HU202585B - Process for protecting e. coli bacterium from natural bacteriofag - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás E. coli baktérium védelmére, természetben előforduló bakteriofágok ellen, és eljárás a módszerben használt klónozó vektorok és transzformánsok előállítására.

A találmány szerinti eljárás különösen fontos, mivel ezzel megoldhatjuk a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó baktériumtenyészetek tömeges fágfertőzésének problémáját Ez előnyös, mivel, ha egy adott terméket meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat egyszer transzformálunk egy gazdasejtbe, úgy alapvető fontosságú az, hogy a gazdasejtet megvédjük bakteriofágok ellen. A védelem alapvető fontosságú, mivel a transzformáns tenyészetek nagyon gyakran érzékenyek bakteriofágokra, amelyek fertőzés esetén az egész tenyészetet lizálják. Mivel a termék genetikai kifejeződése attól függ, hogy a gazdasejtek az adott bioszintézis lejátszódására elég hosszú ideig életben maradnak-e, a fertőzött tenyészet termelőkapacitása csökken.

A mikroorganizmusok fágfertőzése ismert jelenség. A vírus, vagy a bakteriális fertőzés esetén a bakteriofág kapcsolatba kerül a sejttel, adszorbeálódik, és reagál a gazdasejt sejtmembránjával. Az adszorpciókor a fág kromoszómája vagy genetikai anyaga belép a gazdasejtbe, és elkezdődik az a folyamat, amelynek során a sejt bioszintetikus eseményei szünetelnek, és elsősorban az új fágok termelésére állnak rá. A gazdasejt érett fágokkal telítődik, és ezután lizál; általában az eredeti fertőzést követő 30 percen belül. Az új fágok fertőzőképesek, és a ciklus addig ismétlődik, míg az összes jelenlévő gazdasejt elpusztul.

Eddig a nagyméretű fermentorokban E. coli sejtekkel végzett rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiák fejlődését hátráltatta a fentiekben ismertetett fágfertőzéssel együttjáró probléma. Tény, hogy a többféle bakteriofág jelenlétében bekövetkező fertőzés jelentősen hozzájárul ahhoz, hogy egy adott tennék bioszintézise létrejön-e vagy sem. Ez a nehézség különösen akkor játszik szerepet, ha a fermentációt nagy térfogatban végezzük, amikor elveszhet az E. coli transzformánsokból álló tenyészet

A találmány szerinti eljárással a bakteriofágok jelenlétével együttjáró problémákat megszüntethetjük, olcsón kivitelezhető és hatásos módszert alkalmazva a transzformánsok védelmére a természetben előforduló bakteriofágok ellen. Úgy járunk el, hogy a gazdasejteket egy olyan restrikciós rendszerrel látjuk el, amely képes emészteni a Hhall helyet tartalmazó idegen dezoxi-ribonukleinsavat. A Hhall hely a legtöbb természetben előforduló vírusban jelen van, így a találmány szerinti eljárást hatásosan használhatjuk a nehézségeket okozó bakteriofágok nagy része ellen. Amikor a fág dezoxi-ribonukleinsava a találmány szerinti gazdasejtbe bejut, a Hhall restrikciós endonukleáz a Hhall helyen emészti a dezoxi-ribonukleinsavat, amiután a fág életképtelen és veszélytelen lesz. Ily módon a baktérium gazdasejtek védhetők a természetben előforduló fágoktól.Igy biztosítjuk a tenyészet termelőképességét. Ez nem csupán előnyös, de jelentős előrehaladást jelent a jelenleg használt módszerekben.

Ha egyáltalán léteznek, igen kevés más módszert használnak az E. coli és más baktériumok részvételével végzett nagyméretű fermentációk bakteriofágok jelenlétével összefüggő problémáinak megoldására. Tény, hogy a bakteriofág fertőzések bekövetkeznek a leggon2 dosabb steril feltételek biztosítása közben is, és ha egyszer megjelenik, a bakteriofágot igen nehéz eliminálnunk. Bár a bakteriofág eltávolítása lehetséges, igen kényelmetlen és költséges időveszteséggel vagy termeléskieséssel jár.

A jelen leírás során az alábbi kifejezéseket használjuk:

Funkcionális polipeptid: kinyerhető, biológiailag aktív külső eredetű polipeptid vagy prekurzor, egy külső eredetű polipeptidből és részben vagy teljesen homológ polipeptidből álló kinyerhető, biológiailag aktív polipeptid, külső eredetű polipeptidet és egy biológiailag inaktív, homológ polipeptidet tartalmazó, kinyerhető, biológiailag inaktív, fúziós tennék, amely specifikusan hasítható, végül enzimfunkcióval rendelkező polipeptid.

Fuzionált géntermék: olyan külső eredetű, kinyerhető polipeptid, amely homológ (a sejthez tartozó) polipeptid egy részével vagy teljes egészével fuzionált.

Marker: a kromoszómán vagy egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektoron ismert helyen elhelyezkedő és ismert funkciójú gén vagy gének kombinációja.

Transzformáns: transzformációval előállított recipiens gazdasejt.

Érzékeny baktérium: fág jelenlétében növesztve fertőzhető baktérium.

Restrikciós fragmens: olyan, plazmidból, más vektorból vagy kromoszomális dezoxi-ribonukleinsavból előállított lineáris szakasz vagy lineáris teljes molekula, amelyet egy vagy több restrikciós enzimmel kapunk.

Beépülést izomer: két vagy több lehetséges rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekula közül az egyik, amely akkor jön létre, amikor egy dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst beépítünk két vagy több, befogadó dezoxi-ribonukleinsav-molekulán levő hely egyikébe.

R-M-rendszer: restrikciós és modifikációs rendszer.

Amp^R: ampicillin rezisztens fenotípus.

Amp^s: ampicillin érzékeny fenotípus.

Tet^R: tetraciklin rezisztens fenotípus.

Tet^s: tetraciklin érzékeny fenotípus.

A találmány értelmében úgy járunk el, hogy E. coli gazdasejtet

1. a baktérium szempontjából Hhall restrikciós és metilező modifikációs aktivitást meghatározó gént tartalmazó pDHO plazmid ~2,7 kb PstI fragmenst magában foglaló fezoxi-ribonukleinsav-szegmenst,

2. E. coli replikációs origót és

3. az E. coliban funkcionális polipeptidet meghatározó gént tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorral transzformálunk, azzal a feltétellel, hogy

1. a természetben előforduló bakteriofág Hhall restrikciós helyet tartalmaz egy kétszálú dezoxi-ribonukleinsavon, és

2. a metilező modifikációs aktivitás előtt nyilvánul meg.

A kétszálú dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó, természetben előforduló bakteriofág ellen felhasználható, specifikus restrikciós helyet tartalmazó rekombináns klónozó vektorok előállítására a találmány értelmében úgy járunk el, hogy

1. koordinatíven és egymás után következően Hhall restrikciós aktivitást és metilező kifejező géneket tartal-23

HU 202 585 Β mazó pDIlO plazmid ~2,7 kb PstI fragmenst magában foglaló dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst,

2. E. coli replikációs origót és

3. E. coliban funkcionális polipeptidet kifejező gént összekapcsolunk.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti módszer során használt klónozó vektorok és transzformánsok előállítására; ezek fontosak a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav által meghatározott termékeket bioszintetizáló mikroorganizmusokkal végzett nagy méretű fermentációs biztonságosság tételére. Restrikciós és modifikációs rendszer nélkül sok tenyészet bakteriofággal fertőzhető, így csökken az adott tennék bioszintézise.

A találmány szerinti eljárást a Haemophylus haemolyticus Hhall restrikciós-modifikációs rendszerével szemléltetjük. A Hhall restrikciós-modifikációs rendszert meghatározó gének egymáshoz közel helyezkednek el, és a Hhall restrikciós endonukleáz és egy ezzel összefüggő metiláz enzim bioszintézisét kódolják. A Hhall restrikciós enzim a

GANTC

CTNAG’ szekvenciát ismeri fel, és hasítja a kétszálú dezoxi-ribonukleinsavon; ugyanakkor a vele összefüggő modifikációs metiláz metilezi a megadott szekvencia nukleotidjait. A témában jártas szakemberek tudják, hogy a metiláz enzim által meghatározott modifikációs rendszernek azelőtt kell kifejeződnie, mielőtt a Hhall restrikciós enzim bioszintézise bekövetkezik. A Hhall restrikciósmodifikációs rendszert tartalmazó sejtek így védve vannak a Hhall emésztéssel szemben, ugyanakkor a Hhall helyet tartalmazó, nem módosított, idegen, kétszálú dezoxi-ribonukleinsavak hasadnak. Így a Hhall restrikciós-modifikációs rendszer alkalmas a találmány szerinti eljárás szemléltetésére.

Részletesebben szólva, a találmány szerinti eljárást úgy szemléltetjük, hogy a pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI restrikciós fragmensét a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid inzulin A láncába klónozzuk. A ρΙΑ7Δ4Δ1 tartalmazza az E. coli triptofán promoterét, tartalmaz antibiotikum rezisztenciát meghatározó markereket, tartalmaz továbbá egy olyan gént, amely az E. coli K12 trp E protein egy részét a humán inzulin A polipeptid láncával fuzionálva tartalmazó fuzionált génterméket fejez ki. A ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg.

A pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI fragmense Hhall specificitású restrikciós és modifikációs géneket tartalmaz. A pDHOplazmidot az E. coli K12 294/pDI10 sejtekből izoláljuk. A törzs az alábbi állandó törzsgyűjteményben van letétbe helyezve:

Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois. A pDIlO plazmid forrásaként a B-15097 számon rendelhető meg.

A konvenciók szerint a ,A” jel deléciót jelent. így például egy plazmid jellemzése során a „AEcoRI-Xbal” jellel olyan plazmidot adunk meg, amelyből az EcoRI és Xbal restrikciós helyek közötti nukleotid-szekvencia ezen enzimekkel való emésztéssel kihasadt. Az egyszerűség kedvéért bizonyos deléciókat számmal jelzünk, így például a pBR322 plazmidban a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént megelőző EcoRI felismerhető hely első bázispárjától kezdődően a „Δ1” azt jelenti, hogy az 1-30. bázispár (azaz AEcoRI-HindlII) kiesett, így nincs jelen a tetraciklin promoter/operátor rendszer. A „Δ2” azt jelenti, hogy az 1-375 bázispár (azaz AEcoRI-BamHI) és ennek következtében a promoter/operátor rendszer és a strukturgén (tetraciklin rezisztencia) egy része kihasadt. A „Δ4” a trp operon fragmens 900-1500. bázispáijának kiesését jelzi, azaz eliminálódott a trp D polipeptid strukturgénje.

A pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI Hhall restrikciós-modifikációs génjét tartalmazó restrikciós fragmens ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmidba való klónozásakor a pPR26 éspPR27 új plazmidokat kapjuk. Mindkét plazmid megvédi a baktériumot, így például a különböző E. coli törzseket a természetben előforduló bakteriofágok fertőzésétől. A pPR26 és pPR27 plazmidok restrikciós térképét a mellékelt 2. ábrán adjuk meg.

A találmány szerinti eljárást a pPR28 és pPR1228 új plazmidok előállításával is szemléltethetjük. A pPR28 és pPR1228 plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy a pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú, Hhall restrikciós-modifikációs gént tartalmazó PstI restrikciós fragmensét beépítjük a ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmidba. A ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid tartalmazza az E. coli triptofán promotert, antibiotikum rezisztencia markereket, és tartalmaz továbbá egy olyan gént, amely E. coli K12 trp E proteinrészt és ezzel fuzionálva a humán inzulin B polipeptid láncát meghatározó, fuzionált génterméket határoz meg. A pPR28 és pPR1228 plazmidok szintén megvédik a baktériumokat, például a különböző E. coli törzseket a természetben előforduló bakteriofágoktól. A ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid és a pPR28 és pPR1228 plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 3. és 4. ábrákon adjuk meg.

A pPR27 plazmid 6,2 kb nagyságú, Hhall restrikciós-modifikációs gént tartalmazó Aval-BglII restrikciós fragmensenek és a ρΗΙ7Δ1Δ4 plazmid 2,3 kb nagyságú Aval-BglII restrikciós fragmensének ligálásakor egy új plazmidot, a pPR29 jellel jelzett plazmidot kapjuk. A ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid tartalmazza az E. coli triptofán promotert, tartalmaz antibiotikum rezisztencia markereket és egy olyan gént, amely az E. coli K12 trp E protein egy részét és a humán proinzulin polipeptidet fuzionálva tartalmazó fuzionált génterméket fejez ki. A pPR29 plazmid restrikciós és modifikációs aktivitással rendelkezik, és így megvédi a baktériumokat, például a különböző E. coli törzseket a természetben előforduló bakteriofág-fertőzésektől. A ρΗΙ7Δ4Δ1 és pPR29 plazmidok restrikciós és funkcionális térképét az 5., illetve 6. ábrákon adjuk meg.

A találmány szerinti eljárás rugalmasan használható, és felhasználható bármely olyan esetben, amikor rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor által meghatározott bioszintézis történik, de felhasználható bármely endogén metabolikus bioszintézis esetén is. Előnyösen rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorként plazmidot használunk, de felhasználhatunk bakteriofágot, kozmidot és más vektorokat is. A találmány szerinti eljárás során felhasználhatunk bármely restrikciós és modifikációs rendszert, azzal a feltétellel, hogy a gének koordinatívan fejeződnek ki, azaz, a modifikációs funkció a restrikciós funkció előtt fejeződik ki. Mivel a találmány szerinti eljárás felhasználhatósága független a klónozó vektorban levő markerektől vagy más génektől, az eljárás előnyösen alkalmazható rekombináns vagy más, olyan törzsek esetén is, amelyek egy vagy több gyakorlati vagy kutatási értékkel rendelkező gént hordoznak.

HU 202 585 Β

A baktériumok védelmére a természetben előforduló bakteriofágok ellen a találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint Hhall specificitású, plazmidon levő restrikciós és modifikációs géneket használunk. Használhatunk más specificitású restrikciós-modifikációs rendszert meghatározó géneket is. Ezek például a következők: PstI restrikciós-modifikációs rendszer (Walder és munkatársai, Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 78 (3), 1503,1981); EcoRI restrikciós-modifikációs rendszer (Jack és munkatársai, Fed, Proc, Fed. Am. Soc. Exp. Bioi., 39,1875,1980); vagy a Taql restrikciós-modifikációs rendszer (Lan-Hsiaing és munkatársai, Fedeiation Proc., 41, 5427,1982). A Taql restrikciós-modifikációs rendszer génjeit könnyen klónozhatjuk a Thermus aquaticus YT-1 sejtekből (Brock és Freeze, J. Bacteriology, 98 (1), 289, 1969; típustörzs: ATCC 25104) Mann és munkatársai szerint eljárva (Gene, 3, 97,1978). Ugyanúgy, ahogy a Hhall restrikciós-modifikációs rendszernél, a modifikációs géneknek a restrikciós gének előtt kell kifejeződniük. A fenti géneket külön-külön vagy a Hhall vagy más, restrikciós-modifikációs rendszerrel kombinálva is felhasználhatjuk a baktériumok védelmére a természetben előforduló bakteriofágok ellen, így ezek is a találmány oltalmi körén belül esnek.

A találmány szerinti módszert a baktériumok védelmére a természetben előforduló bakteriofágok ellen olyan gazdasejtek esetén is felhasználhatjuk, amelyek egy sor felhasználható terméket kifejező gént hordozó vektort tartalmaznak. Bár a restrikciós-modifikációs géneket egy különálló vektoron is bejuttathatjuk a sejtbe, klónozhatjuk ezeket a géneket egy olyan plazmidba is, amely a felhasználható terméket kifejező gént tartalmaz. Használható polipeptidet kifejező gén lehet természetben előforduló, nem természetes vagy részben természetben előforduló és részben szintetikus vagy nem természetes gén. Részletesebben szólva, a restrikciós-modifikációs rendszer génjeit klónozhatjuk olyan plazmidokba, amelyek tartalmaznak humán pre-proinzulint, humán proinzulint, humán inzulin A-láncot, humán inzulin B-láncot, humán növekedési hormont, nem humán növekedési hormont, marha növekedési hormont, nem humán inzulint, humán interferont, nem humán interferont, vírus antigént, urokinázt, antibiotikum rezisztenciát kialakító enzimet, bármely peptid hormont, bármely peptid enzimet vagy gyakorlatilag bármilyen kutatási vagy gyakorlati értékkel bíró peptidet kifejező gént.

A találmány specifikus kivitelezési változatai során a plazmid replikációját és a polipeptid tennék kifejeződését a pMB 1 -bői származó polA gént igénylő replikonnal [lásd Bolivár, Life Sci., 25, 807-818 (1979)] és a trp promoterrel határozzuk meg. Más replikonokat és promotereket is használhatunk mindaddig, míg ezek funkcionálnak a védendő egyes baktérium-transzfórmánsokban. A témában jártas szakemberek könnyen meghatározhatják, mely replikonok és promoterek használhatók előnyösen az egyes baktériumokban. A felhasználható egyéb replikonok közül megemlítjük a ColEl, NR1, RK2, RK6, pSCIOl, RP1, RP4, F és más, ezekhez hasonló replikonokat, köztük az E. coli K12 sejtekben replikálódni képes bakteriofágokat. Az egyéb felhasználható promoterek például a lambdaP_L promoter, a lipoprotein promoter, lac promoter, a riboszóma protein vagy ribonukleinsav promoterek, illetve gyakorlatilag bármely más promoter. A témában jártas szakemberek megértik, hogy a találmány szerinti restrikciós-modifikációs rendszert tartalmazó vektorok előállításakor egy sor replikációs origót és promotert használhatunk fel.

Az E. coli baktériumról rendelkezésünkre álló genetikai és biokémiai információk gazdagsága miatt ezt a törzset előnyösen használhatjuk a találmány szerinti eljárás során. Ezenkívül, mivel a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiák segítségével előállított biológiai termékek nagy részét E. coli K12 sejtekkel állítják elő, különösen előnyös, ha a találmány szerinti eljárás során ezt a törzset használjuk. Ahogy azt az előzőekben már említettük, az E. coli törzzsel végzett nagy méretű fermentációk során gyakran jelentkezik a fág-fertőzéssel kapcsolatos nehézség. A találmány szerinti eljárással ezt a problémát gyakorlatilag megoldjuk, és így lehetővé válik a bioszintetikus termékek gyakorlati előállítása.

Ennek ellenére, a találmány szerinti eljárást nem korlátozzuk egy nemre, fajra vagy törzsre, mivel bármely olyan mikroorganizmusban használhatjuk, amelyekben egy restrikciós-modifikációs rendszer génjei klónozhatok. A találmány szerinti eljárás alkalmazható például általában a prokarióták esetén, részletesebben baktériumoknál, köztül például E. coli, E. coli K12, E. coli K12 294 (lásd Goeddel és munkatársai,Proc. NaL Acad. Sci., USA, 76,106,1979), E. coli K12 RV308 [lásd Mauerés munkatársai,!. Mól. Biok, 139,147 (1980)], E. coliK12 C600 (lásd Bachman, Bacteriol, Rév., 36, 526 (1972)], E. coli K12 C600R_k-M_k- [lásd Chang és Cohen, Proc, NaL Acad, Sci. USA, 71, 1030 (1974)], E. coli K12 HB101 [Bolivár és munkatársai, Gene, 2,75 (1977)], E. coli K12 BE827 (ATCC 31911), Bacillus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Staphylococcus, Streptococcus, Actinomycetis, Streptomyces, Agrobactcrium, Serratia, Pseudomonas vagy bármely más, olyan baktériumsejt esetén, amely érzékeny bakteriofág-fertőzésre, és amelybe restrikciós-modifikációs rendszer klónozható.

A találmány szerinti eljárás során klónozó vektoiként előnyösen az alábbi plazmidokat használhatjuk: pPR27, pPR28 és pPR29, az előnyös transzformánsok az E. coli K12 RV308/pPR27, az E. coli K12 RV308/pPR28 és az E. coli K12 RV308/pPR29. Ezek, és a találmány szerinti többi kivitelezési változat is azzal a közös jellemzővel bír, hogy alkalmazásával megvédhetjük a baktériumokat a természetben előforduló bakteriofágoktól. így a találmány szerinti eljárással lehetségessé válik a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó mikroorganizmusokkal nagy méretű fermentációs végzése anélkül, hogy jelentős valószínűséggel fágfertőzés, lizis és ennek következtében bioszintetikus kapacitáscsökkenés következzen be.

A találmány szerinti eljárást részletesen az alábbi példákkal szemléltetjük.

1. példa

A pDIlO plazmid izolálása és előállítása

Bazaral és Helinski módszerével [J. Mól. Biot, 36, 185 (1968)] 1 pg pDIlO plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk az E. coli K12 294/pDI 10, NRLL Β-15097 törzsből. A dezoxi-ribonukleinsavat TE-pufferban oldjuk, ennek összetétele a következő:

mM etilén-diamin-tetraecetsav, mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8.

pg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. Mivel az E.

-4HU 221 585 Β coli K12 294 egy Rt’M/ sejt, a plazmid dezoxi-ribonukleinsav EcoK-specificitás alapján metilezéssel izolálható. 5 μΐ, 0,1 pg dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot SSC/10-oldatban (15 mM nátrium-klorid és

1.5 mM trinálrium-citrát, pH = 7) 50 μΐ-re hígítunk. Ezután 25 pl puffer-dezoxi-ribonuklcinsav-oldalot 50 μΐ E. coli KI2 C600R_kM_k scjtszuszpenzióval keverünk.

