプラスミ)(pThlz lと呼称)は、 △ θl遺伝子の存在を示している);−0tLで、(b)
13am If I / Eco 1口開裂によっ
て生し/こ約105哩基対のフラグメントを含有する、 ことがわかった。プラスミドpThCzlの組み立て手
順を・添付の第9図に示した(一定倍率ではない)。5
−リン酸基は黒丸で示した。 3処J!l pThlz + 、!: lノI’r (
d、) 7 ラフJ 7 ト(D反応プラスミドpTh
/7 J IQ、アンビアリン面1 u1三に一指定
する遺伝子と、その5暗号鎖末端f l’lco ]、
L Iザイトに、そして3′末端を13am1]1サイ
トにクローンした、チモンンtz lを指定する遺伝子
、を含む。 このチモシン遺伝子はまた8cj−1,1サイトヲも有
する。上で調製したLE’(a)フラグメンl−を受は
入れることのできるプラスミドを作るため、p i”
II /71をIζco H,J消化した後、そのEC
0It J残部を鈍感末端トfル目的テclTT Pオ
J:、(J−d A i’ P4用いたクレナウボリメ
ラーゼ1反応に刺す。得られた生j戎物を+sg]、l
I消化すると、アンピンリン耐性遺伝子と、両端にそれ
ぞれ粘Mt<E Bgl、 14残部と鈍感末端を有す
る真線状1)NAフラグメントか生成する。この生成物
に、Bgl 1.1粘着末端および鈍感末端を有−3−
るLE’(a)フラグメントと、′■゛1リガー再 ′I″rp24を形成させることができる。この過程に
おいて、鈍感末端のリゲーンヨンが起こった位置にI弓
C01(・1ザイトが再生される。 1矢プラスミドpS〇八47/\2・へ4の組み立て1
”’r p24 f Bgl 11およびL:(:O
I(、Iで順次消化し、次いでP A (3Eおよび電
気溶離を行なうと、3′末端に隣接したEco R,I
粘着末端しよび8cj、 II粘着末端を併うL l!
I(a)ポリペプチドのだめのコトンを有するフラグメ
ントを得る。この1・E’ (a )フラグメントは、
プラスミドpsom7△2のり」11ザイトにクローン
することができ、トリプトファンプロモーター/オペレ
ーターの制御−トに発現されるLl)ポリペプチド/ソ
マトスフチン融合蛋白質がη″敗する。このためVCV
、K、(j)トリブトファンフロモーター/オペレータ
一部(iから離れたEco 111サイトを・間装さぜ
る/こめの、psom7△20Eco IL Iによる
部分消fヒ;おまひ、(2)コドンの読み取り枠を適切
Vこ維持し、l>ct)10開裂サイトを再生するだめ
の、ブライマー配列の適切な選択、 を必要とする。 即ち、プラスミドps om 7 △2 16μg ’
Fc、20m へ1の ト リ ス (pH7,5)
、 5 m へ1のへ!a(ユコ 2、.02係の
N 1’ 40洗浄剤、オJ: ヒ10 Cm A4
(7) Nacl f含有する緩衝液200 ttl!
で希釈し、EcmI口 、5単位で処理する。37°C
で15分経過後、反応混き物をフェノール抽出、クロロ
ボルム抽出、エタノール沈殿し、次いで43g1 [1
て消化する。大きい方の7ラグメント21’ A (,
21去、次いて電気溶離て分離する。このフラグメント
は、1・1号ポリペプチドの近M末端の為のコドンl
I−”’ (p) J 、即ち、13g]−IIザイト
から上流のコト/ヲ含んでいる・次にこのフラグメント
ラ」二重L E (d)フラグメントと、T、 l)
N Aリガーゼの存在下でリゲー7ヨンし、グラスミド
ps om 7へ2へ4を形成さぜる。このプラスミド
汀、E、C01i 294VC導入すルト、トリプトフ
ァンプロモーター りこおいて、完全に再構成されたL Eポリペプチドと
ノマトスタチンより敗る融合蛋白質を・効率良く生産す
る・ プラスミドpB1t322をH ln a Illて消
化し、突出1− /3 If nd. Ill末端を8
1ヌクレア−セ消fヒする。 この8■ヌクレアーゼ消化は、S1緩衝W ( 、 3
A4のN a(E 1 、 1mM の ZnC1
2、 2 5 m M のrli1′酸 ブー
トリウム。pH 4. 5 ) 3 0ull中のIl
ind III開裂pBH322101zgを、S1ヌ
クレア一ゼ300単位で15°Cで30分間処理して行
なう。反応(・−x 3 0 XS1ヌクレアーゼ停止
溶液(、8Mのトリス塩基、5 0 m MのE l)
T A ) I Ileを添加して終止させる。 反応混合物をフェノール抽出し、クロロホルム抽出し、
エタノール沈殿し、次いで前述のより(/こEc。 1(・I消化を行なう。I’ A Ci E法、次いて
電気溶離により得られたフラグメントは、EC01目粘
着末端、および暗号鎖がチミジ/ヌクレオチ)・かもは
じする鈍感末端を有する。チミジンから始する81消化
+1nd III残部に、クレナウポリメラーセ用で処
理したBgl 1.1残部と混合し、リゲーンヨンによ
ってBgl. 11制限サイトヲ再生することができる
。 以上のように、実施例2Cて調製したプラスミドp 8
U八47△2をlsgl. I+消化し、イ!Iられだ
1舅111粘着末端を、4個のチオキシヌクレオチドト
リホスフェートを全て使用してフレナラポリメラーゼl
処理により二本鎖とする。得られた生成物の町010開
裂後、その小さなフラグメン1− r,1 1’ A
(冊弓処理および電気溶離すると、トリプトファンプロ
モーター/オペレーターおよび、13gIIJザイトか
(p)J)を有するD N Aの線状断片か得られる。 この生成物は、l’tc010末端およびl(B71
IIザイトを補完してできた鈍感末端を有する。しかし
ながらこの13gl IIサイトに、該鈍感末端金」二
詔S1消化11ind III フラグメントの鈍感末
端とリゲーノヨンすることにより再構成される。即ち、
2個のフラグメント(、 ’I”、 l) N Aリガ
ーゼの存在下でリゲーンヨンしてプラスミドp I−I
K Y ( 0として再閉環させるが、このプラスミ
ドは、コンビテントな]゛)。 colj 294細胞に導入して増殖さぜる。組換えプ
ラスミ)−I〕H lぐYIOを担ったテトラザイクリ
ン削性細J胞を選択し、そのプラスミドI) N Aを
抽出する。Bl?;IIIおよびI’et lで消化し
、I” A (−冊り法および電気溶離(tこより、大
きなフラグメントヲ単離すると、目的とするI’St
lおよびBgl II粘着末端を有する線状IJ N
A断片が得られる。このようにしてpJ.] K. Y
1 0から調製し/こI) N Aフラグメントir
.I、複製起源を含んでいるので、l;rp+・1゛〕
ボリペブチド融合蛋白質遺伝子およびテトラザイクリン
耐性遺伝子の両者がtrpプロモーター/オペレーター
の制@j下vCするシラスミドp 、I A 7△4△
1の組み立ての際の1つの構成成分として有用である。 (j、Trpプロモーター/オペレーターを有する線状
1)NAの組汐・立て 実施例21・〕で調製したグラスミドp S (、)へ
17△2f・4を部分的1’:COIt l消化、次い
でI’st、l消化に付す。得られたフラグメント&−
、Itr−pプロモーター/オペレーターを含み、PA
GE法、次いで電気溶離にかけて分離する。部分的1!
:cOR1消化は、ソマトスタチン遺伝子の5末端付近
では開裂されるが、アンピンリン耐性遺伝子とtrpプ
ロモーター/オペレーターの間に存在するEco It
]サイトでは開裂されないフラグメントを取得するた
め((必要である。アンピシリン耐性遺伝子の中のPe
tlを切断することによって失わわたアンピシリン耐性
は、」二重実施例2Fで調製した最終的な線状pHKY
IQIJNA誘導体とのリゲーションにより回復させる
ことができる。 ■、インシュリンA鎖構造遺伝子の分離インシュリンA
鎖の構造遺伝子は、グラスミドpIA1のECOR,I
およびL(a、m Hl消化に、、l:ツて得られる。 このプラスミドの組み立ては、(30dd、el等によ
るI’rOC,Nat、 ACa(1,Scj、、U、
8 A 76:106(1979)に記載されている。 目的生成物((1l’ A(11)および電気溶離によ
り精製され、l!;001口およびIsaml、−11
末端を有している。 1、インシュリンA鎖構造遺伝子、Ill r pブロ
モ−ター/オペレーター、セよびPetl並びに1)B
1゜11末端を有するpHK Y I O線状1) N
A−イラグメントのリゲーンヨン インシュリンA鎖構造遺伝子、l;rpプロモーター/
オペレーター含有線状1.) N Aフラグメント(実
施例2(]で調製)、およびpIIK Y l O,銹
状DNAフラグメント(実施191J2Fで調製)を、
第1図に示す方向でリゲーションし、目的プラスミドp
i A 7△4ΔIf:生成させる。グラスミドp
l A 7へ4へ1は、アンピシリンおよびテトラサイ
クリン酬性を回復しているため、容易に選択できる。 実施例3 グラスミドル目(7ハ4△Iの組・夕立でイ
ンシュリンA6JでになくインシュリンB鎖を指定する
構造遺伝子を最終的リゲーションに使用−J’る以外は
、実施例2A−1に従って所望のプラスミドを組み立て
る。インシュリン■3鎖構造遺伝r・u、シラスミドp
iB1(その組みケでは(joeddel等、1979
、に記載)のECOI口およびBam1.I l消化に
よって得られる。インシュリンB鎖を暗号化するI)
N Aフラグメントu、P A (E Eおよび電気溶
離により精製される。これに、&J)11..1および
13a、nHi末端を有している。 プラスミドplB7△4△1は第3図に示した。 このプラスミドはアンピシリンおよびテトラザイクリン
劇性を回復しているため、容易に選択できる、。 実施例4 シラスミドplH7へ4Δ1の組み立てグラ
スミドpH1,7△4△1の組み立ての様式を第11図
(に示す。 目的とする組み立ては、実施例21に・ボへたのと同様
の方法である。即ち、Lrpプロモー ター/オペレー
ターを有する線状1)NAフラグノント(実施例2Gで
調製)および、r+t<y I O線状1)NAフラグ
メント(実施例2Fで調製)を、常法によ7プラスミド
psOM11の、ソマトスフチン遺伝子含有1>co
It l −Ba、nII l制限7 ラクメ7 トV
CIJケー7ヨンスル。フラスミl’ p 5(−1A
I 、1114山、akura等、1979.5cie
nce I 98 : 1056およびイギリス国公告
特許第2007676A弓の記載と実質的に同様の方法
で組み立てることができる。所望のプラスミドpsOM
7△4へ1はアンピシリン耐性を回復しているため、容
易に選択できる。 グロインゾユリンの最初の32個のアミノ酸化・暗号化
する遺伝子の組み立ての第一段階として、表2に示した
l連の18のオリゴヌクレオチドを調製する。個々のヌ
クレオチドは、塩基アデニン、チミン、シトシン、グア
ニンを表わす文字A、′V、(づ、Gによって示し、こ
れによりヌクレオチドを互いに識別11]能とする。最
終的に組み立てられた遺伝子全体のヌクレオチド配列を
第10図に示す。 表2 ソマトスタチン遺伝子のだめの合成オリゴヌクレオチド
III AAi’TcAl”0’門゛11
2 DOTcAATDAOCA113
Dc’l”TTOT(j(3T7+’(
”114 1’ OA に ci” (1
:Oi’ T(i A115 1、’TO
AC(’;AA(:A ’l”D116
に A A A Oに i’ 0 (シi” に A
87 AOOTOAOAAD(’、A1
1B A O(!i’ i’
DA A cに旧 A Oに i”門”0
TA(E132 C′目I G4110
’(j G(i(E l’143 にA
AcOT(i(jTi”Tl1s4 1’
T(:TA(!A CTc(:l’B 5’
A A G A に i” cU D G136
AAcAAOGTACAAH7ACOT
’l”CADCGOA B8 G’!”AGAAGAAAC(:B
g AUTO’■’ A OU A G
i’B10 (JATCCOOCGこの
合成ヌクレオチドは、第10図中で角括弧の間に下線を
何して示した。これらのオリゴヌクレオチドは、トリエ
ステル法(C1r3 a等、1978゜Δ 7327参照)’Lより合成した。このオリゴヌクレオ
チドのうち幾つかは、ヒトイン/ニリンB鎖遺伝−rの
組み立てに使用された( Crea等、1978 。 および”0edde1等、1979参照)。2個のオリ
ゴヌクレオチド(B5′および+3 ] 0’ )飢1
1pa If 、F=・よび末端HamIJJ並びに1
5c010制限ザイトと合同している。この末端サイト
はクローニングの目的」二極めて有用である。 ヒトインンユリン13釦遺伝子(Go edd、 e
]等、1979)の左坐分の組み立てのために前に使用
し/こ8個のオリゴヌクレオチド111〜118は、1
1鎖遺伝子の1〜13番目のアミノ酸およびN末端部の
メチオニン単位の為のコドンを含有している。B IJ
J4の右半分は、0oed、del等の教示する方法と
実質的に同様にして、]+1 D N Aリガーゼの存
在下1.lリボヌクレオチドB 1、B2、H3,13
4,135′、B 6.137、B8、]A3およびB
IOかしリゲーションにより組み立てる。得られた遺伝
子フラグメントは、ヒトイン/ニリンB鎖の14〜30
番目のアミノ酸および架橋鎖の最初のアルギニン単位を
暗は化している。l1pal制限ザイトハ、ヒトインシ
ュリン遺伝子の[:Ipa IJサイトと同じ位置およ
び読み取り枠で、この遺伝子配列中しご組み込まれろ。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動ケこより、このリゲー
7ヨンした遺伝子フラグメントヲ精製し、最大のI)
N Aバンドf:溶離した後、このフラグメントをLl
j red litおよびBam1llて開裂さぜたプ
ラスミドpBIL322に挿入する。得られたプラスミ
ド(pB3と呼称)を1弓、coli K12 29’
l ()\i’ (’CA631446 )に形質転換
によって挿入する。このプラスミドは、抗生物質アンピ
ッリンとテトラサイクリンに対する耐性を付与し、Ma
、−、< a m等(1977、I’roc、 Nat
l、 Acad、Scj、tlsA 74:560参
照)の方法により決定されたものと同じの目的とするヌ
クレオチド配列を有することがわかった。 2個の7ラグメ/1・、即ち58塩基月を待つp133
の1lind III Ham 1117ラグ/ント
および46塩基2=J k持−、l T)旧11 (0
oed、d、e 1等、1979ic記載)のl>co
1(、1,−11i+id、 IIIフラグメントを
リゲー7ヨンして、1り。oIt lおよび1(a、。 II +末端を有−ノーるフラグメントを作る。このフ
ラグメントk 、0oedde1等、1979、に記載
の方法と実質的に同様にしてE。oIt lおよびHa
、m It、 J制限プラスミ1.1.旧t322にリ
ゲー7ヨンする。次いて得られたプラスミド(p11稲
と呼称)を1り、coli K]2 294にクローン
