JPS5963197A - 牛成長ホルモン状ポリペプチドを高収率で製造するためのｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子および製造方法 - Google Patents
牛成長ホルモン状ポリペプチドを高収率で製造するためのｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子および製造方法Info
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- JPS5963197A JPS5963197A JP58148857A JP14885783A JPS5963197A JP S5963197 A JPS5963197 A JP S5963197A JP 58148857 A JP58148857 A JP 58148857A JP 14885783 A JP14885783 A JP 14885783A JP S5963197 A JPS5963197 A JP S5963197A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/168—Steroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、牛成長ホルモン状ポリペブヂドを高収率で製
造するための新規な１）ＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子およ
び製造方法に門するものである。さらに詳細（は、本発
明は、適当な宿主中で高収小にて発現される新規なりＮ
Ａ配列、およびこれら宿主で生産される新規な牛成長ホ
ルモン状ポリペプチドに関するものである。
造するための新規な１）ＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子およ
び製造方法に門するものである。さらに詳細（は、本発
明は、適当な宿主中で高収小にて発現される新規なりＮ
Ａ配列、およびこれら宿主で生産される新規な牛成長ホ
ルモン状ポリペプチドに関するものである。
本発明のＤＮＡ配列お上び組換ＤＮＡ分子は、牛成長ホ
ルモンの成長促進性の生物学的活性を示す新規なポリペ
プチドを暗号化する。以下の記載から明らかなように、
不発１叫のＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子および製造方法
は、牛における一般的な同化作用剤として有用な、特に
これら動物における成長速度、体重増加および肉生産を
増大させるためのポリペプチドの製造に使用することが
できる。
ルモンの成長促進性の生物学的活性を示す新規なポリペ
プチドを暗号化する。以下の記載から明らかなように、
不発１叫のＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子および製造方法
は、牛における一般的な同化作用剤として有用な、特に
これら動物における成長速度、体重増加および肉生産を
増大させるためのポリペプチドの製造に使用することが
できる。
中成長ポル七ン（１−ＢＧＨＪ ）は、脳下垂体前葉部
で合成され、かつそこから分／！Ｖ・されるポリペプチ
ドホルモンである。ＢＧＨは先駆体蛋白質（牛のプレ成
長ホルモン）として合成され、かつ分泌されて血流中へ
放用される際に中成長ホルモンまで放熱すると思われる
。さらに、天然の中成長ホルモンの蛋白質部分は多くの
アミン末端アミノ酸を欠如したポリペプチドを含むが、
それでも生物学的に活性であることが報告されている。
で合成され、かつそこから分／！Ｖ・されるポリペプチ
ドホルモンである。ＢＧＨは先駆体蛋白質（牛のプレ成
長ホルモン）として合成され、かつ分泌されて血流中へ
放用される際に中成長ホルモンまで放熱すると思われる
。さらに、天然の中成長ホルモンの蛋白質部分は多くの
アミン末端アミノ酸を欠如したポリペプチドを含むが、
それでも生物学的に活性であることが報告されている。
中成長ホルモンのヌクレオチド晰−３化配列およびアミ
ノ酸配列は、ダブリュー・エル・ミラー等、ジャーナル
・バイオロジカル・ケミストリー、第、２２を巻、第７
５−／〜ｄ弘頁（／り♂Ｏ）；エム・ティー・デイホツ
フ等、１蛋白質配列および構造の一地図」、ディホップ
編、第ｊ巻、補充第３号、第３グｊ−、−≠、２頁（７
７７ｇ）；エムφヮリス、ＦＥＢＳレター、第３ｊ巻、
第１／〜／４を頁（／り７３）に報告されている。これ
は／り７個のアミノ酸よりなるポリペプチドであり、２
１７個のアミノ酸よジなる牛のプレ成長ホルモンとして
最初に合成されると思われる。
ノ酸配列は、ダブリュー・エル・ミラー等、ジャーナル
・バイオロジカル・ケミストリー、第、２２を巻、第７
５−／〜ｄ弘頁（／り♂Ｏ）；エム・ティー・デイホツ
フ等、１蛋白質配列および構造の一地図」、ディホップ
編、第ｊ巻、補充第３号、第３グｊ−、−≠、２頁（７
７７ｇ）；エムφヮリス、ＦＥＢＳレター、第３ｊ巻、
第１／〜／４を頁（／り７３）に報告されている。これ
は／り７個のアミノ酸よりなるポリペプチドであり、２
１７個のアミノ酸よジなる牛のプレ成長ホルモンとして
最初に合成されると思われる。
、２４個のアミノ酸の信号配列は１合成および分泌の際
にＮ−末端位置から除去される〔ブイ・アール・リンガ
ツバ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ １．Ａｃａｄ。
にＮ−末端位置から除去される〔ブイ・アール・リンガ
ツバ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ １．Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、第２弘巻、第２４１３２，４４頁（ｌ
り７７）〕。
り７７）〕。
成長ホルモンは生命サイクルの全期間にわたって生成さ
れるが、成長前の期間において一層多量に生成されるこ
とが明らかである。これらホルモンは骨賂成長、輩素保
持、蛋白質合成を増進させかつグルコースおよび脂質代
謝に影響を与えることが知られている。したがって、成
長ホルモンは、一般的な同化作用剤として認識されてい
る。
れるが、成長前の期間において一層多量に生成されるこ
とが明らかである。これらホルモンは骨賂成長、輩素保
持、蛋白質合成を増進させかつグルコースおよび脂質代
謝に影響を与えることが知られている。したがって、成
長ホルモンは、一般的な同化作用剤として認識されてい
る。
成長ホルモンは、成る程度、種特異性である。
しかしながら、成る種からの成長ホルモンは、他の種に
おいてその生物学的活性が著しく低い。
おいてその生物学的活性が著しく低い。
成長ホルモンの活性に関するメカニズムはまだよく理解
されていないが、成長ホルモンの投与は動物に２＝−け
る成長速度、体重増加および肉生産を著しく増加きせる
ことが示されている。たとえば、成る試験において、精
製豚生長ホルモンを毎日注射した豚における体重増加の
平均速度は、７日当シ！、λ呂ボンドであった（対照豚
におけるコ、／タボンド／日の平均体重増加に比較）。
されていないが、成長ホルモンの投与は動物に２＝−け
る成長速度、体重増加および肉生産を著しく増加きせる
ことが示されている。たとえば、成る試験において、精
製豚生長ホルモンを毎日注射した豚における体重増加の
平均速度は、７日当シ！、λ呂ボンドであった（対照豚
におけるコ、／タボンド／日の平均体重増加に比較）。
よシ重要なことに、処理された豚は、対照豚よシも／日
当シ著しく少ない飼料を消費した（ざ、弘θボンドに比
較して７．０３ボンド）。
当シ著しく少ない飼料を消費した（ざ、弘θボンドに比
較して７．０３ボンド）。
さらに、処理された豚は死体品質において著しい改善を
示した。すなわち、成長ホルモンで処理した豚の死体は
平均して長さ３θ、！フインチでありかつ７．４１０イ
ンチの脂肪厚さを示したのに対し、対照群の死体は平均
して長さλり、３３インチでありかつ脂肪厚さ１．７フ
インチを有した。可食肉の化学組成も、成長ホルモン処
理した動物にお−いて著しく改善された。すなわち、／
３，１０％蛋白質、≠り、ｌ弘チ水分かつ３乙、７乙チ
脂肪であり、これは対照群の／ ０．１％蛋白質、３り
、４ｔ ｊ ｇ６水分かつ４ｔり、２７％脂肪と対照的
である〔イー・リュー・トルーマン、「脳下垂体前葉成
長ホルモンの豚に対する効果」、論文；プルジュー大学
（／りｊ３年Ｖ月）〕。
示した。すなわち、成長ホルモンで処理した豚の死体は
平均して長さ３θ、！フインチでありかつ７．４１０イ
ンチの脂肪厚さを示したのに対し、対照群の死体は平均
して長さλり、３３インチでありかつ脂肪厚さ１．７フ
インチを有した。可食肉の化学組成も、成長ホルモン処
理した動物にお−いて著しく改善された。すなわち、／
３，１０％蛋白質、≠り、ｌ弘チ水分かつ３乙、７乙チ
脂肪であり、これは対照群の／ ０．１％蛋白質、３り
、４ｔ ｊ ｇ６水分かつ４ｔり、２７％脂肪と対照的
である〔イー・リュー・トルーマン、「脳下垂体前葉成
長ホルモンの豚に対する効果」、論文；プルジュー大学
（／りｊ３年Ｖ月）〕。
残念ながら、成長ホルモンを使用した動物における上記
の改善された成長および向上した肉生産は、充分なりＧ
Ｍが入手しえないため、牛においては広く実現化するこ
とができない。今日、ＢＧＨは牛の脳下垂体腺から抽出
され、或いは適当な宿主における組換ＤＮＡ技術により
製造される（たとえば、ダブリュー彎エル・ミラー等、
ジャーナル・バイオロジカルｅケミストリー、第コｊＪ
′巻、第７３．２／−，２４を頁（／りざの。
の改善された成長および向上した肉生産は、充分なりＧ
Ｍが入手しえないため、牛においては広く実現化するこ
とができない。今日、ＢＧＨは牛の脳下垂体腺から抽出
され、或いは適当な宿主における組換ＤＮＡ技術により
製造される（たとえば、ダブリュー彎エル・ミラー等、
ジャーナル・バイオロジカルｅケミストリー、第コｊＪ
′巻、第７３．２／−，２４を頁（／りざの。
ヨーロッパ特許出願力１ｌ−７ＡＯＯ号および英国特許
出願第、２０７３λグ！Ａ号〕。要するに、前者の供給
源は、必要とされるＢＧＨの産業的使用量を供給するに
は不充分である。また、後者の供給源も不充分である。
出願第、２０７３λグ！Ａ号〕。要するに、前者の供給
源は、必要とされるＢＧＨの産業的使用量を供給するに
は不充分である。また、後者の供給源も不充分である。
伺故なら、各種の宿主におけるＢＧＭ（７）発現収率が
極めて低（、ＢＧＭの経済的にイ１用７上或いは産県的
な使用集（を供給しえないからである。
極めて低（、ＢＧＭの経済的にイ１用７上或いは産県的
な使用集（を供給しえないからである。
本発明は、新規なり Ｇ ｎ状ポリペプチドを暗号化す
るＤＮＡ配列を供給し、かつこれら配列を適当な宿主に
おいて高収率で発現させてＢ Ｇ Ｈの成長促進性の生
物学的活性を示すポリペプチドを多量に効率的かつ経済
的に生産させることによシ上バピの問題を解決する３、
シたがつ゛Ｃ５本発明によれば、ＢＧＨの活性を示すポ
リペプチドを、牛の成長速度および肉生産を増太さぜる
各種の用途に使用するため多１辻にｑ＋＋ることか初め
て可能になる。
るＤＮＡ配列を供給し、かつこれら配列を適当な宿主に
おいて高収率で発現させてＢ Ｇ Ｈの成長促進性の生
物学的活性を示すポリペプチドを多量に効率的かつ経済
的に生産させることによシ上バピの問題を解決する３、
シたがつ゛Ｃ５本発明によれば、ＢＧＨの活性を示すポ