Ismert módon E. coli K12 CóOORfMf [Chang és Cohen, Proc, Nat. Acad, Sci., USA, 71,1030 (1974)] kompetens sejtszuszpenziót készítünk. Úgy járunk el, hogy L-táptalajban [Mikler, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972)] készült friss, egy éjszakán át növesztett tenyészetet 1 : 9 arányban hígítjuk friss Ltáptalajjal, és egy órán át 37 °C hőmérsékleten tovább növesztjük. 6,6 x 10⁷ sejt/ml a tenyészet sűrűsége, amikor a sejteket összegyűjtjük, 2,5 ml, 1Ö0 mmólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, 2,5 ml, 150 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, és 20 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Összegyűjtjük a sejteket, 0,5 ml alábbi összetételű oldatban szuszpendáljuk:

150 mM kalcium-klorid és 10% glicerin.

3-5 percen át jégfürdőben hűtjük, cs ezután fagyasztjuk. A fagyasztott kompetens sejtszuszpenziót használatig folyékony nitrogén alatt tartjuk. Az előkészület és a tárolás nem csökkenti a sejtek élőképességét vagy a kovalensen zárt, kör alakú plazmid dezoxi-ribonukleinsavval végzett transzformáció frekvenciáját. Jcgfürdőben felolvasztjuk a sejtszuszpenziót és 0,5 térfogat dezoxi-ribonukleinsav-oldattal keverjük, transzformáció céljából. A transzformációs elegyet jégfürdőben 20 percen át hűtjük, majd 1 percen át 42 ’C hőmérsékleten hősokkot végzünk, és ezután 10 percen át jégfürdőben ismét hűtjük. Ezután 5,7 térfogat L-táptalajjal hígítjuk a sz.uszpenziót, és 90 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

A transzformánsok izolálására a tenyészetet

12.5 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agaron növesztjük. Az izolátumok tetraciklin-rezisztenciáját ellenőrizzük és megállapítjuk ampicillin-érzékenységüket, amiután megkapjuk az előállítani kívánt E. coli K12 C600R_k'M_k ^_ /pDIlO transzformánsokat. A megfelelő telepekből kovalensen zárt kör alakú dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, Bazaral és Helinski 1968-ban leírt módszere szerint eljárva. A plazmid szerkezetet restrikciós helyeinek térképezésével bizonyítjuk.

2. példa

A ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid előállítása

A) A pBRHtrp plazmid előállítása

ApGMl plazmid hordozza a ALE1413 delóciót tartalmazó E. coli triptofán operont [Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 1457-1466 (1978)], és ezért olyan fúziós proteint fejez ki, amely áll a trp vezető szakasz első 6 aminosavából és a trp E polipcptid körülbelül utolsó egyharmad részéből (a továbbiakban LE’ jellel jelöljük), továbbá kifejezi a trp D polipcptidet teljes egészében, és mindezt a trp promoter-operator rendszer szabályozása alatt. Az E. coli K12 W311Otna2trpA102/pGMl törzs az American Type Culture Collection-ban van letétbe helyezve (ATCC 31622). A sejtekből a pGMl hagyományos módon izolálható.

pg plazmidot PvuII restrikciós enzimmel emésztünk, az enzim a plazmidot öt helyen hasítja. A génfragmenseket EcoRI linkerekkel kapcsoljuk (ez önmagukkal komplementer, alábbi szekvenciájú oligo-nukleotid: pCATGAATTCATG), így olyan EcoRI hasítási helyet biztosítunk amely a későbbiekben felhasználható EcoRI helyet tartalmazó plazmidba való, klónozáshoz. A pGMl plazmidból kapott 20 pg mennyiségű dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 10 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 200 pikomól 5’-foszforilezett, szintetikus pCATGAATTGATG oligonukleotid jelenlétében, 20 μΐ T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-pufferban. A puffer összetétele a következő:

mM trisz, pH = 7,6,

0,5 mM ATP, mM magnézium-klorid és 5 mM ditio-treitol.

A reakciót egy éjszakán át végezzük 4 *C hőmérsékleten. Ezután 10 percen át 70 C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, a ligálás befejezésére. A linkereket EcoRI emésztéssel hasítjuk, és az EcoRI végekkel rendelkező fragmenseket 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve elkülönítjük. A három legnagyobb fragmenst izoláljuk a gélről oly módon, hogy először etidium-bromiddal festjük, és azután ultraibolya fénnyel lokalizáljuk a fragmensek helyeit. Innen kivágjuk a gélt. A géldarabokat 300 pl, 0,1 x TBE-oldatlal dialízis-zsákokba helyezzük, és 1 órán át 0,1 x TBE-oldatban 100 V feszültség mellett elektroforézist végzünk. A TBE-puffer 10,8 g trisz-bázist, 5,5 g bórsavat, 0,09 g dinálrium-ctilén-diamin-tetraecetsavat tartalmaz 1-énként. A dialízis-zsákból összegyűjtjük a vizes oldatot, fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, és nátrium-klorid töménységét 0,2 mólra állítjuk be. Ezután etanolos kicsapással elkülönítjük a dezoxi-ribonukleinsavat. Az EcoRI ragadós végekkel rendelkező, trp promoteroperator rendszert tartalmazó gént az alábbiakban megadott módon azonosítjuk. Úgy járunk el, hogy a fragmenseket tetraciklin-érzékeny plazmidba építjük be, amelyek a promoter-operator rendszer beépülését követően tctraciklin-rezisztenciát fognak meghatározni. A továbbiakban megadott összes dezoxi-ribonuklcinsav-fragmens izolálást poliakril-amid gél-elektroforézist követő elektroelucióval végezzük, ahogy azt az előzőekben megadtuk.

B) A trp promoter-operator rendszer szabályozása alatt tetraciklin rezisztenciát kifejező pBRH trp plazmid előállítása és az A) pontban megadottak szerint izolált trp promoler-operatort tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-fragmens azonosítása és sokszorosítása A pBRHl plazmid [Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3267-3287 (1979)] ampicillinrezisztenciát fejez ki, és tartalmazza a tetraciklin-rezisztenciát meghatározó gént, azonban - mivel ez promoterrel nincs kapcsolatban - a rezisztenciát nem fejezi ki.

A plazmid így tetraciklin-érzékeny. Az EcoRI helyre promoter-operator rendszert beépítve a plazmid tetraciklin-rezisztenssé tehető.

A pBRHl plazmidot EcoRI enzimmel emésztjük. Az enzimet fenolos extrakcióval távolítjuk el, majd kloroformos extrakciót követően a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük cl. A kapott dezoxi-ribonuklcinsav-molekulát egy másik reakcióelegyben az előzőekben a 2A) példa szerint előállított három dezoxi-ribonuklcinsav-fragmens mindegyikével keverjük, és az előzőekben megadottak szerint T4 dczoxi-ribonuklein5

HU 202 585 Β sav-ligázzal ligáljuk. A reakcióelegyben jelenlévő dezoxi-ribonukleinsavval ismert módon [Hershfield és munkatársai,Proc, NaL Acad, Sci., USA, 71,3455-3459 (1974)] E. coli K12 294 kompetens sejteket transzformálunk, és a baktériumokat LB-lemezeken [Miller (1972)] szélesztjük, a táptalajba előzőleg 20 pg/ml ampicillint és 5 pg/ml tetraciklint adagolunk.

Több tetraciklin-rezisztens telepet szelektálunk, és ezekből izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és ezt pBRHtrp jellel jelöljük. Az adott fragmens jelenlétét restrikciós enzimmel végzett analízissel bizonyítjuk. A pBRHtrp plazmid β-laktamáz enzimet fejez ki, az ampicillin rezisztenciát kódol. A plazmid tartalmazza a trp promoter-operator rendszert hordozó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmens meghatároz továbbá egy első fehérjét (ezt LE’ jellel jelöljük), amely a trp vezetőrész első 6 aminosavának és a trp E polipeptid körülbelül utolsó harmadának fúziójából jön létté. Meghatároz a fragmens továbbá egy D’jellel jelzett második proteint is, ez megfelel a trp D polipeptid körülbelül első felének. A meghatározott harmadik protein a tetraciklin-rezisztencia gén által kódolt

C) A pSOM7&2 plazmid előállítása

A pBRHtrp plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott fragmenst poliakril-amid gélelekttoforézissel és elekttoelucióval izoláljuk. Az izolált fragmenst EcoRI enzimmel emésztett pSOMll plazmid [Itakura és munkatársai, Sci., 198,1056(1977); brit szabadalmi leírás, 2 007 676A] fragmensekkel keverjük. Az elegyet T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal ligáljuk, és a kapott dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 294 sejteket transzformálunk, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A transzformáns baktériumokat ampicillint tartalmazó táptalajon szelektáljuk, és az így kapott ampicillinre rezisztens telepeket telephibridizációval vizsgáljuk [Gruenstein és munkatársai, Proc, Nat. Acad. Sci., USA 72, 3951-3965 (1975)]. A fenti kísérletben próbaként a pBRHtrp plazmidból izolált, és ezután P³²-vel radioaktívan jelzett ttp promoter-operatort tartalmazó fragmenst használjuk. A telephibridizáció során több telep pozitív reakciót adott, és így szelektáljuk ezeket. Izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és a beépült fragmensek orientációját restrikciós analízissel meghatározzuk, az analízist BglII és BamHI enzimekkel végezzük, kettős emésztést használva. Az adott plazmidot tartalmazó telepeket, amelyek megfelelő orientációban hordozzák a trp promoter-operator fragmenst, LB-táptalajban [Miller (1972)] növesztjük, 10 gg/ml ampicillin jelenlétében. A plazmidot pSOM7A2 jellel jelöljük, és az alábbi kísérletekben felhasználjuk.

D) A pTrp24 plazmid előállítása

1. Az LE’ polipeptid távolabbi régióit meghatározó kodonokat tartalmazó és a kódoló szál 5’ -illetve 3'-végein Bglíl, illetve EcoRI restrikciós helyet hordozó génfragmens előállítása ' A pSOM7A2 plazmidot HindlII enzimmel, majd ezután lambda exonukleázzal (5’-3’-exonukleáz) kezeljük, olyan körülmények között, hogy az emésztés az LE’-t meghatározó régió BglII restrikciós helye mentén történjen. 20 gg HindlII enzimmel emésztett pSOM7A2 plazmidot 20 mmól glicin-puffer, pH = 9,6,1 mM magnézium-kloridot és 1 mM β-merkapto-etanolt tartalmazó elegyben oldunk. A kapott elegyet 5 egység lambda exonukleázzal kezeljük 60 percen át, szobahőmérsékleten. A kapott reakcióelegyet fenollal, majd kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk.