rる1、常套の増殖と分離の後、プラスミドplB3
f 1ico IL lおよびJ■pa II制限酵素
(題より消化し、メチオニンeごよって先行されるN末
端プロイン/ニリンのアミノ酸を暗号化する合成遺伝子
フラグメント(フラグメント1、第11図)を作成する
。 この合成遺伝子は、常套のポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分離する。 添イq1の第12図に、目的とす71)c I) N
Aを増量する図式を示す。これに従って、138.m、
1.I l認識配列秒よび約20残基から成る3′ポリ
チミジル酸領域の両者を含むデカヌクレオチドI) C
C(j G A i’(I C(: GIll Ill
+p、8+1+ ヲ合成シ、c D N A 合tj
’j、]にメのA M V逆転写酵素を作動(プライム
)させるためにイ史月ト支る。このフライマーは・ 1
.、5 X ]、 O=p 1110 ] のi’ l
’ Pを含有する反応量0.6 yzd中、ターミナル
デオギンヌクレオチジルトランスフエラ−ゼ(1’:n
zo ls:iochem、 2Q Q単位)食用い
、このl(a、to 1.1.1デカヌクレオチドl
// 11101で調製する0反応FJ、 Oha、r
+g等、 1978. Na、1.ure 275 :
617に記、l&の緩衝液系中、37°Cで1時間行な
う。 ヒトインシュリノーマ(島細胞胛)組織は、I11++
いしute fiir I)iabel−esfo
rschung (西ドイツ国ミュンー\ン在)より入
手できる。当業者(・ζは、ヒトインシュリノーマ組織
が容易に入手でき、他の多くの供給源からも取Yj)
i’J能なことが理解されるであろう。ヒトインシュリ
ノーマ組織のポリA111H,NA (2,5//g
) t、Ullrich等の方法(1977゜5cie
nce 196 : 1313参照)と実質的に同様に
して分離し〜〜Vickens等の教示する方法(19
78゜、1.B」−ol、 (、:hem、 253
:2483)に実質的に従って、これを二本鎖cDNA
に変換する。15Tl昌・1の′1゛rj (1−11
Di (+)IJ 8.3.42 ”C)、2111昌
!のKCl、8mMの14 MgCl2.30 m l
l11のβ−メルカグトエタノール、2 m Mのプラ
イ7− d (’; C(3(3A i’CC(’i
(j l■’1g ””、オヨU ] m AIノd
N ””’s’ig含有する反応容量80116をO′
Cでプレインキユヘートしておく。A M V逆転写酵
素を添加後、この混合物t 42 ”Oで15分間イン
キュベー1・する。(4%られたH、 N A / D
N Aを次いで常法(/(より変相さぜる。 25mAJのTrjs−IICI (pH8,3) 、
35 m Mの1(C]、4. m MのA4gC1
2,15m Mのβ−メルカフ。 トエタノール、I m M ノロ、 N T 、l’s
オJ、091’j’位ノD N Aポリメラーゼ1(ク
レナウンラグノント)を含有する反応容量150Ie中
で、相補的(]1)NA@′4を合成する。この混合物
と15℃で90分間次いで4°Cで15時間インキュベ
ートする。続17)−C1〜’VICkelH(等(1
978)の教示する方法と実質的に同様(′(シて、S
1ヌクレアーゼ(MinesLa、brai、orie
s、 EJ、khart、 India、na ) 1
000単位を使用し′TJ、81ヌクレアーゼ消化を−
37”0で2時間11な9゜この二本鎖CI) N A
(、,37t)g)を8係ポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動して、500鳴基対以トの大きさのJ) N
Aフラグメントを溶離する。A’1aizel +J
r、の方法(1971、Meth、 Vj、ro]、。 5 : 180)&こ実質的に従って、ターミナルテオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼを使用してオリ
ゴデオキシシチジル酸残基を、このフラグメントの3′
末端に付加する。最初VこPstl制限酵素で消化し、
次にターミナルデオキノヌクレオチジルトランスフエラ
ーゼを用いてデオキシグアニジル酸の尾部を(=Jけた
p旧t322に、この60尾部を有するcDNAフラグ
メントをアニーリングする。 得られたプラスミドf E、coli K]2 294
に導入し、クローンする。テトラサイクリンにG1耐性
で、アンピシリンには感受性であるコロニー’を分離し
、3個のPstl制限ザイトヲ持つグラスミドを°スク
リーニングする。この制限ス(9式は、プロインツユリ
ン遺伝子について指摘されている( 811r’eS等
。 1980 、5cience 208 : 57参照)
。 600の挿入塩基対を含むあるプラスミド、〕l111
04は予憩された1FBt1制限型式を有し、C1,)
NA調製の際に導入された3′ボ+) A j;−よ
ひボ+) OCの間のBamJI Iザイトヲ含む。挿
入部のヌクレオチド配列の一部を第10図に示す。この
配列・は、使用し/こrr4NAが異なる個体から分離
されたものであるという理由で、5ures等(198
0) および13e1.]等(1979,Nature
282:、525)により以前報告されたものとは多
少異つCいる(F線をイ・]わ したATがGCと置き換っている)。 △ IJ、ヒトプロインシュリンを暗号化する遺伝子の組み
立て ヒトプロインシュリンを暗号化する遺伝止の組み立てに
使用した方法を添伺の第11図に示す。 プロインシュリンの最初の31個のアミノ酸を暗号化す
る合1j7遺伝子セグメント(第11図におけるフラグ
メント1)を、前述のように制限エノドヌクv7−セE
COIt lおよびH,pallを用いて50/Igの
プラスミドplB3より回収する。このフラグメントに
また、プレプロインツユリンの1曲間列21の代わりに
メチオニンに相当するA i” (jコドンをも含んで
いる。 翻訳停止コドンとmRNAの3′非翻訳領域と共に32
〜86番目のアミノ酸全暗号化しているCI) N A
遺伝子セグメントa、401ノgのプラスミ1−p11
1104から、1ず138m111、次いで1.Ip、
a II制限酵素で処理することによV回収できる。二
個(・)フラグメントtポリアクリルアミドゲル電気泳
動、次いて電気溶離により分離する。これらの遺伝子フ
ラグメントを、20/71のリガーゼ緩衝液(Uoec
l、del等、1979)中、40.24時間の′I″
、 1) N Aリカ−ゼ処叩により連結させる。この
混庁物f 50g1eのll2(:1で希釈後、常法に
よりフェノールおよびクロロホルムで抽出し、次いてエ
タノール沈殿する。 得られたI) N A Id Ham If Iおよび
1号cot口制限酵素で処理してこれらの制限サイトを
再生し、遺伝子重合体を除去する。次いで組み立てたプ
ロインツユリン遺伝子をポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離し、l先o I(IおよびHam If
l消化したグラスミドpH1)、322 にリゲー/
ヨン(T、 I)NAIJガーゼを使用)する。得られ
た1月くAを14゜co、hi K12294 しこ導
入し、得られたコロニーをテトラサイクリン感受性およ
びアンビアリン面]性についてスクリーニングする。か
かるコロニーから亦離されたプラスミドI〕■113は
所望のグロイン/ユリ7遺伝子を含んでいた。これは引
き続きヌクレオチド配列分析(でよりその特i住を決定
した。 メチオニンを暗号化しているN末端コドンを含む完全な
ヒトグロインシュリン遺伝子を、li;CO旧およびl
−3a、m 1.11制限酵素処理によってプラスミド
pr−113から回収する。所望のフラグメント’lゲ
ル電気泳動により精製し、次いでプラスミドpS〇へ1
7へ4△1の1°stl −l弓co IL、 l (
部分)消化物ら・よびプラスミドp][Ylo(実施例
12Fで調製)の大きい方のPst l −Bgl、
IIlフラグメントリゲーンヨン(T、 I) N A
リガーゼを使用)する。 、 8 ()M 7△4/川フラグメントは、ll1(
公的Iりc。 10消化、次いでPstlによる完全消化により組み立
てる。得られたフラグメン目”、1trpプロモーター
/オペレ・−ターを有し、]’ A 01す、次いで電
気溶r(’t B’こより分離−「る。部分的ECO1
<、 l消化は、ソマトスタチン遺伝子の5′末端隣接
部で開裂し、かつアンビンリン耐性遺伝子とtrpプロ
モーター/オペレーターの間に存在するEco +t
Iサイトでは開裂しないフラグメントを得るために心安
である。アンビンリン面1性遺云子領域てI’St 1
. /こより切断されることにより失われたアンビンリ
ン削件QJ、、前述の実施例2Fで調製した最終的、〕
IllぐYIO1腺状1) N A誘導体とリゲ−7ヨ
ンすることにより回復する。 1)。oloおよびISam111末端を有する完全な
ヒトプロインシュリン遺伝予約11Ig、pS〇八1へ
、−,4△1の(部分的) Pst l、 −Eco
IL l消化フラグメント41i、g 、およびpi−
1,KY 10のPst I −Bgl IIフラグメ
ント約μgffi、i’4D N Aリガーゼを用いて
リゲ△ 一ジョン緩衝液中で4゛C124時間リゲー/ヨンノー
る ・ リゲーノヨンしたI) N A 91合物は、Uoec
l−d、ei等(1979)の方法に実質的((従って
l゛:、col、i K 12294 に導入する、ア
ンピノリンとテトラサイクリンの両者の存在下に生育す
るコロニーを・選択−4−ると、これらのコロニーFl
、81)8ポリアクリルアミドゲル電気泳動(八1ai
zel、・Jr、、197]、)により、79i嗜(7
)フラスミトpH17,h4ム] k含み、l; rp
L L:’−プロインンーリノ融合物かりr想される分
子量を有する蛋白で発現することか見出さ÷しブζ。 」二連の蛋白を発現するグラスミドpHr7 、゛、
4・\1は、組み込まれた遺伝子およびベクター両者の
1)NA配列粋よび制限サイトにより完全にその苛性を
決定した。プラスミドp1117 w 4ハlに添イマ
1の第5図に示した。このプラスミド&1−ア7ピシリ
ンおよびテトラサイクリン耐性全回復しているため、容
易に選択できる。 実施例5 pDlloの〜27k l) 、I’st
lフラグメントの分離 ゲラスミ1.pJ)J ] Qの〜2.7 kb PS
t 1フラグメントは、Hhallに!特異性の制御堰
および修飾遺伝子を含んでいる。町co]i Kl 2
294/ pDI 10から分離した、共有結合で閉環
した環状pH110約15μgを、Pst l制限酵素
により37′Cで完全に消化する。この反応混合物は、
pL目10溶液(実施例1でA製ン約35tie、10
XPstl緩衝液(1,00mMのMgC1−2,50
QmMの(N l−1+ )280 aおよび20’O
mMの′I″r i、 s −HCl。pH75) 1
511e、牛血Wrフルフミン(1mg/ln1. )
15/16、水775/Je、およびJ’stl制限
酵素(l New Englarld Biolabs
単位/li(’j ) I 75plJ ’ix含有し
ている。制限処理したl) N Aを、T HE ()
リス塩基10.8gm、硼酸5、5 g、m s Na
2 El)TA 、 Q 9 gmを水1e中に含有
)中の、8係アガロースを含有するA OIG (アガ
ロースゲル電気泳動)により、分画する(15時間、2
20ボルト)。このバンドは、エチジウムプロミド(、
51i(t、/ ml! )による染色と紫外光の下で
の観察でijJ視化Jる。所望のフラグメン)を切除し
て、′1゛1旧゛:中で150ボルトで1時間電気溶p
;1Fする。I)NAi平衡緩衝液(KOl、 I A
4 J:、’よひTr i 5−11011QmMo
pH7,8)で平衡化し/仁1) E A Eセル。 −ス(Wl]atman I)E’52 )と結合させ
、平衡緩衝液でカラムを洗浄後、I) N Aを溶離緩
衝i (Na、(ニー11八4およびI’riB−[L
Cl l Q mM 01u117.8 )で溶出する
。溶離液を、Na イオン濃度につい−Ci’J:は
ぼ、35Mとなるほうに1120で調節し、次しここの
I)NAl、100%エタノール2倍量の添加および一
20゛Cで1晩冷却することにより沈殿させる。目的と
する沈殿を遠沈して集め、乾燥し、Ill t、”に溶
解する。 実施例3 Pstl消化プラスミド[)TA7へ4へ
1の分離 実施例2で調製したプラスミドル1.Aフハ4△1約、
5μgを、実施例5と実質的に同様の方法Vこより、P
stl制限11¥素で37″0で3時間消化する。 制限処理した1)NAを、標準手法しこより、フェノー
ルで1回、クロロホルム:イソアミルアルコール(24
:1)で2回抽出する1、この溶液を3Δ1の酢酸ナト
リウム(pit 8 )。1容量と混合し、エタノール
22容駄を添加し一晩−20”Cr&ζン令去IJ−す
ることにより沈殿、\せる。目的とする沈II役ヲコ屯
沈1゜て集め、乾燥し、III Eに溶解する。 実施例7 .1’stl消化プラスミドY〕1B7へ4
へ1の分離 実施例3で調製(またプラスミドp1B7へ4△l l
)、5pgt、実施例5と実質的に同様(、り方法によ
り、1’r+1−.1制限酵素で37′Cで3時間消化
する。τIll限処理したI) N Aを、標準的手法
により、フェノールテ1 回、クロロホルム゛イソアミ
ルアルく2,’I : l)で2回抽出する。この溶7
11を3へ4の酢酸ナトリウム(pDI8)、1容量と
混合し、100チエタノール2,2容量を添加し一晩−
2 0 ”c +c ?令去1)することにより沈殿さ
せる。目的とする沈殿を遠沈して集.V)、乾燥し、j
ll F,に溶j宵rる。 実施例8 プラスミドp l) 1 1 0 (つ〜2
. 7 kb I’st■フラグメントの、Pstl消
化プラスミド△4△lへのリゲーション P8目消化プラスミドp 1. A 7△4,へl約.
2 titf−よびプラスミドpl)110の〜2.
7 kb I’St 1 フラグメント1. 1
pg.f:、TE/10ビI’ri6−11(4.1.
] mPw1( pH 7. 8 )、Na214:
DTA 、l IIIAI ] 4001’e 中で
混合する,、3Mの酢酸ナトリウム(pH13)、1容
計を添り日f多、このI) N Aを100%エタノー
ル22容量の添加および一20″Cで一晩冷却すること
Vこより沈殿さぜる。目的とする沈殿全遠沈しーCM.
め、乾燥スル。lhU中(7) IJ N A 2 p
e, 5 X キナ− −L’ −リガーゼ緩衝液L
MgC1.2 50 m M 、 ジチ」“l・レイト
−)b2 5 mA4, Tris− 11(
−h 250 mM ’( Tal+78)
、および25%グリセロ ルJ 、6/Ie, 、66
11、M 4−) A i” lo.6 pe, オ.