リペプチドを、牛の成長速度および肉生産を増太さぜる
各種の用途に使用するため多１辻にｑ＋＋ることか初め
て可能になる。
以下の記載から判るように、本発明の所用、なりＮＡＡ
配列よび組換ＤＮＡ分子は、適当な宿主において牛成侵
ホルモン状ポリペグチド、すなわちＢ Ｇ ）ｆの成長
促進性の生物学的活性勿示す新規なポリペプチドを多量
に生産さぜることに向けることができる、。
配列よび組換ＤＮＡ分子は、適当な宿主において牛成侵
ホルモン状ポリペグチド、すなわちＢ Ｇ ）ｆの成長
促進性の生物学的活性勿示す新規なポリペプチドを多量
に生産さぜることに向けることができる、。
本発明の新規なポリペプチドは、宿主中で生産されたま
までも或いは向導化させもしくは改善させた後にも牛の
成長速晟および肉生産を改善する組成物および方法Ｖこ
有用である。
までも或いは向導化させもしくは改善させた後にも牛の
成長速晟および肉生産を改善する組成物および方法Ｖこ
有用である。
したがって、上記から判るように、本発明の基礎的局面
はＢＧＭの成長促進性の生物学的活性を示すポリペプチ
ドを暗月化するＤＮＡ配列の製造であシ、このＩＪＮＡ
配列は成熟牛成長ホルモンを暗号化するＤＮＡ配列から
アミノ禾Ｓ／、”ｉ４基を削除したことを特徴とし、さ
らにゴＮ轟な宿主および発現ベクターにおいて、このＭ
の発現に従来使用された成熟牛成長ホルモンを暗号化す
るＤ Ｎ Ａ配列よりも少なくとも約ｉｏｏ倍高い収率
、好ましくは少なくとも約１０００倍商い収率で前記Ｂ
Ｇ Ｈ状の生成’４ｉ７Ｉを生産することができる。
はＢＧＭの成長促進性の生物学的活性を示すポリペプチ
ドを暗月化するＤＮＡ配列の製造であシ、このＩＪＮＡ
配列は成熟牛成長ホルモンを暗号化するＤＮＡ配列から
アミノ禾Ｓ／、”ｉ４基を削除したことを特徴とし、さ
らにゴＮ轟な宿主および発現ベクターにおいて、このＭ
の発現に従来使用された成熟牛成長ホルモンを暗号化す
るＤ Ｎ Ａ配列よりも少なくとも約ｉｏｏ倍高い収率
、好ましくは少なくとも約１０００倍商い収率で前記Ｂ
Ｇ Ｈ状の生成’４ｉ７Ｉを生産することができる。
このａＬのＩＪＮＡ配列は、たとえは、ｐＢ０４（−Δ
ｐ、、ｐＢＧ）Ｉ−Δ９ 、 ｐ Ｂ Ｇ１１−２ｇ（
ＳａｒバｐＢＧＨ−Δり（Ｓｅｒ） のＤ Ｎ Ａ
挿入物、ならびに成熟中成長ポルモンを亀も化するＬ）
ＮＡ配ダ１ｊからアミン末端基が削除されたその他Ｄ
Ｎ Ａ 挿入物よりなる群から選択されたＤＮＡ挿入物
からなシ＊ ｎｉＪ記押入物は成熟牛成長ホルモンを暗
号化するＤＮＡ配列よりも少なくともｉｏｏ倍高い収率
で牛成長ホルモン状ポリペプチドの生産を可能にする。
ｐ、、ｐＢＧ）Ｉ−Δ９ 、 ｐ Ｂ Ｇ１１−２ｇ（
ＳａｒバｐＢＧＨ−Δり（Ｓｅｒ） のＤ Ｎ Ａ
挿入物、ならびに成熟中成長ポルモンを亀も化するＬ）
ＮＡ配ダ１ｊからアミン末端基が削除されたその他Ｄ
Ｎ Ａ 挿入物よりなる群から選択されたＤＮＡ挿入物
からなシ＊ ｎｉＪ記押入物は成熟牛成長ホルモンを暗
号化するＤＮＡ配列よりも少なくともｉｏｏ倍高い収率
で牛成長ホルモン状ポリペプチドの生産を可能にする。
ここに記載する本発明をよシ一層充分に理解するため以
下さらに説明する。
下さらに説明する。
本明細書において次の用語を使用する：ヌクレオチド：
糖成分（ペントース）と燐酸塩と蟹累含有複素環式塩
基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡのモノマ一単位。こ
の塩基はグリコシド炭素（ペントースの／′炭素）を介
して糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌクレ
オシドと呼ぶ。各ヌクレオシドはその塩基を特徴とする
。４ｔａのＤＮＡ地基はアデュ。
糖成分（ペントース）と燐酸塩と蟹累含有複素環式塩
基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡのモノマ一単位。こ
の塩基はグリコシド炭素（ペントースの／′炭素）を介
して糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌクレ
オシドと呼ぶ。各ヌクレオシドはその塩基を特徴とする
。４ｔａのＤＮＡ地基はアデュ。
（［−１）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（ｒＣＪ
）およびチミン（ＩＴＪ ）である。グ種のＲＮＡ塩基
はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵｊ ）である。
）およびチミン（ＩＴＪ ）である。グ種のＲＮＡ塩基
はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵｊ ）である。
ＤＮＡ配列： 隣接するペントースの３′およびｊ′炭
素間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチドの線状列。
素間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチドの線状列。
コドン： ｍＲＮＡを介してアミノ酸翻訳開始信号ま
たは翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレオチド（ト
リプレット）のＤＮＡ配夕１几たとえは、ヌクレオチド
トリルレットＴＴＡ。
たは翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレオチド（ト
リプレット）のＤＮＡ配夕１几たとえは、ヌクレオチド
トリルレットＴＴＡ。
Ｔ’ｒＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧはアミ
ノ酸ロイシフ （［Ｌｅｕ Ｊ ）を暗号化し、ＴＡＧ
。
ノ酸ロイシフ （［Ｌｅｕ Ｊ ）を暗号化し、ＴＡＧ
。
ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、かつＡＴＯ
は翻訳開始信号である。
は翻訳開始信号である。
読 枠： ｍＲＮＡをアミノ酸配列まで翻訳する際の
コドンの群。翻訳の際、適切な読枠を維持しなければな
らない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは３
つの読枠もしくは相に翻訳することができ、そのそれぞ
れは次の異なるアミノ酸配列を与える： ＯＣＴ ＧＧ’ｒ ＴＧＴ ＡＡＧ、＝ＡＩａ−Ｇｌｙ
−ｅｙｓ−ＬｙｓＧ ＣＴＧ ＧＴＴ Ｇ’ｒＡ ＡＧ
＝−Ｌ、ｅｕ−Ｖａｌ −Ｖ’ａｌＧＣＴＧＧ Ｔ
ＴＧ ＴＡＡ Ｇ ・−−１’ｒｐ−Ｌｅｕ
−（イ’ｘ写１：）ポリペプチド：ｒｓ接するアミノ酸
のα−アミン基とカルボキシル基との間のペプチド結合
によシ互いに結合され／こアミノ酸の腺状列。
コドンの群。翻訳の際、適切な読枠を維持しなければな
らない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは３
つの読枠もしくは相に翻訳することができ、そのそれぞ
れは次の異なるアミノ酸配列を与える： ＯＣＴ ＧＧ’ｒ ＴＧＴ ＡＡＧ、＝ＡＩａ−Ｇｌｙ
−ｅｙｓ−ＬｙｓＧ ＣＴＧ ＧＴＴ Ｇ’ｒＡ ＡＧ
＝−Ｌ、ｅｕ−Ｖａｌ −Ｖ’ａｌＧＣＴＧＧ Ｔ
ＴＧ ＴＡＡ Ｇ ・−−１’ｒｐ−Ｌｅｕ
−（イ’ｘ写１：）ポリペプチド：ｒｓ接するアミノ酸
のα−アミン基とカルボキシル基との間のペプチド結合
によシ互いに結合され／こアミノ酸の腺状列。
ゲノム： 細胞もしくはウィルスの全ＤＮＡ０これは特
に生物のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにた
とえはシャイ／−ダルガルノ配列のような配列を包含す
るオペレータ、プロモータ２よびリボンーム結合性およ
び相互反応性の配列を包含する。
に生物のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにた
とえはシャイ／−ダルガルノ配列のような配列を包含す
るオペレータ、プロモータ２よびリボンーム結合性およ
び相互反応性の配列を包含する。
遺伝子： 雛型もしくはメツセンジャーＲＮＡ（しｎＲ
ＮＡＪ ） を介して％異的ポリペプチドに特性的な
アミノ酸の配列を暗号化するＤＮＡ配列。
ＮＡＪ ） を介して％異的ポリペプチドに特性的な
アミノ酸の配列を暗号化するＤＮＡ配列。
転 写： ｍＲＮＡを遺伝子から生成する過程。
翻 訳： ポリペプチドをｍＲＮＡから生成する過程。
発 現： ポリペプチドを生成させるようＤＮＡ配列ま
たは遺伝子により受ける過程。これは、転写と翻訳との
組合せである。
たは遺伝子により受ける過程。これは、転写と翻訳との
組合せである。
グラスミド： ７ラスミドが宿主細胞において複製され
るような完全「レプリコン」からなる非架色体二恵鎖Ｄ
ＮＡ配列。プラスミドを単細胞生物に入れると、この生
物のｔｒｊ性はグラスミドのＤＮＡの結果として変化さ
れ、或いは形質転換される。たとえば、テトラサイクリ
ン削性（ＴｅｔＲ）に対する遺伝子を有するグラスミド
はデトラサイクリ／に対し予め感受性であった細胞を、
ナト２サイクリンに対し耐性の細胞へ形質転換さぜる。
るような完全「レプリコン」からなる非架色体二恵鎖Ｄ
ＮＡ配列。プラスミドを単細胞生物に入れると、この生
物のｔｒｊ性はグラスミドのＤＮＡの結果として変化さ
れ、或いは形質転換される。たとえば、テトラサイクリ
ン削性（ＴｅｔＲ）に対する遺伝子を有するグラスミド
はデトラサイクリ／に対し予め感受性であった細胞を、
ナト２サイクリンに対し耐性の細胞へ形質転換さぜる。
プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転換体」
と呼ぶ。
と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ：その多くが蛋白質
エンペロブもしくは被往蛋白質中にカプセル化されたＤ
ＮＡ配列（「カプシド」）、ｌｔ）なる細菌性ウィルス
。
エンペロブもしくは被往蛋白質中にカプセル化されたＤ
ＮＡ配列（「カプシド」）、ｌｔ）なる細菌性ウィルス
。
クローン化ベヒクル：ＤＮＡ配列を、たとえば複製、被
覆蛋白質の生成のようなり ＮＡの本質的な生物学的機
能の喪失、或いはプロモータもしくは結合部位の喪矢を
伴わずに決定ＯＩ能に切断しうる７個もしくは少数のエ
ンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とする宿主において複
製しうるグラスミド、ンアージＤＮＡ″！、たけその他
のＤＮＡ配列であって、これは形質転侯憾れた細胞の同
定に使用するのに適した標識、たとえばテトラサイクリ
ン耐性またはアンピシリン剛性を含む。クローン化ベヒ
クルをしばしはベクターと呼ぶ。
覆蛋白質の生成のようなり ＮＡの本質的な生物学的機
能の喪失、或いはプロモータもしくは結合部位の喪矢を
伴わずに決定ＯＩ能に切断しうる７個もしくは少数のエ
ンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とする宿主において複
製しうるグラスミド、ンアージＤＮＡ″！、たけその他
のＤＮＡ配列であって、これは形質転侯憾れた細胞の同
定に使用するのに適した標識、たとえばテトラサイクリ
ン耐性またはアンピシリン剛性を含む。クローン化ベヒ
クルをしばしはベクターと呼ぶ。
クローン化： 無性繁殖によシ生物の集落まスｉ：はこ