Az LE’ génfragmens távolabbi végén EcoRI vég előállítására továbbfejlesztett foszfo-triészter-módszerrel [Crea és munkatársai, Proc. Nat Acad. Sci., USA, 75, 5765 (1978)] előállítjuk az alábbi prímért:

P³²CCTGTGC ATG AT. ezt az exonukleázos emésztés után kapott LE’ génfragmens egyszálú végéhez hibridizáljuk. A hibridizációt úgy végezzük, hogy 20 gg lambda exonukleázzal kezelt, HindlII enzimmel emésztett pSOM7A2 plazmid fragmenst 20 pl vízben oldunk, és 6 pl, 80 pikomól 5’-foszforilezett, fentiekben megadott oligonukleotidot tartalmazó oldattal keveijük. A szintetikus fragmenst az LE’ kódoló szekvencia 3’-végéhez hibridizáljuk, és a megmaradó, az LE’ fragmensen lévő egyszálú szakaszt Klenow pohmeráz I enzimmel töltjük fel dATP, dTTP, dGTP és dCTP jelenlétében. A Klenow pohmeráz I a dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I proteolitikus emésztésével kapott enzim. 5’-3’ polimerizációs aktivitással rendelkezik, továbbá rendelkezik 3’-5’ exonukleolitikus aktivitással, hiányzik azonban az eredeti enzim 5’-3’ exonukleolitikus aktivitása [Komberg (1974), Freeman és Co., SFO, 98].

’C hőmérsékletre melegítjük az elegyet, és lassan 10 ’C-ra hűtjűk, amiután 4 gl Klenow enzimet adagolunk. 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd az inkubációt 30 percen át 37 ’C hőmérsékleten folytatjuk. A reakciót 5 gl, 0,25 mólos etiléndiamin-tettaecetsav-oldat adagolásával állítjuk le. Fenollal, majd kloroformmal extraháljuk a reakcióelegyet, és etanollal kicsapjuk. Az izolált dezoxi-ribonukleinsavat BglII restrikciós enzimmel hasítjuk, és a fragmenseket poliakril-amid gél-elektroforézissel elkülönítjük. A várt, 470 bázispárból álló P³²-jelzett fragmens jelenléte révén autoradiogrammot kaptunk. A fragmenst elekttoelucióval izoláljuk. Ahogy azt kifejtettük, ez az LE’ (d) fragmens BG1II véggel és egy olyan tompa véggel rendelkezik, amely az adott príménél kezdődik.

2. A pTHctl plazmid előállítása

A pTHal plazmid előállítására a thimozin-a-1 szintetikus gént beépítjük a pBR322 plazmidba. A thimozinal fehérjét kódoló dezoxi-ribonukleinsav szintézise magában foglalja 16 oligonukleotid (T_rTi₆) szintézisét és ligálását, ahogy azt a mellékelt 7. ábrán a két fejjel jelzett nyilak mutatják. Az N-terminális végre metionin kodont (ATG) kapcsolunk, és az 5’-végeket egyszálú kohéziv végekké alakítjuk abból a célból, hogy EcoRI és BamHI enzimekkel hasított plazmidhoz kapcsolhassuk. Ahogy az könnyen belátható, a gén közepén elhelyezkedő BglII hely elősegíti a rekombináns plazmidok analízisét.

A T,-T₁₆ oligo-dezoxi-ribonukleotidokat módosított foszfo-triészter-módszerrel állítjuk elő, teljesen védett ttidezoxi-ribonukleotid építőköveket használva [Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977) és Crea és munkatársai (1978)]. A különböző oligo-dezoxi-ribonukleotidokat az alábbi I. táblázatban mutatjuk be.

-611

HU 202 585 Β

1. táblázat

A thimozinal gén előállításakor használt szintetikus oligonuldeotidok'

Ve-	Szekvencia	Hosz- HPLC
gyű-		'szú- analízis,
let		ság retenciós ídó (perc’)

T,	A-A-T-T-C-A-T-G-T-C	10	17,4
T2	T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A	15	24,3
T3	T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A	12	20,3
T4	G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A	13	22,0
T5	G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G	15	24,8
T6	G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A	12	20,1
T7	A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A	13	22,6
T8	A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T	12	20,2
T9	G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G	12	20,4
T10	A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T	12	21,1
T„	G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T	12	20,5
T12	G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G	12	20,4
T13	C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T	12	19,9
T„	T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C	12	20,5
T15	G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C	12	20,2
TJ6	G-A-T-C-C-T-A-T-T-A	10	17,2

* = szobahőmérsékleten.

A fenti szintézist a Tu-fragmens előállítása kapcsán ismertetjük, és a mellékelt 8. ábrán foglaljuk össze. A T₁₅-fragmens szintézisekor használt különböző nukleotidokat az ábrán számmal jelöljük. A rövidítések a következő jelentésűtek:

TPSTe: 2,4,6-triizo-propil-bcnzol-szulfonil-tetrazol;

BSA: bcnzol-szulfonsav;

TLC: vékonyréteg-kromatográfia;

HPLC: nagyfelbontású folyadékkromatográfia;

DMT: 4,4’-dimctoxi-tritil-csoport;

CE: 2-ciano-etíl-csoport;

R: p-klór-fenil-csoport;

Bz: benzoilcsoport;

An: anizoilcsoport;

iBu: izobutirilcsoport;

Pi: pirídin;

AcOH: ecetsav;

Et₃N: trietil-amin.

mg (0,05 mmól) teljesen védett 4 tridezoxi-ribonukleotidot és 180 mg (0,1 mmól) 2-t védőcsoporttal látunk el az 5’-hidroxil-csoportokon oly módon, hogy kloroform és metanol 7:3 térfogatarányú elegyében 2% BSA-val (bovin szérumalbumin) kezeljük, 10 percen át, 0 ’C hőmérsékleten.

A reakció leállítására telített, vizes ammónium-bikarbonát 2 ml-ét adagoljuk, az elegyet 25 ml kloroformmal extraháljuk, és 2 x 10 ml vízzel mossuk. A szerves oldószeres fázist magnézium-szulfáttal vízmentesítjük, 5 ml térfogatúra töményítjük és petroléterrel (35 ’C - 60 ’C hőmérsékleten forró frakció) kicsapjuk. A színtelen csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután megkapjuk sorrendben a 6 és 8 vegyületeket. A terméket a szilikagélen (Merck 60 F254) kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyével végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint homogének.

270 mg (0,15 mmól) 1 és 145 mg (0,075 mmól) 3 trimert az 5, illetve 7 foszfo-diészterekké alakítunk át oly módon, hogy 25 percen át, szobahőmérsékleten trietil-amin, pirídin és víz 1 ; 3 : 1 térfogatarányú elegyének 10 ml-ével kezelünk. A reagenseket forgó desztillátorban távolítjuk el, és a desztillációs maradékokat 3 x 10 ml vízmentes piridinnel végzett, ismételt desztillációkkal szárítjuk. 0,05 mmól 8 trimert és 7 trimert 50 mg (0,15 mmól) 2,4,6-triizo-propil-benzol-szulfonil-tetrazollal elegyítünk, és a reakcióelegyet 2 órán át csökkentett nyomású térben hagyjuk szobahőmérsékleten. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint a 8 trimer 95%-a hexamer termékké alakult (úgy vizsgáljuk, hogy a 4,4’-dimetoxi-tritil-csoportokat 10%-os, vizes kcnsavval reagáltatjuk és 60 C hőmérsékleten hevítjük). A reakciót 1 ml víz adagolásával leállítjuk, és az oldószert csökkentett nyomású térben desztillálva eltávolítjuk. Toluollal való együttes desztillációval eltávolítjuk a piridint, és a hexamert az 5’-helyzetben védőcsoport-hasítjuk 8 ml 2% benzol-szulfonsawal, ahogy azt a 4 és 2 trimerck esetén megadtuk. A 10 terméket szilikagél oszlopon (Merck 60 H, 3,5 x 5 cm) tisztítjuk, kloroform és metanol 98:2-95:5 térfogatarányú elegyeivel végzett szakaszos gradiens elucióval. A 10 terméket tartalmazó frakciókat szárazra desztilláljuk.

Az 5 trimert hasonlóképpen összekapcsoljuk a 6 vegyülettel, és a teljesen védett terméket szilikagélen közvetlenül tisztítjuk. Az utóbbi vegyületet 3’-végein védőcsoport-hasítjuk az előzőekben megadottak szerint eljárva, trietil-amin, pridin és víz elegyével. Ily módon megkapjuk a 9 fragmenst.

Végül a 9 és 10 hexamereket 2 ml vízmentes piridinben kapcsoljuk 75 mg (0,225 mmól) 2,4,6-triizo-propil-benzol-szulfonil-tetrazollal, mint kondcnzálószerrel. A reakció szobahőmérsékleten 4 óra alatt tel icssé válik, ezután az elegyet rotavaporban desztilláljuk, és a desztillációs maradékot szilikagélen kromatografáljuk. Petroléteres kicsapással 160 mg 11 terméket kapunk, ez a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint homogén. 0,5 ml piridinben 20 mg 11 vegyületet oldunk, és 7 ml tömény ammónium-hidroxiddal kezeljük 8 órán át, 60 ‘C hőmérsékleten, a védőcsoportok teljes hasítására. Ezután 80%-os ecetsav-oldattal kezeljük, 15 percen át, szobahőmérsékleten. Az ecetsavat desztillációval eltávolítjuk, és a szilárd halmazállapotú desztillációs maradékot 4 ml 4%-os, vizes ammónium-hidroxidban oldjuk, az oldatot 3 x 2 ml etíl-étercel extraháljuk. A vizes fázist 1-2 ml térfogatúra töményítjük, és egy részét a kapott 12 vegyület tisztítására nagyfelbontású folyadékkromatográfiai frakcionáljuk. A nagyobb csúcsnak megfelelő frakciókat összegyűjtjük (2 O.D.^ egység), és 5 ml térfogatúra töményítjük. A végső 12 terméket sómentesítjük 1,5 x 100 cm méretű Bio-gel P-2 oszlopon, az eluálást 20%-os, vizes etanollal végezzük. A frakciókat szárazra desztilláljuk és 200 μΐ vízben szuszpendáljuk, a kapott oldat jellemzője: Ájm = 10. A 12 vegyület szekvenciáját kétdimenziós szekvenciaanalízissel bizonyítjuk.