1: (j: T41) N Aリガ ゼ・117、6
(1単位/μ6)を含有する反応容量3. :3 pe
の溶液中でリゲーションを行なう。この反応混合1勿l
/ユ15°Cで一夜インキユベートする。 実施例9 グラスミドpl)110の〜2. 7 kb
I’ct1フラグメントのl’stl消化ブラスミl
’ p l IS 7 l。 4△1へのリゲーション ブラスミドpLA7Δ4△lの代AノリにI’l;iメ
肖化プラスミドplB7へ4へlを使用−rる以外性、
実施例8と実質的に同様にして所望の1ノゲ−7ヨンを
遂行する。反応混合物は15°Cで一夜インキユベート
する。 実施例10 町coli K12 RV3Q3/pP
R,26および1弓、 colj K12 +tv3o
s、’pr’It27の組み立て並びにグラスミドpP
R26とp P H,27の分離実施例8で調製したリ
ゲーンヨン後のD N A約、1μgt、S S C/
l OVCJ: 、!:’ R終容量50 pe ト
なるように希釈する。この1)NAを、実施191月と
実質的に同様の形質転換手法によつ−C、コノピデント
E、C01IK12I(■308に導入する。所望のE
。 coli K12 RV308/pPR25および1つ
、 C01j K12 ItV308/pPTL27形
質転換体を、テトラザイクリン5μg/祠を含有する1
・寒天上で培養することにより分離する。分離物を試験
してテトラ−リイクリン耐性とアンピシリン感受汁を確
認する。 j3aZaralおよびHe1j n5ki (196
8)の分離手法と実質的に同様にして、適当なコロニー
を、共有結合で閉環(7た環状プラスミドI) N A
の分離に使用する。このプラスミドの構造を、制限エン
ドヌクレアーゼ開裂サイト地図を作成することにより確
限フラグメントハ、どちらの方向にも挿入され得るので
、2方向のプラスミドか得られる。従ってプラスミドp
i’ R26およびpPR27、並びにそれら各々の
形質転換体を上記手法において分離する。 実施例11]り、 coli K121tv30B/p
Plt2BおよびE、coli K12 RV308/
pPH1228の組み立て並びにプラスミドpP1t2
8とpI’H,1228の分離実施例8で調製(−だリ
ゲーンヨンI) N Aの・代わりに実施例9のものを
使用する以外は、実施例11と実質的に同様の方法で所
望の組み立てを行なう。 目的とする1つ、 coli Kl 2RA・’308
/pi”11.28 およヒE、coli Kl 2
JLV308/pP1(1228形Ti転換体を分離し
、各々のグラスミドの構造を、制限エンドヌクレアーゼ
開裂サイト地図の作成により確認−f7)。このグラス
ミドを含む〜2.7 kb Pst I 制限フラグ
メントハ、どちらの方向にも挿入され得るので、2方向
のプラスミドが得らホLる。従ってプラスミドp 、1
’ IL28およびpI’1t1228、並びにそれら
各々の形質転換体を上記手法L・こおいて分離する。 実施例12 睨C01i K121tV308/pl
’R29ノ組み立ておよびプラスミドpI’ R29の
分離ゲラスミ)pPIt27は、塩基対位置はぼコオー
デイネイト331に1個のBg」、 II制限ザイトは
ぼコオーデイネイト2334のM ii!i IIC1
個のAVa1サイl−を有する。シラスミドpPlt2
7 (実栴例10 で調製)約8I1gヲ、37°Cで
、i+r18− IfC,+ 20mA4 (pH7,
4)、Na(−;1 3Q mM 、およびAva、
I if川用酵素16単li′/、(1110・、2単
位/11(! )を含イj才る反応液15011e中で
完全に消化する。ここVこIO×叩]11緩衝液(1八
1の′p、]8−IIC」(+)118. O)、Mg
” J 250 m R1およびNa1l 600+n
八’J2011/J1水25pe、および13g1[I
制限酵素(New Engl−andBiClla、b
s、16単位/ t4J ) S peを加え、37°
Cて60分間、次いで65゛Cで5分間インキュベート
する。この制限処理D N Aは、実施例5と実質的に
同様の方法を用いてACEにより分画化、次いて所望の
〜62kbフラグメントを電気溶離および1) E A
E セルo −スクロ? ) り57 (−H′コア
’I” I!;中に回収する。 ゲラスミ1−pHI 7 、\4/司に、」ふi−X対
位置はぼコオーティネ(+・331f/こ1個の1舅1
11制限ザイト、はぼコオ−ティ不イ) 2614の位
置に1個のAVa1ザイトを有する。実施IFIJ 4
で調製したグラスミドpH17,”、4何約15/1g
’(ix、+ie 実/V 例12 Aと実質的に同様
の方法Vこより、AvalおよびHg111制限酵素(
(て完全に消化する。制限処理した1)NA山実施例5
と実質的に巨1様の方法により、A(冊゛〕で分画し、
次いで電気溶離ら・よびIJ l!; A II;セル
ロースクロマトグラフィ−シこよってi’ l=+中に
回収する。 ゲーノヨン プラスミドp P 1.(,27の〜6.2 kb、
Ava、 l−13g1 Ifフラグメント(実施例1
2Aで調製)約2.3pg、およびp、tl 1.7
へ4 ヘ1の〜2.3 kb Ava、 I JSgl
、 iJフラグメント(実施例1213で調製)約、8
51tgをII+1!: 5701ie中で混合し、実
施例8と実′H的ケご同咋の方法でエタノール沈殿させ
る。回収シ/ζJ)NAを、5×キナーゼ−リガーゼ緩
衝液2pど′1,66打l” ノA”” P 2 pe
−水67’4 オ、J: ヒTI I) N A I
J jj −セ(1単Iff /pe ) 、 I p
13 ’x含む反応液10.1 //(4中でリゲ−7
ヨシする。この反応混合物を90で一夜−fンキュヘ−
トし、既知の方法に従って所望の1)NAを回収する。 実施例8て調製したリゲーンヨン後J) N Aの代わ
りに実施例120のものを使用する以外(1実施例10
と実質的に同様の方法により、目的とする組み立“r−
1行なう。目的とする1、。。]、4 K l 2Hν
308/pPl(29ヲ分離し、制限エンドヌクレアー
ゼ開裂サイト地図の作成により、このプラスミドの構造
を確認した。 以上に記載の方法に従って組み立て可能な代表的形質転
換体を、以丁の表3vこ挙げる。 表 3 代表的形質転換体 1、 E、 coxi KI2 294/pJ’J
L262−!≦0匹旦 [12294/p”K273
」≧、 ccとコ、」−Iぐ12 294/p
Pit284 3、二カニ K]2 294/p”Hl
2285、 l≧、 工≧32−コ4コニ KI
2 294/丁・P IL2 g6 ↓6匹二 K
12 、/p P IL277 μ、且暖ユ K]2
C600/pPH268火、旦旦主土 K12 (じ
6 Q O/p P几279 μ9匹旦 K12 ”
’600/pl’H2310μ、二旦 [12C6Cl
0/pl’Jul 22811t1匹二 K12 C
600/pPH,2912上・9旦/p ’ IL27 13 火、 エソ?ユニし KI2 C6H1
+、に−八’に一/p門L261.4凹coli K
12 C600H,、、1ull−/pl’J715
蛇、旦止しエ K12 C6QQR,、R・lk
/pl’H12816秒、 coli K12
<シロ00H,に−八゛’ k−/pl’RI228
17 1;、 □9,5とコニ1エ +(
12(シロ 00 H,に−八I k−/p I’
+?・2918 μ、三二 K12/p I’ R
2819、1!:、 coli KI2 Hl(1
(Jl/pl’+(2620μ0図旦 K12 11J
QI/pl’H・272j、 E、 coli K
、12 J:IBIQl/pPH,2824E、
胚l j、 / p J’ R2831ル 圧i i
/ p l’ I(,29
導入された後、この宿主細胞がバクテリオファージ感染
から保護ンΣれることか、必須ではないにせよ、望まし
いからである。形質転換培養体がバクテリオファージに
感染され易いということは周知であり、感染すれば全個
体が溶菌することから、このような保護は極めて重要と
なる。生産物の遺伝子(による発現iTj、目的とする
生合成が実行されるに十分な期間生存し得る宿主細胞に
依存するのであるから、感染を受けた培養体の生産能は
低下する。 微生物のファージ感染は周知の現象である。バクテリア
に感染した場合のウィルス、即ちバクテリオファージは
、通常、宿主の細胞膜に接触し、吸着し、これと反応す
る。吸着することによりファージの染色体または遺伝物
質は宿主細胞に入り込み、宿主の細胞機構が服従する、
新しいファージの生産にのみ陸用される工程が開始され
る。宿主細胞は成熟したファージで満たされ、次いで溶
菌するが、これは通常、最初の感染から約30分以内に
起る。この新しいファージは感染性であり。 利用できる宿主細胞が全て破壊されるまで、このす・1
り)しが繰り返される。 E、 C01iの大規模発酵による組換えD N A技
術の応用Qユ、これまで前記のようなファージ感染の問
題によって妨げられてきた。′4f実、種/2のバクテ
リオファージフローラが関係している感染が、目的生産
物の生合成を阻み、不可能にする主要な因子である1、
この問題は、大規模発酵の際には極めて重大となり、E
、colj形質転換個体の多額なかつ決定的な損失をも
たらすことになる。 本発明は、天然におけるバクテリオファージ感染からバ
クテリア形質転換体を保護するだめの安価で効果的な手
段を提供することにより、このバクテリオファージの問
題を解決するものである。 これは、1−(ha11部位を含有する外来性D 、N
Aを消化する制限系を、宿主細胞に供給することG′
こよってなされる。このJIha U部位は、天然に存
在するほとんどのウィルスに見いだされており、故に本
発明は広範囲の厄介なバクテリオファージに対して有効
である。即ち、ファージI) N Aが本発明に係る宿
主細胞の適所に入ると、l1ha IJ制限エンドヌク
レアーゼが、このI)NAをHha 11部位で消化し
、ファージを非機能性かつ無害なものとする。 このようにして宿主細胞のバクテリアに天然に存在する
バクテリオファージから保護され、培養体の生産性が確
保されるのである。この方法は、有利である&Jかりて
なく、本技術分野における著しい進歩をなすものである
。 E、co」i および曲のバクテリアの大規模発酵に
併うバクテリオファージの問題3七解決する方法は、他
にはほとんど無い。事実、バクテリオファージ感染は極
めて無菌の条件下でも起こり、一度感染すれば、これを
除くのは極めて困難であることが知られている。かかる
除去は可能でにあるが、それ(1非常に繁雑で、しかも
時間および損失生産物の点&c:l−・いて高価につく
。 以F″に訛載−rる本発明の理解を助けるために、以下
に用語を定義する。 機能的ポリプチド:回収可能な、生物学的に活t’Jユ
な、全゛C外来性のポリペプチド−11:J、I−前駆
体;外来1(!:ポリベグチドと内性ポリペプチドの一
部または全てからなる、回収可能な生物学的に活性なポ
リペプチド;特異的に開裂ijJ能な、生物学的(・こ
不活性化する内性(固有の)ポリペプチドおまひ外来性
ポリペプチドからなる、回収+iJ能な生物学的に不活
性な融合ポリペプチド;もしくは酵素機能を有するポリ
ペプチド。 融合遺伝子生産物:内性ポリペプチドの全部斗たは1部
と融合した回収可能な外来性ポリペプチド。 マーカー:染色体上または組換え1) N Aクローニ
ングベクター上の位置および機能が既知の遺伝子または
それらの組合せ。 形質転換体;形質転換を受けだ受容菌宿主細胞。 感受性バクテリア:ファージ存在下で増殖すると感染を
受けるバクテリア。 制限フラグメント:1またはそれ以」二の制限酵素の作
用によって生成した、プラスミド、他のベクター捷たは
染色体DNAのあらゆる線状部分まだはその全体。 挿入異性体:1個のJ) N Aフラグメントが、受容
体1) N Aの2またはそれ以上の適合部位のうち0
1箇所に挿入されて生成する、2捷たはそれ以1−の用
油な組換えl) N A分子のうちの1個。 It −、M系:制限:Iチ・よび修飾系。 AlI3− アンピノリン酬性表現型。 A11l11” アンピシリン感受性表現型。 +p、シ11.テトラリーイクリン耐性耐性型現型I+
01; 9 、テトラザイクリン感受性表現型。 具体的には、本発明は、組換えD N Aクローニング
ベクターによりバクテリアを形質転換させることからな
る 天然に存在するバクテリオファージから該バクテリ
アを保護する方法に関するものであり、かかるベクター
に、 1)該バクテリアに制限活性および同起源(Cogna
te)△ よび、 3)該バクテリアにおいて機能的ポリペプチドを発現す
る遺伝子、 含有することを特徴とするものである (/こだし、1
)」二重の天然に存在するバクテリオファージに、該バ
クテリアに伺与された制限部1’l:と同じ特異性の制
限部位を有する二重らぜん(2本鎖)IINAを含み、 2)該修飾活性に、該バクテリアにおいて、制限活性に
先)′/Xつて発現される)。 特異的活性の制限部位を有する二重らせんI) NAを
持った天然のバクテリオファージから、ノくクチリアを
保護する方法Uこ有用7に組換えクロ−ユニ・グベクタ
ーは、 1) a)同起源の修飾活性、および b)該制限部位と同じ特異性の制限活性、を、調和よく
、かつ連続的C・ζ発現する遺伝子を含む1) N A
セグメント、 2)該バクテリアにおいて機能する複製単位(レプリコ
ン)、および、 3)該バクテリアにおいて機能的ポリペプチドを発現す
る遺伝子、 を、結紮(寸たは結合) (Iiga、be)すること
により調製される。 さらに本発明に、前記方法に使用されるクローニングベ
クターおよび形質転換体に関し、本発明は、組換え1.
、) N Aにより暗号化された生産物を生産する微生
物の大規模発酵の成功計確実C・てするだめに、重要で
ある。制限および修li系が存在しないと、多くの培養
体はバクテリオファージの感染を受け、そのために目的
生産物の生物学的生帝は低下する。 本発明を例示する為に、lIaemophi]、us
haemolyticusのl1ha1.1制限−修飾
系を使用する。1(11a、 II且−A1系を含む遺
伝T−は密接に連結しており、1lha I+制限工/
ドヌクレアーゼおよび同起源の酵素メチラーゼを合成す
る。I:IhaLl制限酵素は、(3A N T C−
とCi’ N A U いう配列を持つ/ξ二重らせんl) N A (以下、
との配列を1.11−+a、 I−1リ−イトと呼称す
る)を認識、開裂[7、一方、同起d・;1の修飾系は
、前述の配列を含むヌクレオチドをメチル化する。メチ
ラーゼ酵素修飾系は、1.’、Iba II制限酵素が
生合成される前に発現されねば、ならないことに、当業
著には理解されるであろう。この」:うにして、Hha
11 1t −M系を含む組節[11+a、 11消
化から保護されるが、1lhallザイトを含む非修飾
外来性二重らせん1) N A Ii、その消化を受け
ることになる。こうした理由で、11)〕a111、(
、−M系は本発明を例示するという目的にとつ−C理想
的な系となる。 さらに、詳細には、本発明は、プラスミドpl)Jl
0+7)〜2.7 kb 、Pst I 制限7 ラク
メ71・kインシュリンA鎖のプラスミドpJ、A 7
、\4△1にクローンすることで例示される。プラス
ミドp、IA7△4へ1に、■弓、 coli のトリ
プトファンプロモーター、抗生物質耐性マーカー、およ
びヒトインシュリンのAポリペプチド鎖、L:融合した
E、 CO’1.i K 12trpl!+蛋白質の一
部分′2含む融合遺伝子生産物を発現する遺伝子を含有
している。プラスミドpIA7△4へ1の制限サイトお
よび機能地図を・、添1・1の第1図に示す。 ブラスミ1.pI)11 Qの〜2.7 kb I’s
l; Iフラク゛メン) i−,1:、I(ha [1
に対して特異的な制限および修飾遺伝子を含む。グラス
ミ191月10 im、J: 、NorthernI&
gional l&5earch 1.aborato
ry (1’eoria、、 111i、nOi、s在
)に寄託され、永久ストックカルチャー コレク/ヨン
の一部とな壬)ている菌株、l’;、 co:+、j
K 12 294/ pυ+10から分#/−rること
がてきる。これはグラスミド’ pl)l l Oの空
寸しい供給源および保存源Jニジて、受理番号”150
97の一口で、誰でも人T′−1jf能である。 取り決めについて述べると、符号1ΔJは除去を意味す
る。例えば、1△イ1係o H,l −Xb’a、 I
」という符合が後に記載されているプラスミド&’−
1、”co It lおよびXba、 I制限酵素サイ
トの間のヌクレオチド配列が、これらの酵素の消化によ
り除去さ7′1.たプラスミドを表わす1.捕便のため
、ある神の除去は番号で表わすこととする。即ち、親プ
ラスミ)> pJut 322におけるテトラザイクリ
ン面1姓遺伝でに先行するr’jcO1口認識サイトの
最初の塩基対(1−bp、I ) J:り始まって、1
−△1」は、bpl〜30の除去(即ち△’?JCOI
ローJ jj、n d III )、およびその結果と
してテトラサイクリンプロモーター/オペレーター系が
作動できなくなることを意味する。1へ2」は、bpl
〜375の除去(即ちAEcmJロー13am月1)、
およびその結果として起こるテI・ラリーイクリングヮ
モーター/オペレーターおよびテI・ラザイクリン耐1
住を暗号化している構造遺伝子の一部分、の両者の除去
を意味する。 そして「△4」は、trpオペロンノラグメノトがらt
rpDボリペグチドの構造遺伝子を取り除くbp〜90
0−〜150oの除六を意味する。 グラスミドpDIIoの〜2.7 kb I’st l
、IlhallR−M遺伝子含有制限フラグメントの
ゲラスミうなバクテリアを、天然に存在するバクテリオ
ファージ感物から守る。プラ、スミドp I’ 1.t
26とppH・27の各々の制限サイト地図を、誰何
の第2図((示す。 さらに本発明を例示説明するため((、新規プラスミド
p、P 1t2 BおよびpJ’R1228を組み立こ
ることもできる。プラスミドp P It23とpPJ
171228は、プラスミドpD110の〜2.7 k
l)Pst i 1.Ihal(・−へ1遺伝子含有制
限フラグメノトをグラスミドp 、1. B 7Δ4へ
1に挿入する結果生成する。プラスミドp 1. J3
7△4△1ば、E、 coli のトリプトファンプ
ロモーター、抗−生物質耐性マーカー、およびヒトイン
ンユリンのI3ポリペプチド鎖と融合した1°:、 c
ojj K 12 trp l>蛋白質の一部分を含
む融合遺伝子生産物を発現する遺伝子を含有している。 プラスミドp P It2 BおよびpPILI 22
8も壕だ、例えば種/7のE’、 co]、i菌株のよ
うなバクテリア応天然G・こ存在−j−るバクテリオフ
ァージから保護する。 グラスミドp i B 7へ4へ1およびプラスミド1
.+ 1坩28と1〕門J228の各々の制限サイト並
びに機能地図を、それぞれ添何の第3図すよひ第4図に
示す。 プラスミドpI’ 1t27の6.2 kb Ava
l −13g’L 1111ha II ”・−M遺伝
子含有制限フラグメントと、グラスミドpI:+] 7
△l △4の〜2.3 kb AVa、 1.−8g
111制限フラグメントとのリゲー/ヨン(結合)の結
果、新規プラスミドp、PR29が生成する。プラスミ
ドp、1I17Δ4△1は、E、 CO]iのトリグト
フフ′ンブロモー ター、抗生物質耐性マーカー、およ
びヒトのプロインシュリンポリペプチドと融合し生産物
を発現する遺伝子を含有している。プラスミドp I’
It29 IrJ−1制限および修飾活性を付鳥いか
くして例えば種1tの綻cO1i菌株のようなバクテリ
アは、天然に存在するバクテリオファージの感染から守
られる。プラスミドpH17へ4へ1お、l:びpPl
(,2gの制限サイトおよび機能地図は、そ−hぞれ添
イマ]の第5図および第6図に示した。 本発明に極めて多方面!で渡る応用性を有し、ぞの合成
が、組換えD’N Aクローニングベクターを含む1.