れら生物の７種もしくは配列から生ずるＤＮＡ配列を得
る過程。
れら生物の７種もしくは配列から生ずるＤＮＡ配列を得
る過程。
組換ＤＮＡ分子またはヒフリドＤＮＡ：生細胞の外部で
端部結合され、かつ成る種の宿主細胞に感染する能力ｔ
−ｉすると共にそこに維持される異なるゲノムからのＤ
ＮＡ断片よりなる分子。
端部結合され、かつ成る種の宿主細胞に感染する能力ｔ
−ｉすると共にそこに維持される異なるゲノムからのＤ
ＮＡ断片よりなる分子。
発現制御配列二 作用結合された際、ＤＮＡ配列または
遺伝子の発現を制御かつ調整するヌクレオチドの配列。
遺伝子の発現を制御かつ調整するヌクレオチドの配列。
これらは摩糸、υ上糸、７アージヌの主要オペレータお
よびプロモータ領域、ｆｄ被後後蛋白質制御鎖酸、なら
びに原始核もしくは成熟核細胞およびそのウィルスの遺
伝子の発現を制御することが知られたその他の配列また
はその組合せを包含する。
よびプロモータ領域、ｆｄ被後後蛋白質制御鎖酸、なら
びに原始核もしくは成熟核細胞およびそのウィルスの遺
伝子の発現を制御することが知られたその他の配列また
はその組合せを包含する。
ＢＧＭ： 牛成長ホルモン。
Ｂ Ｇ １１状ポリベグチド：ＢＧｎの成長促進性の生
物学的活性を示すポリペプチド。
物学的活性を示すポリペプチド。
第７図は、牛成長ホルモンを暗号化するＤＮＡ配列を有
することを特徴とする組換ＤＮＡ分子の製造方法におけ
る１例の略図を示している。
することを特徴とする組換ＤＮＡ分子の製造方法におけ
る１例の略図を示している。
組織を塩化グアニジンで抽出しかっこの抽出物をオリゴ
ｄＴ−カラムでクロマトグラフにかけることにより、牛
の脳下垂体腺がら牛成長ホルモンを暗号化するＲＮＡを
単離した〔エッチ・グツトマンおよびアール・マクドナ
ルド、メソッド・イン・エッチモロジー・レコンピナン
トＤＮＡ、アール・ウー編、第４１巻、第７ｊ〜♂り貝
（／り７り）；エッチ−アビプおよびピー・レダー、Ｐ
ｒｏｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｕｓＡ、
ＪＴ、６り巻、ｆ、／４１０１〜／Ｊ負（／Ｐ７２）Ｊ
、次いで、得られたホＩＪＡ＋ＲＮＡを等速面糖＃度勾
配（１０−，２０係）で寸法分ｉｉ！ｉｉ した〔ブエ
ル等。
ｄＴ−カラムでクロマトグラフにかけることにより、牛
の脳下垂体腺がら牛成長ホルモンを暗号化するＲＮＡを
単離した〔エッチ・グツトマンおよびアール・マクドナ
ルド、メソッド・イン・エッチモロジー・レコンピナン
トＤＮＡ、アール・ウー編、第４１巻、第７ｊ〜♂り貝
（／り７り）；エッチ−アビプおよびピー・レダー、Ｐ
ｒｏｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｕｓＡ、
ＪＴ、６り巻、ｆ、／４１０１〜／Ｊ負（／Ｐ７２）Ｊ
、次いで、得られたホＩＪＡ＋ＲＮＡを等速面糖＃度勾
配（１０−，２０係）で寸法分ｉｉ！ｉｉ した〔ブエ
ル等。
ジャーナル・バイオロジカル・り“ミスドリー、第、２
３３巻、第２グア／〜ｇ、２頁（／り７ｇ）；ライケン
ス等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
２！３巻、第、２グざ３〜りｊ負（／り７ｇン〕。
３３巻、第２グア／〜ｇ、２頁（／り７ｇ）；ライケン
ス等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
２！３巻、第、２グざ３〜りｊ負（／り７ｇン〕。
牛成長ホルモンを暗号化するメツセージを含む寸法分画
されたボＩＪＡＲＮＡを逆転写用の雛型として使用し〔
うさぎ網様細胞を含まない翻訳系分析（エッチ・ペルハ
ムおよびアール・ジャクソン、ヨーロピアン・ジャーナ
ルｅバイオケミストリー、第６７巻、第２弘７号（／Ｐ
７Ｑ）によシ決定〕、それによシ単−鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａ
を調製して、とのｃＤＮＡをプエル（上記）およびライ
ケンス（上記）に実質的に記載されたように二重鎖にし
た。
されたボＩＪＡＲＮＡを逆転写用の雛型として使用し〔
うさぎ網様細胞を含まない翻訳系分析（エッチ・ペルハ
ムおよびアール・ジャクソン、ヨーロピアン・ジャーナ
ルｅバイオケミストリー、第６７巻、第２弘７号（／Ｐ
７Ｑ）によシ決定〕、それによシ単−鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａ
を調製して、とのｃＤＮＡをプエル（上記）およびライ
ケンス（上記）に実質的に記載されたように二重鎖にし
た。
この二重鎖ａ Ｄ Ｎ ＡをＳ／ヌクレアーゼで処理し
てヘアピン構造を開いた後、末端トランスフエラー−＠
によ５ ｄｃ末端をｃ Ｄ Ｎ Ａに付加さぜた〔アー
ル・ロイコウドバリー等、ヌクレイツク・アシッド・リ
サーチ％Ｍ３巻、第１０／〜／乙頁（／り７６）〕。次
いで、ｄＣ処理されたｃ ＤＮＡ ｆ Ｐす１で線状化
されかつｄＧ処理されたＰＢＲ３，２２へ挿入し、再現
化された組換ＤＮＡ分子によシイ−・コリに／２ ＨＢ
１０／を形質転換させた〔キュツバ−等、ネイチャー誌
、第、２♂／巻、＠！！ｊＳ−Ｊ夕頁（／り♂／）；プ
エル等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第２ｊ≠巻、第タコ７７〜１３頁（／り７り）〕。
てヘアピン構造を開いた後、末端トランスフエラー−＠
によ５ ｄｃ末端をｃ Ｄ Ｎ Ａに付加さぜた〔アー
ル・ロイコウドバリー等、ヌクレイツク・アシッド・リ
サーチ％Ｍ３巻、第１０／〜／乙頁（／り７６）〕。次
いで、ｄＣ処理されたｃ ＤＮＡ ｆ Ｐす１で線状化
されかつｄＧ処理されたＰＢＲ３，２２へ挿入し、再現
化された組換ＤＮＡ分子によシイ−・コリに／２ ＨＢ
１０／を形質転換させた〔キュツバ−等、ネイチャー誌
、第、２♂／巻、＠！！ｊＳ−Ｊ夕頁（／り♂／）；プ
エル等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第２ｊ≠巻、第タコ７７〜１３頁（／り７り）〕。
ＢＧＨ関連のＤＮＡ挿入物を有するようなりローンを選
択するため、制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＮ／を用い
かつ標準的な制限条件および緩衝剤を使用してクローン
の保存物を選別した［ ／ 、ｔ １ｉｆｔ／’ｍｌテ
トラサイクリンを含有する培地で増殖］。ＢＧＭにつき
報告されたＤＮＡ配列は独特なりｓｔＮ／部位を翁する
ので、この選別方法は長いＢＧＨＩＩ連配列を含有する
２＠のクローンをこれら配列を含まない他の多くの保存
クローンから選別することを可能にした。
択するため、制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＮ／を用い
かつ標準的な制限条件および緩衝剤を使用してクローン
の保存物を選別した［ ／ 、ｔ １ｉｆｔ／’ｍｌテ
トラサイクリンを含有する培地で増殖］。ＢＧＭにつき
報告されたＤＮＡ配列は独特なりｓｔＮ／部位を翁する
ので、この選別方法は長いＢＧＨＩＩ連配列を含有する
２＠のクローンをこれら配列を含まない他の多くの保存
クローンから選別することを可能にした。
選別された。２種のクローンの組換ＤＮＡ分子を、ＢＧ
Ｈ１０Ｊ’およびｐＢＧＨ，２コＯと呼ぶ。
Ｈ１０Ｊ’およびｐＢＧＨ，２コＯと呼ぶ。
ｐＢＧＨｌｏｒを多量に単離し〔アール・ディー拳クラ
イン等、プラスミド、第３巻、第ざｇ〜り７頁（／り”
）Ｌそのヌクレオチド配列を決定した〔マギサムおよび
ギルバー） 、 Ｐｒｏｃ。
イン等、プラスミド、第３巻、第ざｇ〜り７頁（／り”
）Ｌそのヌクレオチド配列を決定した〔マギサムおよび
ギルバー） 、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａ ｔ １．Ａｃａｄ、 Ｓｅ ｉ、Ｕ Ｓ Ａ、第
７≠巻、第、３′６０〜６７頁（／り７７）〕。この配
列およびその対応するアミノ酸配列を第２図に示す。こ
のアミノ酸配列はＢＧＨにつき従来報告された配列〔デ
イポツフ（上記）；ワリス（上記）〕と一致するが、た
だしアミノ酸≠７および＆Ｊが異なる。
７≠巻、第、３′６０〜６７頁（／り７７）〕。この配
列およびその対応するアミノ酸配列を第２図に示す。こ
のアミノ酸配列はＢＧＨにつき従来報告された配列〔デ
イポツフ（上記）；ワリス（上記）〕と一致するが、た
だしアミノ酸≠７および＆Ｊが異なる。
ヌクレオチド配列は１位置／７７、．２４ｔＯおよび弘
ｊ１．を以外はＢＧＭを暗号化するＤＮＡにつき従来報
告された配列〔ミラー（上記）Ｊと一致する。
ｊ１．を以外はＢＧＭを暗号化するＤＮＡにつき従来報
告された配列〔ミラー（上記）Ｊと一致する。
位置／７７および、２グＯの相違はアミノ酸変化をもた
らさず、ｔ、ｔＳ弘における相違はアミノ酸変化をもた
らす。後者の変化は、この位置において従来報告された
異質性〔ワリス（上記）〕と一致する。
らさず、ｔ、ｔＳ弘における相違はアミノ酸変化をもた
らす。後者の変化は、この位置において従来報告された
異質性〔ワリス（上記）〕と一致する。
第２図および第３図に示したように、ｐＢＧＨｌｏｒの
挿入物のＤＮＡ配列は牛プレ成長ホルモンの推定信号配
列における。２６個のアミノ酸の、２３個および牛成長
ホルモンの／り／偶のアミノ酸を暗号化する。さらに、
このＤＮＡ配列は、ＢＧＭの３′未翻訳末端からの６ｊ
個のヌクレオチドを含有する（第３図）。
挿入物のＤＮＡ配列は牛プレ成長ホルモンの推定信号配
列における。２６個のアミノ酸の、２３個および牛成長
ホルモンの／り／偶のアミノ酸を暗号化する。さらに、
このＤＮＡ配列は、ＢＧＭの３′未翻訳末端からの６ｊ
個のヌクレオチドを含有する（第３図）。
牛成長ホルモンを暗号化するＩ）ＮＡ配列の発現
ｐ Ｂ Ｇ Ｈ／ Ｏｇを使用して、牛成長ホルモンの
ｌり７個のアミノ酸を暗号化するＤＮＡ配列を坩離し、
かつこの配列を有する各種の発現ベクターを作成してＡ
ＴＧ翻訳開始信号へ直接に融合さぜ、そして各種発現制
御配列の制御下で種々のイー・コリ宿主菌株においてｆ
−ｍＯｔ −ＢＧＨ（アミノ末端にメチオニンを有する
ＢＧ、［ｌの／り７個のアミノ酸）の合成レベルを分析
した。
ｌり７個のアミノ酸を暗号化するＤＮＡ配列を坩離し、
かつこの配列を有する各種の発現ベクターを作成してＡ
ＴＧ翻訳開始信号へ直接に融合さぜ、そして各種発現制
御配列の制御下で種々のイー・コリ宿主菌株においてｆ
−ｍＯｔ −ＢＧＨ（アミノ末端にメチオニンを有する
ＢＧ、［ｌの／り７個のアミノ酸）の合成レベルを分析
した。
これら構成および合成の結果を下記に示す：ｔｒｐ
Ｏ，００／ ！Ｏ
ＰＬ θ、θ／ 〜／θ０
θこれら収量から、成熟牛成長ホルモンを暗号化するＤ
ＮＡ配列の開始部へＡＴＧ開始コドンを単に挿入した構
成はイー・コリにおいて有益量のＢＧＨを合成しえない
と結論された。
Ｏ，００／ ！Ｏ
ＰＬ θ、θ／ 〜／θ０
θこれら収量から、成熟牛成長ホルモンを暗号化するＤ
ＮＡ配列の開始部へＡＴＧ開始コドンを単に挿入した構
成はイー・コリにおいて有益量のＢＧＨを合成しえない
と結論された。
さらに、ＡＴＧ９ｉｌ始コドンと成熟牛成長ホルモンの
最初のアミノｆｆｌ （Ａｌａ ）を暗号化するＧＣＣ
との間に牛プレ成長ホルモンの５個のアミノ酸（Ｍ、２
図においてアミノ酸−／〜−りを有する種々の発現ベク
ターを作成した。、これらの構成はＢＧＭの／り１個の