A teljes thimozinal gént aló szintetikus oligonukleotídból állítjuk össze az irodalomban a szomatosztatin kapcsán részletesen leírt módszert használva [Itakura és munkatársai (1977)]; ezzel a módszerrel állították elő

-Ί13

HU 202 585 Β továbbá az inzulin [Goeddel és munkatársai (1979)], és a növekedési hormon [Goeddel és munkatársai, Natúré, 281,544 (1979)] génjét is. 10pg-nyi mennyiségű T₂-T₁₅ oligonuklcotidot kvantitatívan foszforilezünk (gammaP³²)-adenozin-trifoszfáttal [New England Nuclear] T₄ polinukleotid-kináz jelenlétében [Goeddel és munkatársai (1979)], amikor 1 Ci/mmól specifikus aktivitású terméket kapunk. A radioaktívan jelzett fragmenseket 20% poliakril-amidot/7 mól karbamidot tartalmazó gélen elcktroforézisscl fragmentáljuk, és az eluált fragmensek szekvenciáját kétdimenziós elektroforézis/részlegcsen emésztett kígyóméreg homokromatográfiával bizonyítjuk [Jay és munkatársai, Nucleic Acids, Rcs., 7, 331 (1974)].

AT! és T₁₆ fragmenseket nem foszforilezzük, ezzel minimálisra csökkentjük a következő ligációs reakció során bekövetkező, előnytelen polimerizációt. 2-2 pg oligonukleotidot négy fragmcnsből álló négy csoportba gyűjtjük össze (lásd a mellékelt 9. ábrát), az összekapcsolást T₄ dczoxi-ribonuklcinsav-ligázzal végezzük, ismert módon [Goeddel és munkatársai, 1979], A reakciótermékeket 7 mól karbamidot tartalmazó, 15%-os poliakril-amid gélen végzett elcktroforézisscl tisztítjuk [MaxamésGilbcrt,Proc,Nat. Acad. Sci.,USA, 77,3455 (1977)]. A 4 izolált terméket ligáljuk, cs a reakcióelegyet 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen végzett elektroforézisscl frakcionáljuk. A thimozinal génnek megfelelő, 90-105 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsavat elektroeluáljuk.

0,5 pg pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és EcoRl restrikciós endonukleázzal kezelünk, és a fragmenseket poliakril-amid gélen végzett elcktroforézissel elkülönítjük. A nagyobb fragmenst elcktroelucióval izoláljuk a gélről, és ezután a kapcsolt, szintetikus dezoxi-ribonuklcinsavhoz ligáljuk [Goeddel és munkatársai (1979)]. Ezzel az eleggyel E. coli K12 294 sejteket transzformálunk. A transzformációs elegy 5%át 20 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarra szélesztjük. A kapott 4 ampicillin rezisztens telep tetraciklinre érzékeny; ez azt jelentheti, hogy a beépülés a tetraciklin rezisztenciát meghatározó génbe történt. A 4 telepből izolált plazmidok analízise azt jelzi, hogy a pThal jellel jelzett mindegyik plazmid tartalmaz:

a) a pBR322 plazmidban magában található BglII helyet, ami azt jelenti, hogy a thimozinal gén jelen van, ahogy azt a 7. ábrán bemutatjuk; tartalmaz továbbá

b) 105 bázispárból álló BamHI/EcoRI hasítással kapott fragmenst

A pThal plazmid előállításának lépeseit a mellékelt 9. ábrán adjuk meg, ahol a vastag jelzés az 5’-foszfátcsoportokat jelzi.

3. A kezelt pThal és LE’ (d) fragmens reakciója

A pThal plazmid tartalmaz egy ampicillin rezisztenciát meghatározó gént, és a timozinal fehérjét meghatározó strukturgént az EcoRl helyen az 5’-kódoló szálvégen és a 3’-végen egy BamHI helyen. A timozin gén tartalmaz továbbá egy BglII helyet is. Az LE’ (d) fentiek szerint előállított fragmensét befogadni képes plazmid előállítására a pThal plazm időt EcoRl enzimmel kezeljük, majd dTTPés dATP jelenlétében Klenow polimeráz I enzimmel reagáltatjuk az EcoRl végek tompa végekké alakítására. A kapott termék BglII emésztését követően olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst kapunk, amely tartalmazza az ampicillin rezisztencia gént, és az ellenkező végen egy ragadós BglII helyet és egy tompa véget. A kapott termék LE’ (d) fragmenssel, amely BglII ragadós véget és egy tompa véget hordoz, recirkulálható T₄ ligáz katalitikus hatásával. Ekkor megkapjuk a pTrp24 plazmidot. A tompa végligáció helyén EcoRl hely jön létre.

E) A pSOM7A2A4 plazmid előállítása

A pTrp24 plazmidot BglII, majd EcoRl enzimmel hasítjuk, és ezt követően poliakril-amid gél-elektroforézist és elektro-eluciót végzünk. Ily módon olyan fragmenst kapunk, amely tartalmaz LE’ (d) polipeplidet meghatározó kodonokat, és BglII ragadós véget, és egy EcoRl ragadós véget a3’-kódoló vég szomszédságában. Az LE’ (d) fragmenst a pSOM7A2 plazmid BglII helyére klónozhatjuk, amikor a triptofán promoter-operátor rendszer szabályozása alatt álló, kifejeződő LE ’ pol ipeptid/szomatosztatin fúziós proteint kapunk. Úgy járunk cl, hogy

1. a pSOM7A2 plazmidot EcoRl enzimmel részlegesen emésztjük, amikor hasad a triptofán promoter/operátor rendszertől távolabb cső EcoRl hely, majd

2. a primer szekvenciát megfelelően megválasztva, elérjük, hogy a kodon leolvasási fázisa megfelelő maradjon, és hogy újra létrejöjjön az EcoRl hasítási hely. Részletesebben szólva, úgy járunk el, hogy 16 pg pSOM7A2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 0,5 egység EcoRl enzimmel hasítunk az alábbi, 200 pl térfogatú pufferban: 20 mM írisz, pH = 7,5, 5 mM magnéziumklorid, 0,02% NP40 detergens és 100 mM nátrium-klorid. A reakciót 15 percen át végezzük 37 ”C hőmérsékleten, majd fenollal, ezt követően klorofommal extraháljuk az elegyet, a terméket etanollal kicsapjuk, és ezután BglII enzimmel emésztjük. A kapott nagyobb fragmenst poliakril-amid gél-elcktroforézist követően elektroclucióval izoláljuk. A fragmens tartalmazza az LE’ polipeptid proximális végét meghatározó [LE’ (p)] kodonokat, azáz azokat, amelyek a BglII helytől balra esnek. A fragmenst ezután a fenti LE’ (d) fragmenssel ligáljuk T₄ dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, amikor megkapjuk a pSOM7A2A4 plazmidot. A plazmiddal E. coli 294 sejteket transzformálunk, a transzformánsok hatásosan termelik azt a fúziós proteint, amely áll a teljes LE polipeptidből és a szomatosztatinból. A kifejeződés a triptofán promoter/operátor rendszer szabályozása alatt áll.

F) A 3’-végen Pstl helyet, az 5'-végen BglII helyet hordozó, tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása

A pBR322 plazmidot Hindlll enzimmel hasítjuk, és a ragadós Hindlll végeket SÍ nukleázzal kezeljük. Az SÍ nuklcázos kezelést úgy végezzük, hogy 10 pg Hindlll enzimmel hasított pBR322 dezoxi-ribonuklcinsavat 30 pl alábbi összetételű pufferban, 300 egység SÍ nukleázzal hasítunk 30 percen át, 15 “C hőmérsékleten: 0,3 M nátrium-klorid, 1 mM cink-klorid, 25 mM nátrium-acélát, pH = 4,5. A reakció leállítására 1 pl 30X S1 nuklcáz reakciót leállító oldatot adagolunk. Ennek összetétele a következő: 0,8 M trisz-báz.is és 50 mM etilén-diamin-tetraccetsav. Az elegyet fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és a termeket EcoRl enzimmel emésztjük, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A kapott fragmenst poliakrilamid gél-clektroforézist követő elektro-elucióval izoláljuk. A termék EcoRl ragadós véggel és egy tompa vég-815

HU 202 585 Β gél rendelkezik, a kódoló szál timidin-nukleotiddal kezdődik A timidinnel kezdődő SÍ enzimmel emésztett Hindlll vég Klenow polimeráz I enzimmel kezelt BglII helyhez kapcsolható oly módon, hogy a BglII restrikciós hely ligáció után helyreáll.

Ügy járunk el, hogy a 2C) példában megadottak szerint előállított pSOM7A2 plazmidot BglII restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a kapott BglII ragadós végeket kétszálúvá egészítjük ki Klenow polimeráz I enzimmel, a 4 dezoxi-nukleotid-trifoszfát jelenlétében. A kapott terméket EcoRI enzimmel hasítjuk, majd a kis fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektro-elucióval izoláljuk. Ily módon olyan rövid dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, amely tartalmazza a triptofán promoter/operátor rendszert, és a BglII helytől balra eső proximális LE’ szekvenciát meghatározó kodonokat. A termék EcoRI véggel és a BglII hely feltöltése lévén egy tompa véggel rendelkezik. A BglII helyet ugyanakkor újra visszaállítjuk oly módon, hogy a tompa véget hozzákötjük a fentiek szerint SÍ enzimmel emésztett Hindlll fragmens tompa végéhez. A két fragmenst T4 dezoxi-ribonuklcinsav-ligázzal kapcsoljuk össze, amikor megkapjuk a rccirkularizált pHKYlO plazmidot, amit E. coli 294 kompetens sejtekbe transzformálva szaporítunk. A rekombináns pHK Y10 plazmidot hordozó telraciklin-rezisztcns sejteket szelektáljuk és izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonuklcinsavat. Ezt BglII és PsÜ enzimmel emésztjük, majd a nagyobb fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és clektro-elucióval izoláljuk. Ily módon megkapjuk a Pstl és BglII ragadós végekkel rendelkező, lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst A pHKY 10 plazmidból előállított dezoxi-ribonukleinsav-fragmens tartalmazza a replikációs origót, és így felhasználható a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid előállításakor, amelyben mind a trp LE’ polipeptid fúziós protein, mind pedig a tetraciklin rezisztenciát kódoló gének a trp promoter/operátor rendszer szabályozása alatt állnak.

G) Trp promoter/operátor rendszert tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előáll ítása

A 2E) példában megadottak szerint előállított pSOM7A2A4 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI restrikciós endonukleázzal részlegesen, majd Pstl enzimmel emésztjük. A kapott fragmens tartalmazza a trp promoter/operátort; ezt poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektro-elucióval izoláljuk. EcoRI enzimmel végzett részleges emésztést azért végzünk, hogy olyan fragmenshez jussunk amely a szomatosztatin gén 5’-végénck szomszédságában hasadt, de nem vágódott el az az EcoRI hely, amely az ampicillin rezisztenciát meghatározó gén és a trp promoter/operátor rendszer között helyezkedik el. A Pstl enzim által katalizált hasadás miatt elvesztett ampicillin rezisztencia visszaállítható oly módon, hogy a 2F) példában megadottak szerint előállított lineáris végső pHKYlO dezoxi-ribonukleinsavval Egálunk.