) N Aにより規定されるが、ある“いは内性(固有
の)代謝経路により規定されるあらゆる物質の生産に本
発明方法を適用することが1きる。 本発明の説明の目的に好捷しい組換えi) N Aクロ
ーニングベクターはプラスミドであるが、バクテリオフ
ァージ、コスミド、および他のベクターも捷だ使用する
ことができ、それは当業者には明らかであろう。本発明
は、その修飾1幾能が制限機能に先立って整合的(調和
まくり発現される1wす、△ いかなる制限および修飾系のだめの遺伝子も使用できる
。不発萌:ノ)有用I牛(・ゴ、クローニング−ベクタ
ー中にクローンされたマーカー捷/ζは他の遺伝子とt
91−無関係−Cあろので、商業的゛4たは研究的両値
を有する1′i/こQまそれ以−l二の遺伝子−をtt
1つ組換え菌株もしくは他の菌株に対し、本発明を適用
することがIIJ能である。 本究明の好ましい態様(−1、天然に存在する〕くクデ
リAファージからバクテリアを保護rるために11ha
、 II特異性を有するプラスミド担持の制限IL−よ
び修飾遺伝子−を使用することである。さらに、他の特
異性を持ったR −M系遺伝子を使用することもできる
。これらの遺伝子には、例えは]ゝSシlH,−M系(
Wa]der等、 1981 、 Proc、 Nat
l、Aca、d。 HCl、 I’ S A 78(:3) 1503)、
l・:+: (1・l(,1It −M系(+Ia、c
k等、 1980 、 、Fed、Proc、 Fed
、 Am、 8oc、ICxp、 13ioL 39
:1875)、およびTaql tt−M系(La、n
n−11siajn等、 I 982 、 l”ed
era、tionProc、 41 : 5427 )
がある。Taql、 R−M系の遺伝子は、へIann
等による1978,0ene3 : 97に記載の方法
と実質的に同様の方法によって、’rhermus a
quaticus ’1’T−1(Llrock :
t、−よびJ’reeze、 l 959 、 J、
of BacLerjalogy、98 (1):
2 8 9 、 type 5train
A’1’(](’ )I62 5104 )から常法
によりクローンすることができる。l I h all
R−M系と同様、この修飾遺伝子は制限遺伝子より前に
発現されねばならない。rll]a、 11−4だは他
のIt −M系直伝子と別個に、寸た11組み合わぜて
上記遺伝子群を使用すると、天然VC育在するバクテリ
オファージからバクテリアを保護することができ、従っ
てこれらもまた本発明の範囲に属する。 天然に存在するyくクアリオファージからバクテリアを
保護する本発明方法は、■Φ、72の有用な生産物を発
現する遺伝子を有するベクターを含有する宿主細胞に適
用することができる。1(1M遺伝r−は別個のベクタ
ーに保持されCいギもよいが、1(・−A4遺伝)は、
有用な生産物を発現する1貞伝子°i含むプラスミド中
に、同時にクロー ンすることが望ましい。有用なポリ
ペプチド生産物を発現する遺伝子は、天然に存在するも
のであっても非天然のものであってもよく、また一部は
天然のもので一部は合成もしくは非天然のものであって
もよい。 より詳細(C述べると、H,−M系遺伝子は、ヒトのグ
レープロインシュリン、ヒトのグロインンユリン、ヒト
インシュリンA鎖、ヒトインンユリン!3鎖、ヒト成長
ホルモン、ヒト以外の成長ホルモン、牛成長ホルモン、
ヒト以外のインシュリン、ヒトインターフェロン、ヒト
以外のインターフェロン、ウィルス抗原、ウロキナーゼ
、抗生物質耐性e 、f=J1−、するあらゆる酵素、
あらゆるペプチドホルモン、あらゆるペプチド酵素、ま
たは実質的に研究もしくは商業的ffflif直を有す
る他のあらゆるペプチド類を暗号化し、発現する遺伝子
を含むプラスミド中にクローンすることが可能である。 本発明のある実施態様においては、プラスミドの複製お
よびポリペプチド生産物の発現は、それぞJLpM1月
からのpol A遺伝子要求レプリコン(Holva、
r、1979. Lif e Sci、 25
:807〜818に開示されている)およびtrpプロ
モーターによって決定される。他のレプリコンおよびプ
ロモーターも、それらが特定の保護されるべきバクテリ
ア形質転換体中において機能する限り&、U、1史川す
ることができる。当業者に汀、牛1定のバクテリアにと
ってどのレプリコンおよO・ブロモ ターの使用が好ま
しいかは、既知であるか、または容易に決定できるであ
ろう。他のレプリコンの例としては、C011り1.N
R1、H,r< 2.1目(61,S(]101、it
P 1、ltP、4.1゛のレプリコン等があり、E
、 coli K 12中で複製を行なうバクテリオフ
ァージもこれらに含まれるが、これらUこ限定される訳
でidない。他のプロモーターの例としては、バクテリ
オファージλPIJプロモータ 、リボプロティンプロ
モーター、]、a、Cプrjモーター、リボゾーム蛋白
質重たはIt N Aプロモーターなどが含、・tJ−
Lるが、これらに限定される訳で杓なく、事実1−他の
いかなるプロモーターも含寸れる。種々pレプリコンお
よびプロモーターを組み立て、本発明のIt −AI系
遺伝子含有ベクターに使用することができるということ
は、当業者にに1理解できるであろう。 E、 Co11に関しては、遺伝学的および生化学的情
報が豊富であるので、E、coliが本発明目的に沿っ
た簡便で好ましい宿主バクテリアである。さらに、1つ
、coli K l 2は組換えI−) N A技術
による物質の生物学的生産Vことって選り抜きの宿主で
あるから、この微生物の菌株に対して本発明を適用でき
ることは、極めて有利である。既述したように、E、
coljO大規模発酵は、ファージ感染に付随した困1
α1fが伴なう。本発明はこの問題を実質的に解決し、
それ(でより生合成生産物の商業的生産(Ll’tJ’
能にするものである。 本発明方法は1種類の属、種寸だは菌株に限定されるも
のではなく、It −M系遺伝=r−をクローンしイj
jZ)微生物々らj−fいかなるものVこも使用′丈る
ことかできる。例えば、本発明Qま一般に原核生物に適
用でき、さらに詳細Vこは、刷coli、l弓、 co
liK 12.1′J、 coli K l 2 29
4 (0oedd、el等。 1979 、 l’roc、 Nat、 Acad、
Sci、 t18A 76:106に記載)、E、 c
oij−K 12RV 3 Q 3 (M3uer等
1 gB□ 、、1.Ma]、Biol、I 39
: L47に記載)、E、 colj Kl 2 C6
00(Ba+::hman、 I 972゜Bacte
riol、Itev、 36 : 526 K記載)
、1号。 C01i t< 12 C(3Q Q H,に−Mk−
(Cba、ngおよび(’:o b e n 。 1974、Proc、Nat、 Acad、 8cj、
、 USA 7];1030 に記載ン、1す、 c
oコ1K12111稍01(1う011−ver等、1
977.0ene 2ニア5に記載)、■気coli
K12BE827 A’l’CC31911,B、、1
.cill、uS。 Ba、 c j、 ]コus 5ubtilis、
Bacj、1.’1.uS ehuringjenS
j、e。 Bacillue megateriumv 5tap
hylococcus、 8trep1;+〕−coc
cuS、Actinomycetis、5trep+、
omyces、Agrobac−しerium、5er
ratia、 I’seudomona、s% ’i含
むノ(クチリアに適用できるが、これらに限定されるも
のでV′、1なく、バクテリオファージ感染を受は易く
、1(、−M系遺伝子をそれにクローンできる〕くクチ
リアならば、いかなるものも使用可能である。 本発明の打型しいクローニングベクターG1、シラスミ
ドpJ’lL;ビア、p I) JL2 g、および1
)1ゝ1(・29であおよびE、 coli K121
LV3Q8/pl’ll・29が金型れる。これらの、
および他のす−〈ての本発明のm4施態様は、天然に存
在するバクテリオファージ感染からバクテリアを保護す
るという共通の′特徴を分かち持つものであり、故Qc
本発明rよ、ファージ感染、溶菌、およびこれらに併う
生合成能の損失という実際の危険を併うことなく、組換
えI) N A含有微生物の大規模発酵を行なうことを
可能にするものである。 以下の実施例において本発明をより詳細に説明する。本
発明についての説明、ら・まひ本発明5’f構成する具
体的7ン方法を、適宜記載した。 実施例1 プラスミドpD110の分離および調製 プラスミドpl)1.10のDNA約1 /l(1(E
、 coliK12294/pJ)110(”’RL
[3−15097)から、I3a、za r a、
1およびHe1inskj によりJlMOl。 13io1.36 : I 85 (1968)に記載
の分1+jk方法に実質的に従って分離〕を、TIり緩
衝液C] m MのE l) i” A (エチレンジ
アミン四酢酸)と10mMのトリス−11CIopH7
,8)に約20 t’g/nl’の濃度となる様に溶解
する。l!;、C011K 12 294は1乞k M
k 宿主であるので、グラスミドI)NAi、j。 EcoK特異性に従ってメチル化に上り分tent:で
きる。 この溶液約5.ie(約O1μビのJ) N Aを含有
)足、S’SC/IQ(88G−標準食塩クエン酸緩衝
液、S S C/ l Q[NaC115mへ′1およ
びクエン酸ナトリウム(Naa) 1.5mMを含有
、pl+7)E↓す50tte、に希釈−ノ”る。次い
てこの88(−: /10. 1)NA溶液約25 I
I(lt 夙coli r(12C6001(、k−M
k−(IJ)Jンピテント1匠濁液50p(!と混i7
7る。 ”、 COl、Kl 2C5QQ Itk−八+k((
:har+g #’+、ヨヒCohenによる1 97
4 、 Proc、Na、t、 Aca、d、 5ci
USA 71:1030に記載)のコンピテント野ン蜀
液Cat、当業者により常套の方法で調製される。した
かつ−〔、新しい一夜経過した1・−ブロスl]へ4t
ll−er。 1 9 7 2 、 Experiments
j、n Mo1.ecu’、1.a、r Uene
しice。 にO1d Spring l1arbor Lab
ora、t;ory ((:<ld Spr団4(1
1a、rbor、 New York在)による〕中の
培養ヲ・、新しいL−ブロス中で副次培養(1,、/1
0 )L、370で1時間増殖させる。計660.1(
]、 e t、 を単位のt(II l1flJ全収穫
し、100mMのN aC」、 ’;1.5 nleで
洗浄し、150 tn A4の’;a’−’122.5
+mにLj?mL、室+RT 20分間インキュベー1
・する。この細+1i!!を取り、150 In A4
の(,1aC]、 2および10%のグリセロールを含
む溶液051扉に再懸濁し、氷で3〜5分間令囚jし、
次いで凍結させる。この凍結したコンピナンl−細)回
りよ、使用時まで液体窒素中(lこ保存する。保存ない
し貯蔵は、共有結合で閉環した環状プラスミド1) N
A (itl 、J、る形質転換類IWはンlζQよ
生存能力(lζ悪影響を及はさなかった。この細胞懸濁
液を水泡中で溶かし、形質転換用1) N A 1/2
容量と混合する。 この形質転換混合物を氷で20分間冷却し、42Cで1
分間の熱ンヨツクを匂え、氷で10分間冷却し、次いて
1・−ブロス5.7容量で希釈し、最後に:37<yで
90分間インギュベー 1・する。 形質転換体は、デトラザイクリ712.51ig、/l
uiを含有する1・−寒天上で増殖させることにより、
分離する。分雛物のテトラサイクリン耐性およびアンピ
シリ/感受性を試験により確認し、目的とスルE、 c
ol、j K I 2 C600lLk−Mk−/pJ
)I I O形質転換体であることを確認した。Baz
a、raI および適当なコロニーを、共有結合で閉
環した環状IJNAを分離するために使用した。このプ
ラスミドの構造を、制限サイト地図を作成することによ
り確1都した。 実施例2 プラスミドル■へ7ハ4・へ1の組み立CA
、グシスミドpB l(・■1trpの組み立てプラス
ミドp(3八11は、7・1汁: I 413といつ欠
失ヲ有するE、 c 01 iのトリグトファンオペロ
ンを担っており(A’1iozza、ri等、1978
、11. ISacterjo−alog、 14
57〜1466 )、このI’tめt r pリーダ
の最初の6個のアミノ酸と、はぼ最後の1/3のシy−
p1′;ポリペプチドからなる削(合蛋白(以I・、合
せて1・E と記載する)、並びにt]−ρ1)ポリペ
プチドの全体を発現する(こJC1つは全こし]pプロ
モーター−オペレーター系の支配Fにある)。1′:。 colj K12 W31 10 tna2 t
rp△102/pOA4 1 Fl、America
n i’ype Cu1ture CO」−J、ect
ionに寄託さ:hCおI)(ATCC/I63]62
2 )、pUA41 t(K 以下に述べる方法に従っ
て使用のために、この菌株から常套の方法で取得するこ
とができる、上記プラスミド約20/’p;を制限酵素
1.’vulJで消化すると、5個の部位で開裂する。 次にこの遺伝子断片を、l’JcOI口 リンカ−(配
列: pD A T CiA A T i’ CA 1
.” (iを有する自己相補的オリコヌレチドからなる
)と結合し、て、後にl’r 0□ 、1(、Iザ・C
トを有するシラスミドにクローンするだめのI弓Co1
(・1開裂ザイトを供給する。p(3Mlから得られた
この1.) N Aフラグメント20tigを、5′−
リン酸化合成オリゴヌクレオチドp OA T (I
A A i”I” CA i’0200ピコモルの存在
下、T、D N Aリガーゼ緩衝W (20m Mのト
リス(pH7,6)、0.5 In MのA i冒)、
lQmMのへ4gC12,5mMのジチオトレイトール
)中、’I’41)NAリガーゼ10単位で一夜4゛C
で処理する。次いで70°Cで10分間加熱してリゲー
/ヨンを停止さぜる。リンカ−をIりcol(・1消化
により開裂し、Eco几I末端を有するようになつ/ζ
フラグメントを5係ポリアクリルアミドゲル電気泳動く
以下l−1’ A OE Jと呼称する)を用いて分離
する。最も大きな3個Dフラグメントを、まずエチジウ
ムプロミドC・こより染色し、次に紫外線を用いてその
位置を決定し、所望の部位をゲルより切り離すことによ
りゲルから分所1する。 ゲル断片の各々を300μeの、I X i’13Fと
共に透析バッグに入れ5.IX’l’旧゛;緩衝液(1
’ 1目ら緩衝液は水Il中にトリス塩基10: 8、
−m、硼酸5.5gmNa、 2 E 1)”T’ A
、 □g gmを含有する)中で1時間、100■で
電気泳動に付−r。水性溶液を・透析バッグより集め、
フェノール抽出、クロロポルム抽出を行ない、NaC」
について、2Mとする。このl) N A ’?i。 エタノール沈殿後、水中に回」[Vする。得られたEC
□RI粘着末端を有するtrpプロモーター/オペL/
−ター含有遺伝子は、次ぐと述べる方法により同定され
るが、その結果テトラザイクリン感受1′/lプンスミ
ド中にフラグメントが挿入され、このプラスミドはプロ
モーター/オペレーターの挿入りこよりテトラサイクリ
ン耐性となる。以下に述へるJ)NAフラグメントの分
離は全て、上述したJ) A (月・C5およびそれに
続く電気溶離法によって行なわれる。 テトラサイクリン耐性を発現するプラスミドプラスミド
p13H,ll l (Hod、rj、guez等、1
979゜Nuclejc Ac1d、s Re5ea、
rch 6 、3267〜3287)はアンピアリン耐
性を発現する。これはまだ、テトラサイクリン耐性直伝
子をも含有するが、これに関tうするプロモーターを欠
くのでこの面j性を発現しない。よってこのプラスミド
はテトラサ・rクリン感受性である。Ec O” ’ザ
イトにプロモー。 ター/オペレーター系を導入することにより、このグラ
スミドをテトラサイクリン耐性とすることができるン グラスミドpHILl、l 1をEC0It l tl
こより消化する。 この酵素をフェノール抽出、次いでクロロホルム抽出し
て除去し、l) N Aをエタノール沈殿後、水中に回
収する。得られたI) N A分子を、上記実施例2A
で得られた3種のl) N Aフラグメントとそれぞれ
個別に混合し、前述のようにl’41) N A IJ
ガーゼでリゲーションする。反応混合物中シこ存在する
l) N A ′ff:、標準的な技法(flersh
fj、e:ld等。 1974、 l’ro、 Nat、Acad−1’fc
i、 L18A 71 :3455〜3459 参照)
Qこまり、コンビテンl−1“:。 co]1K12を形質転換させるのに使用し、次にこめ
バクテリアを、アンピンリン20 pg、/me −L
−iひテトラサイクリン5 pg/ ml! f含有す
るL H)17−板(Mj、11er、 1972
)に蒔く。 数詞のテトラサイクリン耐柑叡口二一を選択し、そのプ
ラスミド1) N Aを分離してp HR1l l;
rl。 命名した。目的とするフラグメントの存在は、flll
限酵素分析により確認した。グラスミド1.+131L
IItr−pは、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタ
マーゼを発現し、trpプロモーター/オーペレータ−
を含むI) N Aフラグメントを含有する。この1.
