JPS5963197A - 牛成長ホルモン状ポリペプチドを高収率で製造するためのdna配列、組換dna分子および製造方法 - Google Patents
牛成長ホルモン状ポリペプチドを高収率で製造するためのdna配列、組換dna分子および製造方法Info
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- JPS5963197A JPS5963197A JP58148857A JP14885783A JPS5963197A JP S5963197 A JPS5963197 A JP S5963197A JP 58148857 A JP58148857 A JP 58148857A JP 14885783 A JP14885783 A JP 14885783A JP S5963197 A JPS5963197 A JP S5963197A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/168—Steroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、牛成長ホルモン状ポリペブヂドを高収率で製
造するための新規な1)NA配列、組換DNA分子およ
び製造方法に門するものである。さらに詳細(は、本発
明は、適当な宿主中で高収小にて発現される新規なりN
A配列、およびこれら宿主で生産される新規な牛成長ホ
ルモン状ポリペプチドに関するものである。
造するための新規な1)NA配列、組換DNA分子およ
び製造方法に門するものである。さらに詳細(は、本発
明は、適当な宿主中で高収小にて発現される新規なりN
A配列、およびこれら宿主で生産される新規な牛成長ホ
ルモン状ポリペプチドに関するものである。
本発明のDNA配列お上び組換DNA分子は、牛成長ホ
ルモンの成長促進性の生物学的活性を示す新規なポリペ
プチドを暗号化する。以下の記載から明らかなように、
不発1叫のDNA配列、組換DNA分子および製造方法
は、牛における一般的な同化作用剤として有用な、特に
これら動物における成長速度、体重増加および肉生産を
増大させるためのポリペプチドの製造に使用することが
できる。
ルモンの成長促進性の生物学的活性を示す新規なポリペ
プチドを暗号化する。以下の記載から明らかなように、
不発1叫のDNA配列、組換DNA分子および製造方法
は、牛における一般的な同化作用剤として有用な、特に
これら動物における成長速度、体重増加および肉生産を
増大させるためのポリペプチドの製造に使用することが
できる。
中成長ポル七ン(1−BGHJ )は、脳下垂体前葉部
で合成され、かつそこから分/!V・されるポリペプチ
ドホルモンである。BGHは先駆体蛋白質(牛のプレ成
長ホルモン)として合成され、かつ分泌されて血流中へ
放用される際に中成長ホルモンまで放熱すると思われる
。さらに、天然の中成長ホルモンの蛋白質部分は多くの
アミン末端アミノ酸を欠如したポリペプチドを含むが、
それでも生物学的に活性であることが報告されている。
で合成され、かつそこから分/!V・されるポリペプチ
ドホルモンである。BGHは先駆体蛋白質(牛のプレ成
長ホルモン)として合成され、かつ分泌されて血流中へ
放用される際に中成長ホルモンまで放熱すると思われる
。さらに、天然の中成長ホルモンの蛋白質部分は多くの
アミン末端アミノ酸を欠如したポリペプチドを含むが、
それでも生物学的に活性であることが報告されている。
中成長ホルモンのヌクレオチド晰−3化配列およびアミ
ノ酸配列は、ダブリュー・エル・ミラー等、ジャーナル
・バイオロジカル・ケミストリー、第、22を巻、第7
5−/〜d弘頁(/り♂O);エム・ティー・デイホツ
フ等、1蛋白質配列および構造の一地図」、ディホップ
編、第j巻、補充第3号、第3グj−、−≠、2頁(7
77g);エムφヮリス、FEBSレター、第3j巻、
第1/〜/4を頁(/り73)に報告されている。これ
は/り7個のアミノ酸よりなるポリペプチドであり、2
17個のアミノ酸よジなる牛のプレ成長ホルモンとして
最初に合成されると思われる。
ノ酸配列は、ダブリュー・エル・ミラー等、ジャーナル
・バイオロジカル・ケミストリー、第、22を巻、第7
5−/〜d弘頁(/り♂O);エム・ティー・デイホツ
フ等、1蛋白質配列および構造の一地図」、ディホップ
編、第j巻、補充第3号、第3グj−、−≠、2頁(7
77g);エムφヮリス、FEBSレター、第3j巻、
第1/〜/4を頁(/り73)に報告されている。これ
は/り7個のアミノ酸よりなるポリペプチドであり、2
17個のアミノ酸よジなる牛のプレ成長ホルモンとして
最初に合成されると思われる。
、24個のアミノ酸の信号配列は1合成および分泌の際
にN−末端位置から除去される〔ブイ・アール・リンガ
ツバ等、Proc、 Nat 1.Acad。
にN−末端位置から除去される〔ブイ・アール・リンガ
ツバ等、Proc、 Nat 1.Acad。
Sci、USA、第2弘巻、第24132,44頁(l
り77)〕。
り77)〕。
成長ホルモンは生命サイクルの全期間にわたって生成さ
れるが、成長前の期間において一層多量に生成されるこ
とが明らかである。これらホルモンは骨賂成長、輩素保
持、蛋白質合成を増進させかつグルコースおよび脂質代
謝に影響を与えることが知られている。したがって、成
長ホルモンは、一般的な同化作用剤として認識されてい
る。
れるが、成長前の期間において一層多量に生成されるこ
とが明らかである。これらホルモンは骨賂成長、輩素保
持、蛋白質合成を増進させかつグルコースおよび脂質代
謝に影響を与えることが知られている。したがって、成
長ホルモンは、一般的な同化作用剤として認識されてい
る。
成長ホルモンは、成る程度、種特異性である。
しかしながら、成る種からの成長ホルモンは、他の種に
おいてその生物学的活性が著しく低い。
おいてその生物学的活性が著しく低い。
成長ホルモンの活性に関するメカニズムはまだよく理解
されていないが、成長ホルモンの投与は動物に2=−け
る成長速度、体重増加および肉生産を著しく増加きせる
ことが示されている。たとえば、成る試験において、精
製豚生長ホルモンを毎日注射した豚における体重増加の
平均速度は、7日当シ!、λ呂ボンドであった(対照豚
におけるコ、/タボンド/日の平均体重増加に比較)。
されていないが、成長ホルモンの投与は動物に2=−け
る成長速度、体重増加および肉生産を著しく増加きせる
ことが示されている。たとえば、成る試験において、精
製豚生長ホルモンを毎日注射した豚における体重増加の
平均速度は、7日当シ!、λ呂ボンドであった(対照豚
におけるコ、/タボンド/日の平均体重増加に比較)。
よシ重要なことに、処理された豚は、対照豚よシも/日
当シ著しく少ない飼料を消費した(ざ、弘θボンドに比
較して7.03ボンド)。
当シ著しく少ない飼料を消費した(ざ、弘θボンドに比
較して7.03ボンド)。
さらに、処理された豚は死体品質において著しい改善を
示した。すなわち、成長ホルモンで処理した豚の死体は
平均して長さ3θ、!フインチでありかつ7.410イ
ンチの脂肪厚さを示したのに対し、対照群の死体は平均
して長さλり、33インチでありかつ脂肪厚さ1.7フ
インチを有した。可食肉の化学組成も、成長ホルモン処
理した動物にお−いて著しく改善された。すなわち、/
3,10%蛋白質、≠り、l弘チ水分かつ3乙、7乙チ
脂肪であり、これは対照群の/ 0.1%蛋白質、3り
、4t j g6水分かつ4tり、27%脂肪と対照的
である〔イー・リュー・トルーマン、「脳下垂体前葉成
長ホルモンの豚に対する効果」、論文;プルジュー大学
(/りj3年V月)〕。
示した。すなわち、成長ホルモンで処理した豚の死体は
平均して長さ3θ、!フインチでありかつ7.410イ
ンチの脂肪厚さを示したのに対し、対照群の死体は平均
して長さλり、33インチでありかつ脂肪厚さ1.7フ
インチを有した。可食肉の化学組成も、成長ホルモン処
理した動物にお−いて著しく改善された。すなわち、/
3,10%蛋白質、≠り、l弘チ水分かつ3乙、7乙チ
脂肪であり、これは対照群の/ 0.1%蛋白質、3り
、4t j g6水分かつ4tり、27%脂肪と対照的
である〔イー・リュー・トルーマン、「脳下垂体前葉成
長ホルモンの豚に対する効果」、論文;プルジュー大学
(/りj3年V月)〕。
残念ながら、成長ホルモンを使用した動物における上記
の改善された成長および向上した肉生産は、充分なりG
Mが入手しえないため、牛においては広く実現化するこ