H) Az inzulin A láncát meghatározó strukturgén izolálása

Az inzulin A lánc strukturgénjét a pIAl plazmid EcoRI és BamHI emésztésével állítjuk elő. A plazmid előállítását Goeddel és munkatársai írják le [Proc. Nat.

Acad. Sci., USA, 76, 106 (1979)]. Az adott fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és az ezt követő elektro-elucióval tisztítjuk, a fragmens EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik.

I) Az inzulin A lánc struklurgénjének, a Trp promoter/operátor rendszer és a Pstl és BglII végekkel rendelkező pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmens ligálása

Az inzulin A lánc strukturgénjét, a 2G) példában megadottak szerint előállított, trp promoter/operátort tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst és a 2F) példában megadottak szerint kapott pHKY10 lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst az 1. ábrán megadott orientációban összekapcsoljuk, amiután megkapjuk a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmidot. A ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid könnyen szelektálható, mivel az ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gének ismét jelen vannak.

3. példa

A ρΙΒ7Α4Δ1 plazmid előállítása

A 2A) - I) példákban megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az inzulin A lánc génje helyett a végső ligáláskor az inzulin B láncot meghatározó strukturgént használjuk. Az inzulin B lánc strukturgénjét a pIB 1 plazmid EcoRI és BamHI emésztésével kapjuk. Ezt a plazmidot Goeddel és munkatársai írják le 1979-ben. Az inzulin B láncot kódoló dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézist követő elektro-elucióval tisztítjuk, a termék EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik. A 3. ábrán bemutatott ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid könnyen szelektálható, mivel ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gének jelen vannak.

4. példa

A ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid előállítása

A ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid előállítását a mellékelt 11. ábrán adjuk meg.

A) A pSOM7A4Al plazmid előállítása

A 21) példában megadottakat ismételjük meg. Úgy járunk el, hogy a 2G) példában megadottak szerint előállított, trp promoter/operátor rendszert tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst és a 2F) példában megadottak szerint előállított pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst ismert módon kapcsoljuk a pSOMll plazmid szomatosztatin gént tartalmazó EcoRI-BamHI restrikciós fragmenséhez. A pSOMll plazmidot Itakura és munkatársai szerint állítjuk elő [Science, 198, 1056 (1977)] és [2 007 676A sorszámú brit szabadalmi közlemény]. A ρδΟΜ7Δ4Δ1 plazmidot az ampicillin rezisztenciát meghatározó gén jelenléte miatt könnyen szelektálhatjuk.

B) A proinzulin 32 N-terminális aminosavát kódoló szintetikus gén előállítása

A proinzulin első 32 aminosavát kódoló gén előállításának első lépéseként 18, a II. táblázatban megadott oligonukleotidot állítjuk elő. Az egyes nukleotidokat A, T, C vagy G betűkkel jelöljük, ezek az adenint, timint, citozint vagy guanint jelentik. A 10. ábrán bemutatjuk az előállított gén teljes nukleotid-szckvenciáját.

-917

HU 202 585 Β

11. táblázat

A szomatosztatin szintetikus úton előállított oligonukleotidjai

Vegyület	Szekvencia
Hl	AATTCATGTT
H2	CGTCAATCAGCA
H3	CCTTTGTGGTTC
H4	TCACCTCGTTGA
H5	TTGACGAACATG
H6	CAAAGGTGCTGA
H7	AGGTGAGAACCA
H8	AGCTTCAACG
B1	AGCTTTGTAC
B2	CTTGTTTGCGGT
B3	GAACGTGGTTTC
B4	TTCTACACTCCT
B5’	AAGACTCGCC
B6	AACAAGGTACAA
B7	ACGTTCACCGCA
B8	GTAGAAGAAACC
B9	AGTCTTAGGAGT
B10’	GATCCGGCG

A 10. ábrán a szintetikus nuklcotidokat zárójelek között adjuk meg, és aláhúzzuk. A nukleotidokat az alábbi szerzők által kidolgozott triészter-módszcrrel állítjuk elő: Crea és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 75,5765 (1978)]; Itakura és munkatársai [J. Bioi. Chem., 250,4592 (1975)]; és Itakura és munkatársai [J. Am. Chem. Soc., 97,7327 (1975)]. Egyes oligonukleotidokat felhasználunk a Crea és munkatársai által leírt (1978), továbbá Goeddel és munkatársai (1979) által ismertetett humán inzulin B láncot meghatározó gén előállítására. Két oligonukleotid, a B5’ és BIO’ Hpall és terminális BamHI és EcoRl restrikciós helyeket tartalmaz. A terminális helyek különösen előnyösen használhatók klónozásra.

A humán inzulin B lánc baloldali felének génjét előzőleg Goeddel és munkatársai (1979) az előzőekben megadott nyolc oligonukleotidból (H1-H8) állították elő, ezek a B lánc 1-13 aminosavat meghatározó kodonokat tartalmazzák, tartalmazzák továbbá az N-terminális melionin-egységet. A B lánc génjének jobboldali felét a B_b B₂, B₃, B₄, Bj·, B₆, B₇, B₈, B, és B₁₀. oligonukleotidokból állítjuk elő T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kivitelezett ligációval Goeddel és munkatársai szerint eljárva (1979). A kapott gén-fragmens a humán inzulin B láncának 14-30. aminosavait határozza meg, és az összekötő lánc első argininjét. A gén-szekvenciába egy Hpall restrikciós helyet építünk be, hasonló leolvasási fázisban és elhelyezkedésben, mint ahogy a Hpall hely a humán inzulin génben helyezkedik el. A ligáit génfragmens tisztítását poliakril-amid gél-elektroforézissel végezzük, a legnagyobb dezoxi-ribonukleinsav-fragmensnek megfelelő csíkot eluáljuk. A fragmenstHindlII - BamHI-hasított pBR322 plazmidba építjük be. A kapott pB3 jellel jelzett plazmidot E. coli K12 294 (ATCC 31446) sejtekbe juttatjuk transzformációval. A plazmid ampicillin és tetraciklin antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát határoz meg, és tartalmazza az adott nukleotid-szekvenciát, amit Maxam és munkatársai szerint határoztunk meg [Proc, Natl. Adac, Sci., USA, 74560, (1977)].

Az 58 bázispárból álló pB3 Hindin - BamHI fragmenst és a pBHl plazmid 46 bázispárból álló EcoRl Hindin fragmensét összekapcsoljuk, amikor EcoRl és BamHI végekkel rendelkező fragmenst kapunk. A pBHl plazmidot Goeddel és munkatársai (1979) írták le. A kapott fragmenst a pBR322, EcoRl és BamHI enzimekkel emésztett plazmid-fragmensekhez kapcsoljuk Goeddel és munkatársai szerint (1979) eljárva. A kapott plazmidot pIB3 jellel jelöljük, amit E. coli K12 294 sejtekbe transzformálunk. Az ismert módon kivitelezett sokszorosítást és izolálást követően a pIB3 plazmidot EcoRl és Hpall restrikciós enzimekkel kezeljük, amikor megkapjuk all. ábra első fragmensét, azaz olyan szintetikus gén-fragmenst, amely a proinzulin N-terminális aminosavait határozza meg, amelyeket egy metionin előz meg. A szintetikus gént poliakril-amid gél-clektroforézissel ismert módon izoláljuk.

C) A humán proinzulin 50 C-terminális aminosavait meghatározó cDNS izolálása A mellékelt 12. ábrán adjuk meg az adott cDNS előállításának módszerét. Úgy járunk el, hogy egy BamHI enzim állal felismerhető szekvenciát és egy, körülbelül 20 csoportból álló 3’-politimidinsav részt tartalmazó, alábbi összetételű dekanukleotidot szintetizálunk: pCCGGATCCGGTTT,_gT. A szintetikus dekanukleotidot a cDNS szintézishez használt vírus reverz transzkriptáz printerjeként használjuk fel. A prímért terminális dczoxi-nukleotidil-transzferázzal (Enzo Biochem, 200 egység) állítjuk elő, 0,6 ml, 1,5 x 10^* μΜ TTP-t és 1 μΜ BamHI dekanukleotidot tartalmazó reakcióelegyben. A reakciót 1 órán át végezzük 37 ’C hőmérsékéleten, Chang és munkatársai által leírt [Natúré, 275, 617 (1978)] puffer-rendszerben.

A humán inzulinoma szöveteket az alábbi helyről szereztük be: Institute für Diabctcsforschung, München, Német Szövetségi Köztársaság. A témában jártas szakember megérti, hogy a humán inzulin szövet könnyen hozzáférhető és több forrásból megszerezhető. A humán inzulinoma szövet poli-A mRNS-ét (2,5 pg) Ullrich és munkatársai szerint [Science, 196,1313 (1977)] izoláljuk, és Wickens és munkatársai szerint [J. Bioi. Chem., 253, 2483 (1978)] kétszálú cDNS-sé alakítjuk át. Részletesebben szólva, úgy járunk el, hogy 80 pl, 15 mmól trisz-hidrogén-kloridot, (pH = 8,3, 42 ’C hőmérsékleten), 21 mM kálium-kloridot, 8 mM magnéziumkloridot, 30 mM β-merkapto-etanolt, 2 mM dCCGGATCCGGTT₁₈T-t, továbbá 1 mM dNTPs-t tartalmazó reakcióelegyet 0 ’C hőmérsékleten előinkubálunk. Vírus reverz transzkriptáz adagolását követően 15 percen át 42 ’C hőmérsékleten inkubálunk. A kapott RNS/DNS-t ismert módon denaturáljuk.

A komplementer cDNS szálat 150 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben szintetizáljuk: 25 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 8,3, 35 mM kálium-klorid, 4 mM magnézium-klorid, 15 mM β-merkapto-etanol és 1 mM dNTPs, továbbá 9 egység dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz I (Klenow-fragmens). A reakciót 15 ’C hőmérsékleten végezzük 90 percen át, majd 15 órán át 4 ’C hőmérsékleten. Ezután 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten S1 -nukleázos kezelést végzünk, a reakcióelegyhez 1000 egység Sl-nukleázt adagolunk [Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, USA], A reakciót Wickens és munkatársai szerint végezzük (1978). 0,37 pg kétszálú cDNS-t 8% poliakril-amid gélen elektroforézissel tisztítunk, és

-1019

HU 202 585 Β az 500 bázispámál nagyobb fragmenseket eluáljuk. A fragmensek 3’-végeihez oligo-dezoxi-citidilsavval kapcsolunk, terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázzal Maizei szerint eljárva [Meth, Virol., 5,180 (1971)]. A dC-végű cDNS fragmenseket olyan pBR322 plazmidhoz kapcsoljuk, amelyet először Pstl restrikciós enzimmel emésztettünk, és azután terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázzal dezoxi-guanidilsav véggel láttunk el. A kapott plazmidokat E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk. A tetraciklinre rezisztens, de ampicillinre érzékeny telepeket izoláljuk, és három Pstl restrikciós helyet tartalmazó plazmidokra szkrinelünk. Ez a restrikciós kép azt jelzi, hogy a proinzulin gén jelen van [Sures és munkatársai, Science, 208,57 (1980)].