アミノ酸を有する生成物の合成をもたらし、そのうち６
個のアミノ酸がそのアミン末端に融合されている（メチ
オニン十ＢＧＨのプレ配列からのｊ個のアミノ酸）。
最初のアミノｆｆｌ （Ａｌａ ）を暗号化するＧＣＣ
との間に牛プレ成長ホルモンの５個のアミノ酸（Ｍ、２
図においてアミノ酸−／〜−りを有する種々の発現ベク
ターを作成した。、これらの構成はＢＧＭの／り１個の
アミノ酸を有する生成物の合成をもたらし、そのうち６
個のアミノ酸がそのアミン末端に融合されている（メチ
オニン十ＢＧＨのプレ配列からのｊ個のアミノ酸）。
これら構成および合成の結果を下記に示す：ｔｒｐ
Ｏ１０／ ！００ｐＬ
ｏ、θ／ ／θθＯこれらの
結果から、特定構造の発現制御配列とＡＴＧ開始コドン
との間の間隔ケ単に変化させても発現レベルを太し７て
改善しないと結論された。さらに、開始コドンと成熟牛
成長ホルモンの最初のアミノ酸との間の間隔を変化させ
ても有益でないと結論された。
Ｏ１０／ ！００ｐＬ
ｏ、θ／ ／θθＯこれらの
結果から、特定構造の発現制御配列とＡＴＧ開始コドン
との間の間隔ケ単に変化させても発現レベルを太し７て
改善しないと結論された。さらに、開始コドンと成熟牛
成長ホルモンの最初のアミノ酸との間の間隔を変化させ
ても有益でないと結論された。
次いで、上記のＰＬ制御された構成における多数の改変
を行なって発現ベクターにおけるＢＧＨ暗号化配列とシ
ャイン・タールガルノ配列との間の間隔を短縮させ、こ
のベクターのシャイン・タールガルノ配列を有するタタ
ヌクレオチド断片（ｍμ）における削除によりグロモー
タ効率を増大させ、ＢＧＨ暗号化配列の未翻訳３′ｄＣ
末端を除去し、かつ形質転換宿主のンラスミドコピー数
を増加させた。
を行なって発現ベクターにおけるＢＧＨ暗号化配列とシ
ャイン・タールガルノ配列との間の間隔を短縮させ、こ
のベクターのシャイン・タールガルノ配列を有するタタ
ヌクレオチド断片（ｍμ）における削除によりグロモー
タ効率を増大させ、ＢＧＨ暗号化配列の未翻訳３′ｄＣ
末端を除去し、かつ形質転換宿主のンラスミドコピー数
を増加させた。
しかしながら、これら改変のいずれも、これらベクター
によシ形質転換された宿主においてＢＧＭの発現レベル
に対し顕著に影響を与えなかった。したがって、ＢＧＨ
暗号化配列はイー・コリにおける高レベルの発現を妨り
゛る幾つかの固有の特性を有すると思われる。′ 特定の理論に拘束されるものではないが、これらベクタ
ーにおけるＢＧＭ暗号化配列の低い発現レベルは、ベク
ターのシャイン・ダルガルノ配列（１ｉｌ１１もしくは
ｔｒｐ ）の近傍のＡ ／ Ｇ−リッチな配列と、成熟
ＢＧＨに対する暗号化配列の開始部におけるＴ／Ｃ−ｌ
７ツチな領域との結合によｐもたらされると信じられる
。
によシ形質転換された宿主においてＢＧＭの発現レベル
に対し顕著に影響を与えなかった。したがって、ＢＧＨ
暗号化配列はイー・コリにおける高レベルの発現を妨り
゛る幾つかの固有の特性を有すると思われる。′ 特定の理論に拘束されるものではないが、これらベクタ
ーにおけるＢＧＭ暗号化配列の低い発現レベルは、ベク
ターのシャイン・ダルガルノ配列（１ｉｌ１１もしくは
ｔｒｐ ）の近傍のＡ ／ Ｇ−リッチな配列と、成熟
ＢＧＨに対する暗号化配列の開始部におけるＴ／Ｃ−ｌ
７ツチな領域との結合によｐもたらされると信じられる
。
たとえば
ｍｕ 部位 ＡＡＣＴＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴｔｒ
ｐ部位 ＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧ’ｌ”ＡＴＣＧＢＧ
Ｈ部位 ＡＴに ＧＣＣＴＴｅＣＣ人ＧＣＣＡＴＧ ｉ
’ｃｃ ＴＴＧ １’Ｃにの種の結合はＡＴＧ開始コ
ドンを不明確にすると共に、適当な配列に対する９ボン
ームの良好な結合を妨げる。。
ｐ部位 ＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧ’ｌ”ＡＴＣＧＢＧ
Ｈ部位 ＡＴに ＧＣＣＴＴｅＣＣ人ＧＣＣＡＴＧ ｉ
’ｃｃ ＴＴＧ １’Ｃにの種の結合はＡＴＧ開始コ
ドンを不明確にすると共に、適当な配列に対する９ボン
ームの良好な結合を妨げる。。
したがって、ＢＧＭ暗号化配列の開始部におけるこれら
Ｔ／Ｃ−リッチな領域を変化させ。
Ｔ／Ｃ−リッチな領域を変化させ。
かくしてシャインーダルカルノ配列のＡ／Ｇ−リッチな
所要領域への結合を阻止することが提案される。
所要領域への結合を阻止することが提案される。
＊ 観察された合成の低レベルは、イー・コリにおける
ＢＵＨの分片ｔにより説明することはできない。何故な
ら、天然ＢＧＨはイー拳コリ細胞抽出物において安定で
あると思われるからである。
ＢＵＨの分片ｔにより説明することはできない。何故な
ら、天然ＢＧＨはイー拳コリ細胞抽出物において安定で
あると思われるからである。
木本本発明の理論に対する黒伺けとして、ＢＧｆ（暗号
化配列をＭＳ、２からのタタ例のアミノ酸を暗号化する
ＤＮＡ配列に融合させて融合蛋白質として発現させた場
合、高レベルのＢＧＨ状ポリペプチドの発現が観察され
た。しかしながら、この種の融合蛋白質は牛の処理には
好適でない。何故なら、これに含まれる他のアミノ酸は
処理動物において免疫反応を誘発しつるからである。
化配列をＭＳ、２からのタタ例のアミノ酸を暗号化する
ＤＮＡ配列に融合させて融合蛋白質として発現させた場
合、高レベルのＢＧＨ状ポリペプチドの発現が観察され
た。しかしながら、この種の融合蛋白質は牛の処理には
好適でない。何故なら、これに含まれる他のアミノ酸は
処理動物において免疫反応を誘発しつるからである。
ＢＧＭ暗号化配列のＴ／Ｃ−リッチな領域に彫物を与え
る／方法は、ＢＧＨＩｖ号化配列の初ル１コドンにおけ
る突然変異を用いてＴ／ Ｃ−リッチな領域を改変させ
るが、これら領域によシ暗号化されるプミノ除全保Ｊ°
、−することである。
る／方法は、ＢＧＨＩｖ号化配列の初ル１コドンにおけ
る突然変異を用いてＴ／ Ｃ−リッチな領域を改変させ
るが、これら領域によシ暗号化されるプミノ除全保Ｊ°
、−することである。
しかしながら、ＢＧＨの初期アミノ酸およびこれらを暗
号化する変性コドンを検討すれば一１’４Ｊるように、
初期コドンのＴ／Ｃ含荒は突然変異を保持するこの釉の
アミノ酸により顕著に影響を受けない。したがって、Ｂ
ＧＨ暗号化配列のこのＴ／Ｃ−リッチな領域におけるコ
ドンの幾つかを削除することに決斧した。
号化する変性コドンを検討すれば一１’４Ｊるように、
初期コドンのＴ／Ｃ含荒は突然変異を保持するこの釉の
アミノ酸により顕著に影響を受けない。したがって、Ｂ
ＧＨ暗号化配列のこのＴ／Ｃ−リッチな領域におけるコ
ドンの幾つかを削除することに決斧した。
第弘図は、適当な宿主において剥規なりＧＨ状ポリペプ
チドを高収率で生産しうる本発明のＤＮＡ配列の作成方
法におりる７例を示している。
チドを高収率で生産しうる本発明のＤＮＡ配列の作成方
法におりる７例を示している。
１０ｘ旦１ｎｄｌｌ緩衝液および１００１１ｔｎのＮｔ
ｓＣ１中においてＮｅｏ ｌ （／λ年単位によシ３７
℃にて１０ｔｔｇのｐ ＢＧＨ−（Ｍｅｔ−Ａｌａ ）
を３０分間処理した。！μｌのＥＤＴＡ（０，λｔＭ）
と／μｌのリボヌクレアーゼとを加えることによシ反応
を停止させた。混合物を３７℃で５分間加熱した彼、７
滴のフェノールを加えて混合物を振とうした。次いで、
線状化したＤＮＡ（ＨＡｊＭ（ビオラド社）におけるク
ロマトグラフィーによｐｆＩｌ製しく ／ ＯｍＭ ト
リス−ＨＣＩ （ｐＨＩ ）、／ｍＭＥＤＴＡによシ溶
出）かつＤＮＡ含有のピーク（４／−ｏｏμ６）を保存
した。次いで、１００μｌのルリ３１塩と／単位の、艷
すエ３／とを加え。
ｓＣ１中においてＮｅｏ ｌ （／λ年単位によシ３７
℃にて１０ｔｔｇのｐ ＢＧＨ−（Ｍｅｔ−Ａｌａ ）
を３０分間処理した。！μｌのＥＤＴＡ（０，λｔＭ）
と／μｌのリボヌクレアーゼとを加えることによシ反応
を停止させた。混合物を３７℃で５分間加熱した彼、７
滴のフェノールを加えて混合物を振とうした。次いで、
線状化したＤＮＡ（ＨＡｊＭ（ビオラド社）におけるク
ロマトグラフィーによｐｆＩｌ製しく ／ ＯｍＭ ト
リス−ＨＣＩ （ｐＨＩ ）、／ｍＭＥＤＴＡによシ溶
出）かつＤＮＡ含有のピーク（４／−ｏｏμ６）を保存
した。次いで、１００μｌのルリ３１塩と／単位の、艷
すエ３／とを加え。
混合物を３０℃で培養して線状化ＤＮＡにおける削除物
を生成させた〔これについては、エヌ・パナヨタトスお
よびケー・トルオングによシ「予備選択塩基間における
ＤＮＡ配列の特異的削除」、ヌクレイツク・アシッド優
リサーチ、第り巻、第ｊｔ７り〜ざｇ頁（／りＪ’／）
に実質的に記載されているＪ。ｊつの時間（ｔｏ秒、、
２゜秒、３０秒、≠ｊ秒およびｔｏ秒）にてこの混合物
から１００μｌの試料を採取して、線状化ＤＮＡからの
各種の削除物を得た。
を生成させた〔これについては、エヌ・パナヨタトスお
よびケー・トルオングによシ「予備選択塩基間における
ＤＮＡ配列の特異的削除」、ヌクレイツク・アシッド優
リサーチ、第り巻、第ｊｔ７り〜ざｇ頁（／りＪ’／）
に実質的に記載されているＪ。ｊつの時間（ｔｏ秒、、
２゜秒、３０秒、≠ｊ秒およびｔｏ秒）にてこの混合物
から１００μｌの試料を採取して、線状化ＤＮＡからの
各種の削除物を得た。
フェノールの添加により各試料における削除反応を停止
させ、混合物を、２３０μｌのフェノールで７回および
Ｑ、！μＥのエーテルで７回抽出した。ＤＮＡ１ＥｔＯ
Ｈで沈澱させ、そしてこれ全遠心分離により回収した（
ざＯＯ（７ｒｐｍ、♂ｍｉｎ、 ）。収量：各試料にお
いて１０μｓ。
させ、混合物を、２３０μｌのフェノールで７回および
Ｑ、！μＥのエーテルで７回抽出した。ＤＮＡ１ＥｔＯ
Ｈで沈澱させ、そしてこれ全遠心分離により回収した（
ざＯＯ（７ｒｐｍ、♂ｍｉｎ、 ）。収量：各試料にお
いて１０μｓ。
ｐ Ｂ ＧＷ −（ｂ’ｉｅｔ −Ａｌａ ）における
Ｎｃｏｌ制限部位（ＣＣＡＴＧＧ）はこのプラスミドに
おけるｆ−ｍｅｔ ＢＧＨを暗号化するＤＮＡ配列の開
始近傍に位置するので（第弘図）、Ｎｃｏｌによる制限
およびル１３／による線状化ＤＮＡの処理はＢＧＭを暗
号化するＤＮＡ配列において各種の削除物をもたらし、
したがって標準ＢＧＭと比較して７個もしくはそれ以上
のアミン末端アミノ酸を喪失したＢＧＨ状ポリペプチド
を暗号化するＤＮＡ配列を生産する（第弘図）。
Ｎｃｏｌ制限部位（ＣＣＡＴＧＧ）はこのプラスミドに
おけるｆ−ｍｅｔ ＢＧＨを暗号化するＤＮＡ配列の開
始近傍に位置するので（第弘図）、Ｎｃｏｌによる制限
およびル１３／による線状化ＤＮＡの処理はＢＧＭを暗
号化するＤＮＡ配列において各種の削除物をもたらし、
したがって標準ＢＧＭと比較して７個もしくはそれ以上
のアミン末端アミノ酸を喪失したＢＧＨ状ポリペプチド
を暗号化するＤＮＡ配列を生産する（第弘図）。
Ｔで終端するこれら削除物を選択するため（下記するよ
うにＢＧＭ暗号化配列の外部にＨｉｎｄｌ１１部位が便
利に位置するために選択される）、エヌ・バナヨタトス
およＯ：クー３トルオング（上記）により記載した方法
を使用した。
うにＢＧＭ暗号化配列の外部にＨｉｎｄｌ１１部位が便
利に位置するために選択される）、エヌ・バナヨタトス
およＯ：クー３トルオング（上記）により記載した方法
を使用した。
ＤＮＡを３グμｌのＨ２Ｏ中に溶解させ、弘μｌの／（
７Ｘ坦懸■緩衝液と２０単位の坦郵ｍとを加え、混合物
を３７℃で７時間培養した。