とができない。今日、BGHは牛の脳下垂体腺から抽出
され、或いは適当な宿主における組換DNA技術により
製造される(たとえば、ダブリュー彎エル・ミラー等、
ジャーナル・バイオロジカルeケミストリー、第コjJ
′巻、第73.2/−,24を頁(/りざの。
の改善された成長および向上した肉生産は、充分なりG
Mが入手しえないため、牛においては広く実現化するこ
とができない。今日、BGHは牛の脳下垂体腺から抽出
され、或いは適当な宿主における組換DNA技術により
製造される(たとえば、ダブリュー彎エル・ミラー等、
ジャーナル・バイオロジカルeケミストリー、第コjJ
′巻、第73.2/−,24を頁(/りざの。
ヨーロッパ特許出願力1l−7AOO号および英国特許
出願第、2073λグ!A号〕。要するに、前者の供給
源は、必要とされるBGHの産業的使用量を供給するに
は不充分である。また、後者の供給源も不充分である。
出願第、2073λグ!A号〕。要するに、前者の供給
源は、必要とされるBGHの産業的使用量を供給するに
は不充分である。また、後者の供給源も不充分である。
伺故なら、各種の宿主におけるBGM(7)発現収率が
極めて低(、BGMの経済的にイ1用7上或いは産県的
な使用集(を供給しえないからである。
極めて低(、BGMの経済的にイ1用7上或いは産県的
な使用集(を供給しえないからである。
本発明は、新規なり G n状ポリペプチドを暗号化す
るDNA配列を供給し、かつこれら配列を適当な宿主に
おいて高収率で発現させてB G Hの成長促進性の生
物学的活性を示すポリペプチドを多量に効率的かつ経済
的に生産させることによシ上バピの問題を解決する3、
シたがつ゛C5本発明によれば、BGHの活性を示すポ
リペプチドを、牛の成長速度および肉生産を増太さぜる
各種の用途に使用するため多1辻にq++ることか初め
て可能になる。
るDNA配列を供給し、かつこれら配列を適当な宿主に
おいて高収率で発現させてB G Hの成長促進性の生
物学的活性を示すポリペプチドを多量に効率的かつ経済
的に生産させることによシ上バピの問題を解決する3、
シたがつ゛C5本発明によれば、BGHの活性を示すポ
リペプチドを、牛の成長速度および肉生産を増太さぜる
各種の用途に使用するため多1辻にq++ることか初め
て可能になる。
以下の記載から判るように、本発明の所用、なりNAA
配列よび組換DNA分子は、適当な宿主において牛成侵
ホルモン状ポリペグチド、すなわちB G )fの成長
促進性の生物学的活性勿示す新規なポリペプチドを多量
に生産さぜることに向けることができる、。
配列よび組換DNA分子は、適当な宿主において牛成侵
ホルモン状ポリペグチド、すなわちB G )fの成長
促進性の生物学的活性勿示す新規なポリペプチドを多量
に生産さぜることに向けることができる、。
本発明の新規なポリペプチドは、宿主中で生産されたま
までも或いは向導化させもしくは改善させた後にも牛の
成長速晟および肉生産を改善する組成物および方法Vこ
有用である。
までも或いは向導化させもしくは改善させた後にも牛の
成長速晟および肉生産を改善する組成物および方法Vこ
有用である。
したがって、上記から判るように、本発明の基礎的局面
はBGMの成長促進性の生物学的活性を示すポリペプチ
ドを暗月化するDNA配列の製造であシ、このIJNA
配列は成熟牛成長ホルモンを暗号化するDNA配列から
アミノ禾S/、”i4基を削除したことを特徴とし、さ
らにゴN轟な宿主および発現ベクターにおいて、このM
の発現に従来使用された成熟牛成長ホルモンを暗号化す
るD N A配列よりも少なくとも約ioo倍高い収率
、好ましくは少なくとも約1000倍商い収率で前記B
G H状の生成’4i7Iを生産することができる。
はBGMの成長促進性の生物学的活性を示すポリペプチ
ドを暗月化するDNA配列の製造であシ、このIJNA
配列は成熟牛成長ホルモンを暗号化するDNA配列から
アミノ禾S/、”i4基を削除したことを特徴とし、さ
らにゴN轟な宿主および発現ベクターにおいて、このM
の発現に従来使用された成熟牛成長ホルモンを暗号化す
るD N A配列よりも少なくとも約ioo倍高い収率
、好ましくは少なくとも約1000倍商い収率で前記B
G H状の生成’4i7Iを生産することができる。
このaLのIJNA配列は、たとえは、pB04(−Δ
p、、pBG)I−Δ9 、 p B G11−2g(
SarバpBGH−Δり(Ser) のD N A
挿入物、ならびに成熟中成長ポルモンを亀も化するL)
NA配ダ1jからアミン末端基が削除されたその他D
N A 挿入物よりなる群から選択されたDNA挿入物
からなシ* niJ記押入物は成熟牛成長ホルモンを暗
号化するDNA配列よりも少なくともioo倍高い収率
で牛成長ホルモン状ポリペプチドの生産を可能にする。
p、、pBG)I−Δ9 、 p B G11−2g(
SarバpBGH−Δり(Ser) のD N A
挿入物、ならびに成熟中成長ポルモンを亀も化するL)
NA配ダ1jからアミン末端基が削除されたその他D
N A 挿入物よりなる群から選択されたDNA挿入物
からなシ* niJ記押入物は成熟牛成長ホルモンを暗
号化するDNA配列よりも少なくともioo倍高い収率
で牛成長ホルモン状ポリペプチドの生産を可能にする。
ここに記載する本発明をよシ一層充分に理解するため以
下さらに説明する。
下さらに説明する。
本明細書において次の用語を使用する:ヌクレオチド:
糖成分(ペントース)と燐酸塩と蟹累含有複素環式塩
基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマ一単位。こ
の塩基はグリコシド炭素(ペントースの/′炭素)を介
して糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌクレ
オシドと呼ぶ。各ヌクレオシドはその塩基を特徴とする
。4taのDNA地基はアデュ。
糖成分(ペントース)と燐酸塩と蟹累含有複素環式塩
基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマ一単位。こ
の塩基はグリコシド炭素(ペントースの/′炭素)を介
して糖成分に結合される。塩基と糖との組合せをヌクレ
オシドと呼ぶ。各ヌクレオシドはその塩基を特徴とする
。4taのDNA地基はアデュ。
([−1)、グアニン(「G」)、シトシン(rCJ
)およびチミン(ITJ )である。グ種のRNA塩基
はA、G、Cおよびウラシル(rUj )である。
)およびチミン(ITJ )である。グ種のRNA塩基
はA、G、Cおよびウラシル(rUj )である。
DNA配列: 隣接するペントースの3′およびj′炭
素間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチドの線状列。
素間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチドの線状列。
コドン: mRNAを介してアミノ酸翻訳開始信号ま
たは翻訳停止信号を暗号化する3個のヌクレオチド(ト
リプレット)のDNA配夕1几たとえは、ヌクレオチド
トリルレットTTA。
たは翻訳停止信号を暗号化する3個のヌクレオチド(ト
リプレット)のDNA配夕1几たとえは、ヌクレオチド
トリルレットTTA。
T’rG、CTT、CTC,CTAおよびCTGはアミ
ノ酸ロイシフ ([Leu J )を暗号化し、TAG
。
ノ酸ロイシフ ([Leu J )を暗号化し、TAG
。
TAAおよびTGAは翻訳停止信号であり、かつATO
は翻訳開始信号である。
は翻訳開始信号である。
読 枠: mRNAをアミノ酸配列まで翻訳する際の
コドンの群。翻訳の際、適切な読枠を維持しなければな
らない。たとえば、配列GCTGGTTGTAAGは3
つの読枠もしくは相に翻訳することができ、そのそれぞ
れは次の異なるアミノ酸配列を与える: OCT GG’r TGT AAG、=AIa−Gly
−eys−LysG CTG GTT G’rA AG
=−L、eu−Val −V’alGCTGG T
TG TAA G ・−−1’rp−Leu
−(イ’x写1:)ポリペプチド:rs接するアミノ酸
のα−アミン基とカルボキシル基との間のペプチド結合
によシ互いに結合され/こアミノ酸の腺状列。
コドンの群。翻訳の際、適切な読枠を維持しなければな
らない。たとえば、配列GCTGGTTGTAAGは3
つの読枠もしくは相に翻訳することができ、そのそれぞ
れは次の異なるアミノ酸配列を与える: OCT GG’r TGT AAG、=AIa−Gly