) N A 7ラグメントは、trpリーダーの最初の
6個Q)アミノ酸と、trpEポリペグチドの最後の約
1//3ζカ〜融合したものからなる第1の蛋白(1,
+(、!:nl称1−る)、trp1〕ポリペゾチドの
ほぼ前半分&ζ4目・rl−j−る第2の蛋白(D’と
呼称′!る)、およびテトラヅーィクリン1制性遺伝子
Cてよって暗号化される第3の蛋白質を・も暗号化して
い乙。 C,プラスミドp S +’)へ17△2の組み立てグ
ラスミドpI(則l j;rpをEco l(、I制限
酵素で消化し、1′A(目゛:および電気溶削によって
分離することにより得られたフラグメントを、1“CC
010消化7”ラスミドp80M 11 (Jtaku
ra等、1977゜Sci、 198 :1056 、
イギリス国公告特許第2゜007.676 A号参照)
と混合する。混合物を′1゛41) N Aリガーゼを
用いてリゲーションし、得られたI) N Aを前述の
ごとく1弓、coli K12 294に導入する。形
質転換バクテリアをアンピノリン含有平板上で選択し、
得られたアンピアリンit l<)コロニーをコロニー
雑種形成(coコony hybrjdjzaい0rl
) ←0ruensしej−n等 、 1975.1
’roc、 Nat:、Acad。 Sci、’ USA 72:3951〜3965)[
よってスクリ一ングする。 pB’RII ’trp、
’より分離し、次いで1″′で放射活性標識化したtr
、pプロモーター/オペレーター含有フラグメントを上
記の方法における探査手段(プローベ)として[吏用す
る1、数個のコロニーがコロニー雑種形成(こより陽1
′1゛を示したので、これらを選択し/こ。プラスミド
D N A f。 分離し、酵素B g 11Iち・よびHaml、、l
1の二重消化による制限分析により、挿入されたフラグ
メントの方向を決定する。trpプロモーター/オペレ
ーターを適切な方向で含有する目的プラスミドを持った
コロニーヲ、アンピンリン10μg/me f 含有す
ルL 13培地(A4’111er 、 I 972
)上で培養する。目的プラスミドHpSOM7へ2と命
名し、以Fし′こ述べる組み立てに使用した。 】、 13gコ、 1.1およびBCol、(・1制限
ザイ)を暗号鎖の各々5′および3′末端に有する、I
−R;4i リペゾチドの遠1′X′L(端部)領域の
コトノを含む遺伝子フラグメントの組み立て グラスミドpSOM7Δ2を114 nd IIIで消
化、次いで1・1り暗号化領域内の13g]、 If制
限す゛イトを越えて消化するように選択した条件ト−で
ラムダニキノヌクレアーゼ(5から3へのエキソヌクレ
アーゼ)で消化する。111nd III で消化した
980M7 /\2約20Irg’&緩衝液(グリメン
緩衝e 20 m M 、pit96、MgC121r
r+M、β−メルカプトエタノール1mM)に溶Hする
。得られた混合物をラムダエキソヌクセアーヒで室温下
、60分間処理「る。 得られた反応混合物をフェノール抽出し、クロロホルム
抽出し、次いでエタノール沈殿を行なう。 Llり遺伝子フラグメントの遠位末端G′ζ1°Ic(
> It 1残基を作るため、プライマー32 p (
2(じi” 01’ 0 (kA i” OA ’rを
、改良ホスホトリエステル法((!1e6等+ 197
8. proc、 Nat、 Acad、 Sc1.
LI8A75:5765参照)により合成し、ラムダエ
キソヌクレアーゼ処理によって得られたJ、、 E’遺
1へ1フラグメントの1本鎖末端と雑種形成させも。こ
の雑種形成は、水20111!中VcクラスミドpsO
M7△2+7)ラムダエキソヌクレアーゼ処理した[l
i、+1d lit 消化生成物2011gヲ、容解し
、上記の5−リン酸fヒオリゴヌクレオチド約80ピコ
モルを含有する溶液6p(lと混合することによって行
なう。合成フラグメントはL E暗号配列の3′末端と
雑種形成(7,1・訃]フラグメントの残りの1本鎖部
分は、d A i’ l)、Klenow) ポリメ
ラービ1によりこれを満たす。 クレナウボリメラーゼ■は、I) N Aポリメラーゼ
1の蛋白質分解酵素Vこよる開裂Vこよって得もれる。 この酵素iJ:5−)3’のポリメリゼ−/ヨン活性お
よび3 )5のエキンヌクレオリチソク活1’有するが
、親酵素の5→3エキノヌクレオリチツク活性(1持′
つていない(Kornberg、 1974.W、I
I、 1堝。、−man and D(3SFo、 9
8参照9゜反応混合物を50°Cに加熱し7、徐々に1
0°ctて冷却し、その後フレナラ酵素4tteを加え
る。室温で15分間、次いで37°C−c 30分間イ
ンキュベーhLfC後1,25 モルノE l) i、
’ A 5pe’a:添j)n Lで反応を停止させる
。反応混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽出し・
次いでエタノール沈殿する。次いてこのJ)NAを制限
酵素Bgコ、 IJて開裂し、フラグメントをr’ A
OEにより分離する。このゲルから得たオートラジオ
グラムにより、目的とする約470bpの長さの P標
識化フラグメントが得られたことを確認し、これを電気
溶離によって回収し/し概説した様に、このフラグメン
ト1.1り(d)は、13g1. II末端お・よびプ
ライマーの開始点に一致した鈍感末端を有する。 2グラスミドp’l”hrllの組みヴCプラスミドp
′’hrz l if、チモシノ〆11を暗号化rる合
成遺伝fをプラスミドp1.3 R・322に挿入する
ことにより組み守、でる。チモンンσ1を暗号化するI
)N Aは、第7図の両端矢印によって示した16個の
オリゴヌクレオチド< Ill、〜”’+6)の合1ノ
y、とそれに続くリゲ ソヨンVこよって調製し7’j
ON末端に八’I e tコドンであるA i’ <3
を挿入し、5′末端(1,1’+co I(、I ト1
321HI II lによって開裂させンクプラスミド
と結合させ易くするため、1本鎖粘着末端(相補末端)
とする。容易に理)〕子さFしるであろうが、遺伝子中
央部の1<gJ、 Itシーイトは組換えグラスミドの
分析に役立つ。 オリボデオキ/リボヌクレオチド′■゛1〜”’16
id、完全に保護したトリデオキンリボヌクレオヂド構
成ブロックを用いて、ホスホトリエステル変法Vこより
合成する( Jta、kura等、 1977、5cj
ence 198: 1056.およびCrea等、1
978参照) 。Jiri /。 のオリゴデオキシリボヌクレオチドを以下つ表11(示
した。 表 1 チモンンα・1遺伝子のだめの合成オリコヌクレオヂド
イ 上記化合物の合成に、添付の第8図に要約した、フラグ
メンl’ ”’I5を合成する以下(/′C記載した方
法によって代表される。′v15の合[i3:に使用す
る種々のヌクレオチドを、番号を付けてこの図りこ示し
た。使用L *−略語r、I以下のとおりである目)
8 III 、 = 2゜4、6− ) IJ ’I
:/ プロピルベンゼンスルホニルテトラゾール、HS
A−ベンゼ/スルホン酸;TIノ(ニー薄層クロマト
グラフィー; Jl l’ I・(゛−高速液体クロマ
トグラフイー; 1) l’、41” = 4,4−ジ
メナトキシトリチル; CI!1−2−ンアノエチル;
If、 −、−1) −クロロフェニル;BFペンソ
イIし; An=アニノイル;1Bu=イノブチリ/l
/ ; Py=ピリジン;AC(、)II:二酢酸;
Et:+N=I−リエチルアミン。 完全に保護したトリデオキノリボヌクレオチト4 (3
5II+!/ 、 、05+11 mol )および2
(!80〃ly。 、 l m mol、)を、ノロロホルム、/メタノー
ルし一7/3 (V/V) 、それぞれ10および20
1?11〕中、2係Is S AでQ”C,10分間処
牝づ−ることにより、5′−水酸基位を脱保護する。飽
和炭酸水素アンモニウム水(2−)を添加して反応を停
止させ、クロロホルム(25md )で抽出い水&(1
0nψX2回)「ろ。有1.J層を乾燥(硫酸Jグネ/
ウム)し、少量(約57zJ )に濃縮し石油エーテル
(35゜〜60(]留分)を加えて沈殿千゛トせる。無
色の沈殿全遠沈(、で集め、減圧下テンケータ 中−ご
乾燥−J−ると旦および旦か得られ、こIしらC1゛/
リプノゲルII+1、 e (八Ierck 50I’
2!154. クロロ、にルーム/メタノール−9,
,/1.)により、それそIL均一なも・つと#つかっ
た。 Eat:体l オ、1:ヒ3 (2701,7!/、
、15mmol 、b−、+こび145 in!7+
、075 m :n、+1 ) ’fJ:、周囲温IA
Imで25分間トリエチルアミン/ピリジン/水(1:
3:i。 v/v 、 10nte )で処理することにより、各
/、の4ニスホ一ジエステルf本(Aおよび7)に凹i
Q f ;巳1、試薬1−ロータリーエノくボレーンヨ
ンシこより除き、残留物を無水ピリジン(lcDmX3
回)をυ[jえ−この蒸発を反復して乾燥する。三量体
、8 (,05mmo1)および三址体ヱを、無水ピリ
ジン(3nTlり中、l”PSTe (50m9 、.
15mmol) と合わせ、この反応混合物を周囲温度
、減圧下で2時間放置する。 1冒・C分析ic J: り、95俤の三量体旦が大量
体に変換しCいることが確認された(10%硫酸を噴霧
後60”Cに加熱することによりI) M i’グルー
プを検出−rることにより肉眼観察)。水(1nIe)
を添7Jll t、て反応を鎮め、溶媒を減圧Fて留去
する。 トルエンを加えてピリジンを共弊蒸[+i i′−上・
l 1’j: !A、(ミの六附体全上記三司体Aおよ
び乞に述へ/このと同様にして2%tBA(smg)を
用いで処理し、5′位台で脱保護する1、この生成物(
2)をノリ力ゲル力ラム(〜1erck 60J、I
、 3.5 X 5cm ) &C入1t、クロロホル
ム7./メタノ−ルの段階的勾配溶出(982から95
.5まで。v/v )により精製する。 生成i吻10を含む分画を蒸発乾固−1rる。 同様にし−こ、三星体互を旦と結合させ、完全に保みシ
フ/ξ生成!吻を直接、/り力ゲル上精製−rる。この
生成物を、上記のようにトリエチルアミン/ピリジン/
水により処理して3′末端秀:脱保護し、フラグメント
旦を得る。 最後に、i’PsTe (75mg、 、’225mm
o]−) を縮合剤として用い、六量体−9および1
0を無水ピリジン中で結合させる。反応完結後(4時間
、周囲温度)、混合物をロータリーエ・くボレーターV
こかけ、残留物ff:ソリ力ゲルクロマ(・グラフにか
ける。石油エーテル沈殿Vこよって得られた生成物置(
1601119)i、J:、′I″L (、’ &コ”
s イテ均−T 、り ツit。 ピリジン(,5媚) (1(入れた化合物上」の一部分
(20+1!9 ) ”g)、濃水酸「ヒア/モニウム
処理(7−S、8時間、60°C)により完全に脱保護
し、引へ1跣へ80 % (ζ1酸中て処理(15分間
、周…]温度)−1石。1!11酸を留去後、固体残留
物で4チ水1裳[1ニア/モニウム欠(v/v 、
4 me ) K ’a I管し、エチルエーテル(2
771XS回)で抽出する。水層?C1〜2〃fに濃縮
いその一部を110・Cにかけて上λを精製する。上背
なピーりに相当する分画εブー・°ししく約20.1)
、254 単位)、約57zzd l’こ6型線才る
。最終生5v物12を、Bto −geIP−2(1,
5X 100cm)上、20係水性エタノール(lこよ
り溶出ざげ゛C脱l見11、蒸発乾固し、水(/!OO
/〕e)に再懸濁させ′〔A2S+=IOの溶液ケ得る
。12の配列は二次元配列分析により確認した。 ソマトスタチン(Itakura等、1977)、イン
シュリン((2oedd++−14jj 、 l 97
9 )、および成Jソホルモン(0oeddel 、
1leyneker等、 1979 、 Na、、tu
re281:544)に′ついて詳細に記載された方法
に従い、16の合成オリゴヌクレオチ1から完全なチモ
シンa1遺伝子を組み立てる。オリゴヌクレオチド1゛
2からl1115壕での10 pg、肝を、′I゛4ポ
リヌクレオオチドキナーセ((−3oed、del等、
1979)の存在下で、1−1−” P J −、A
’I” I’ (New Er++!’Jandfヒ Nucl、ear)により定量的リン酸τ行な)と、約
101 、/’??l 1110 ’lの比l舌IIt
を得る。放射線Qこ上り標識したフラグメントを、20
%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルを用いた電気泳動
によって精製1−1溶離したフラグメントの配列を、蛇
jが部分消化(′(二よる一次元電気泳動/ホモクロマ
トグラフィー(、Jay等 、 1974. Nu
Cコet・−、Ac1d:; Hes、 I :3
31)を用いて確認した。フラグメント=111.よび
′r16は、次工程のリゲーノヨン反応の際の望ましく
ないボリメリ化4:最小限に抑えるため、リン酸化31
・せずにおく。これらオリゴヌクレオチド(それぞれ2
μg)は、i’h J) N A リガーゼにより、文
献に記11アの方法(00eaae1等、1979)K
;用いてそ−れそれ4個のフラグメントから成る4個の
グループ(第9 添付の図往企参照)に組み立てる、反応生5V、物i−
I、△ 7Mの尿素を含有する15%ポリアクリルアミドゲル上
のゲル電気泳動(八Iaxa、mおよびg]1bert
。 1977、 ”roc、 N、qt、 Aca、、a、
、 8cj、1.Js、A 71 :3455)により
精製する。4個の単離した生成物・工・リゲ−ンヨ/し
、反応混合物を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(こかけろと、チモノノ71Z1遺伝Pの人きさく90
〜105塩基対)のl) N・〜か電気溶離される。 プラスミドpBH322(057咄)を制限工、/トヌ
クレアーゼBam If I 粋よひl):ctツ1(
、It、 lで処(il 1.、フラグメントをポリア
クリルアミドゲル電気泳動にヨリ分離する。大きいフラ
グメントを電気溶出によりゲルから回収し、組み立てた
合成IJ N Aと結合させる( 0oeddel、
I:1eyneker等、1979)。 この混合物を]気coli Kl 2 294 の形質
転換に使用・する。形質転換した混合物の5%金、アシ
ビンリン20μg/77Tlを含有するL B平板に蒔
く。得られた4個のアンピノリン耐性コロニーFJ−テ
トラザイクリン感受性であり、これにテトラザイクリン
面1性遺伝子への挿入を示唆している。これら4個のコ
ロニーから得られたプラスミドの分析の結果、いずれの
場合にもこのプラスミ)(pThlz lと呼称)は、 △ θl遺伝子の存在を示している);−0tLで、(b)
13am If I / Eco 1口開裂によっ
て生し/こ約105哩基対のフラグメントを含有する、 ことがわかった。プラスミドpThCzlの組み立て手
順を・添付の第9図に示した(一定倍率ではない)。5
−リン酸基は黒丸で示した。 3処J!l pThlz + 、!: lノI’r (
d、) 7 ラフJ 7 ト(D反応プラスミドpTh
/7 J IQ、アンビアリン面1 u1三に一指定
する遺伝子と、その5暗号鎖末端f l’lco ]、
L Iザイトに、そして3′末端を13am1]1サイ
トにクローンした、チモンンtz lを指定する遺伝子
、を含む。 このチモシン遺伝子はまた8cj−1,1サイトヲも有
する。上で調製したLE’(a)フラグメンl−を受は
入れることのできるプラスミドを作るため、p i”
II /71をIζco H,J消化した後、そのEC
0It J残部を鈍感末端トfル目的テclTT Pオ
J:、(J−d A i’ P4用いたクレナウボリメ
ラーゼ1反応に刺す。得られた生j戎物を+sg]、l
I消化すると、アンピンリン耐性遺伝子と、両端にそれ
ぞれ粘Mt<E Bgl、 14残部と鈍感末端を有す
る真線状1)NAフラグメントか生成する。この生成物
に、Bgl 1.1粘着末端および鈍感末端を有−3−
るLE’(a)フラグメントと、′■゛1リガー再 ′I″rp24を形成させることができる。この過程に
おいて、鈍感末端のリゲーンヨンが起こった位置にI弓
C01(・1ザイトが再生される。 1矢プラスミドpS〇八47/\2・へ4の組み立て1
”’r p24 f Bgl 11およびL:(:O
I(、Iで順次消化し、次いでP A (3Eおよび電
気溶離を行なうと、3′末端に隣接したEco R,I
粘着末端しよび8cj、 II粘着末端を併うL l!