７Ｘ坦懸■緩衝液と２０単位の坦郵ｍとを加え、混合物
を３７℃で７時間培養した。
この制限反応は）Ｉｉｎｄ１部位において線状化ＤＮＡ
の非ＢＧＨ末端を切断した（第グ図）。
の非ＢＧＨ末端を切断した（第グ図）。
次いで、ＤＮＡをｊμｌの／ｍＭのｄＮＴＰおよび／μ
ｌのクレノー（／単位）と混合することによ５Ｈｉｎｄ
［１部位を充填し、混合物を３７℃で７５分間培養した
。充填されたＤＮＡをアガロースゲル上で分画した後、
一つのバンドを観測した：すなわちＤＮＡの小Ｈｉｎｄ
ｌ断片に対応する１００塩基対の小バンドおよびＤＮＡ
主要断片に相当する犬バンド（第グ図）。
ｌのクレノー（／単位）と混合することによ５Ｈｉｎｄ
［１部位を充填し、混合物を３７℃で７５分間培養した
。充填されたＤＮＡをアガロースゲル上で分画した後、
一つのバンドを観測した：すなわちＤＮＡの小Ｈｉｎｄ
ｌ断片に対応する１００塩基対の小バンドおよびＤＮＡ
主要断片に相当する犬バンド（第グ図）。
ＤＮＡ主要断片をゲルから溶出させ、これをＥｔＯＨで
沈澱させ、かつ遠心分離（ざ０００μｌｍ♂ｍｉｎ、
）によＪＤＮＡを回収した。第弘図に図示するように、
このＤＮＡ断片は一端部に充填１４ｉｎｄｌｌｌ制限部
位（ＡＡＧＣＴ）を有すると共に、他端部には前記Ｂａ
１Ｊ／処理により生成されたＢＧＨ暗号化配列における
各種の削除物の７つを有する。要するに、ＤＮＡの再環
化は、ＢＧＨ暗号化配列における一艷已３／削除が′ｒ
で終端するような場合にのみ再結合点においてＨｉｎｄ
ｌ１１部位（ＡＡＧＣＴＴ）を再生する。したがって、
ＤＮＡを再結合させかつこれを再ひＨｉｎｄｌｌｌによ
り切断して所望Ｔ−末端削除物を選択した（第弘図）。
沈澱させ、かつ遠心分離（ざ０００μｌｍ♂ｍｉｎ、
）によＪＤＮＡを回収した。第弘図に図示するように、
このＤＮＡ断片は一端部に充填１４ｉｎｄｌｌｌ制限部
位（ＡＡＧＣＴ）を有すると共に、他端部には前記Ｂａ
１Ｊ／処理により生成されたＢＧＨ暗号化配列における
各種の削除物の７つを有する。要するに、ＤＮＡの再環
化は、ＢＧＨ暗号化配列における一艷已３／削除が′ｒ
で終端するような場合にのみ再結合点においてＨｉｎｄ
ｌ１１部位（ＡＡＧＣＴＴ）を再生する。したがって、
ＤＮＡを再結合させかつこれを再ひＨｉｎｄｌｌｌによ
り切断して所望Ｔ−末端削除物を選択した（第弘図）。
このＤＮＡを再環化させるため、上記からのＥｔＯＨ沈
澱物ｆ：３３ｔｔｌのＨ２Ｏ中に溶解させ。
澱物ｆ：３３ｔｔｌのＨ２Ｏ中に溶解させ。
この溶液をμμｌの１０×結合用塩および、２μｌのＴ
弘ＤＮＡリガーゼと合し、そして混合物を／４ｔ℃にて
７６時間培養した〔これについては。
弘ＤＮＡリガーゼと合し、そして混合物を／４ｔ℃にて
７６時間培養した〔これについては。
エヌ・パナヨタトスおよびケー幸トルオンク、（上記）
により実質的に記載されている〕。次いで、混合物を７
０℃にて７５分間加熱することによシ反応を停止させ、
上記と同様にＤＮＡを単離した。
により実質的に記載されている〕。次いで、混合物を７
０℃にて７５分間加熱することによシ反応を停止させ、
上記と同様にＤＮＡを単離した。
所望の削除を有するＤＮＡ断片（すなわちＴに終端する
もの〕を単離するため、上記からの占用化されたＤ Ｎ
Ａ Ｊａ：Ｈｉｎｄ ｌおよび貼二ｆ（ｌにより制限
した。、第弘図に示したように、この制限は削除されｆ
ｃＢ Ｇ Ｈ暗号化配列ｋＭするＤＮＡ断片の選択を可
能にする。、シたがって、ＤＮＡをｊμｌの／ Ｏｘ
Ｈｉｎｄ ｌ緩似１液中に浴ＪＭさせ１．２０単位の央
列１１とλＱ年単位抑ＨＩとを加え、そしてこの混合物
を３７℃で６０分間培養した。処理の後、この混合物を
アクリルアミドゲル上で分画し、このゲルから所望ＤＮ
Ａのｇｅｔ塩基対断片を溶出させ、これをＥｔＯｆ（で
沈澱させ、かつ遠心分離により上記と同様に回収した。
もの〕を単離するため、上記からの占用化されたＤ Ｎ
Ａ Ｊａ：Ｈｉｎｄ ｌおよび貼二ｆ（ｌにより制限
した。、第弘図に示したように、この制限は削除されｆ
ｃＢ Ｇ Ｈ暗号化配列ｋＭするＤＮＡ断片の選択を可
能にする。、シたがって、ＤＮＡをｊμｌの／ Ｏｘ
Ｈｉｎｄ ｌ緩似１液中に浴ＪＭさせ１．２０単位の央
列１１とλＱ年単位抑ＨＩとを加え、そしてこの混合物
を３７℃で６０分間培養した。処理の後、この混合物を
アクリルアミドゲル上で分画し、このゲルから所望ＤＮ
Ａのｇｅｔ塩基対断片を溶出させ、これをＥｔＯｆ（で
沈澱させ、かつ遠心分離により上記と同様に回収した。
この断片（／ストランド）は一端部にＴを有し、これは
Ｂ Ｇ Ｍ暗号化配列において川３／での処理によジ行
なった特定削除の末端を示し、さらに他端部にはＢａｍ
ＨＩ開裂残基を有し、これはＢＧ）ｌ階上化配列のＣ０
ＯＨ末端を越えて位置する。各種の削除物（すなわち、
このＴにおいて削除は停止する）のヌクレオチド配列を
決定するため、ＤＮＡ１ｉｏｔｔｔのｌＩ２０に溶解さ
せ、Ｏ９／μｇの復列ｌｌｌ−沖ＨＩ処理されたｐＢＲ
Ｊ、２．２（／μｔ）と八λμｌの１０×結合用緩衝液
とＯ９ｊμｌＯＴグＩ） Ｎ Ａリガーゼとを加えるこ
とによりとＨＩ−町閃■断片を復剪１１１−独１（１線
状化ｐ Ｂ Ｒ３，２２中に挿入し、そしてこの混合物
を／４”Ｃにて／Ｇ時間培養しグヒ。
Ｂ Ｇ Ｍ暗号化配列において川３／での処理によジ行
なった特定削除の末端を示し、さらに他端部にはＢａｍ
ＨＩ開裂残基を有し、これはＢＧ）ｌ階上化配列のＣ０
ＯＨ末端を越えて位置する。各種の削除物（すなわち、
このＴにおいて削除は停止する）のヌクレオチド配列を
決定するため、ＤＮＡ１ｉｏｔｔｔのｌＩ２０に溶解さ
せ、Ｏ９／μｇの復列ｌｌｌ−沖ＨＩ処理されたｐＢＲ
Ｊ、２．２（／μｔ）と八λμｌの１０×結合用緩衝液
とＯ９ｊμｌＯＴグＩ） Ｎ Ａリガーゼとを加えるこ
とによりとＨＩ−町閃■断片を復剪１１１−独１（１線
状化ｐ Ｂ Ｒ３，２２中に挿入し、そしてこの混合物
を／４”Ｃにて／Ｇ時間培養しグヒ。
結合を停止させた後１．２００／ｌｌの競合イー・コリ
Ｋ１２λ（ワルターのフイアースの寄贈）を１０μｌの
０．／ Ｍ Ｍ９Ｃ１２の存在下で形ＩＪｉ１転換させ
、その際細胞を水中で７５分間急冷し、グコ℃で２分間
培養しかつ室温で７０分間培養した。、２ＭのＬ−培地
を加えた後、細胞を３７℃にて７時間増殖させ１．２０
０μｌをｓｏｔｔｇ／ゴアンビシリンが補充されたＬ−
培地を含むベトリ皿へ接種した。集落を３７℃にて／を
時間増殖させ、アンピシリンに耐性である。２弘種のク
ローンをこれら集落から任意に選択した。
Ｋ１２λ（ワルターのフイアースの寄贈）を１０μｌの
０．／ Ｍ Ｍ９Ｃ１２の存在下で形ＩＪｉ１転換させ
、その際細胞を水中で７５分間急冷し、グコ℃で２分間
培養しかつ室温で７０分間培養した。、２ＭのＬ−培地
を加えた後、細胞を３７℃にて７時間増殖させ１．２０
０μｌをｓｏｔｔｇ／ゴアンビシリンが補充されたＬ−
培地を含むベトリ皿へ接種した。集落を３７℃にて／を
時間増殖させ、アンピシリンに耐性である。２弘種のク
ローンをこれら集落から任意に選択した。
これらクローンのそれぞれの培養物をｊθｔｅ（１／ｖ
ｒｌアンピシリンが補充されたＬ−培地！ｍ）中で３７
℃にて／、２時間増殖させ、細胞ｌｌからのプラスミド
Ｉ） Ｎ Ａをクライン等（上記）により記載されたミ
ニ調製法によシ各培養物からｆｔＹ製した。次いで、、
２Ｌ１１ｉのノ“ラスミド１）ＮＡにおけるハザ世Ｉｌ
ｌ −Ｂａｍ ）ｉ Ｉ押入物を一曵劉１１１−Ｂａユ
ｆｌＩ制限およびポリアクリルアミドゲル分画によって
寸法分画した。長押入物を有するり種のンラスミ）’
Ｄ Ｎ Ａを選択し、これら挿入物の幾つかを配列決定
１／ １その際Ｈｉｎｄｌｌｌ−り匹Ｉ断片を岸陥する
と共にマ今ザムおよびギルバート（上記）により記載さ
れた配列決定法を使用した。この配列決定は、押入物の
成るものは第２図においてヌクレオチド１０４ｔ（Ｔ）
において開始しくすなわち、ＢＧＨのアミノｔｒ：；
／−タに対する暗号化領域が削除されている）かつ挿入
物の他のものは第２図におけるヌクレオチドとり（Ｔ）
で開始する（すなわち、ＢＧＨのアミノ酸／−≠に対す
る暗号化領域が削除されている）ことを示した。
ｒｌアンピシリンが補充されたＬ−培地！ｍ）中で３７
℃にて／、２時間増殖させ、細胞ｌｌからのプラスミド
Ｉ） Ｎ Ａをクライン等（上記）により記載されたミ
ニ調製法によシ各培養物からｆｔＹ製した。次いで、、
２Ｌ１１ｉのノ“ラスミド１）ＮＡにおけるハザ世Ｉｌ
ｌ −Ｂａｍ ）ｉ Ｉ押入物を一曵劉１１１−Ｂａユ
ｆｌＩ制限およびポリアクリルアミドゲル分画によって
寸法分画した。長押入物を有するり種のンラスミ）’
Ｄ Ｎ Ａを選択し、これら挿入物の幾つかを配列決定
１／ １その際Ｈｉｎｄｌｌｌ−り匹Ｉ断片を岸陥する
と共にマ今ザムおよびギルバート（上記）により記載さ
れた配列決定法を使用した。この配列決定は、押入物の
成るものは第２図においてヌクレオチド１０４ｔ（Ｔ）
において開始しくすなわち、ＢＧＨのアミノｔｒ：；
／−タに対する暗号化領域が削除されている）かつ挿入
物の他のものは第２図におけるヌクレオチドとり（Ｔ）
で開始する（すなわち、ＢＧＨのアミノ酸／−≠に対す
る暗号化領域が削除されている）ことを示した。
新規なりＧＨ状ポリペプチドを高収率で生産第５図は、
新規なりＧＨ状ポリベプグードを高収率で生産しうる本
発明のＤＮＡ配列を特徴とする発現ベクターの作成方法
の７例を示している。
新規なりＧＨ状ポリベプグードを高収率で生産しうる本
発明のＤＮＡ配列を特徴とする発現ベクターの作成方法
の７例を示している。
上Ｈピコ種の削除物（ΔグおよびΔり）からのＤ Ｎ
Ａ配列を発現させるため、ＤＮＡ挿入物を７°ラスミド
ＤＮＡから単片（ＲＬ、その際プラスミドを前記と同様
に旦ｉｎｄ ［１により切断し、前記と同様にＨｉｎｄ
ｌｌｌ断片にクレノーを充填し、次いでＤＮＡを前記し
た条件下で７θ単位の馬■ＨＩにより切断した。次いで
、所望のＢＧＨ関連ＤＮＡ断片を５％（Ｉｔ）ポリアク
リルアミドゲル上で精製した。この断片はｌストランド
中においてそのＢＧＨ関連末端に配列ＡＧＣＴＴを有し
、このＡＧＣＴは坦す■部位の充填に由来し、かつ最終
Ｔは第２図のヌクレオチド１０１／ｌ（Δり）であるか
または第２図のヌクレオチドｇり（Δｔ）である。
Ａ配列を発現させるため、ＤＮＡ挿入物を７°ラスミド
ＤＮＡから単片（ＲＬ、その際プラスミドを前記と同様
に旦ｉｎｄ ［１により切断し、前記と同様にＨｉｎｄ
ｌｌｌ断片にクレノーを充填し、次いでＤＮＡを前記し
た条件下で７θ単位の馬■ＨＩにより切断した。次いで
、所望のＢＧＨ関連ＤＮＡ断片を５％（Ｉｔ）ポリアク
リルアミドゲル上で精製した。この断片はｌストランド
中においてそのＢＧＨ関連末端に配列ＡＧＣＴＴを有し
、このＡＧＣＴは坦す■部位の充填に由来し、かつ最終
Ｔは第２図のヌクレオチド１０１／ｌ（Δり）であるか
または第２図のヌクレオチドｇり（Δｔ）である。
このＤＮＡ配列を得るための発現ベクターを調装するた
め、上記で使用したと同一のベクターをｐｌ、プロモー
タ（たとえばｐＢＧＨ−（Ｍｅｔ−Ａｌａ））の制御下
にぺ鵠ＩによってＲ４裂させてＢＧＨ配列を発現させ、
この断片にクレノーを充填しかつ慣用の条件および緩衝
液を使用してたメ状化ＤＮＡ′ｆニジ偲Ｈ１により開裂
させた。
め、上記で使用したと同一のベクターをｐｌ、プロモー
タ（たとえばｐＢＧＨ−（Ｍｅｔ−Ａｌａ））の制御下
にぺ鵠ＩによってＲ４裂させてＢＧＨ配列を発現させ、
この断片にクレノーを充填しかつ慣用の条件および緩衝
液を使用してたメ状化ＤＮＡ′ｆニジ偲Ｈ１により開裂