−eys−LysG CTG GTT G’rA AG
=−L、eu−Val −V’alGCTGG T
TG TAA G ・−−1’rp−Leu
−(イ’x写1:)ポリペプチド:rs接するアミノ酸
のα−アミン基とカルボキシル基との間のペプチド結合
によシ互いに結合され/こアミノ酸の腺状列。
ゲノム: 細胞もしくはウィルスの全DNA0これは特
に生物のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにた
とえはシャイ/−ダルガルノ配列のような配列を包含す
るオペレータ、プロモータ2よびリボンーム結合性およ
び相互反応性の配列を包含する。
に生物のポリペプチドを暗号化する遺伝子、ならびにた
とえはシャイ/−ダルガルノ配列のような配列を包含す
るオペレータ、プロモータ2よびリボンーム結合性およ
び相互反応性の配列を包含する。
遺伝子: 雛型もしくはメツセンジャーRNA(しnR
NAJ ) を介して%異的ポリペプチドに特性的な
アミノ酸の配列を暗号化するDNA配列。
NAJ ) を介して%異的ポリペプチドに特性的な
アミノ酸の配列を暗号化するDNA配列。
転 写: mRNAを遺伝子から生成する過程。
翻 訳: ポリペプチドをmRNAから生成する過程。
発 現: ポリペプチドを生成させるようDNA配列ま
たは遺伝子により受ける過程。これは、転写と翻訳との
組合せである。
たは遺伝子により受ける過程。これは、転写と翻訳との
組合せである。
グラスミド: 7ラスミドが宿主細胞において複製され
るような完全「レプリコン」からなる非架色体二恵鎖D
NA配列。プラスミドを単細胞生物に入れると、この生
物のtrj性はグラスミドのDNAの結果として変化さ
れ、或いは形質転換される。たとえば、テトラサイクリ
ン削性(TetR)に対する遺伝子を有するグラスミド
はデトラサイクリ/に対し予め感受性であった細胞を、
ナト2サイクリンに対し耐性の細胞へ形質転換さぜる。
るような完全「レプリコン」からなる非架色体二恵鎖D
NA配列。プラスミドを単細胞生物に入れると、この生
物のtrj性はグラスミドのDNAの結果として変化さ
れ、或いは形質転換される。たとえば、テトラサイクリ
ン削性(TetR)に対する遺伝子を有するグラスミド
はデトラサイクリ/に対し予め感受性であった細胞を、
ナト2サイクリンに対し耐性の細胞へ形質転換さぜる。
プラスミドにより形質転換された細胞を「形質転換体」
と呼ぶ。
と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ:その多くが蛋白質
エンペロブもしくは被往蛋白質中にカプセル化されたD
NA配列(「カプシド」)、lt)なる細菌性ウィルス
。
エンペロブもしくは被往蛋白質中にカプセル化されたD
NA配列(「カプシド」)、lt)なる細菌性ウィルス
。
クローン化ベヒクル:DNA配列を、たとえば複製、被
覆蛋白質の生成のようなり NAの本質的な生物学的機
能の喪失、或いはプロモータもしくは結合部位の喪矢を
伴わずに決定OI能に切断しうる7個もしくは少数のエ
ンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とする宿主において複
製しうるグラスミド、ンアージDNA″!、たけその他
のDNA配列であって、これは形質転侯憾れた細胞の同
定に使用するのに適した標識、たとえばテトラサイクリ
ン耐性またはアンピシリン剛性を含む。クローン化ベヒ
クルをしばしはベクターと呼ぶ。
覆蛋白質の生成のようなり NAの本質的な生物学的機
能の喪失、或いはプロモータもしくは結合部位の喪矢を
伴わずに決定OI能に切断しうる7個もしくは少数のエ
ンドヌクレアーゼ識別部位を特徴とする宿主において複
製しうるグラスミド、ンアージDNA″!、たけその他
のDNA配列であって、これは形質転侯憾れた細胞の同
定に使用するのに適した標識、たとえばテトラサイクリ
ン耐性またはアンピシリン剛性を含む。クローン化ベヒ
クルをしばしはベクターと呼ぶ。
クローン化: 無性繁殖によシ生物の集落まスi:はこ
れら生物の7種もしくは配列から生ずるDNA配列を得
る過程。
れら生物の7種もしくは配列から生ずるDNA配列を得
る過程。
組換DNA分子またはヒフリドDNA:生細胞の外部で
端部結合され、かつ成る種の宿主細胞に感染する能力t
−iすると共にそこに維持される異なるゲノムからのD
NA断片よりなる分子。
端部結合され、かつ成る種の宿主細胞に感染する能力t
−iすると共にそこに維持される異なるゲノムからのD
NA断片よりなる分子。
発現制御配列二 作用結合された際、DNA配列または
遺伝子の発現を制御かつ調整するヌクレオチドの配列。
遺伝子の発現を制御かつ調整するヌクレオチドの配列。
これらは摩糸、υ上糸、7アージヌの主要オペレータお
よびプロモータ領域、fd被後後蛋白質制御鎖酸、なら
びに原始核もしくは成熟核細胞およびそのウィルスの遺
伝子の発現を制御することが知られたその他の配列また
はその組合せを包含する。
よびプロモータ領域、fd被後後蛋白質制御鎖酸、なら
びに原始核もしくは成熟核細胞およびそのウィルスの遺
伝子の発現を制御することが知られたその他の配列また
はその組合せを包含する。
BGM: 牛成長ホルモン。
B G 11状ポリベグチド:BGnの成長促進性の生
物学的活性を示すポリペプチド。
物学的活性を示すポリペプチド。
第7図は、牛成長ホルモンを暗号化するDNA配列を有
することを特徴とする組換DNA分子の製造方法におけ
る1例の略図を示している。
することを特徴とする組換DNA分子の製造方法におけ
る1例の略図を示している。
組織を塩化グアニジンで抽出しかっこの抽出物をオリゴ
dT−カラムでクロマトグラフにかけることにより、牛
の脳下垂体腺がら牛成長ホルモンを暗号化するRNAを
単離した〔エッチ・グツトマンおよびアール・マクドナ
ルド、メソッド・イン・エッチモロジー・レコンピナン
トDNA、アール・ウー編、第41巻、第7j〜♂り貝
(/り7り);エッチ−アビプおよびピー・レダー、P
roo、Natl、Acad、 Sci、 usA、
JT、6り巻、f、/4101〜/J負(/P72)J
、次いで、得られたホIJA+RNAを等速面糖#度勾
配(10−,20係)で寸法分ii!ii した〔ブエ
ル等。
dT−カラムでクロマトグラフにかけることにより、牛
の脳下垂体腺がら牛成長ホルモンを暗号化するRNAを
単離した〔エッチ・グツトマンおよびアール・マクドナ
ルド、メソッド・イン・エッチモロジー・レコンピナン
トDNA、アール・ウー編、第41巻、第7j〜♂り貝
(/り7り);エッチ−アビプおよびピー・レダー、P
roo、Natl、Acad、 Sci、 usA、
JT、6り巻、f、/4101〜/J負(/P72)J
、次いで、得られたホIJA+RNAを等速面糖#度勾
配(10−,20係)で寸法分ii!ii した〔ブエ
ル等。
ジャーナル・バイオロジカル・り“ミスドリー、第、2
33巻、第2グア/〜g、2頁(/り7g);ライケン
ス等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
2!3巻、第、2グざ3〜りj負(/り7gン〕。
33巻、第2グア/〜g、2頁(/り7g);ライケン
ス等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
2!3巻、第、2グざ3〜りj負(/り7gン〕。
牛成長ホルモンを暗号化するメツセージを含む寸法分画
されたボIJARNAを逆転写用の雛型として使用し〔
うさぎ網様細胞を含まない翻訳系分析(エッチ・ペルハ
ムおよびアール・ジャクソン、ヨーロピアン・ジャーナ
ルeバイオケミストリー、第67巻、第2弘7号(/P
7Q)によシ決定〕、それによシ単−鎖c D N A
を調製して、とのcDNAをプエル(上記)およびライ
ケンス(上記)に実質的に記載されたように二重鎖にし
た。
されたボIJARNAを逆転写用の雛型として使用し〔
うさぎ網様細胞を含まない翻訳系分析(エッチ・ペルハ
ムおよびアール・ジャクソン、ヨーロピアン・ジャーナ
ルeバイオケミストリー、第67巻、第2弘7号(/P
7Q)によシ決定〕、それによシ単−鎖c D N A
を調製して、とのcDNAをプエル(上記)およびライ
ケンス(上記)に実質的に記載されたように二重鎖にし
た。
この二重鎖a D N AをS/ヌクレアーゼで処理し
てヘアピン構造を開いた後、末端トランスフエラー−@
によ5 dc末端をc D N Aに付加さぜた〔アー