I(a)ポリペプチドのだめのコトンを有するフラグメ
ントを得る。この1・E’ (a )フラグメントは、
プラスミドpsom7△2のり」11ザイトにクローン
することができ、トリプトファンプロモーター/オペレ
ーターの制御−トに発現されるLl)ポリペプチド/ソ
マトスフチン融合蛋白質がη″敗する。このためVCV
、K、(j)トリブトファンフロモーター/オペレータ
一部(iから離れたEco 111サイトを・間装さぜ
る/こめの、psom7△20Eco IL Iによる
部分消fヒ;おまひ、(2)コドンの読み取り枠を適切
Vこ維持し、l>ct)10開裂サイトを再生するだめ
の、ブライマー配列の適切な選択、 を必要とする。 即ち、プラスミドps om 7 △2 16μg ’
Fc、20m へ1の ト リ ス (pH7,5)
、 5 m へ1のへ!a(ユコ 2、.02係の
N 1’ 40洗浄剤、オJ: ヒ10 Cm A4
(7) Nacl f含有する緩衝液200 ttl!
で希釈し、EcmI口 、5単位で処理する。37°C
で15分経過後、反応混き物をフェノール抽出、クロロ
ボルム抽出、エタノール沈殿し、次いで43g1 [1
て消化する。大きい方の7ラグメント21’ A (,
21去、次いて電気溶離て分離する。このフラグメント
は、1・1号ポリペプチドの近M末端の為のコドンl
I−”’ (p) J 、即ち、13g]−IIザイト
から上流のコト/ヲ含んでいる・次にこのフラグメント
ラ」二重L E (d)フラグメントと、T、 l)
N Aリガーゼの存在下でリゲー7ヨンし、グラスミド
ps om 7へ2へ4を形成さぜる。このプラスミド
汀、E、C01i 294VC導入すルト、トリプトフ
ァンプロモーター りこおいて、完全に再構成されたL Eポリペプチドと
ノマトスタチンより敗る融合蛋白質を・効率良く生産す
る・ プラスミドpB1t322をH ln a Illて消
化し、突出1− /3 If nd. Ill末端を8
1ヌクレア−セ消fヒする。 この8■ヌクレアーゼ消化は、S1緩衝W ( 、 3
A4のN a(E 1 、 1mM の ZnC1
2、 2 5 m M のrli1′酸 ブー
トリウム。pH 4. 5 ) 3 0ull中のIl
ind III開裂pBH322101zgを、S1ヌ
クレア一ゼ300単位で15°Cで30分間処理して行
なう。反応(・−x 3 0 XS1ヌクレアーゼ停止
溶液(、8Mのトリス塩基、5 0 m MのE l)
T A ) I Ileを添加して終止させる。 反応混合物をフェノール抽出し、クロロホルム抽出し、
エタノール沈殿し、次いで前述のより(/こEc。 1(・I消化を行なう。I’ A Ci E法、次いて
電気溶離により得られたフラグメントは、EC01目粘
着末端、および暗号鎖がチミジ/ヌクレオチ)・かもは
じする鈍感末端を有する。チミジンから始する81消化
+1nd III残部に、クレナウポリメラーセ用で処
理したBgl 1.1残部と混合し、リゲーンヨンによ
ってBgl. 11制限サイトヲ再生することができる
。 以上のように、実施例2Cて調製したプラスミドp 8
U八47△2をlsgl. I+消化し、イ!Iられだ
1舅111粘着末端を、4個のチオキシヌクレオチドト
リホスフェートを全て使用してフレナラポリメラーゼl
処理により二本鎖とする。得られた生成物の町010開
裂後、その小さなフラグメン1− r,1 1’ A
(冊弓処理および電気溶離すると、トリプトファンプロ
モーター/オペレーターおよび、13gIIJザイトか
(p)J)を有するD N Aの線状断片か得られる。 この生成物は、l’tc010末端およびl(B71
IIザイトを補完してできた鈍感末端を有する。しかし
ながらこの13gl IIサイトに、該鈍感末端金」二
詔S1消化11ind III フラグメントの鈍感末
端とリゲーノヨンすることにより再構成される。即ち、
2個のフラグメント(、 ’I”、 l) N Aリガ
ーゼの存在下でリゲーンヨンしてプラスミドp I−I
K Y ( 0として再閉環させるが、このプラスミ
ドは、コンビテントな]゛)。 colj 294細胞に導入して増殖さぜる。組換えプ
ラスミ)−I〕H lぐYIOを担ったテトラザイクリ
ン削性細J胞を選択し、そのプラスミドI) N Aを
抽出する。Bl?;IIIおよびI’et lで消化し
、I” A (−冊り法および電気溶離(tこより、大
きなフラグメントヲ単離すると、目的とするI’St
lおよびBgl II粘着末端を有する線状IJ N
A断片が得られる。このようにしてpJ.] K. Y
1 0から調製し/こI) N Aフラグメントir
.I、複製起源を含んでいるので、l;rp+・1゛〕
ボリペブチド融合蛋白質遺伝子およびテトラザイクリン
耐性遺伝子の両者がtrpプロモーター/オペレーター
の制@j下vCするシラスミドp 、I A 7△4△
1の組み立ての際の1つの構成成分として有用である。 (j、Trpプロモーター/オペレーターを有する線状
1)NAの組汐・立て 実施例21・〕で調製したグラスミドp S (、)へ
17△2f・4を部分的1’:COIt l消化、次い
でI’st、l消化に付す。得られたフラグメント&−
、Itr−pプロモーター/オペレーターを含み、PA
GE法、次いで電気溶離にかけて分離する。部分的1!
:cOR1消化は、ソマトスタチン遺伝子の5末端付近
では開裂されるが、アンピンリン耐性遺伝子とtrpプ
ロモーター/オペレーターの間に存在するEco It
]サイトでは開裂されないフラグメントを取得するた
め((必要である。アンピシリン耐性遺伝子の中のPe
tlを切断することによって失わわたアンピシリン耐性
は、」二重実施例2Fで調製した最終的な線状pHKY
IQIJNA誘導体とのリゲーションにより回復させる
ことができる。 ■、インシュリンA鎖構造遺伝子の分離インシュリンA
鎖の構造遺伝子は、グラスミドpIA1のECOR,I
およびL(a、m Hl消化に、、l:ツて得られる。 このプラスミドの組み立ては、(30dd、el等によ
るI’rOC,Nat、 ACa(1,Scj、、U、
8 A 76:106(1979)に記載されている。 目的生成物((1l’ A(11)および電気溶離によ
り精製され、l!;001口およびIsaml、−11
末端を有している。 1、インシュリンA鎖構造遺伝子、Ill r pブロ
モ−ター/オペレーター、セよびPetl並びに1)B
1゜11末端を有するpHK Y I O線状1) N
A−イラグメントのリゲーンヨン インシュリンA鎖構造遺伝子、l;rpプロモーター/
オペレーター含有線状1.) N Aフラグメント(実
施例2(]で調製)、およびpIIK Y l O,銹
状DNAフラグメント(実施191J2Fで調製)を、
第1図に示す方向でリゲーションし、目的プラスミドp
i A 7△4ΔIf:生成させる。グラスミドp
l A 7へ4へ1は、アンピシリンおよびテトラサイ
クリン酬性を回復しているため、容易に選択できる。 実施例3 グラスミドル目(7ハ4△Iの組・夕立でイ
ンシュリンA6JでになくインシュリンB鎖を指定する
構造遺伝子を最終的リゲーションに使用−J’る以外は
、実施例2A−1に従って所望のプラスミドを組み立て
る。インシュリン■3鎖構造遺伝r・u、シラスミドp
iB1(その組みケでは(joeddel等、1979
、に記載)のECOI口およびBam1.I l消化に
よって得られる。インシュリンB鎖を暗号化するI)
N Aフラグメントu、P A (E Eおよび電気溶
離により精製される。これに、&J)11..1および
13a、nHi末端を有している。 プラスミドplB7△4△1は第3図に示した。 このプラスミドはアンピシリンおよびテトラザイクリン
劇性を回復しているため、容易に選択できる、。 実施例4 シラスミドplH7へ4Δ1の組み立てグラ
スミドpH1,7△4△1の組み立ての様式を第11図
(に示す。 目的とする組み立ては、実施例21に・ボへたのと同様
の方法である。即ち、Lrpプロモー ター/オペレー
ターを有する線状1)NAフラグノント(実施例2Gで
調製)および、r+t<y I O線状1)NAフラグ
メント(実施例2Fで調製)を、常法によ7プラスミド
psOM11の、ソマトスフチン遺伝子含有1>co
It l −Ba、nII l制限7 ラクメ7 トV
CIJケー7ヨンスル。フラスミl’ p 5(−1A
I 、1114山、akura等、1979.5cie
nce I 98 : 1056およびイギリス国公告
特許第2007676A弓の記載と実質的に同様の方法
で組み立てることができる。所望のプラスミドpsOM
7△4へ1はアンピシリン耐性を回復しているため、容
易に選択できる。 グロインゾユリンの最初の32個のアミノ酸化・暗号化
する遺伝子の組み立ての第一段階として、表2に示した
l連の18のオリゴヌクレオチドを調製する。個々のヌ
クレオチドは、塩基アデニン、チミン、シトシン、グア
ニンを表わす文字A、′V、(づ、Gによって示し、こ
れによりヌクレオチドを互いに識別11]能とする。最
終的に組み立てられた遺伝子全体のヌクレオチド配列を
第10図に示す。 表2 ソマトスタチン遺伝子のだめの合成オリゴヌクレオチド
III AAi’TcAl”0’門゛11
2 DOTcAATDAOCA113
Dc’l”TTOT(j(3T7+’(
”114 1’ OA に ci” (1
:Oi’ T(i A115 1、’TO
AC(’;AA(:A ’l”D116
に A A A Oに i’ 0 (シi” に A
87 AOOTOAOAAD(’、A1
1B A O(!i’ i’
DA A cに旧 A Oに i”門”0
TA(E132 C′目I G4110
’(j G(i(E l’143 にA
AcOT(i(jTi”Tl1s4 1’
T(:TA(!A CTc(:l’B 5’
A A G A に i” cU D G136
AAcAAOGTACAAH7ACOT
’l”CADCGOA B8 G’!”AGAAGAAAC(:B
g AUTO’■’ A OU A G
i’B10 (JATCCOOCGこの
合成ヌクレオチドは、第10図中で角括弧の間に下線を
何して示した。これらのオリゴヌクレオチドは、トリエ
ステル法(C1r3 a等、1978゜Δ 7327参照)’Lより合成した。このオリゴヌクレオ
チドのうち幾つかは、ヒトイン/ニリンB鎖遺伝−rの
組み立てに使用された( Crea等、1978 。 および”0edde1等、1979参照)。2個のオリ
ゴヌクレオチド(B5′および+3 ] 0’ )飢1
1pa If 、F=・よび末端HamIJJ並びに1
5c010制限ザイトと合同している。この末端サイト
はクローニングの目的」二極めて有用である。 ヒトインンユリン13釦遺伝子(Go edd、 e
]等、1979)の左坐分の組み立てのために前に使用
し/こ8個のオリゴヌクレオチド111〜118は、1
1鎖遺伝子の1〜13番目のアミノ酸およびN末端部の
メチオニン単位の為のコドンを含有している。B IJ
J4の右半分は、0oed、del等の教示する方法と
実質的に同様にして、]+1 D N Aリガーゼの存
在下1.lリボヌクレオチドB 1、B2、H3,13
4,135′、B 6.137、B8、]A3およびB
IOかしリゲーションにより組み立てる。得られた遺伝
子フラグメントは、ヒトイン/ニリンB鎖の14〜30
番目のアミノ酸および架橋鎖の最初のアルギニン単位を
暗は化している。l1pal制限ザイトハ、ヒトインシ
ュリン遺伝子の[:Ipa IJサイトと同じ位置およ
び読み取り枠で、この遺伝子配列中しご組み込まれろ。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動ケこより、このリゲー
7ヨンした遺伝子フラグメントヲ精製し、最大のI)
N Aバンドf:溶離した後、このフラグメントをLl
j red litおよびBam1llて開裂さぜたプ
ラスミドpBIL322に挿入する。得られたプラスミ
ド(pB3と呼称)を1弓、coli K12 29’
l ()\i’ (’CA631446 )に形質転換
によって挿入する。このプラスミドは、抗生物質アンピ
ッリンとテトラサイクリンに対する耐性を付与し、Ma
、−、< a m等(1977、I’roc、 Nat
l、 Acad、Scj、tlsA 74:560参
照)の方法により決定されたものと同じの目的とするヌ
クレオチド配列を有することがわかった。 2個の7ラグメ/1・、即ち58塩基月を待つp133
の1lind III Ham 1117ラグ/ント
および46塩基2=J k持−、l T)旧11 (0
oed、d、e 1等、1979ic記載)のl>co
1(、1,−11i+id、 IIIフラグメントを
リゲー7ヨンして、1り。oIt lおよび1(a、。 II +末端を有−ノーるフラグメントを作る。このフ
ラグメントk 、0oedde1等、1979、に記載
の方法と実質的に同様にしてE。oIt lおよびHa
、m It、 J制限プラスミ1.1.旧t322にリ
ゲー7ヨンする。次いて得られたプラスミド(p11稲
と呼称)を1り、coli K]2 294にクローン
rる1、常套の増殖と分離の後、プラスミドplB3
f 1ico IL lおよびJ■pa II制限酵素
(題より消化し、メチオニンeごよって先行されるN末
端プロイン/ニリンのアミノ酸を暗号化する合成遺伝子
フラグメント(フラグメント1、第11図)を作成する
。 この合成遺伝子は、常套のポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分離する。 添イq1の第12図に、目的とす71)c I) N
Aを増量する図式を示す。これに従って、138.m、
1.I l認識配列秒よび約20残基から成る3′ポリ
チミジル酸領域の両者を含むデカヌクレオチドI) C
C(j G A i’(I C(: GIll Ill
+p、8+1+ ヲ合成シ、c D N A 合tj
’j、]にメのA M V逆転写酵素を作動(プライム
)させるためにイ史月ト支る。このフライマーは・ 1