A pHI 104 jellel jelzett egyik plazmid 600 bázispárból álló beépített szakaszt tartalmaz, és adja a Pstl restrikciós képet, továbbá a 3’-poli A és a poliCC, a cDNS előállítása során beépített részek között egy BamHI helyet tartalmaz. A 10. ábrán megadjuk a beépített szakasz nukleotid-szekvenciáját. Ez a szekvencia kicsit különbözik a Sures és munkatársai (1980) és Bell és munkatársai [Natúré, 282, 525 (1979)] által közölttől (egy adenin-titnint - aláhúztuk - GC pár helyettesít), mivel a felhasznált mRNS különböző szövetből volt izolálva.

D) Humán proinzulint meghatározó gén összeállítása

A humán proinzulint meghatározó gén előállítását a mellékelt 11. ábrán adjuk meg.

Apioinzulin első 31 aminosavát meghatározó szintetikus gén-szegmenst, a 11. ábra 1. fragmensét 50 gg pIB3 plazmidból nyerjük EcoRI és Hball restrikciós endonukleázokkal, ahogy azt az előzőekben megadtuk. Ez a fragmens a preproinzulin előszekvenciája helyett a metionin ATG kodonját is tartalmazza.

A 32-86. aminosavakat meghatározó cDNS génszegmenst, továbbá a transzlációs stop kodonokat és az mRNS 3’-nem transzlatált szakaszát 40 gg pHI104 plazmidból izoláljuk oly módon, hogy először BamHI és ezután Hpall restrikciós enzimmel kezeljük. A két fragmenst poliakril-amid gcl-elektroforézist követő elektio-elueióval izoláljuk. T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal összekapcsoljuk a gén-fragmenseket, a reakciót 20 gl ligáz-pufferban végezzük [Goeddel és munkatársai (1979)], 4 ’C hőmérsékleten, 24 órán át. A reakcióelegyet 50 gl vízzel hígítjuk, fenollal és kloroformmal extraháljuk mindegyiket, majd etanollal kicsapjuk.

A kapott dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel kezeljük, ezen helyek regenerálására és a gén-polimerek eltávolítására. Az összeállt proinzulin gént poliakril-amid gél-elektroforézissel izoláljuk és T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal összekapcsoljuk az EcoRI és BamHI enzimekkel hasított pBR322 plazmiddal. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk, és a kapott telepeket tetraciklin-érzékenység és ampicillin rezisztencia alapján szelektáljuk. Az egyik ilyen telepből izolált pHI3 plazmid tartalmazza az adott proinzulin gént, ezt ezután nukleotid-szekvencia-analízissel jellemezzük.

E) Humán proinzulint tartalmazó kimer prot ein kifejezésére képes plazmid előállítása

A pHI3 plazmidból EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel kihasítjuk a metionint meghatározó N-tcrminális kodonokat is tartalmazó teljes humán proinzulin gént. Az adott fragmenst gél-elektroforézissel tisztítjuk, és ezután T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal hozzákapcsoljuk a ρδΟΜ7Δ4Δ1 plazmid részleges Pstl - EcoRI emésztéssel kapott fragmenséhez és a 2F) példában megadottak szerint előállított pHKYlO plazmid nagyobb Pstl - Bgin fragmenséhez.

A pSOM7Á4Á 1 fragmenst úgy állítjuk elő, hogy részleges EcoRI emésztést, majd ezután teljes Pstl emésztést végzünk. A kapott firagmens tartalmazza a trp promoter/operátor rendszert, izolálását poliakril-amid gél-elektroforézist követő elektro-elucióval végezzük. A részleges EcoRI emésztésre azért van szükség, hogy olyan fragmenshez jussunk, amely a szomatosztatin gén 5’-végével szomszédos részen hasad, nem válik szét azonban az ampicillin-rezisztcncia gén és a trp promoter/operátor rendszer között fekvő EcoRI helyen. Az ampicillin rezisztencia génben bekövetkező Pstl hasadás miatt elveszik az ampicillin rezisztencia, ez azonban visszaállítható oly módon, hogy ligációt végzünk a 2F) példában megadottak szerint előállított végső pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsavval.

EcoRI és BamHI végekkel rendelkező, 1 pg teljes humán proinzulin gént, 4 pg Pstl - EcoRI (részleges) pSOM7A4Al fragmenst és 1 pg pHKYlO Pstl - BglII fragmenst összekapcsolunk 4 ’C hőmérsékleten, 24 órán ál tartó reakcióval, ligációs pufferban, T4 dezoxi-ribonuklcinsav-ligáz jelenlétében.

A ligációs dezoxi-ribonukleinsav eleggyel E. coli K12 294 sejteket transzformálunk Goeddel és munkatársai (1979) szerint eljárva. Az ampicillin és tefraciklin jelenlétében egyaránt növekvő telepeket szelektáljuk, ezek a nátrium-dodecil-szulfátos poliakril-amid gélelektroforézis [Maizei, 1971] szerint tartalmazzák a ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidot, és kifejeznek egy olyan proteint, amely megfelel a trp LE’-proinzulin fúziós termék molekulasúlyának. A fenti proteint kifejező ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidot dezoxi-ribonukleinsav-szekvenálással és a beépített gén, továbbá a vektor restrikciós térképezésével teljesen jellemezzük. A ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmidot a mellékelt 5. ábrán mutatjuk be, a plazmid az ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gének jelenléte révén könnyen szelektálható.

5. példa

A pDllO plazmid 2,6 kb nagyságú Pstl fragmensének izolálása

A pDllO plazmid 2,7 kb nagyságú Pstl fragmense Hhall specificitású restrikciós és modifikációs géneket tartalmaz. E. coli K12 294/pDI10 sejtekből 15 pg kovalensen zárt, kör alakú pDllO dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, majd teljesen emésztjük Pstl restrikciós enzimmel, 37 ’C hőmérsékleten kivitelezett reakcióban. A reakcióelegy 35 pl, az 1. példában megadottak szerint előállított pDI 10 oldatot, 15 pl 10xPstIpuffert(100mM magnézium-klorid, 500 mM ammónium-szulfát és 200mMtrisz-hidrogén-kIorid,pH=7,5), 15 pl, 1 mg/ml töménységű borjú szérum albumint, 77,5 pl vizet és 17,5 pl Pstl restrikciós enzimet (1 New England Biolabs egység/pl) tartalmaz. Ahasított dezoxi-ribonukleinsavat agaróz gél-eletkroforézissel frakcionáljuk olyan gélen, amely 0,8 agarózt tartalmaz az alábbi összetételű TBE-oldatban: 10,8 g trisz-bázis, 5,5 g bórsav és 0,09 g dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsav 1 1 vízben.

Az elektroforézist 1,5 órán át végezzük 220 V feszültsé11

-1121

HU 202 585 Β gén. A csíkokat 0,5 pg/ml etidium-bromid-oldat adagolásával tesszük láthatóvá, és ultraibolya fényben vizsgáljuk. A szükséges fragmenst kihasítjuk, és 1 órán át 150 V feszültségen TBE-oldatba elektro-eluáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat DEAE-cellulózon (Whatman DE52) kötjük, az oszlopot egyensúlyi pufferral egyensúlyozzuk ki. Ennek összetétele: 0,1 M kálium-klorid és 10 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8. Az oszlopot az egyensúlyi pufferral mossuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetételű eluciós pufferral eluáljuk: 1 M nátrium-klorid és 10 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8. Az eluátum nátrium-ion koncentrációját víz adagolásával 0,35 M-ra állítjuk be, ezután pedig két térfogat 100%-os etanol adagolásával és egy éjszakán át -20 ’C hőmérsékleten való hűtéssel kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. A kapott csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, szárítjuk és TE-oldatban oldjuk.

6. példa

A ρ!Α7ΔΑΔ1 plazmid PstIfragmensének izolálása

A 2. példában megadottak szerint előállított ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid 0,5 pg-ját 3 órán át 37 ’C hőmérsékleten PstI restrikciós enzimmel kezeljük, az 5. példában megadottak szerint. A hasított dezoxi-ribonukleinsavat egyszer fenollal és kétszer kloroform és izoamil-alkohol 24 : 1 arányú elegyével extraháljuk, ismert módon. Az oldatot 0,1 térfogat, 3 M nátrium-acelát-oldattal (pH = 8) keverjük, és kicsapjuk oly módon, hogy 2,2 térfogat etanolt adunk hozzá, és egy éjszakán át -20 ’C hőmérsékléeten tartjuk. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, szárítjuk és TE-oldatban oldjuk.

7. példa

A ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid PstI enzimmel emésztett fragmenseinek izolálása

0,5 pg, a 3. példában megadottak szerint előállított ρΙΒ7Δ4Δ 1 plazmidot 3 órán át 37 ’C hőmérsékleten PstI restrikciós enzimmel kezelünk, az 5. példában megadottak szerint eljárva. A hasított dezoxi-ribonukleinsavat fenollal, és ezután kétszer kloroform és izoamil-alkohol 24 : 1 arányú elegyével extraháljuk, ismert módon. Az oldatot 0,1, 8,0 pH-jú, 3 M nátrium-acetát-oldattal keverjük, és 2,2 térfogat 100%-os etanol adagolásával kicsapjuk. Egy éjszakán át -20 ’C hőmérsckéleten hűtjük a szuszpenziót. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, szárítjuk és TE-oldatban oldjuk.

8. példa

A pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI fragmensének kapcsolása a ρΙΑ7ΜΔ1 plazmid PstI fragmenséhez

0,2 gg PstI enzimmel emésztett pl Α7Δ4Δ1 plazmidot és 1,1 gg, a pDIlO plazmid PstI enzimmel kapott 2,7 kb nagyságú fragmenst 400 gl alábbi összetételű TE/10 oldalban keverünk: 1 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = =7,8,0,1 mM dinátrium-etilén-diamin-tctraecetsav. 0,1 térfogat 8,0 pH-jú, 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adagolunk, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 2,2 térfogat 100%-os etanol adagolásával kicsapjuk, és a szuszpenziót-20 ’C hőmérsékleten tartjuk egy éjszakán át. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és szántjuk. A ligációs reakciót 3,3 gl reakcióelegyben végezzük, ez az alábbi összetételű: 2 gl dezoxi-ribonukleinsav (vizes oldatban), 0,6 gl, 5 x kináz-ligáz-puffer (50 mM magnézium-klorid, 25 mM ditio-treitol, 250 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8, 25% glicerin), 0,6 gl, 0,66 mmólosadenozin-trifoszfát-oldatésO,l gl, 1 egység/gl töménységű T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-oldat. A reakcióelegyet egy éjszakán át inkubáljuk, 15 ’C hőmérsékleten.