ル・ロイコウドバリー等、ヌクレイツク・アシッド・リ
サーチ%M3巻、第10/〜/乙頁(/り76)〕。次
いで、dC処理されたc DNA f Pす1で線状化
されかつdG処理されたPBR3,22へ挿入し、再現
化された組換DNA分子によシイ−・コリに/2 HB
10/を形質転換させた〔キュツバ−等、ネイチャー誌
、第、2♂/巻、@!!jS−J夕頁(/り♂/);プ
エル等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第2j≠巻、第タコ77〜13頁(/り7り)〕。
てヘアピン構造を開いた後、末端トランスフエラー−@
によ5 dc末端をc D N Aに付加さぜた〔アー
ル・ロイコウドバリー等、ヌクレイツク・アシッド・リ
サーチ%M3巻、第10/〜/乙頁(/り76)〕。次
いで、dC処理されたc DNA f Pす1で線状化
されかつdG処理されたPBR3,22へ挿入し、再現
化された組換DNA分子によシイ−・コリに/2 HB
10/を形質転換させた〔キュツバ−等、ネイチャー誌
、第、2♂/巻、@!!jS−J夕頁(/り♂/);プ
エル等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第2j≠巻、第タコ77〜13頁(/り7り)〕。
BGH関連のDNA挿入物を有するようなりローンを選
択するため、制限エンドヌクレアーゼBstN/を用い
かつ標準的な制限条件および緩衝剤を使用してクローン
の保存物を選別した[ / 、t 1ift/’mlテ
トラサイクリンを含有する培地で増殖]。BGMにつき
報告されたDNA配列は独特なりstN/部位を翁する
ので、この選別方法は長いBGHII連配列を含有する
2@のクローンをこれら配列を含まない他の多くの保存
クローンから選別することを可能にした。
択するため、制限エンドヌクレアーゼBstN/を用い
かつ標準的な制限条件および緩衝剤を使用してクローン
の保存物を選別した[ / 、t 1ift/’mlテ
トラサイクリンを含有する培地で増殖]。BGMにつき
報告されたDNA配列は独特なりstN/部位を翁する
ので、この選別方法は長いBGHII連配列を含有する
2@のクローンをこれら配列を含まない他の多くの保存
クローンから選別することを可能にした。
選別された。2種のクローンの組換DNA分子を、BG
H10J’およびpBGH,2コOと呼ぶ。
H10J’およびpBGH,2コOと呼ぶ。
pBGHlorを多量に単離し〔アール・ディー拳クラ
イン等、プラスミド、第3巻、第ざg〜り7頁(/り”
)Lそのヌクレオチド配列を決定した〔マギサムおよび
ギルバー) 、 Proc。
イン等、プラスミド、第3巻、第ざg〜り7頁(/り”
)Lそのヌクレオチド配列を決定した〔マギサムおよび
ギルバー) 、 Proc。
Na t 1.Acad、 Se i、U S A、第
7≠巻、第、3′60〜67頁(/り77)〕。この配
列およびその対応するアミノ酸配列を第2図に示す。こ
のアミノ酸配列はBGHにつき従来報告された配列〔デ
イポツフ(上記);ワリス(上記)〕と一致するが、た
だしアミノ酸≠7および&Jが異なる。
7≠巻、第、3′60〜67頁(/り77)〕。この配
列およびその対応するアミノ酸配列を第2図に示す。こ
のアミノ酸配列はBGHにつき従来報告された配列〔デ
イポツフ(上記);ワリス(上記)〕と一致するが、た
だしアミノ酸≠7および&Jが異なる。
ヌクレオチド配列は1位置/77、.24tOおよび弘
j1.を以外はBGMを暗号化するDNAにつき従来報
告された配列〔ミラー(上記)Jと一致する。
j1.を以外はBGMを暗号化するDNAにつき従来報
告された配列〔ミラー(上記)Jと一致する。
位置/77および、2グOの相違はアミノ酸変化をもた
らさず、t、tS弘における相違はアミノ酸変化をもた
らす。後者の変化は、この位置において従来報告された
異質性〔ワリス(上記)〕と一致する。
らさず、t、tS弘における相違はアミノ酸変化をもた
らす。後者の変化は、この位置において従来報告された
異質性〔ワリス(上記)〕と一致する。
第2図および第3図に示したように、pBGHlorの
挿入物のDNA配列は牛プレ成長ホルモンの推定信号配
列における。26個のアミノ酸の、23個および牛成長
ホルモンの/り/偶のアミノ酸を暗号化する。さらに、
このDNA配列は、BGMの3′未翻訳末端からの6j
個のヌクレオチドを含有する(第3図)。
挿入物のDNA配列は牛プレ成長ホルモンの推定信号配
列における。26個のアミノ酸の、23個および牛成長
ホルモンの/り/偶のアミノ酸を暗号化する。さらに、
このDNA配列は、BGMの3′未翻訳末端からの6j
個のヌクレオチドを含有する(第3図)。
牛成長ホルモンを暗号化するI)NA配列の発現
p B G H/ Ogを使用して、牛成長ホルモンの
lり7個のアミノ酸を暗号化するDNA配列を坩離し、
かつこの配列を有する各種の発現ベクターを作成してA
TG翻訳開始信号へ直接に融合さぜ、そして各種発現制
御配列の制御下で種々のイー・コリ宿主菌株においてf
−mOt −BGH(アミノ末端にメチオニンを有する
BG、[lの/り7個のアミノ酸)の合成レベルを分析
した。
lり7個のアミノ酸を暗号化するDNA配列を坩離し、
かつこの配列を有する各種の発現ベクターを作成してA
TG翻訳開始信号へ直接に融合さぜ、そして各種発現制
御配列の制御下で種々のイー・コリ宿主菌株においてf
−mOt −BGH(アミノ末端にメチオニンを有する
BG、[lの/り7個のアミノ酸)の合成レベルを分析
した。
これら構成および合成の結果を下記に示す:trp
O,00/ !O
PL θ、θ/ 〜/θ0
θこれら収量から、成熟牛成長ホルモンを暗号化するD
NA配列の開始部へATG開始コドンを単に挿入した構
成はイー・コリにおいて有益量のBGHを合成しえない
と結論された。
O,00/ !O
PL θ、θ/ 〜/θ0
θこれら収量から、成熟牛成長ホルモンを暗号化するD
NA配列の開始部へATG開始コドンを単に挿入した構
成はイー・コリにおいて有益量のBGHを合成しえない
と結論された。
さらに、ATG9il始コドンと成熟牛成長ホルモンの
最初のアミノffl (Ala )を暗号化するGCC
との間に牛プレ成長ホルモンの5個のアミノ酸(M、2
図においてアミノ酸−/〜−りを有する種々の発現ベク
ターを作成した。、これらの構成はBGMの/り1個の
アミノ酸を有する生成物の合成をもたらし、そのうち6
個のアミノ酸がそのアミン末端に融合されている(メチ
オニン十BGHのプレ配列からのj個のアミノ酸)。
最初のアミノffl (Ala )を暗号化するGCC
との間に牛プレ成長ホルモンの5個のアミノ酸(M、2
図においてアミノ酸−/〜−りを有する種々の発現ベク
ターを作成した。、これらの構成はBGMの/り1個の
アミノ酸を有する生成物の合成をもたらし、そのうち6
個のアミノ酸がそのアミン末端に融合されている(メチ
オニン十BGHのプレ配列からのj個のアミノ酸)。
これら構成および合成の結果を下記に示す:trp
O10/ !00pL
o、θ/ /θθOこれらの
結果から、特定構造の発現制御配列とATG開始コドン
との間の間隔ケ単に変化させても発現レベルを太し7て
改善しないと結論された。さらに、開始コドンと成熟牛
成長ホルモンの最初のアミノ酸との間の間隔を変化させ
ても有益でないと結論された。
O10/ !00pL
o、θ/ /θθOこれらの
結果から、特定構造の発現制御配列とATG開始コドン
との間の間隔ケ単に変化させても発現レベルを太し7て
改善しないと結論された。さらに、開始コドンと成熟牛
成長ホルモンの最初のアミノ酸との間の間隔を変化させ
ても有益でないと結論された。
次いで、上記のPL制御された構成における多数の改変
を行なって発現ベクターにおけるBGH暗号化配列とシ
ャイン・タールガルノ配列との間の間隔を短縮させ、こ
のベクターのシャイン・タールガルノ配列を有するタタ
ヌクレオチド断片(mμ)における削除によりグロモー
タ効率を増大させ、BGH暗号化配列の未翻訳3′dC
末端を除去し、かつ形質転換宿主のンラスミドコピー数
を増加させた。
を行なって発現ベクターにおけるBGH暗号化配列とシ
ャイン・タールガルノ配列との間の間隔を短縮させ、こ
のベクターのシャイン・タールガルノ配列を有するタタ
ヌクレオチド断片(mμ)における削除によりグロモー
タ効率を増大させ、BGH暗号化配列の未翻訳3′dC
末端を除去し、かつ形質転換宿主のンラスミドコピー数
を増加させた。