.、5 X ]、 O=p 1110 ] のi’ l
’ Pを含有する反応量0.6 yzd中、ターミナル
デオギンヌクレオチジルトランスフエラ−ゼ(1’:n
zo ls:iochem、 2Q Q単位)食用い
、このl(a、to 1.1.1デカヌクレオチドl
// 11101で調製する0反応FJ、 Oha、r
+g等、 1978. Na、1.ure 275 :
617に記、l&の緩衝液系中、37°Cで1時間行な
う。 ヒトインシュリノーマ(島細胞胛)組織は、I11++
いしute fiir I)iabel−esfo
rschung (西ドイツ国ミュンー\ン在)より入
手できる。当業者(・ζは、ヒトインシュリノーマ組織
が容易に入手でき、他の多くの供給源からも取Yj)
i’J能なことが理解されるであろう。ヒトインシュリ
ノーマ組織のポリA111H,NA (2,5//g
) t、Ullrich等の方法(1977゜5cie
nce 196 : 1313参照)と実質的に同様に
して分離し〜〜Vickens等の教示する方法(19
78゜、1.B」−ol、 (、:hem、 253
:2483)に実質的に従って、これを二本鎖cDNA
に変換する。15Tl昌・1の′1゛rj (1−11
Di (+)IJ 8.3.42 ”C)、2111昌
!のKCl、8mMの14 MgCl2.30 m l
l11のβ−メルカグトエタノール、2 m Mのプラ
イ7− d (’; C(3(3A i’CC(’i
(j l■’1g ””、オヨU ] m AIノd
N ””’s’ig含有する反応容量80116をO′
Cでプレインキユヘートしておく。A M V逆転写酵
素を添加後、この混合物t 42 ”Oで15分間イン
キュベー1・する。(4%られたH、 N A / D
N Aを次いで常法(/(より変相さぜる。 25mAJのTrjs−IICI (pH8,3) 、
35 m Mの1(C]、4. m MのA4gC1
2,15m Mのβ−メルカフ。 トエタノール、I m M ノロ、 N T 、l’s
オJ、091’j’位ノD N Aポリメラーゼ1(ク
レナウンラグノント)を含有する反応容量150Ie中
で、相補的(]1)NA@′4を合成する。この混合物
と15℃で90分間次いで4°Cで15時間インキュベ
ートする。続17)−C1〜’VICkelH(等(1
978)の教示する方法と実質的に同様(′(シて、S
1ヌクレアーゼ(MinesLa、brai、orie
s、 EJ、khart、 India、na ) 1
000単位を使用し′TJ、81ヌクレアーゼ消化を−
37”0で2時間11な9゜この二本鎖CI) N A
(、,37t)g)を8係ポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動して、500鳴基対以トの大きさのJ) N
Aフラグメントを溶離する。A’1aizel +J
r、の方法(1971、Meth、 Vj、ro]、。 5 : 180)&こ実質的に従って、ターミナルテオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼを使用してオリ
ゴデオキシシチジル酸残基を、このフラグメントの3′
末端に付加する。最初VこPstl制限酵素で消化し、
次にターミナルデオキノヌクレオチジルトランスフエラ
ーゼを用いてデオキシグアニジル酸の尾部を(=Jけた
p旧t322に、この60尾部を有するcDNAフラグ
メントをアニーリングする。 得られたプラスミドf E、coli K]2 294
に導入し、クローンする。テトラサイクリンにG1耐性
で、アンピシリンには感受性であるコロニー’を分離し
、3個のPstl制限ザイトヲ持つグラスミドを°スク
リーニングする。この制限ス(9式は、プロインツユリ
ン遺伝子について指摘されている( 811r’eS等
。 1980 、5cience 208 : 57参照)
。 600の挿入塩基対を含むあるプラスミド、〕l111
04は予憩された1FBt1制限型式を有し、C1,)
NA調製の際に導入された3′ボ+) A j;−よ
ひボ+) OCの間のBamJI Iザイトヲ含む。挿
入部のヌクレオチド配列の一部を第10図に示す。この
配列・は、使用し/こrr4NAが異なる個体から分離
されたものであるという理由で、5ures等(198
0) および13e1.]等(1979,Nature
282:、525)により以前報告されたものとは多
少異つCいる(F線をイ・]わ したATがGCと置き換っている)。 △ IJ、ヒトプロインシュリンを暗号化する遺伝子の組み
立て ヒトプロインシュリンを暗号化する遺伝止の組み立てに
使用した方法を添伺の第11図に示す。 プロインシュリンの最初の31個のアミノ酸を暗号化す
る合1j7遺伝子セグメント(第11図におけるフラグ
メント1)を、前述のように制限エノドヌクv7−セE
COIt lおよびH,pallを用いて50/Igの
プラスミドplB3より回収する。このフラグメントに
また、プレプロインツユリンの1曲間列21の代わりに
メチオニンに相当するA i” (jコドンをも含んで
いる。 翻訳停止コドンとmRNAの3′非翻訳領域と共に32
〜86番目のアミノ酸全暗号化しているCI) N A
遺伝子セグメントa、401ノgのプラスミ1−p11
1104から、1ず138m111、次いで1.Ip、
a II制限酵素で処理することによV回収できる。二
個(・)フラグメントtポリアクリルアミドゲル電気泳
動、次いて電気溶離により分離する。これらの遺伝子フ
ラグメントを、20/71のリガーゼ緩衝液(Uoec
l、del等、1979)中、40.24時間の′I″
、 1) N Aリカ−ゼ処叩により連結させる。この
混庁物f 50g1eのll2(:1で希釈後、常法に
よりフェノールおよびクロロホルムで抽出し、次いてエ
タノール沈殿する。 得られたI) N A Id Ham If Iおよび
1号cot口制限酵素で処理してこれらの制限サイトを
再生し、遺伝子重合体を除去する。次いで組み立てたプ
ロインツユリン遺伝子をポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離し、l先o I(IおよびHam If
l消化したグラスミドpH1)、322 にリゲー/
ヨン(T、 I)NAIJガーゼを使用)する。得られ
た1月くAを14゜co、hi K12294 しこ導
入し、得られたコロニーをテトラサイクリン感受性およ
びアンビアリン面]性についてスクリーニングする。か
かるコロニーから亦離されたプラスミドI〕■113は
所望のグロイン/ユリ7遺伝子を含んでいた。これは引
き続きヌクレオチド配列分析(でよりその特i住を決定
した。 メチオニンを暗号化しているN末端コドンを含む完全な
ヒトグロインシュリン遺伝子を、li;CO旧およびl
−3a、m 1.11制限酵素処理によってプラスミド
pr−113から回収する。所望のフラグメント’lゲ
ル電気泳動により精製し、次いでプラスミドpS〇へ1
7へ4△1の1°stl −l弓co IL、 l (
部分)消化物ら・よびプラスミドp][Ylo(実施例
12Fで調製)の大きい方のPst l −Bgl、
IIlフラグメントリゲーンヨン(T、 I) N A
リガーゼを使用)する。 、 8 ()M 7△4/川フラグメントは、ll1(
公的Iりc。 10消化、次いでPstlによる完全消化により組み立
てる。得られたフラグメン目”、1trpプロモーター
/オペレ・−ターを有し、]’ A 01す、次いで電
気溶r(’t B’こより分離−「る。部分的ECO1
<、 l消化は、ソマトスタチン遺伝子の5′末端隣接
部で開裂し、かつアンビンリン耐性遺伝子とtrpプロ
モーター/オペレーターの間に存在するEco +t
Iサイトでは開裂しないフラグメントを得るために心安
である。アンビンリン面1性遺云子領域てI’St 1
. /こより切断されることにより失われたアンビンリ
ン削件QJ、、前述の実施例2Fで調製した最終的、〕
IllぐYIO1腺状1) N A誘導体とリゲ−7ヨ
ンすることにより回復する。 1)。oloおよびISam111末端を有する完全な
ヒトプロインシュリン遺伝予約11Ig、pS〇八1へ
、−,4△1の(部分的) Pst l、 −Eco
IL l消化フラグメント41i、g 、およびpi−
1,KY 10のPst I −Bgl IIフラグメ
ント約μgffi、i’4D N Aリガーゼを用いて
リゲ△ 一ジョン緩衝液中で4゛C124時間リゲー/ヨンノー
る ・ リゲーノヨンしたI) N A 91合物は、Uoec
l−d、ei等(1979)の方法に実質的((従って
l゛:、col、i K 12294 に導入する、ア
ンピノリンとテトラサイクリンの両者の存在下に生育す
るコロニーを・選択−4−ると、これらのコロニーFl
、81)8ポリアクリルアミドゲル電気泳動(八1ai
zel、・Jr、、197]、)により、79i嗜(7
)フラスミトpH17,h4ム] k含み、l; rp
L L:’−プロインンーリノ融合物かりr想される分
子量を有する蛋白で発現することか見出さ÷しブζ。 」二連の蛋白を発現するグラスミドpHr7 、゛、
4・\1は、組み込まれた遺伝子およびベクター両者の
1)NA配列粋よび制限サイトにより完全にその苛性を
決定した。プラスミドp1117 w 4ハlに添イマ
1の第5図に示した。このプラスミド&1−ア7ピシリ
ンおよびテトラサイクリン耐性全回復しているため、容
易に選択できる。 実施例5 pDlloの〜27k l) 、I’st
lフラグメントの分離 ゲラスミ1.pJ)J ] Qの〜2.7 kb PS
t 1フラグメントは、Hhallに!特異性の制御堰
および修飾遺伝子を含んでいる。町co]i Kl 2
294/ pDI 10から分離した、共有結合で閉環
した環状pH110約15μgを、Pst l制限酵素
により37′Cで完全に消化する。この反応混合物は、
pL目10溶液(実施例1でA製ン約35tie、10
XPstl緩衝液(1,00mMのMgC1−2,50
QmMの(N l−1+ )280 aおよび20’O
mMの′I″r i、 s −HCl。pH75) 1
511e、牛血Wrフルフミン(1mg/ln1. )
15/16、水775/Je、およびJ’stl制限
酵素(l New Englarld Biolabs
単位/li(’j ) I 75plJ ’ix含有し
ている。制限処理したl) N Aを、T HE ()
リス塩基10.8gm、硼酸5、5 g、m s Na
2 El)TA 、 Q 9 gmを水1e中に含有
)中の、8係アガロースを含有するA OIG (アガ
ロースゲル電気泳動)により、分画する(15時間、2
20ボルト)。このバンドは、エチジウムプロミド(、
51i(t、/ ml! )による染色と紫外光の下で
の観察でijJ視化Jる。所望のフラグメン)を切除し
て、′1゛1旧゛:中で150ボルトで1時間電気溶p
;1Fする。I)NAi平衡緩衝液(KOl、 I A
4 J:、’よひTr i 5−11011QmMo
pH7,8)で平衡化し/仁1) E A Eセル。 −ス(Wl]atman I)E’52 )と結合させ
、平衡緩衝液でカラムを洗浄後、I) N Aを溶離緩
衝i (Na、(ニー11八4およびI’riB−[L
Cl l Q mM 01u117.8 )で溶出する
。溶離液を、Na イオン濃度につい−Ci’J:は
ぼ、35Mとなるほうに1120で調節し、次しここの
I)NAl、100%エタノール2倍量の添加および一
20゛Cで1晩冷却することにより沈殿させる。目的と
する沈殿を遠沈して集め、乾燥し、Ill t、”に溶
解する。 実施例3 Pstl消化プラスミド[)TA7へ4へ
1の分離 実施例2で調製したプラスミドル1.Aフハ4△1約、
5μgを、実施例5と実質的に同様の方法Vこより、P
stl制限11¥素で37″0で3時間消化する。 制限処理した1)NAを、標準手法しこより、フェノー
ルで1回、クロロホルム:イソアミルアルコール(24
:1)で2回抽出する1、この溶液を3Δ1の酢酸ナト
リウム(pit 8 )。1容量と混合し、エタノール
22容駄を添加し一晩−20”Cr&ζン令去IJ−す
ることにより沈殿、\せる。目的とする沈II役ヲコ屯
沈1゜て集め、乾燥し、III Eに溶解する。 実施例7 .1’stl消化プラスミドY〕1B7へ4
へ1の分離 実施例3で調製(またプラスミドp1B7へ4△l l
)、5pgt、実施例5と実質的に同様(、り方法によ
り、1’r+1−.1制限酵素で37′Cで3時間消化
する。τIll限処理したI) N Aを、標準的手法
により、フェノールテ1 回、クロロホルム゛イソアミ
ルアルく2,’I : l)で2回抽出する。この溶7
11を3へ4の酢酸ナトリウム(pDI8)、1容量と
混合し、100チエタノール2,2容量を添加し一晩−
2 0 ”c +c ?令去1)することにより沈殿さ
せる。目的とする沈殿を遠沈して集.V)、乾燥し、j
ll F,に溶j宵rる。 実施例8 プラスミドp l) 1 1 0 (つ〜2
. 7 kb I’st■フラグメントの、Pstl消
化プラスミド△4△lへのリゲーション P8目消化プラスミドp 1. A 7△4,へl約.
2 titf−よびプラスミドpl)110の〜2.
7 kb I’St 1 フラグメント1. 1
pg.f:、TE/10ビI’ri6−11(4.1.
] mPw1( pH 7. 8 )、Na214:
DTA 、l IIIAI ] 4001’e 中で
混合する,、3Mの酢酸ナトリウム(pH13)、1容
計を添り日f多、このI) N Aを100%エタノー
ル22容量の添加および一20″Cで一晩冷却すること
Vこより沈殿さぜる。目的とする沈殿全遠沈しーCM.
め、乾燥スル。lhU中(7) IJ N A 2 p
e, 5 X キナ− −L’ −リガーゼ緩衝液L
MgC1.2 50 m M 、 ジチ」“l・レイト
−)b2 5 mA4, Tris− 11(
−h 250 mM ’( Tal+78)
、および25%グリセロ ルJ 、6/Ie, 、66
11、M 4−) A i” lo.6 pe, オ.