させた。
この１ヶｒ片は／ストランドにおいて一端部に、μ巴１
部位の充填から生ずる配列ＣＣＡ ’１’ Ｇを有し、
かつ他端部にはＢａｍｆＬＩ開裂からの残部を南する（
第５図）。次いで、／μｌの結合用緩衝液これを７４ｔ
℃にて７６時間培養した。
部位の充填から生ずる配列ＣＣＡ ’１’ Ｇを有し、
かつ他端部にはＢａｍｆＬＩ開裂からの残部を南する（
第５図）。次いで、／μｌの結合用緩衝液これを７４ｔ
℃にて７６時間培養した。
との再環化け１．２ｆ１！のベクターをそれぞれ生成し
た。一方のベクターにおいて、ＡＴＧで開始するヌクレ
オチド配列はＡＴＧＡＧＣＴＴＧであυ、それに続いて
第２図のＢＧＨ暗号化配列のアミノ酸２が存在する（ｐ
ＢＧＨΔ４７（Ｓｅす）（第５図）。他方のベクターに
おいて、ＡＴＧで開始するヌクレオチド配列はＡＴＧＡ
ＧＣＴ１’Ｇであシ、それに続き第２図のＢＧＨ暗号化
配列のアミノ酸／／が存在する（ｐＢＧ）ｌ−Δり（Ｓ
ｅｒ））←第ｊ図）。したがって、第１の作成において
、成熟ＢＧＨの最初のび個のアミノ酸に対する暗号化領
域が除去されておシ、コドンＡＧＣ（セリン）が挿入さ
れ、かつ成熟ＢＧｆｉの第ｊ番目のアミノ酸に対する暗
号化領域がＡＴＧからＴＴＧまで改変されて、そのアミ
ノ酸をメチオニンからロイシンまで変化している。他の
作成、すなわち本発明の好適作成において、成熟ＢＧＭ
の最初のり個のアミノ酸に対する暗号化領域が除去され
ておシ、コドンＡＧＣ（セリン）が挿入され、かつ成熟
ＢＧＨの第７θ番目のアミノ酸に対する暗号化領域がＣ
ＴＧからＴＴＧまで変化され、この変化はそのアミノ酸
（ロイシン）に影響を与えない。したがって、最初の作
成は成熟ＢＧＨの配列Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−アミノ
酸６−／りｌの蛋白質を発現し、かつ他方の作成は成熟
ＢＧＨの配列Ｍｅｔ−８ｅｒ〜アミノ酸ター／りｌの蛋
白質を発現する筈である。したがって、こｉＬ Ｃ）
２ 糊のベクターをそれぞれｐＢＧＨ−Δμ（Ｓｅｒ）
およびｐＢＧＨ−Δり（Ｓｅｒ ）と呼ぶ（第５図）。
た。一方のベクターにおいて、ＡＴＧで開始するヌクレ
オチド配列はＡＴＧＡＧＣＴＴＧであυ、それに続いて
第２図のＢＧＨ暗号化配列のアミノ酸２が存在する（ｐ
ＢＧＨΔ４７（Ｓｅす）（第５図）。他方のベクターに
おいて、ＡＴＧで開始するヌクレオチド配列はＡＴＧＡ
ＧＣＴ１’Ｇであシ、それに続き第２図のＢＧＨ暗号化
配列のアミノ酸／／が存在する（ｐＢＧ）ｌ−Δり（Ｓ
ｅｒ））←第ｊ図）。したがって、第１の作成において
、成熟ＢＧＨの最初のび個のアミノ酸に対する暗号化領
域が除去されておシ、コドンＡＧＣ（セリン）が挿入さ
れ、かつ成熟ＢＧｆｉの第ｊ番目のアミノ酸に対する暗
号化領域がＡＴＧからＴＴＧまで改変されて、そのアミ
ノ酸をメチオニンからロイシンまで変化している。他の
作成、すなわち本発明の好適作成において、成熟ＢＧＭ
の最初のり個のアミノ酸に対する暗号化領域が除去され
ておシ、コドンＡＧＣ（セリン）が挿入され、かつ成熟
ＢＧＨの第７θ番目のアミノ酸に対する暗号化領域がＣ
ＴＧからＴＴＧまで変化され、この変化はそのアミノ酸
（ロイシン）に影響を与えない。したがって、最初の作
成は成熟ＢＧＨの配列Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−アミノ
酸６−／りｌの蛋白質を発現し、かつ他方の作成は成熟
ＢＧＨの配列Ｍｅｔ−８ｅｒ〜アミノ酸ター／りｌの蛋
白質を発現する筈である。したがって、こｉＬ Ｃ）
２ 糊のベクターをそれぞれｐＢＧＨ−Δμ（Ｓｅｒ）
およびｐＢＧＨ−Δり（Ｓｅｒ ）と呼ぶ（第５図）。
＊ 勿論、ｆ−ｍａｔは発現の際に或いはそれに続いて
これらポリペプチドから除去されてＢＧＨの式Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−ＡＡ６〜ＡＡ１９１およびＢＧＨのＳｅｒ
−ＡＡ９〜ＡＡＢ＋のポリペプチドをそれぞれ生成しう
ろことを了解すべきである。事実、その後のＢＧＨ−Δ
り（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列決定は、ｆ−ｍｅｔが発現
または精製の際に一裂されたことを示した。
これらポリペプチドから除去されてＢＧＨの式Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−ＡＡ６〜ＡＡ１９１およびＢＧＨのＳｅｒ
−ＡＡ９〜ＡＡＢ＋のポリペプチドをそれぞれ生成しう
ろことを了解すべきである。事実、その後のＢＧＨ−Δ
り（Ｓｅｒ）のアミノ酸配列決定は、ｆ−ｍｅｔが発現
または精製の際に一裂されたことを示した。
上記したようにイー・コリ■（／２λを形質転換させる
ために再環化フラスミドを使用し、この場合アンピシリ
ン耐性の集落を再び選択した。
ために再環化フラスミドを使用し、この場合アンピシリ
ン耐性の集落を再び選択した。
次いで、アンピシリン耐性クローン７．２種の培養物を
増殖させ、前記したようなミニ調製法によりプラスミド
ＤＮＡを単離し、かつ慣用の売件を使用して旦り■／以
碧Ｒ１制限によシ押入物を寸法分画した。寸法分画の結
果から、適当な挿入物を有するプラスミドＤＮＡを選択
した。
増殖させ、前記したようなミニ調製法によりプラスミド
ＤＮＡを単離し、かつ慣用の売件を使用して旦り■／以
碧Ｒ１制限によシ押入物を寸法分画した。寸法分画の結
果から、適当な挿入物を有するプラスミドＤＮＡを選択
した。
次いで、１）ＮＡを使用してジー・エヌーブエル等、ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第、２ｊ４
を巷、第２ｄ７２〜と３頁（／り７り）に実質的に記載
されているよう６ｃイー・コリＭｃｔｏｔｉを形質転換
させた。さしに、１１ ｔｉ／ざよ７（タンリュー・フ
イアースの寄贈）によシ細胞を形りｆ転換させた。上８
Ｃのようにアンピシリンを補充しかつカナマイシン（４
１０μｇ／ｍ６）を補充したし一培地において集ｆ＆に
３０パＣにで、Ｉ乙時間増殖させることにより、Ｂ Ｇ
Ｈ関連のプラスミドＤ Ｎ Ａおよびｐｃ／ｆ、ｔ７
により形質転換した細胞を選択した。
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第、２ｊ４
を巷、第２ｄ７２〜と３頁（／り７り）に実質的に記載
されているよう６ｃイー・コリＭｃｔｏｔｉを形質転換
させた。さしに、１１ ｔｉ／ざよ７（タンリュー・フ
イアースの寄贈）によシ細胞を形りｆ転換させた。上８
Ｃのようにアンピシリンを補充しかつカナマイシン（４
１０μｇ／ｍ６）を補充したし一培地において集ｆ＆に
３０パＣにで、Ｉ乙時間増殖させることにより、Ｂ Ｇ
Ｈ関連のプラスミドＤ Ｎ Ａおよびｐｃ／ｆ、ｔ７
により形質転換した細胞を選択した。
次イテ、アンピシリンおよびカナマイシン剛性の集落を
任意に採取し、これらを上ｅ４ｔ２とｌｌＴ１様にアン
ピシリンおよびカナマイシンが補充された一ｔ１ｒＩｌ
のＬ−培地において３０℃で７晩増殖させた。この培養
物を２６１ｎｅのＬ−培地ＶｒＣよｐ≠λ℃で希釈し、
そしてこれら１１昧１シをグｌＣにて２時間増殖さぜた
（０，１）、−／）。。
任意に採取し、これらを上ｅ４ｔ２とｌｌＴ１様にアン
ピシリンおよびカナマイシンが補充された一ｔ１ｒＩｌ
のＬ−培地において３０℃で７晩増殖させた。この培養
物を２６１ｎｅのＬ−培地ＶｒＣよｐ≠λ℃で希釈し、
そしてこれら１１昧１シをグｌＣにて２時間増殖さぜた
（０，１）、−／）。。
形質転換された細胞により生成されるＢＧＨ状ポリペプ
チドを即離するため、ｉｍｅの細胞を採取し、これらを
遠心分離しく １０００ ｒｐｍ 、 ４１１旧１１
）、ｓｏμｌのラメリ緩衝液（７％５ＤＳ）〔ラメリ、
洋イチャー誌、第、２．２７巻、第６ざ／負以降（／り
７０）〕を加え、混合物を１１分間煮沸し、そして再び
細胞を遠心分離して（１０００ｒｐｍ 、 ｌ／−ｍｉ
ｎ ） 細胞残骸を除去した。うさぎ抗血清を用いるＢ
ＧＭの放射線免疫分析によシ上澄腋を標徨！ＢＧＨに対
して分析した。′＊１本１１ Ｃ／ Ｉ ｊ ７は、感
温ＰＬリフレッサとカナマイシン耐性を暗号化する遺伝
子と４哨する小型プラスミドである。
チドを即離するため、ｉｍｅの細胞を採取し、これらを
遠心分離しく １０００ ｒｐｍ 、 ４１１旧１１
）、ｓｏμｌのラメリ緩衝液（７％５ＤＳ）〔ラメリ、
洋イチャー誌、第、２．２７巻、第６ざ／負以降（／り
７０）〕を加え、混合物を１１分間煮沸し、そして再び
細胞を遠心分離して（１０００ｒｐｍ 、 ｌ／−ｍｉ
ｎ ） 細胞残骸を除去した。うさぎ抗血清を用いるＢ
ＧＭの放射線免疫分析によシ上澄腋を標徨！ＢＧＨに対
して分析した。′＊１本１１ Ｃ／ Ｉ ｊ ７は、感
温ＰＬリフレッサとカナマイシン耐性を暗号化する遺伝
子と４哨する小型プラスミドである。
＊傘 これらは、成熟ＢＧＨを暗号化するＤＮＡ配列を
用いるＢＧ）ＩのＰｌ７−制御発現につき上記で使用し
たと同一の増殖争件である。
用いるＢＧ）ＩのＰｌ７−制御発現につき上記で使用し
たと同一の増殖争件である。
＊オ傘 これは、成熟ＢＧＭを暗号化する１）ＮＡ配
列を使用するＢＧＨのＰｌ、制御発現につき上記で使用
したと同一の単離方法および分析である。
列を使用するＢＧＨのＰｌ、制御発現につき上記で使用
したと同一の単離方法および分析である。
次のＢ Ｇ Ｈ状ポリペプチドの発現レベルが得られた
： Δ！（Ｓｅｒ） ３０．θ ／Ｊ ｘ ／
０’Δり（Ｓｅｒ ） １００
ＪＯ×１０６さらに、成熟Ｂ Ｇ Ｈを暗号化する１）
ＮＡ配列衾使用してＢＧＭを発現させるために上記で使
用したと同一のｔｒｐ含有ベクターにおいて、ΔＩＩ
（Ｓｅｒ ）およびΔり（Ｓｅｒ）ＤＮＡ配列を使用し
た。これら作成において次の発現レベルが得られた： ΔＩｔ （Ｓｅｒ ） ０．／！ １０
００ΔＹ （Ｓｅｒ ） ０，３０ Ｊ０
０００最後に、これら作成物を処理して、肛す■１充填
により付加されたへ〇ｃｃコドン（セリンを暗号化する
）をこれら作成物から削除した。
： Δ！（Ｓｅｒ） ３０．θ ／Ｊ ｘ ／
０’Δり（Ｓｅｒ ） １００
ＪＯ×１０６さらに、成熟Ｂ Ｇ Ｈを暗号化する１）
ＮＡ配列衾使用してＢＧＭを発現させるために上記で使
用したと同一のｔｒｐ含有ベクターにおいて、ΔＩＩ
（Ｓｅｒ ）およびΔり（Ｓｅｒ）ＤＮＡ配列を使用し
た。これら作成において次の発現レベルが得られた： ΔＩｔ （Ｓｅｒ ） ０．／！ １０
００ΔＹ （Ｓｅｒ ） ０，３０ Ｊ０
０００最後に、これら作成物を処理して、肛す■１充填
により付加されたへ〇ｃｃコドン（セリンを暗号化する
）をこれら作成物から削除した。
ＡＧＣ削除された作成物ｐＢＧＨ−Δ弘およびｐＢＧＨ
−Δりは本発明の一層好適な作成物でろｐ、ｐＢＧＨ−
Δりが特に好適である。′ これら作成物を得るため、
上０１のＢＧＨ関連配列のＢｉｎｄｌｌ１部位の充填を
改変して、ｄＡ’ｒＰのみを混合物中に存在させた。こ
の改変は充填に際し単一のＡのみを付加した（第を図）
。
−Δりは本発明の一層好適な作成物でろｐ、ｐＢＧＨ−
Δりが特に好適である。′ これら作成物を得るため、
上０１のＢＧＨ関連配列のＢｉｎｄｌｌ１部位の充填を
改変して、ｄＡ’ｒＰのみを混合物中に存在させた。こ
の改変は充填に際し単一のＡのみを付加した（第を図）
。
次いで、反応混合物をｓｉｐ衝液（３θｍＭＮａＯＡｃ
（ｐＨ４’Ｊ ）、３０ ｍＭ ＮｔｓＣ！ 、 ３