しかしながら、これら改変のいずれも、これらベクター
によシ形質転換された宿主においてBGMの発現レベル
に対し顕著に影響を与えなかった。したがって、BGH
暗号化配列はイー・コリにおける高レベルの発現を妨り
゛る幾つかの固有の特性を有すると思われる。′ 特定の理論に拘束されるものではないが、これらベクタ
ーにおけるBGM暗号化配列の低い発現レベルは、ベク
ターのシャイン・ダルガルノ配列(1il11もしくは
trp )の近傍のA / G−リッチな配列と、成熟
BGHに対する暗号化配列の開始部におけるT/C−l
7ツチな領域との結合によpもたらされると信じられる
。
によシ形質転換された宿主においてBGMの発現レベル
に対し顕著に影響を与えなかった。したがって、BGH
暗号化配列はイー・コリにおける高レベルの発現を妨り
゛る幾つかの固有の特性を有すると思われる。′ 特定の理論に拘束されるものではないが、これらベクタ
ーにおけるBGM暗号化配列の低い発現レベルは、ベク
ターのシャイン・ダルガルノ配列(1il11もしくは
trp )の近傍のA / G−リッチな配列と、成熟
BGHに対する暗号化配列の開始部におけるT/C−l
7ツチな領域との結合によpもたらされると信じられる
。
たとえば
mu 部位 AACTTAGGAGGGTTTTTtr
p部位 ACGTAAAAAGGG’l”ATCGBG
H部位 ATに GCCTTeCC人GCCATG i
’cc TTG 1’Cにの種の結合はATG開始コ
ドンを不明確にすると共に、適当な配列に対する9ボン
ームの良好な結合を妨げる。。
p部位 ACGTAAAAAGGG’l”ATCGBG
H部位 ATに GCCTTeCC人GCCATG i
’cc TTG 1’Cにの種の結合はATG開始コ
ドンを不明確にすると共に、適当な配列に対する9ボン
ームの良好な結合を妨げる。。
したがって、BGM暗号化配列の開始部におけるこれら
T/C−リッチな領域を変化させ。
T/C−リッチな領域を変化させ。
かくしてシャインーダルカルノ配列のA/G−リッチな
所要領域への結合を阻止することが提案される。
所要領域への結合を阻止することが提案される。
* 観察された合成の低レベルは、イー・コリにおける
BUHの分片tにより説明することはできない。何故な
ら、天然BGHはイー拳コリ細胞抽出物において安定で
あると思われるからである。
BUHの分片tにより説明することはできない。何故な
ら、天然BGHはイー拳コリ細胞抽出物において安定で
あると思われるからである。
木本本発明の理論に対する黒伺けとして、BGf(暗号
化配列をMS、2からのタタ例のアミノ酸を暗号化する
DNA配列に融合させて融合蛋白質として発現させた場
合、高レベルのBGH状ポリペプチドの発現が観察され
た。しかしながら、この種の融合蛋白質は牛の処理には
好適でない。何故なら、これに含まれる他のアミノ酸は
処理動物において免疫反応を誘発しつるからである。
化配列をMS、2からのタタ例のアミノ酸を暗号化する
DNA配列に融合させて融合蛋白質として発現させた場
合、高レベルのBGH状ポリペプチドの発現が観察され
た。しかしながら、この種の融合蛋白質は牛の処理には
好適でない。何故なら、これに含まれる他のアミノ酸は
処理動物において免疫反応を誘発しつるからである。
BGM暗号化配列のT/C−リッチな領域に彫物を与え
る/方法は、BGHIv号化配列の初ル1コドンにおけ
る突然変異を用いてT/ C−リッチな領域を改変させ
るが、これら領域によシ暗号化されるプミノ除全保J°
、−することである。
る/方法は、BGHIv号化配列の初ル1コドンにおけ
る突然変異を用いてT/ C−リッチな領域を改変させ
るが、これら領域によシ暗号化されるプミノ除全保J°
、−することである。
しかしながら、BGHの初期アミノ酸およびこれらを暗
号化する変性コドンを検討すれば一1’4Jるように、
初期コドンのT/C含荒は突然変異を保持するこの釉の
アミノ酸により顕著に影響を受けない。したがって、B
GH暗号化配列のこのT/C−リッチな領域におけるコ
ドンの幾つかを削除することに決斧した。
号化する変性コドンを検討すれば一1’4Jるように、
初期コドンのT/C含荒は突然変異を保持するこの釉の
アミノ酸により顕著に影響を受けない。したがって、B
GH暗号化配列のこのT/C−リッチな領域におけるコ
ドンの幾つかを削除することに決斧した。
第弘図は、適当な宿主において剥規なりGH状ポリペプ
チドを高収率で生産しうる本発明のDNA配列の作成方
法におりる7例を示している。
チドを高収率で生産しうる本発明のDNA配列の作成方
法におりる7例を示している。
10x旦1ndll緩衝液および10011tnのNt
sC1中においてNeo l (/λ年単位によシ37
℃にて10ttgのp BGH−(Met−Ala )
を30分間処理した。!μlのEDTA(0,λtM)
と/μlのリボヌクレアーゼとを加えることによシ反応
を停止させた。混合物を37℃で5分間加熱した彼、7
滴のフェノールを加えて混合物を振とうした。次いで、
線状化したDNA(HAjM(ビオラド社)におけるク
ロマトグラフィーによpfIl製しく / OmM ト
リス−HCI (pHI )、/mMEDTAによシ溶
出)かつDNA含有のピーク(4/−ooμ6)を保存
した。次いで、100μlのルリ31塩と/単位の、艷
すエ3/とを加え。
sC1中においてNeo l (/λ年単位によシ37
℃にて10ttgのp BGH−(Met−Ala )
を30分間処理した。!μlのEDTA(0,λtM)
と/μlのリボヌクレアーゼとを加えることによシ反応
を停止させた。混合物を37℃で5分間加熱した彼、7
滴のフェノールを加えて混合物を振とうした。次いで、
線状化したDNA(HAjM(ビオラド社)におけるク
ロマトグラフィーによpfIl製しく / OmM ト
リス−HCI (pHI )、/mMEDTAによシ溶
出)かつDNA含有のピーク(4/−ooμ6)を保存
した。次いで、100μlのルリ31塩と/単位の、艷
すエ3/とを加え。
混合物を30℃で培養して線状化DNAにおける削除物
を生成させた〔これについては、エヌ・パナヨタトスお
よびケー・トルオングによシ「予備選択塩基間における
DNA配列の特異的削除」、ヌクレイツク・アシッド優
リサーチ、第り巻、第jt7り〜ざg頁(/りJ’/)
に実質的に記載されているJ。jつの時間(to秒、、
2゜秒、30秒、≠j秒およびto秒)にてこの混合物
から100μlの試料を採取して、線状化DNAからの
各種の削除物を得た。
を生成させた〔これについては、エヌ・パナヨタトスお
よびケー・トルオングによシ「予備選択塩基間における
DNA配列の特異的削除」、ヌクレイツク・アシッド優
リサーチ、第り巻、第jt7り〜ざg頁(/りJ’/)
に実質的に記載されているJ。jつの時間(to秒、、
2゜秒、30秒、≠j秒およびto秒)にてこの混合物
から100μlの試料を採取して、線状化DNAからの
各種の削除物を得た。
フェノールの添加により各試料における削除反応を停止
させ、混合物を、230μlのフェノールで7回および
Q、!μEのエーテルで7回抽出した。DNA1EtO
Hで沈澱させ、そしてこれ全遠心分離により回収した(
ざOO(7rpm、♂min、 )。収量:各試料にお
いて10μs。
させ、混合物を、230μlのフェノールで7回および
Q、!μEのエーテルで7回抽出した。DNA1EtO
Hで沈澱させ、そしてこれ全遠心分離により回収した(
ざOO(7rpm、♂min、 )。収量:各試料にお
いて10μs。
p B GW −(b’iet −Ala )における
Ncol制限部位(CCATGG)はこのプラスミドに
おけるf−met BGHを暗号化するDNA配列の開
始近傍に位置するので(第弘図)、Ncolによる制限
およびル13/による線状化DNAの処理はBGMを暗
号化するDNA配列において各種の削除物をもたらし、
したがって標準BGMと比較して7個もしくはそれ以上
のアミン末端アミノ酸を喪失したBGH状ポリペプチド
を暗号化するDNA配列を生産する(第弘図)。
Ncol制限部位(CCATGG)はこのプラスミドに
おけるf−met BGHを暗号化するDNA配列の開
始近傍に位置するので(第弘図)、Ncolによる制限
およびル13/による線状化DNAの処理はBGMを暗
号化するDNA配列において各種の削除物をもたらし、
したがって標準BGMと比較して7個もしくはそれ以上
のアミン末端アミノ酸を喪失したBGH状ポリペプチド
を暗号化するDNA配列を生産する(第弘図)。