1: (j: T41) N Aリガ ゼ・117、6
(1単位/μ6)を含有する反応容量3. :3 pe
の溶液中でリゲーションを行なう。この反応混合1勿l
/ユ15°Cで一夜インキユベートする。 実施例9 グラスミドpl)110の〜2. 7 kb
I’ct1フラグメントのl’stl消化ブラスミl
’ p l IS 7 l。 4△1へのリゲーション ブラスミドpLA7Δ4△lの代AノリにI’l;iメ
肖化プラスミドplB7へ4へlを使用−rる以外性、
実施例8と実質的に同様にして所望の1ノゲ−7ヨンを
遂行する。反応混合物は15°Cで一夜インキユベート
する。 実施例10 町coli K12 RV3Q3/pP
R,26および1弓、 colj K12 +tv3o
s、’pr’It27の組み立て並びにグラスミドpP
R26とp P H,27の分離実施例8で調製したリ
ゲーンヨン後のD N A約、1μgt、S S C/
l OVCJ: 、!:’ R終容量50 pe ト
なるように希釈する。この1)NAを、実施191月と
実質的に同様の形質転換手法によつ−C、コノピデント
E、C01IK12I(■308に導入する。所望のE
。 coli K12 RV308/pPR25および1つ
、 C01j K12 ItV308/pPTL27形
質転換体を、テトラザイクリン5μg/祠を含有する1
・寒天上で培養することにより分離する。分離物を試験
してテトラ−リイクリン耐性とアンピシリン感受汁を確
認する。 j3aZaralおよびHe1j n5ki (196
8)の分離手法と実質的に同様にして、適当なコロニー
を、共有結合で閉環(7た環状プラスミドI) N A
の分離に使用する。このプラスミドの構造を、制限エン
ドヌクレアーゼ開裂サイト地図を作成することにより確
限フラグメントハ、どちらの方向にも挿入され得るので
、2方向のプラスミドか得られる。従ってプラスミドp
i’ R26およびpPR27、並びにそれら各々の
形質転換体を上記手法において分離する。 実施例11]り、 coli K121tv30B/p
Plt2BおよびE、coli K12 RV308/
pPH1228の組み立て並びにプラスミドpP1t2
8とpI’H,1228の分離実施例8で調製(−だリ
ゲーンヨンI) N Aの・代わりに実施例9のものを
使用する以外は、実施例11と実質的に同様の方法で所
望の組み立てを行なう。 目的とする1つ、 coli Kl 2RA・’308
/pi”11.28 およヒE、coli Kl 2
JLV308/pP1(1228形Ti転換体を分離し
、各々のグラスミドの構造を、制限エンドヌクレアーゼ
開裂サイト地図の作成により確認−f7)。このグラス
ミドを含む〜2.7 kb Pst I 制限フラグ
メントハ、どちらの方向にも挿入され得るので、2方向
のプラスミドが得らホLる。従ってプラスミドp 、1
’ IL28およびpI’1t1228、並びにそれら
各々の形質転換体を上記手法L・こおいて分離する。 実施例12 睨C01i K121tV308/pl
’R29ノ組み立ておよびプラスミドpI’ R29の
分離ゲラスミ)pPIt27は、塩基対位置はぼコオー
デイネイト331に1個のBg」、 II制限ザイトは
ぼコオーデイネイト2334のM ii!i IIC1
個のAVa1サイl−を有する。シラスミドpPlt2
7 (実栴例10 で調製)約8I1gヲ、37°Cで
、i+r18− IfC,+ 20mA4 (pH7,
4)、Na(−;1 3Q mM 、およびAva、
I if川用酵素16単li′/、(1110・、2単
位/11(! )を含イj才る反応液15011e中で
完全に消化する。ここVこIO×叩]11緩衝液(1八
1の′p、]8−IIC」(+)118. O)、Mg
” J 250 m R1およびNa1l 600+n
八’J2011/J1水25pe、および13g1[I
制限酵素(New Engl−andBiClla、b
s、16単位/ t4J ) S peを加え、37°
Cて60分間、次いで65゛Cで5分間インキュベート
する。この制限処理D N Aは、実施例5と実質的に
同様の方法を用いてACEにより分画化、次いて所望の
〜62kbフラグメントを電気溶離および1) E A
E セルo −スクロ? ) り57 (−H′コア
’I” I!;中に回収する。 ゲラスミ1−pHI 7 、\4/司に、」ふi−X対
位置はぼコオーティネ(+・331f/こ1個の1舅1
11制限ザイト、はぼコオ−ティ不イ) 2614の位
置に1個のAVa1ザイトを有する。実施IFIJ 4
で調製したグラスミドpH17,”、4何約15/1g
’(ix、+ie 実/V 例12 Aと実質的に同様
の方法Vこより、AvalおよびHg111制限酵素(
(て完全に消化する。制限処理した1)NA山実施例5
と実質的に巨1様の方法により、A(冊゛〕で分画し、
次いで電気溶離ら・よびIJ l!; A II;セル
ロースクロマトグラフィ−シこよってi’ l=+中に
回収する。 ゲーノヨン プラスミドp P 1.(,27の〜6.2 kb、
Ava、 l−13g1 Ifフラグメント(実施例1
2Aで調製)約2.3pg、およびp、tl 1.7
へ4 ヘ1の〜2.3 kb Ava、 I JSgl
、 iJフラグメント(実施例1213で調製)約、8
51tgをII+1!: 5701ie中で混合し、実
施例8と実′H的ケご同咋の方法でエタノール沈殿させ
る。回収シ/ζJ)NAを、5×キナーゼ−リガーゼ緩
衝液2pど′1,66打l” ノA”” P 2 pe
−水67’4 オ、J: ヒTI I) N A I
J jj −セ(1単Iff /pe ) 、 I p
13 ’x含む反応液10.1 //(4中でリゲ−7
ヨシする。この反応混合物を90で一夜−fンキュヘ−
トし、既知の方法に従って所望の1)NAを回収する。 実施例8て調製したリゲーンヨン後J) N Aの代わ
りに実施例120のものを使用する以外(1実施例10
と実質的に同様の方法により、目的とする組み立“r−
1行なう。目的とする1、。。]、4 K l 2Hν
308/pPl(29ヲ分離し、制限エンドヌクレアー
ゼ開裂サイト地図の作成により、このプラスミドの構造
を確認した。 以上に記載の方法に従って組み立て可能な代表的形質転
換体を、以丁の表3vこ挙げる。 表 3 代表的形質転換体 1、 E、 coxi KI2 294/pJ’J
L262−!≦0匹旦 [12294/p”K273
」≧、 ccとコ、」−Iぐ12 294/p
Pit284 3、二カニ K]2 294/p”Hl
2285、 l≧、 工≧32−コ4コニ KI
2 294/丁・P IL2 g6 ↓6匹二 K
12 、/p P IL277 μ、且暖ユ K]2
C600/pPH268火、旦旦主土 K12 (じ
6 Q O/p P几279 μ9匹旦 K12 ”
’600/pl’H2310μ、二旦 [12C6Cl
0/pl’Jul 22811t1匹二 K12 C
600/pPH,2912上・9旦/p ’ IL27 13 火、 エソ?ユニし KI2 C6H1
+、に−八’に一/p門L261.4凹coli K
12 C600H,、、1ull−/pl’J715
蛇、旦止しエ K12 C6QQR,、R・lk
/pl’H12816秒、 coli K12
<シロ00H,に−八゛’ k−/pl’RI228
17 1;、 □9,5とコニ1エ +(
12(シロ 00 H,に−八I k−/p I’
+?・2918 μ、三二 K12/p I’ R
2819、1!:、 coli KI2 Hl(1
(Jl/pl’+(2620μ0図旦 K12 11J
QI/pl’H・272j、 E、 coli K
、12 J:IBIQl/pPH,2824E、
胚l j、 / p J’ R2831ル 圧i i
/ p l’ I(,29
第1図11プラスミドpIA7 /l/I の制限サ
イトおよび機能地図、第2図はプラスミド、] I’
R26ち・よびpP且27の制限サイト地図、第3図は
プラスミドp1. B 764△1の制限サイトおよび
機能地図(矢印は転写の方向を示す)、第4図G1プラ
スミドルJ”K28 オヨU pP ”1228ノ?l
1jfllt ”)−・(ト地図、第5図はプラスミド
pII I 7 、Z、 4△1の制限サイトおよび機
能地図(矢印な転写の力自社示す)、第6図はプラスミ
ドp P I(,29の制限サイト地図、第7図r1チ
モシンσ1遺伝子の構造2示す模式図、第8図にフラグ
メン1I;5の合成方法を示すフローチャート、第9図
はプラスミドp、i’ h /11の組み立゛C経路を
・示すフローチャート、第10図は合成プロイン/ニリ
ン遺伝子のヌクレオチド配列イヒ示ず模式図(アミノ酸
1〜30、B鎖、31〜65:C鎖、66〜86二A鎖
)、第11図iriプラスミドpHJ7へ4へ1の組み
立て経路を示すフローチャート、第12図はプラスミド
ル1目t04の組み立て経路を示すフローチャートであ
る。 FIG、1 α FIG、 2 FIG、 3 圧 FIG、4 FIG、5 FIG、 6 第1頁の続き 諺)Int、 C1,3識別記号 庁内整理番号(
C12N 15100 C12R1/19 ) 6760
−48(C12N 15100 C12R1107) 6760−
48(C12N 15100 C12R1/425) 6760
−4.8(C12N 15100 C12R1/38 ) 6760
−48(C12N 15100 CI2 R17’44 ) 67
60−4’B(C12N 15100 C12R1/46 ) 6760
−48(C12N 15100 C12R1104) 6760−
−48(C12N 15100 C12R1/465) 6760
−48(C12N 15100 C12R1101) 6760−
4BO発 明 者 ポール・ロバート・ロスチック・ジ
ュニア アメリカ合衆国インディアナ46 107ビーチ・グローブ・ヤズー ・ドライブ1526番
イトおよび機能地図、第2図はプラスミド、] I’
R26ち・よびpP且27の制限サイト地図、第3図は
プラスミドp1. B 764△1の制限サイトおよび
機能地図(矢印は転写の方向を示す)、第4図G1プラ
スミドルJ”K28 オヨU pP ”1228ノ?l
1jfllt ”)−・(ト地図、第5図はプラスミド
pII I 7 、Z、 4△1の制限サイトおよび機
能地図(矢印な転写の力自社示す)、第6図はプラスミ
ドp P I(,29の制限サイト地図、第7図r1チ
モシンσ1遺伝子の構造2示す模式図、第8図にフラグ
メン1I;5の合成方法を示すフローチャート、第9図
はプラスミドp、i’ h /11の組み立゛C経路を
・示すフローチャート、第10図は合成プロイン/ニリ
ン遺伝子のヌクレオチド配列イヒ示ず模式図(アミノ酸
1〜30、B鎖、31〜65:C鎖、66〜86二A鎖
)、第11図iriプラスミドpHJ7へ4へ1の組み
立て経路を示すフローチャート、第12図はプラスミド
ル1目t04の組み立て経路を示すフローチャートであ
る。 FIG、1 α FIG、 2 FIG、 3 圧 FIG、4 FIG、5 FIG、 6 第1頁の続き 諺)Int、 C1,3識別記号 庁内整理番号(
C12N 15100 C12R1/19 ) 6760
−48(C12N 15100 C12R1107) 6760−
48(C12N 15100 C12R1/425) 6760
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−48(C12N 15100 CI2 R17’44 ) 67
60−4’B(C12N 15100 C12R1/46 ) 6760
−48(C12N 15100 C12R1104) 6760−
−48(C12N 15100 C12R1/465) 6760
−48(C12N 15100 C12R1101) 6760−
4BO発 明 者 ポール・ロバート・ロスチック・ジ
ュニア アメリカ合衆国インディアナ46 107ビーチ・グローブ・ヤズー ・ドライブ1526番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、組換えI) N Aクローニングベクターによりバ
クテリアを形質転換させることからなる、天然に存rE
−J−るバクテリオファージから該バクテリアを保護す
る方法であって、該ベクターが、1)該バクアリアに制
限活性および同起源修飾活V1を伺りするl) N A
セグメント、2)該バクテリアにおいて機能するレプリ
コン、および、 3)該バクテリア中で機能的ポリペプチドを発現する遺
伝子、 を含有するととを特徴とする方法(ただし、1)天然に
存在するバクテリオファージは、該バクテリアに何カさ
れ/こ制限活性と同じ特異性の制限部位を有する2本鎖
r) N Aを含み、2)該修飾活性は、該バクテリア
において、制限活性に先qって発現される)。 2該バクテリアが、E、COl ]、”aC11−、L
u81Serra tla、−Pseudomonas
、 5taphylococcus、 5trepto
coccus。 Actinomycetes、 Streptomyc
es、 iたはAgrobacteriumのいずれか
である、第1項に記載の方法。 3該バクテリアがBacillus、好ましくは5ub
ti、]isまたはthurj ngiensis種で
ある、第2項に記載の方法。 4該組換えI) N Aクローニングベクターがプラス
ミドであり、該バクテリアがE、 coli、 K 1
2である第1項に記載−の方法。 5、 l) N AセグメントがPst l 制限およ
び修飾活性、1!coltl制限および修飾活性、1.
fha II制限および修飾活性、またはTaqI制限
および修飾活性のいずれかを付与する、第4項に記載の
方法、6、1lha、 II制限および修飾活性をイ・
t−’yスるl) N Aセグメントが、グラスミド9
1月10の〜2,7kbPet 、l制限フラグメント
である、第5項に写載の方法。 A遺伝子要求1qpM、1月レプリコン、。1tK2レ
プリコン、ILK(3レプリコン、 pSC10ル)
′リコン、1目層レプリコン、It、 P 4レプリコ
ン、It゛しブリコノ、または?;、 colj、 K
12中で複製を行なうノ(クテリオファージ由来のレ
プリコン、のいずれかである、第1頃、第5頃−または
第6項のv)14れかU′こ記載の方法。 8レプリコンがpOIA 遺伝子要求性pMtsルフ。 リコンである第7頃に記載の方法。 9該組換えI) N Aクローニングベクターが、ヒト
のプレーグロインシュリン、ヒトのプロインシュリン、
ヒトインシュリンA鎖、ヒトインシュリンB鎖、ヒト成
長ホルモン、ヒト以外の成長ホルモン、牛成長ホルモン
、ヒイ以列のインシュリン、ヒトインターフェロン、ヒ
ト以外のインターフェロン、ウィルス抗原、ウロキナー
ゼ、抗生物質針VL1・jlう、酵素、“あらゆるペプ
チドホルモン、またはあらゆるペプチド酵素、のいずれ
かを発現する直伝子である、第7項筺たは第8項に記載
の方法。 10プラスミドが、グラスミドp l’ It・26、
pI’l+・27・1)PIL28、pI’1t29、
またはp P 1(,12し8のいずれかである、第4
項〜第9項のいずれかに記載の方法。 Ll、該ハク−y−IJ アカ、E、 C01j K
12 z) n、v 30 B、294、C600、C
600RffM、h、llB1旧、捷たは旧シ827、
のいずれかの菌株である、第1O項に記載の方法。 12第1項〜第6項のいずれかに定義した組換えDNA
クローニングベクター。 ■3ノ”ラスミドpPIt25、pPlt271,1)
几28、pP几29、 またはpPR1228のいずれ
かである、第12項に記載のベクター。 14、 Taq l制限および修飾活性を付与するI)
N Aセグメント。 15、第1項〜第6項のいずれかに定義1.た組換え1
) N Aクローニングベクターを含有する形質転換バ
クテリア。 Ap;robac teriur++のいずれかである
、第15項に記載のバクテリア。 17グラスミドpPR27、pi’tt2BまたにpP
IL29のいずれかによって形質転換されたE、col
、i K 12の1LV308菌株、グラスミドppi
t27、l) P 1.(・28またはp I’ IC
29のいずれかによって形質転換された1ツ。 C’li r< l 2の294菌株、グラスミドpi
’a27によって形質転換されたE、 coli、K1
2c7)C600菌株、グラスミドpP11・28によ
って形質転換され′kE。 colj、 K 12 ノC600Rk−M k菌株、
プラスミ)”p”’2 g vcよって形′η転換され
た1つ0cm]−i K12のJ、I B101菌株、
もしくはプラスミドp、[’1L2Bによって形質転
換されたIC0con K 12のJ3E827菌株、
のいずれかである、第15項または第16項に記載のバ
クテリア。 18プラスミドpJ、) I I Qの〜2.7 kb
、Pst I 制限フラグメントをプラスミドplA
7へ4へlのI’si;■消化物にリゲーションするこ
とからなる、グラスミドI) l’ R26またはプラ
スミドpl’1L27の調製方法。 19、プラスミドpIJ11Oの〜2.7 kb、1)
stl制限フラグメントをグラスミドp 1. B 7
△41\1のPst、 1消化物にリゲーションするこ
とからなる、プラスミドpp IC2B’ 4たはプラ
スミドpP H,1228の調製方法。 20プラスミドpI’1t27の〜6.2 k l)
Ava I −Bgi IIフラグメントとフ゛ラスミ
ドpH17へ4△lの〜23 kb Ava I −B
g11フラグメントをリゲーションすることからなる、
プラスミドpI’ 1.C29の調製方法・
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