9. példa

A pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI fragmensének ligálása aρΙΒ7Δ4Δ1 PstI enzimmel hasított plazmidhoz

A ligációt a 8. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid helyett a PstI enzimmel hasított ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmidot használjuk. A reakcióelegyet egy éjszakán át inkubáljuk, 15 ’C hőmérsékleten.

10. példa

Az E. coli K12 RV308/pPR26 és az E. coli K12 RV308!pPR27 előállítása és apPR26 éspPR27plazmidok izolálása

A 8. példában megadottak szerint előállított ligáit dezoxi-ribonukleinsav 0,1 gg-jál 50 gl SSC/10 oldatban hígítjuk. A dczoxi-ribonukleinsavval kompetens E. coli K12 RV308 sejteket transzformálunk, az 1. példában megadott transzformációs eljárást használva. Az E. coli K12 RV308/pPR26 és E. coli K12 RV308/pPR27 transzformánsokat 5 gg/ml tctraciklint tartalmazó L-agaron tenyésztve izoláljuk. Az izolátumok tetraciklin rezisztenciáját és ampicillin érzékenységét vizsgáljuk. A megfelelő telepeket használjuk fel a kovalensen zárt, kör alakú plazmid dezoxi-ribonukleinsav izolálására, amit Bazaral és Helinski (1968) módszerével végzünk. A plazmidok szerkezetét restrikciós endonukleázos analízissel bizonyítjuk. Két orientációjú plazmidot kapunk, mivel a 2,7 kb nagyságú PstI restrikciós fragmens két irányban épülhet be. A pPR26 és pPR27 plazmidokat és a megfelelő transzformánsokat megkapjuk a fenti eljárással.

11. példa

Az E. coli K12 RV308/pPR28 és az E. coli K12 RV308/pPR1228 előállítása és a pPR28, illetve a pPR1228 plazmidok izolálása

All. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 8. példában megadottak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav helyett a 9. példában megadottak szerint előállított terméket használjuk. Az E. coli K12 RV308/pPR28 és az E. coli K12 RV308/pPR1228 transzformánsokat izoláljuk és a bennük levő plazmidok szerkezetét restrikciós endonukleázzal kivitelezett térképezéssel bizonyítjuk. Két orientációjú plazmidot kapunk, mivel a plazmidban levő 2,7 kb nagyságú PstI restrikciós fragmens mindkét irányban beépülhet. így a fenti eljárás során megkapjuk mind a pPR28, mind pedig a pPR1228 plazmidokat és ezek transzformánsaiL

12. példa

Az E. coli K12 RV308ipPR29 előállítása és a pPR29 plazmid izolálása

A) A pPR27 plazmid 6(2 kb nagyságú Aval - Bglll fragmensének izolálása

A pPR27 plazmid a 331 sorszámú bázispárnál egyetlen Bglll restrikciós helyet és a 2334 sorszámú bázispárnál egyetlen Aval helyet tartalmaz. A 10. példában megadottak szerint előállítou pPR27 plazmid 8 pg-ját az alábbi összetételű reakcióelegyben 16 egység Aval rest-1223

HU 201 183 Β rikciós enzimmel (BRL, 2 egység/μΐ) teljesen emésztünk: 20 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 30 mM nátrium-klorid. A reakciót 37 ‘C hőmérsékleten végezzük. 20 μΐ, 10X BglII puffer adagolását követően a reakcióelegyet 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, 60 percen át, majd 5 percen át 65 ’C hőmérsékleten. A puffer összetétele a következő: 1M trisz-hidrogén-klorid, pH= = 8,0, 50 mM magnézium-klorid és 600 mM nátriumklorid. A reakcióelegy tartalmaz továbbá 25 μΐ vizet és 5 pl BglII restrikciós enzimet (New England Bioiabs, 1,6 egység/μΐ). A hasított dezoxi-ribonukleinsavat agaróz gél-elektroforézissel frakciónáljuk, és a 6,2 kb nagyságú fragmenst TE-oldatba elektro-eluáljuk, majd DEAE cellulóz oszlopon kromatografáljuk, az 5. példában megadottak szerint eljárva.

B) A ρΜ7ΜΔ12,3kb nagyásúg Aval - BglII fragmensének, izolálása

A ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid egyetlen BglII restrikciós helyet tartalmaz a 331. sorszámú bázispár mentén, és egyetlen Aval helyet a 2614. sorszámú bázispámál. A 4. példában megadottak szerint előállított ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid 15 pg-ját Aval és BglII restrikciós enzimekkel teljesen emésztjük, a 12A) példában megadottak szerint eljárva. A hasított dezoxi-ribonukleinsavat agaróz gélelektroforézissel frakciónáljuk, és a 6,2 kb nagyságú fragmenst TE-oldatba elektro-eluáljuk, majd ezután az

5. példában megadottak szerint eljárva DEAE cellulóz oszlopon kromatografálva tisztítjuk.

C) A pPR27 plazmid 62 kb nagyságú Aval - BglII fragmensének kapcsolása a ρΗΓ7ΔΑΔ1 plazmid 23 kb nagyságú Aval - BglII fragmenséhez

A 12A) példában megadottak szerint előállított pPR27 plazmid 6,2 kb nagyságú Aval - BglII fragmensének 2,3 pg-ját és a 12B) példában megadottak szerint előállított ρΗΙ7Δ4Δ1 plazmid 2,3 kb nagyságú Aval BglII fragmensének 0,85 pg-ját 570 pl TE-oldatban keverjük. A dezoxi-ribonukleinsavat a 8. példában megadottak szerint kicsapjuk. Az izolált dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetétel, 10,1 pl reakcióelegyben ligáljuk: 2 μΐ 5X kináz-ligáz-puffer, 2 pl, 0,66 mM adenozin-trifoszfát-oldat, 6 pl víz és 0,1 pl, 1 egység/pl koncentrációjú T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz. Az elegyet egy éjszakán át 9 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, majd ismert módon izoláljuk az előállítani kívánt dezoxi-ribonukleinsavat

D) Az E. coli KI 2 RV308lpPR29 előállítása és a pPR29 plazmid izolálása

A10. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a 8. példában megadott tennék helyett a 12C) példa szerint előállított, ligáit dezoxi-ribonukleinsavat használjuk. Az E. coli K12 RV308/pPR29 törzset izoláljuk, és a benne levő plazmid szerkezetét restrikciós endonukleázok által felismerhető helyek térképezésével bizonyítjuk.

Az előzőekben megadott eljárással a következő, III. táblázatban megadott reprezentatív transzformánsokat állíthatjuk elő.

///. táblázat

Jellemző transzformánsok

1. E. coli K12 294/pPR26

2. E. coli K12 294/pPR27

3. E. coli K12 294/pPR28

4. E. coli K12 294/pPR1228

5. E. coli K12 294/pPR29

6. E. coli K12/pPR27

7. E. coli K12 C600/pPR26

8. E. coli K12 C600/pPR27

9. E. coli K12 C600/pPR28

10. E. coli K12 C600/pPR1228

11. E. coli K12 C600/pPR29

12. E. coli/pPR27

13. E. coli K12 C600R_kM_k7pPR26

14. E. coli K12 C600R_kMJpPR27

15. E. coli K12 C600R_kM_k7pPR28

16. E. coli K12 C600R_kM_k7pPR1228

17. E. coli K12 C600R_kM_k7pPR29

18. E. coli K12/pPR28

19. E. coli K12 HB101/pPR26

20. E. coli K12 HB101/pPR27

21. E. coli K12 HB101/pPR28

22. E. coli K12 HB101/pPR1228

23. E. coli K12 HB101/pPR29

24. E. coli/pPR28

25. E. coli K12 BE827/pPR26

26. E. coli K12 BE827/pPR27

27. E. coli K12 BE827/pPR28

28. E. coli K12 BE827/pPR1228

29. E. coli K12 BE827/pPR29

30. E. coli K12/pPR29

31. E. coli/pPR29.

Claims (12)

1. Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló 2 szálú, DNS-t és ezen Hhall restrikciós endonukleáz helyet tartalmazó bakteriofág ellen, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdasejtet

1. a baktérium szempontjából Hhall restrikciós és metilező modifikációs aktivitást meghatározó gént tartalmazó pDHO plazmid ~2,7 kb PstI fragmenst magában foglalódezoxi-ribonukleinsav-szegmenst,

2. E. coli replikációs origót és

3. az E. coliban funkcionális polipeptidet meghatározó gént tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorral transzformálunk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorként egy plazmidot alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdasejtként E. coli K12 törzset alkalmazunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektort alkalmazunk, mely humán pre-proinzulint, humán proinzulint, humán inzulin A-láncot vagy humán inzulin B-láncot meghatározó gént tartalmaz.

5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pPR26, pPR27, pPR28, pPR29 vagy pPR1228 plazmidot alkalmazunk.

6. Eljárás E. coli baktérium védelmére felhasználható rekombináns klónozó vektor előállítására természetben előforduló, Hhall restrikciós helyet tartalmazó kétszálú dezoxi-ribonukleinsavval rendelkező bakteriofág ellen, azzal jellemezve, hogy

-1325

HU 202 585 Β

1. koordinativen és egymás után következően Hhall restrikciós aktivitást és metiiező kifejező géneket tartalmazó pDHO plazmid ~2,7 kb Pstl fragmenst magában foglaló dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst,

2. E. coli replikációs origót és

3. az E. coliban funkcionális polipeptidet kifejező gént összekapcsolunk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, a replikációs origót és a gént egy piazmidba kapcsoljuk össze.

8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektort alkalmazunk, mely humán pre-proinzulint, humán proinzulint, humán inzulin A-láncot, humán inzulin B-láncot meghatározó gént tartalmaz.

9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás a pPR26 vagy a pPR27 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pDHO plazmid 2,7 kb nagyságú Pstl restrikciós fragmensét ligáljuk a ρΙΑ7Δ4Δ1 plazmid Pstl fragmen5 séhez.

10. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás a pPr28 vagy a pPR1228 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pDHO plazmid 2,7 kb nagyságú PsŰ restikciós fragmensét ligáljuk a ρΙΒ7Δ4Δ1 plazmid Pstl fragmen10 séhez.

11. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás a pPR29 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy ligáljuk a pPR27 plazmid 2,6 kb nagyságú Aval - BglII fragmensét és a ρΗΙ7Δ4Δ 1 plazmid 2,3 kb nagyságú Aval - BglII

15 fragmensét