Tで終端するこれら削除物を選択するため(下記するよ
うにBGM暗号化配列の外部にHindl11部位が便
利に位置するために選択される)、エヌ・バナヨタトス
およO:クー3トルオング(上記)により記載した方法
を使用した。
うにBGM暗号化配列の外部にHindl11部位が便
利に位置するために選択される)、エヌ・バナヨタトス
およO:クー3トルオング(上記)により記載した方法
を使用した。
DNAを3グμlのH2O中に溶解させ、弘μlの/(
7X坦懸■緩衝液と20単位の坦郵mとを加え、混合物
を37℃で7時間培養した。
7X坦懸■緩衝液と20単位の坦郵mとを加え、混合物
を37℃で7時間培養した。
この制限反応は)Iind1部位において線状化DNA
の非BGH末端を切断した(第グ図)。
の非BGH末端を切断した(第グ図)。
次いで、DNAをjμlの/mMのdNTPおよび/μ
lのクレノー(/単位)と混合することによ5Hind
[1部位を充填し、混合物を37℃で75分間培養した
。充填されたDNAをアガロースゲル上で分画した後、
一つのバンドを観測した:すなわちDNAの小Hind
l断片に対応する100塩基対の小バンドおよびDNA
主要断片に相当する犬バンド(第グ図)。
lのクレノー(/単位)と混合することによ5Hind
[1部位を充填し、混合物を37℃で75分間培養した
。充填されたDNAをアガロースゲル上で分画した後、
一つのバンドを観測した:すなわちDNAの小Hind
l断片に対応する100塩基対の小バンドおよびDNA
主要断片に相当する犬バンド(第グ図)。
DNA主要断片をゲルから溶出させ、これをEtOHで
沈澱させ、かつ遠心分離(ざ000μlm♂min、
)によJDNAを回収した。第弘図に図示するように、
このDNA断片は一端部に充填14indlll制限部
位(AAGCT)を有すると共に、他端部には前記Ba
1J/処理により生成されたBGH暗号化配列における
各種の削除物の7つを有する。要するに、DNAの再環
化は、BGH暗号化配列における一艷已3/削除が′r
で終端するような場合にのみ再結合点においてHind
l11部位(AAGCTT)を再生する。したがって、
DNAを再結合させかつこれを再ひHindlllによ
り切断して所望T−末端削除物を選択した(第弘図)。
沈澱させ、かつ遠心分離(ざ000μlm♂min、
)によJDNAを回収した。第弘図に図示するように、
このDNA断片は一端部に充填14indlll制限部
位(AAGCT)を有すると共に、他端部には前記Ba
1J/処理により生成されたBGH暗号化配列における
各種の削除物の7つを有する。要するに、DNAの再環
化は、BGH暗号化配列における一艷已3/削除が′r
で終端するような場合にのみ再結合点においてHind
l11部位(AAGCTT)を再生する。したがって、
DNAを再結合させかつこれを再ひHindlllによ
り切断して所望T−末端削除物を選択した(第弘図)。
このDNAを再環化させるため、上記からのEtOH沈
澱物f:33ttlのH2O中に溶解させ。
澱物f:33ttlのH2O中に溶解させ。
この溶液をμμlの10×結合用塩および、2μlのT
弘DNAリガーゼと合し、そして混合物を/4t℃にて
76時間培養した〔これについては。
弘DNAリガーゼと合し、そして混合物を/4t℃にて
76時間培養した〔これについては。
エヌ・パナヨタトスおよびケー幸トルオンク、(上記)
により実質的に記載されている〕。次いで、混合物を7
0℃にて75分間加熱することによシ反応を停止させ、
上記と同様にDNAを単離した。
により実質的に記載されている〕。次いで、混合物を7
0℃にて75分間加熱することによシ反応を停止させ、
上記と同様にDNAを単離した。
所望の削除を有するDNA断片(すなわちTに終端する
もの〕を単離するため、上記からの占用化されたD N
A Ja:Hind lおよび貼二f(lにより制限
した。、第弘図に示したように、この制限は削除されf
cB G H暗号化配列kMするDNA断片の選択を可
能にする。、シたがって、DNAをjμlの/ Ox
Hind l緩似1液中に浴JMさせ1.20単位の央
列11とλQ年単位抑HIとを加え、そしてこの混合物
を37℃で60分間培養した。処理の後、この混合物を
アクリルアミドゲル上で分画し、このゲルから所望DN
Aのget塩基対断片を溶出させ、これをEtOf(で
沈澱させ、かつ遠心分離により上記と同様に回収した。
もの〕を単離するため、上記からの占用化されたD N
A Ja:Hind lおよび貼二f(lにより制限
した。、第弘図に示したように、この制限は削除されf
cB G H暗号化配列kMするDNA断片の選択を可
能にする。、シたがって、DNAをjμlの/ Ox
Hind l緩似1液中に浴JMさせ1.20単位の央
列11とλQ年単位抑HIとを加え、そしてこの混合物
を37℃で60分間培養した。処理の後、この混合物を
アクリルアミドゲル上で分画し、このゲルから所望DN
Aのget塩基対断片を溶出させ、これをEtOf(で
沈澱させ、かつ遠心分離により上記と同様に回収した。
この断片(/ストランド)は一端部にTを有し、これは
B G M暗号化配列において川3/での処理によジ行
なった特定削除の末端を示し、さらに他端部にはBam
HI開裂残基を有し、これはBG)l階上化配列のC0
OH末端を越えて位置する。各種の削除物(すなわち、
このTにおいて削除は停止する)のヌクレオチド配列を
決定するため、DNA1iotttのlI20に溶解さ
せ、O9/μgの復列lll−沖HI処理されたpBR
J、2.2(/μt)と八λμlの10×結合用緩衝液
とO9jμlOTグI) N Aリガーゼとを加えるこ
とによりとHI−町閃■断片を復剪111−独1(1線
状化p B R3,22中に挿入し、そしてこの混合物
を/4”Cにて/G時間培養しグヒ。
B G M暗号化配列において川3/での処理によジ行
なった特定削除の末端を示し、さらに他端部にはBam
HI開裂残基を有し、これはBG)l階上化配列のC0
OH末端を越えて位置する。各種の削除物(すなわち、
このTにおいて削除は停止する)のヌクレオチド配列を
決定するため、DNA1iotttのlI20に溶解さ
せ、O9/μgの復列lll−沖HI処理されたpBR
J、2.2(/μt)と八λμlの10×結合用緩衝液
とO9jμlOTグI) N Aリガーゼとを加えるこ
とによりとHI−町閃■断片を復剪111−独1(1線
状化p B R3,22中に挿入し、そしてこの混合物
を/4”Cにて/G時間培養しグヒ。
結合を停止させた後1.200/llの競合イー・コリ
K12λ(ワルターのフイアースの寄贈)を10μlの
0./ M M9C12の存在下で形IJi1転換させ
、その際細胞を水中で75分間急冷し、グコ℃で2分間
培養しかつ室温で70分間培養した。、2MのL−培地
を加えた後、細胞を37℃にて7時間増殖させ1.20
0μlをsottg/ゴアンビシリンが補充されたL−
培地を含むベトリ皿へ接種した。集落を37℃にて/を
時間増殖させ、アンピシリンに耐性である。2弘種のク
ローンをこれら集落から任意に選択した。
K12λ(ワルターのフイアースの寄贈)を10μlの
0./ M M9C12の存在下で形IJi1転換させ
、その際細胞を水中で75分間急冷し、グコ℃で2分間
培養しかつ室温で70分間培養した。、2MのL−培地
を加えた後、細胞を37℃にて7時間増殖させ1.20
0μlをsottg/ゴアンビシリンが補充されたL−
培地を含むベトリ皿へ接種した。集落を37℃にて/を
時間増殖させ、アンピシリンに耐性である。2弘種のク
ローンをこれら集落から任意に選択した。
これらクローンのそれぞれの培養物をjθte(1/v
rlアンピシリンが補充されたL−培地!m)中で37
℃にて/、2時間増殖させ、細胞llからのプラスミド
I) N Aをクライン等(上記)により記載されたミ
ニ調製法によシ各培養物からftY製した。次いで、、
2L11iのノ“ラスミド1)NAにおけるハザ世Il
l −Bam )i I押入物を一曵劉111−Baユ
flI制限およびポリアクリルアミドゲル分画によって
寸法分画した。長押入物を有するり種のンラスミ)’
D N Aを選択し、これら挿入物の幾つかを配列決定
1/ 1その際Hindlll−り匹I断片を岸陥する
と共にマ今ザムおよびギルバート(上記)により記載さ
れた配列決定法を使用した。この配列決定は、押入物の
成るものは第2図においてヌクレオチド104t(T)
において開始しくすなわち、BGHのアミノtr:;