ｍＭＺｎＣ１２）で７０倍希釈し、λ単位／ｌｉｐ
ＤＮＡのＳ／を加え、そして混合物を３７゛Ｃにて３０
分間培養し、未充填ＤＮＡを開裂させた（第６図）。次
いで、フェノールにより反応を停止させ、前記と同様に
処理して十偲ＨＩによりＤＮＡ断片を制限し、かつこれ
を所望の発現ベクター中へ押入した。これらベクターを
使用し、次の発現レベルが観察された： Δタ ＰＬ １０Ｑ よｘ １
０６＊ これら作成物の発現に際し生成されるアミノ末
端ｆ −Ｍｅ ｔ ｉｄ ’、発現の際に或いはその後
にこれらＢＧＭ関連のポリペプチドから除去することが
できた。ＢＧＨ−Δり（Ｓｅｒ）の実際のアミノ酸配列
に関する経験により、ｆ’ −Ａ４ｅ ｔは発現または
精製の際に除去されることが期待される。
（ｐＨ４’Ｊ ）、３０ ｍＭ ＮｔｓＣ！ 、 ３
ｍＭＺｎＣ１２）で７０倍希釈し、λ単位／ｌｉｐ
ＤＮＡのＳ／を加え、そして混合物を３７゛Ｃにて３０
分間培養し、未充填ＤＮＡを開裂させた（第６図）。次
いで、フェノールにより反応を停止させ、前記と同様に
処理して十偲ＨＩによりＤＮＡ断片を制限し、かつこれ
を所望の発現ベクター中へ押入した。これらベクターを
使用し、次の発現レベルが観察された： Δタ ＰＬ １０Ｑ よｘ １
０６＊ これら作成物の発現に際し生成されるアミノ末
端ｆ −Ｍｅ ｔ ｉｄ ’、発現の際に或いはその後
にこれらＢＧＭ関連のポリペプチドから除去することが
できた。ＢＧＨ−Δり（Ｓｅｒ）の実際のアミノ酸配列
に関する経験により、ｆ’ −Ａ４ｅ ｔは発現または
精製の際に除去されることが期待される。
さらに、本発明のΔ弘およびΔりのＤＮＡ配列ならびに
本発明の方法により作成されたＢＧＨ−Δ／’ｉＰＬ制
御の下で使用して（’ＭＪ記と同様、ｒｎｕ−由来のリ
ボンーム結合部位を用いるン、各種のイー、・コリ宿主
を形質転換させ、発現レベルを比較した： １、全ての宿主はｐｃ／♂ｊ７＋）グレツサプラスミド
を有した。
本発明の方法により作成されたＢＧＨ−Δ／’ｉＰＬ制
御の下で使用して（’ＭＪ記と同様、ｒｎｕ−由来のリ
ボンーム結合部位を用いるン、各種のイー、・コリ宿主
を形質転換させ、発現レベルを比較した： １、全ての宿主はｐｃ／♂ｊ７＋）グレツサプラスミド
を有した。
２、宿主の遺伝子型は次の通りである。：ＰＲ７： ｔ
ｈｒ Ｉｅｕ ｐｎｐ ｔｈｉ ｒｎｓ ｍａｌｘａｌ
ｍｔｌ Ｓｍ” ｔｒＡ ６、振と９フラスコにおいて４ｔｊ ℃でコ時間誘発さ
せた後の細胞７個当シの分子数におけるＨＩＡ収率。
ｈｒ Ｉｅｕ ｐｎｐ ｔｈｉ ｒｎｓ ｍａｌｘａｌ
ｍｔｌ Ｓｍ” ｔｒＡ ６、振と９フラスコにおいて４ｔｊ ℃でコ時間誘発さ
せた後の細胞７個当シの分子数におけるＨＩＡ収率。
したがって、削除されｉ？：、Ｂ Ｇ Ｈ暗号化配列の
部分子、有するＤＮＡ配列およびそれを特徴とする組換
ＤＮＡ分子は、牛成長ホルモン状ホリベプチドを高収率
で生産すること？！−１−ｉ」能にし、その収率は同じ
発現ベクターにおいて成熟牛成長ホルモンを暗号化する
ＤＮＡ配列よシも少なくとも７００倍高く、好ましくは
それよシも１０００倍商い。さらに、この種の削除は、
ｙＬ用方法を用いるｆＶｌｌ製の後に牛における一般的
同化作用剤として、特にこれら動物における成長速度、
体重増加および肉生産を増大させるのに有用な新規な牛
成長ホルモン状ポリベグチドの発現を可能にする。たと
えば、約２０％の均質性まで精製した後、特に好適な両
様イー・コＩＪ ＭＣ１０６／（ＰＬ−ｍｕ−ΔターＢ
ＧＨ）により生成されるΔターＢＧＨは、標準的ラッテ
のチヒア分析ニおいて天然ＢＧＨの成長促進性の約ざ。
部分子、有するＤＮＡ配列およびそれを特徴とする組換
ＤＮＡ分子は、牛成長ホルモン状ホリベプチドを高収率
で生産すること？！−１−ｉ」能にし、その収率は同じ
発現ベクターにおいて成熟牛成長ホルモンを暗号化する
ＤＮＡ配列よシも少なくとも７００倍高く、好ましくは
それよシも１０００倍商い。さらに、この種の削除は、
ｙＬ用方法を用いるｆＶｌｌ製の後に牛における一般的
同化作用剤として、特にこれら動物における成長速度、
体重増加および肉生産を増大させるのに有用な新規な牛
成長ホルモン状ポリベグチドの発現を可能にする。たと
えば、約２０％の均質性まで精製した後、特に好適な両
様イー・コＩＪ ＭＣ１０６／（ＰＬ−ｍｕ−ΔターＢ
ＧＨ）により生成されるΔターＢＧＨは、標準的ラッテ
のチヒア分析ニおいて天然ＢＧＨの成長促進性の約ざ。
チを示した。
本発明のＤＮＡ配列におけるアミン末端蘭除の実際の程
度は、本発明および本発明によ・り得られる新規なりＧ
Ｈ状ポリペプチドの＾収率に対し臨界的でない。例数な
ら、削除の程度は使用する発現制御配列または宿主に依
存しうるからである。寧ろ、アミン末端削除は、１）Ｎ
Ａ配列が特定の宿主および発現ベクターにおいて、成熟
ＢＧＨを暗号化するＤＮＡ配列により生成されるよりも
少なくとも約１００倍多い、よシ好ましくは少なくとも
約７０００倍多い分子／細胞のＢＧＨ状ポリペプチドを
生産させるのに充分である。この種のＤＮＡ配列および
分析は、本発明の開示および実施例にしたがって当業者
には容易に実施することができる。したがって、この種
のＤＮＡ配列、これを含有する組換ＤＮＡ分子、および
これにより生成される牛成長ボルモン状ポリベズチドは
本発明の一部を構成する。
度は、本発明および本発明によ・り得られる新規なりＧ
Ｈ状ポリペプチドの＾収率に対し臨界的でない。例数な
ら、削除の程度は使用する発現制御配列または宿主に依
存しうるからである。寧ろ、アミン末端削除は、１）Ｎ
Ａ配列が特定の宿主および発現ベクターにおいて、成熟
ＢＧＨを暗号化するＤＮＡ配列により生成されるよりも
少なくとも約１００倍多い、よシ好ましくは少なくとも
約７０００倍多い分子／細胞のＢＧＨ状ポリペプチドを
生産させるのに充分である。この種のＤＮＡ配列および
分析は、本発明の開示および実施例にしたがって当業者
には容易に実施することができる。したがって、この種
のＤＮＡ配列、これを含有する組換ＤＮＡ分子、および
これにより生成される牛成長ボルモン状ポリベズチドは
本発明の一部を構成する。
本発明の削除を行なうのに使用する実際の方法も臨界的
でない。たとえば、μ已３１を用いて削除を行ないかつ
Ｔで終端する削除を選択する実施例につき説明したが、
他の削除方法も本発明に使用することができる。これら
の方法は、ＢＧ）ｉ暗号化配列を開裂させ、開裂された
配列の１部を合成断片で交換し、湛す３／で処理し、Ｔ
で終端するもの以外の削除を選択すること。
でない。たとえば、μ已３１を用いて削除を行ないかつ
Ｔで終端する削除を選択する実施例につき説明したが、
他の削除方法も本発明に使用することができる。これら
の方法は、ＢＧ）ｉ暗号化配列を開裂させ、開裂された
配列の１部を合成断片で交換し、湛す３／で処理し、Ｔ
で終端するもの以外の削除を選択すること。
または、２種の方法の組合せ或いは当条界で知られた他
の削除方法を包含する。
の削除方法を包含する。
勿論、本発明の新規なりＮＡ配列を発現５させかつ本発
明の新規なポリペプチドを高収率で生産させるには、他
の宿主および発現１ベクターも使用しうることを了解す
べきである。これらの宿主は他の菌株のイー・コリ、な
らびにシュードモナス、ストレフトミセス、バチルス、
酵母およびその他の真菌類の菌株、ならびに８．１物性
および動物性細胞の培養物を包合する。ストレプトミセ
スが特に好適な宿主である。これら宿主において本発明
のＤＮＡ配列を発覗、芒せるには、これらＤＮＡ配列を
特定の選択Ｔｄ主に対し適合性の発現ベクター、或いは
上記に使用したようなベクターに挿入する。
明の新規なポリペプチドを高収率で生産させるには、他
の宿主および発現１ベクターも使用しうることを了解す
べきである。これらの宿主は他の菌株のイー・コリ、な
らびにシュードモナス、ストレフトミセス、バチルス、
酵母およびその他の真菌類の菌株、ならびに８．１物性
および動物性細胞の培養物を包合する。ストレプトミセ
スが特に好適な宿主である。これら宿主において本発明
のＤＮＡ配列を発覗、芒せるには、これらＤＮＡ配列を
特定の選択Ｔｄ主に対し適合性の発現ベクター、或いは
上記に使用したようなベクターに挿入する。
本発明の方法により作成された微生物および組換ＤＮＡ
分子は、／りｌｒ２年ざ月／乙日付でメリーランド州ロ
ックビル在のアメリカン−タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託され、かつ下記のＢＧＭ−Ａ−Ｃとして同
定された培養物金側とする： Ａ、 Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ／、２λ（ｐＢＧＨ−（Ｍ
ａｔ−Ａｌａ） ）ＩＪ Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ／、２
λ（ｐＢＧＨ−Δ４ｊ（Ｓｅｒ））Ｃ，Ｅ、 ｏｏｌｉ
Ｋ／２λ（ｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ））これら培養物
にはそれぞれ寄託番号３り１７３゜３り／７４／および
３り１７ｊが付力された。
分子は、／りｌｒ２年ざ月／乙日付でメリーランド州ロ
ックビル在のアメリカン−タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託され、かつ下記のＢＧＭ−Ａ−Ｃとして同
定された培養物金側とする： Ａ、 Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ／、２λ（ｐＢＧＨ−（Ｍ
ａｔ−Ａｌａ） ）ＩＪ Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ／、２
λ（ｐＢＧＨ−Δ４ｊ（Ｓｅｒ））Ｃ，Ｅ、 ｏｏｌｉ
Ｋ／２λ（ｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ））これら培養物
にはそれぞれ寄託番号３り１７３゜３り／７４／および
３り１７ｊが付力された。
以上、本発明の多くの実施例につき説明したが、この基
本構成を改変して本発明の方法および組成物を使用しう
る他の具体例を提供しうろことも明らかであろう。した
がって、本発明の範囲はこれら特定実施例のみに限定さ
れないことが了解されよう。
本構成を改変して本発明の方法および組成物を使用しう
る他の具体例を提供しうろことも明らかであろう。した
がって、本発明の範囲はこれら特定実施例のみに限定さ
れないことが了解されよう。
牛成長ホルモン状ポリペプチドを高収率で製造するため
のＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子および製造方法、ならび
にそれによシ製造される新規なポリペプチドにつき上記
に説明した。これらポリペプチドは牛の成長速度、なら
びに牛における肉生産および品質を同上させるのに有用
である。
のＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子および製造方法、ならび
にそれによシ製造される新規なポリペプチドにつき上記
に説明した。これらポリペプチドは牛の成長速度、なら
びに牛における肉生産および品質を同上させるのに有用
である。
第７図はＢ Ｇ Ｈを暗号化する１）ＮＡ配列を特徴と
する組換ＤＮＡ分子の製造方法の７例を示す略図であシ
、 第一図および第３図社中プレ成長ホルモンを暗号化し、
ｄＧ切断末端からｄＣ切断開始部まで番号を伺した（ヌ