/−タに対する暗号化領域が削除されている)かつ挿入
物の他のものは第2図におけるヌクレオチドとり(T)
で開始する(すなわち、BGHのアミノ酸/−≠に対す
る暗号化領域が削除されている)ことを示した。
rlアンピシリンが補充されたL−培地!m)中で37
℃にて/、2時間増殖させ、細胞llからのプラスミド
I) N Aをクライン等(上記)により記載されたミ
ニ調製法によシ各培養物からftY製した。次いで、、
2L11iのノ“ラスミド1)NAにおけるハザ世Il
l −Bam )i I押入物を一曵劉111−Baユ
flI制限およびポリアクリルアミドゲル分画によって
寸法分画した。長押入物を有するり種のンラスミ)’
D N Aを選択し、これら挿入物の幾つかを配列決定
1/ 1その際Hindlll−り匹I断片を岸陥する
と共にマ今ザムおよびギルバート(上記)により記載さ
れた配列決定法を使用した。この配列決定は、押入物の
成るものは第2図においてヌクレオチド104t(T)
において開始しくすなわち、BGHのアミノtr:;
/−タに対する暗号化領域が削除されている)かつ挿入
物の他のものは第2図におけるヌクレオチドとり(T)
で開始する(すなわち、BGHのアミノ酸/−≠に対す
る暗号化領域が削除されている)ことを示した。
新規なりGH状ポリペプチドを高収率で生産第5図は、
新規なりGH状ポリベプグードを高収率で生産しうる本
発明のDNA配列を特徴とする発現ベクターの作成方法
の7例を示している。
新規なりGH状ポリベプグードを高収率で生産しうる本
発明のDNA配列を特徴とする発現ベクターの作成方法
の7例を示している。
上Hピコ種の削除物(ΔグおよびΔり)からのD N
A配列を発現させるため、DNA挿入物を7°ラスミド
DNAから単片(RL、その際プラスミドを前記と同様
に旦ind [1により切断し、前記と同様にHind
lll断片にクレノーを充填し、次いでDNAを前記し
た条件下で7θ単位の馬■HIにより切断した。次いで
、所望のBGH関連DNA断片を5%(It)ポリアク
リルアミドゲル上で精製した。この断片はlストランド
中においてそのBGH関連末端に配列AGCTTを有し
、このAGCTは坦す■部位の充填に由来し、かつ最終
Tは第2図のヌクレオチド101/l(Δり)であるか
または第2図のヌクレオチドgり(Δt)である。
A配列を発現させるため、DNA挿入物を7°ラスミド
DNAから単片(RL、その際プラスミドを前記と同様
に旦ind [1により切断し、前記と同様にHind
lll断片にクレノーを充填し、次いでDNAを前記し
た条件下で7θ単位の馬■HIにより切断した。次いで
、所望のBGH関連DNA断片を5%(It)ポリアク
リルアミドゲル上で精製した。この断片はlストランド
中においてそのBGH関連末端に配列AGCTTを有し
、このAGCTは坦す■部位の充填に由来し、かつ最終
Tは第2図のヌクレオチド101/l(Δり)であるか
または第2図のヌクレオチドgり(Δt)である。
このDNA配列を得るための発現ベクターを調装するた
め、上記で使用したと同一のベクターをpl、プロモー
タ(たとえばpBGH−(Met−Ala))の制御下
にぺ鵠IによってR4裂させてBGH配列を発現させ、
この断片にクレノーを充填しかつ慣用の条件および緩衝
液を使用してたメ状化DNA′fニジ偲H1により開裂
させた。
め、上記で使用したと同一のベクターをpl、プロモー
タ(たとえばpBGH−(Met−Ala))の制御下
にぺ鵠IによってR4裂させてBGH配列を発現させ、
この断片にクレノーを充填しかつ慣用の条件および緩衝
液を使用してたメ状化DNA′fニジ偲H1により開裂
させた。
この1ヶr片は/ストランドにおいて一端部に、μ巴1
部位の充填から生ずる配列CCA ’1’ Gを有し、
かつ他端部にはBamfLI開裂からの残部を南する(
第5図)。次いで、/μlの結合用緩衝液これを74t
℃にて76時間培養した。
部位の充填から生ずる配列CCA ’1’ Gを有し、
かつ他端部にはBamfLI開裂からの残部を南する(
第5図)。次いで、/μlの結合用緩衝液これを74t
℃にて76時間培養した。
との再環化け1.2f1!のベクターをそれぞれ生成し
た。一方のベクターにおいて、ATGで開始するヌクレ
オチド配列はATGAGCTTGであυ、それに続いて
第2図のBGH暗号化配列のアミノ酸2が存在する(p
BGHΔ47(Seす)(第5図)。他方のベクターに
おいて、ATGで開始するヌクレオチド配列はATGA
GCT1’Gであシ、それに続き第2図のBGH暗号化
配列のアミノ酸//が存在する(pBG)l−Δり(S
er))←第j図)。したがって、第1の作成において
、成熟BGHの最初のび個のアミノ酸に対する暗号化領
域が除去されておシ、コドンAGC(セリン)が挿入さ
れ、かつ成熟BGfiの第j番目のアミノ酸に対する暗
号化領域がATGからTTGまで改変されて、そのアミ
ノ酸をメチオニンからロイシンまで変化している。他の
作成、すなわち本発明の好適作成において、成熟BGM
の最初のり個のアミノ酸に対する暗号化領域が除去され
ておシ、コドンAGC(セリン)が挿入され、かつ成熟
BGHの第7θ番目のアミノ酸に対する暗号化領域がC
TGからTTGまで変化され、この変化はそのアミノ酸
(ロイシン)に影響を与えない。したがって、最初の作
成は成熟BGHの配列Met−8er−Leu−アミノ
酸6−/りlの蛋白質を発現し、かつ他方の作成は成熟
BGHの配列Met−8er〜アミノ酸ター/りlの蛋
白質を発現する筈である。したがって、こiL C)
2 糊のベクターをそれぞれpBGH−Δμ(Ser)
およびpBGH−Δり(Ser )と呼ぶ(第5図)。
た。一方のベクターにおいて、ATGで開始するヌクレ
オチド配列はATGAGCTTGであυ、それに続いて
第2図のBGH暗号化配列のアミノ酸2が存在する(p
BGHΔ47(Seす)(第5図)。他方のベクターに
おいて、ATGで開始するヌクレオチド配列はATGA
GCT1’Gであシ、それに続き第2図のBGH暗号化
配列のアミノ酸//が存在する(pBG)l−Δり(S
er))←第j図)。したがって、第1の作成において
、成熟BGHの最初のび個のアミノ酸に対する暗号化領
域が除去されておシ、コドンAGC(セリン)が挿入さ
れ、かつ成熟BGfiの第j番目のアミノ酸に対する暗
号化領域がATGからTTGまで改変されて、そのアミ
ノ酸をメチオニンからロイシンまで変化している。他の
作成、すなわち本発明の好適作成において、成熟BGM
の最初のり個のアミノ酸に対する暗号化領域が除去され
ておシ、コドンAGC(セリン)が挿入され、かつ成熟
BGHの第7θ番目のアミノ酸に対する暗号化領域がC
TGからTTGまで変化され、この変化はそのアミノ酸
(ロイシン)に影響を与えない。したがって、最初の作
成は成熟BGHの配列Met−8er−Leu−アミノ
酸6−/りlの蛋白質を発現し、かつ他方の作成は成熟
BGHの配列Met−8er〜アミノ酸ター/りlの蛋
白質を発現する筈である。したがって、こiL C)
2 糊のベクターをそれぞれpBGH−Δμ(Ser)
およびpBGH−Δり(Ser )と呼ぶ(第5図)。
* 勿論、f−matは発現の際に或いはそれに続いて
これらポリペプチドから除去されてBGHの式Ser
−Leu−AA6〜AA191およびBGHのSer
−AA9〜AAB+のポリペプチドをそれぞれ生成しう
ろことを了解すべきである。事実、その後のBGH−Δ
り(Ser)のアミノ酸配列決定は、f−metが発現
または精製の際に一裂されたことを示した。
これらポリペプチドから除去されてBGHの式Ser
−Leu−AA6〜AA191およびBGHのSer
−AA9〜AAB+のポリペプチドをそれぞれ生成しう
ろことを了解すべきである。事実、その後のBGH−Δ
り(Ser)のアミノ酸配列決定は、f−metが発現
または精製の際に一裂されたことを示した。
上記したようにイー・コリ■(/2λを形質転換させる
ために再環化フラスミドを使用し、この場合アンピシリ
ン耐性の集落を再び選択した。
ために再環化フラスミドを使用し、この場合アンピシリ
ン耐性の集落を再び選択した。
次いで、アンピシリン耐性クローン7.2種の培養物を
増殖させ、前記したようなミニ調製法によりプラスミド
DNAを単離し、かつ慣用の売件を使用して旦り■/以
碧R1制限によシ押入物を寸法分画した。寸法分画の結
果から、適当な挿入物を有するプラスミドDNAを選択
した。
増殖させ、前記したようなミニ調製法によりプラスミド
DNAを単離し、かつ慣用の売件を使用して旦り■/以