クレオチド７〜７／３）ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配
列を示す配列図であり、この配列は推定牛プレ成長ホル
モン信号配列の、２６個のアミノ酸のうち、２部個（ア
ミノ酸−２３〜−ｌ）と成熟牛成長ホルモンのアミノ酸
の／り７個（アミノ酸ｌ〜／りｌ）とを含んでおり。 第Ｖ図は牛成長ポルモン暗号化領域のアミノ末端暗号化
端部が削除された本発明の１）ＮＡ配列の製造方法にお
ける７例を示す説明図であり。 第５図は本発明の新規な牛成長ホルモン状ポリペプチド
の高レベルの発現を可能にするＤＮＡ自己列を特徴とし
た本発明による発現１ベクターの製造方法の７例を示す
説明図であり。 第６図は本発明の新規な牛成長ホルモン状ポリペプチド
の高レベルの発現を可能にするＩＪＮＡ配列を特徴とし
た本発明の発現ベクターの製造方法における他の具体例
を示す説明図である。 図面のｌ９書（内容に変更なし） ｃＤＮＡ Ｐβ（ｙＨＩＯ１３ ｐ８６Ｎ２２θ ＦＩＧ。 各Ａ曜１百り■孜 ＦＩＧ、 ６ −に２筺定饗饗お］ Ｐθ６〃−Δ９第１頁の続き ９Ｉｎｔ、 Ｃ１，３識別記号 庁内整理番号（Ｃ
Ｉ２ Ｐ ２１１０２ ＣＩ２ Ｒ１／１９ ） ６７６
０−４８（Ｃ１２Ｎ １５１００ Ｃ１２Ｒ１／１９ ） ６７６０
−４Ｂ−ｆ 沼に ネ市 ｊ、Ｅ ’ｉ”’７；’
（’、、Ｉ）１０１１〆拝ＩＩ 、’＋ ８ （１−／
／月ｚｉ−１特許庁長官 若杉 和 夫 １股 １、重性の表示 １１７（１］ ５８年特６１願 第１４１１８５７ ’
＝３２、発明の名称 ３、ン市１１：を′４゛るンず 事＋’ｌとの関係 特ｇ’ｒ＋Ｉ！幀ノ、４、代
哩 人 ６、袖山の内容
する組換ＤＮＡ分子の製造方法の７例を示す略図であシ
、 第一図および第３図社中プレ成長ホルモンを暗号化し、
ｄＧ切断末端からｄＣ切断開始部まで番号を伺した（ヌ
クレオチド７〜７／３）ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配
列を示す配列図であり、この配列は推定牛プレ成長ホル
モン信号配列の、２６個のアミノ酸のうち、２部個（ア
ミノ酸−２３〜−ｌ）と成熟牛成長ホルモンのアミノ酸
の／り７個（アミノ酸ｌ〜／りｌ）とを含んでおり。 第Ｖ図は牛成長ポルモン暗号化領域のアミノ末端暗号化
端部が削除された本発明の１）ＮＡ配列の製造方法にお
ける７例を示す説明図であり。 第５図は本発明の新規な牛成長ホルモン状ポリペプチド
の高レベルの発現を可能にするＤＮＡ自己列を特徴とし
た本発明による発現１ベクターの製造方法の７例を示す
説明図であり。 第６図は本発明の新規な牛成長ホルモン状ポリペプチド
の高レベルの発現を可能にするＩＪＮＡ配列を特徴とし
た本発明の発現ベクターの製造方法における他の具体例
を示す説明図である。 図面のｌ９書（内容に変更なし） ｃＤＮＡ Ｐβ（ｙＨＩＯ１３ ｐ８６Ｎ２２θ ＦＩＧ。 各Ａ曜１百り■孜 ＦＩＧ、 ６ −に２筺定饗饗お］ Ｐθ６〃−Δ９第１頁の続き ９Ｉｎｔ、 Ｃ１，３識別記号 庁内整理番号（Ｃ
Ｉ２ Ｐ ２１１０２ ＣＩ２ Ｒ１／１９ ） ６７６
０−４８（Ｃ１２Ｎ １５１００ Ｃ１２Ｒ１／１９ ） ６７６０
−４Ｂ−ｆ 沼に ネ市 ｊ、Ｅ ’ｉ”’７；’
（’、、Ｉ）１０１１〆拝ＩＩ 、’＋ ８ （１−／
／月ｚｉ−１特許庁長官 若杉 和 夫 １股 １、重性の表示 １１７（１］ ５８年特６１願 第１４１１８５７ ’
＝３２、発明の名称 ３、ン市１１：を′４゛るンず 事＋’ｌとの関係 特ｇ’ｒ＋Ｉ！幀ノ、４、代
哩 人 ６、袖山の内容
Claims (9)
- （１） 牛成長ホルモン状ポリペプチドを製造するに
際し、発現制御配列に作用結合されたｎｕ記ポリペプチ
ドを暗号化するＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡ分子によ
シ形質転換された宿主を培養し、前記ＤＮＡ配列は成熟
中成長ホルモンを暗号化するＤＮＡ配列からアミン末端
を削除してなりかつ前記ＤＮＡ配列は成熟中成長ホルモ
ンを暗号化するＤＮＡ配列よシも少なくとも１００倍高
い収率で前記ポリペプチドを生産し、次いで１ＩＩＩ記
ポリペプチドを回収することを特徴とする牛成長ホルモ
ン状ポリペプチドの製造方法。 - （２）ＤＮＡ配列をｐＢＧＨ−Δ／、ｐＢＧＨ−Δ弘ｐ
Ｂ Ｇ Ｈ−Δりの牛成長ホルモン関連挿入物、なら
びに成熟中成長ホルモンを暗号化するＤＮＡ配列から７
ミノ末端が削除されかつ成熟中成長ホルモンを暗号化す
るＩ）ＮＡ配列よりも少なくともｉｏｏ倍＾い収率にて
牛成長ホルモン状ポリベグチドを生産さぜうるその他の
ＤＮＡ挿入物よシなる群から選択することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （３） ＤＮＡ配列は、成熟中成長ホルモンを暗号化
するＤＮＡ配列よシも少なくとも１０００倍高い収率に
て牛成長ホルモン状ポリペプチドを生産させうろことを
特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項記載の方
法。 - （４）牛成長ホルモン状ポリペプチドはＢＧＨのＭｅ
ｔＰｈ ｃ−ＡＡＳ〜ＡＡ Ｉｐｌ、ＢＧＨのＦ’ｈｅ
−ＡＡ、＋＋＋ＡＡ、、、、ＢＧＨのＭｅｔＳｅｒＬｅ
ｕ −ＡＡ ６〜ＡＡ １９ ＋、ＢＧＨのＳｅ ｒ−
Ｌｅｕ−ＡＡ６〜ＡＡ１９１ｂ ＢＧＨのＭｅｔＬｅｕ
−ＡＡ６〜ＡＡ１ｐ、。 Ｓ ｅ ｒ −ＡＡ ｑ〜ＡＡ Ｉ ９１、ＢＧＨの５
ｅｒ−ＡＡ９〜ＡＡｌｌ、ＢＧＨのＭｅ ｔ −ＡＡ
？ 〜ＡＡ １． 、 、 ＢＧｉｌのＡＡ９〜ＡＡ
＋ ９１ のポリペプチドならひにＤＮＡ配列により
、１Ｉｌｆ号化されるポリペプチドよりなる群から選択
されｓ ＨｉＪ記ＤＮＡ配列は成熟中成長ホルモンを暗
号化するＬ）ＮＡ配タリからアミノ末端が削除されかつ
成熟中成長ホルモンを暗号化するＩ） Ｎ Ａ配列よシ
も少なくとも１００倍高い収率にてｒｆｉＪ記ポリペグ
チドを生産しうろことを特徴とする特許請求の範囲第１
項乃至第３項のいずれかに記載の方法。 - （５）牛成長ホルモン状ポリペプチドを暗号化するＤＮ
Ａ配列と発現制御配列とからなシ、前記ＤＮＡ配列は前
記発現制御配列に作用結合されかつ成熟中成長ホルモン
を暗号化するＤＮＡ配列からアミノ末端が削除されると
共に成熟中成長ホルモンを暗号化するＤＮＡ配列よシも
少なくとも１００倍高い収率にて適当な宿主において前
記牛成長ホルモン状ポリペプチドを生産しうろことを特
徴とする組換ＤＮＡ分子− - （６） ｐ Ｂ ＧＩｌ−Δ／、ｐＢＧＨ−ΔＩＩ（
Ｓｏｒ）、ｐＢＧＨ−ΔＰ、ｐＢＧＨ−Δり（Ｓｅｒ）
、ｐＢＧＨ−Δり、ならびに成熟中成長ホルモンを暗号
化するＬ）ＮＡ配列からアミノ末端が削除芒れかつ成熟
中成長ホルモンを暗号化するＤＮＡ配列よシも少なくと
も１００倍高い収率にてｎ１１記牛成長ホルモン状ポリ
ペプチドを生産しうるＤ Ｎ Ａ挿入物を有する組換Ｄ
ＮＡ分子よルなる群から選択されることを特徴とする特
許請求の範囲第！項Ｒｅ載の組換ＤＮＡ分子。 - （７）発現制御配列が主系、す」系、ファージλの主要
オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄ被覆蛋白質の制
御領域、原始核もしくは成熟核細胞およびそのウィルス
の遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列
、ならびにそれらの組合せよりなる群から選択されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第５項または第６現記戦
の組換ＤＮＡ分子。 - （８）式：ＢＧ）ｆのＭｅ ｔＰｈ ｅ−ＡＡ３〜ＡＡ
１９１、ＢＧＨのＰｂｅ−ＡＡ５〜ＡＡ１．、、ＢＧＨ
のＭｅｔＳｅｒＬｅｕ−ＡＡ６〜ＡＡ１ｐ１、ＢＧＨの
５ｅｒＬｅｕ−ＡＡ６、ＡＡ、、、、 ＢＧｎのｆシｅ
ｔ Ｌｅ １ｌ−ＡＡ、、〜ＡＡ、、、、ＢＧＨのＬ
ｅｕ−ＡＡ６〜ＡＡ、９１、ＢＧＨのＭｅｔＳｅｒ−Ａ
Ａ９〜ＡＡ１９９、ＢＧ）Ｉの５ｅｒ−ＡＡ？ 〜ＡＡ
Ｂ１．ＢＧＨのＭ ｅ Ｌ −Ａ Ａ ？ 〜ＡＡ、、
、、ＢＧＨのＡＡ、〜ＡＡ１９１のポリペプチド、成熟
中成長ホルモンを暗号化するＤＮＡから７ミノ末端が削
除され、かつ牛成長ホルモンを暗号化するＤＮＡ配列よ
りも少なくとも７００倍高い収率でポリペプチドを生産
しうるＤＮＡ配列により暗号化されるその他のポリペプ
チド、ならびに前記ポリペプチドの断片および誘導体よ
りなる群から選択される牛成長ホルモン状ポリペプチド
。 - （９）式 ＢＧＨのΔ４ｅ ｔ−ＡＡ、 〜ＡＡ１Ｈお
よびＢＧＨのＡＡ９〜ＡＡ ｊ ９ ＋のポリペプチド
よりなる群から選択されることを特徴とする特許請求の
範囲第ｒ項記載のポリペプチド。 （１ｏ）％許請求の範囲第１ｒ項または第り項目ピ載の
ポリペプチドよシなる群から選択されるポリペプチドに
よって行なうこと？特徴とする動物の処理方法。 Ｑｌ） 特許１ｆｆｉ求の範囲第ｇ項またＶｉ、第２
項Ｂ【２戦のポリペプチドよりなる群から選択されろポ
リペプチド金％徴とする動物処理用組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8223695 | 1982-08-17 | ||
| GB8223695 | 1982-08-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5963197A true JPS5963197A (ja) | 1984-04-10 |
Family
ID=10532360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58148857A Pending JPS5963197A (ja) | 1982-08-17 | 1983-08-16 | 牛成長ホルモン状ポリペプチドを高収率で製造するためのｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子および製造方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4693973A (ja) |
| EP (1) | EP0103395A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5963197A (ja) |
| AU (1) | AU568597B2 (ja) |
| CA (1) | CA1224432A (ja) |
| DD (1) | DD212982A5 (ja) |
| DK (1) | DK375283A (ja) |
| ES (1) | ES8502476A1 (ja) |
| NO (1) | NO832948L (ja) |
| NZ (1) | NZ205212A (ja) |
| PT (1) | PT77206B (ja) |
| ZA (1) | ZA835880B (ja) |
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| JPH08205888A (ja) * | 1985-07-15 | 1996-08-13 | Internatl Minerals & Chem Corp <Imc> | 生物学的に活性な成長ホルモンの精製および濃縮方法 |
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