碧R1制限によシ押入物を寸法分画した。寸法分画の結
果から、適当な挿入物を有するプラスミドDNAを選択
した。
次いで、1)NAを使用してジー・エヌーブエル等、ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第、2j4
を巷、第2d72〜と3頁(/り7り)に実質的に記載
されているよう6cイー・コリMctotiを形質転換
させた。さしに、11 ti/ざよ7(タンリュー・フ
イアースの寄贈)によシ細胞を形りf転換させた。上8
Cのようにアンピシリンを補充しかつカナマイシン(4
10μg/m6)を補充したし一培地において集f&に
30パCにで、I乙時間増殖させることにより、B G
H関連のプラスミドD N Aおよびpc/f、t7
により形質転換した細胞を選択した。
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第、2j4
を巷、第2d72〜と3頁(/り7り)に実質的に記載
されているよう6cイー・コリMctotiを形質転換
させた。さしに、11 ti/ざよ7(タンリュー・フ
イアースの寄贈)によシ細胞を形りf転換させた。上8
Cのようにアンピシリンを補充しかつカナマイシン(4
10μg/m6)を補充したし一培地において集f&に
30パCにで、I乙時間増殖させることにより、B G
H関連のプラスミドD N Aおよびpc/f、t7
により形質転換した細胞を選択した。
次イテ、アンピシリンおよびカナマイシン剛性の集落を
任意に採取し、これらを上e4t2とllT1様にアン
ピシリンおよびカナマイシンが補充された一t1rIl
のL−培地において30℃で7晩増殖させた。この培養
物を261neのL−培地VrCよp≠λ℃で希釈し、
そしてこれら11昧1シをグlCにて2時間増殖さぜた
(0,1)、−/)。。
任意に採取し、これらを上e4t2とllT1様にアン
ピシリンおよびカナマイシンが補充された一t1rIl
のL−培地において30℃で7晩増殖させた。この培養
物を261neのL−培地VrCよp≠λ℃で希釈し、
そしてこれら11昧1シをグlCにて2時間増殖さぜた
(0,1)、−/)。。
形質転換された細胞により生成されるBGH状ポリペプ
チドを即離するため、imeの細胞を採取し、これらを
遠心分離しく 1000 rpm 、 411旧11
)、soμlのラメリ緩衝液(7%5DS)〔ラメリ、
洋イチャー誌、第、2.27巻、第6ざ/負以降(/り
70)〕を加え、混合物を11分間煮沸し、そして再び
細胞を遠心分離して(1000rpm 、 l/−mi
n ) 細胞残骸を除去した。うさぎ抗血清を用いるB
GMの放射線免疫分析によシ上澄腋を標徨!BGHに対
して分析した。′*1本11 C/ I j 7は、感
温PLリフレッサとカナマイシン耐性を暗号化する遺伝
子と4哨する小型プラスミドである。
チドを即離するため、imeの細胞を採取し、これらを
遠心分離しく 1000 rpm 、 411旧11
)、soμlのラメリ緩衝液(7%5DS)〔ラメリ、
洋イチャー誌、第、2.27巻、第6ざ/負以降(/り
70)〕を加え、混合物を11分間煮沸し、そして再び
細胞を遠心分離して(1000rpm 、 l/−mi
n ) 細胞残骸を除去した。うさぎ抗血清を用いるB
GMの放射線免疫分析によシ上澄腋を標徨!BGHに対
して分析した。′*1本11 C/ I j 7は、感
温PLリフレッサとカナマイシン耐性を暗号化する遺伝
子と4哨する小型プラスミドである。
*傘 これらは、成熟BGHを暗号化するDNA配列を
用いるBG)IのPl7−制御発現につき上記で使用し
たと同一の増殖争件である。
用いるBG)IのPl7−制御発現につき上記で使用し
たと同一の増殖争件である。
*オ傘 これは、成熟BGMを暗号化する1)NA配
列を使用するBGHのPl、制御発現につき上記で使用
したと同一の単離方法および分析である。
列を使用するBGHのPl、制御発現につき上記で使用
したと同一の単離方法および分析である。
次のB G H状ポリペプチドの発現レベルが得られた
: Δ!(Ser) 30.θ /J x /
0’Δり(Ser ) 100
JO×106さらに、成熟B G Hを暗号化する1)
NA配列衾使用してBGMを発現させるために上記で使
用したと同一のtrp含有ベクターにおいて、ΔII
(Ser )およびΔり(Ser)DNA配列を使用し
た。これら作成において次の発現レベルが得られた: ΔIt (Ser ) 0./! 10
00ΔY (Ser ) 0,30 J0
000最後に、これら作成物を処理して、肛す■1充填
により付加されたへ〇ccコドン(セリンを暗号化する
)をこれら作成物から削除した。
: Δ!(Ser) 30.θ /J x /
0’Δり(Ser ) 100
JO×106さらに、成熟B G Hを暗号化する1)
NA配列衾使用してBGMを発現させるために上記で使
用したと同一のtrp含有ベクターにおいて、ΔII
(Ser )およびΔり(Ser)DNA配列を使用し
た。これら作成において次の発現レベルが得られた: ΔIt (Ser ) 0./! 10
00ΔY (Ser ) 0,30 J0
000最後に、これら作成物を処理して、肛す■1充填
により付加されたへ〇ccコドン(セリンを暗号化する
)をこれら作成物から削除した。
AGC削除された作成物pBGH−Δ弘およびpBGH
−Δりは本発明の一層好適な作成物でろp、pBGH−
Δりが特に好適である。′ これら作成物を得るため、
上01のBGH関連配列のBindll1部位の充填を
改変して、dA’rPのみを混合物中に存在させた。こ
の改変は充填に際し単一のAのみを付加した(第を図)
。
−Δりは本発明の一層好適な作成物でろp、pBGH−
Δりが特に好適である。′ これら作成物を得るため、
上01のBGH関連配列のBindll1部位の充填を
改変して、dA’rPのみを混合物中に存在させた。こ
の改変は充填に際し単一のAのみを付加した(第を図)
。
次いで、反応混合物をsip衝液(3θmMNaOAc
(pH4’J )、30 mM NtsC! 、 3
mMZnC12)で70倍希釈し、λ単位/lip
DNAのS/を加え、そして混合物を37゛Cにて30
分間培養し、未充填DNAを開裂させた(第6図)。次
いで、フェノールにより反応を停止させ、前記と同様に
処理して十偲HIによりDNA断片を制限し、かつこれ
を所望の発現ベクター中へ押入した。これらベクターを
使用し、次の発現レベルが観察された: Δタ PL 10Q よx 1
06* これら作成物の発現に際し生成されるアミノ末
端f −Me t id ’、発現の際に或いはその後
にこれらBGM関連のポリペプチドから除去することが
できた。BGH−Δり(Ser)の実際のアミノ酸配列
に関する経験により、f’ −A4e tは発現または
精製の際に除去されることが期待される。
(pH4’J )、30 mM NtsC! 、 3
mMZnC12)で70倍希釈し、λ単位/lip
DNAのS/を加え、そして混合物を37゛Cにて30
分間培養し、未充填DNAを開裂させた(第6図)。次
いで、フェノールにより反応を停止させ、前記と同様に
処理して十偲HIによりDNA断片を制限し、かつこれ
を所望の発現ベクター中へ押入した。これらベクターを
使用し、次の発現レベルが観察された: Δタ PL 10Q よx 1
06* これら作成物の発現に際し生成されるアミノ末
端f −Me t id ’、発現の際に或いはその後
にこれらBGM関連のポリペプチドから除去することが
できた。BGH−Δり(Ser)の実際のアミノ酸配列
に関する経験により、f’ −A4e tは発現または
精製の際に除去されることが期待される。
さらに、本発明のΔ弘およびΔりのDNA配列ならびに
本発明の方法により作成されたBGH−Δ/’iPL制
御の下で使用して(’MJ記と同様、rnu−由来のリ
ボンーム結合部位を用いるン、各種のイー、・コリ宿主
を形質転換させ、発現レベルを比較した: 1、全ての宿主はpc/♂j7+)グレツサプラスミド
を有した。
本発明の方法により作成されたBGH−Δ/’iPL制
御の下で使用して(’MJ記と同様、rnu−由来のリ
ボンーム結合部位を用いるン、各種のイー、・コリ宿主
を形質転換させ、発現レベルを比較した: 1、全ての宿主はpc/♂j7+)グレツサプラスミド
を有した。
2、宿主の遺伝子型は次の通りである。:PR7: t
hr Ieu pnp thi rns malxal
mtl Sm” trA 6、振と9フラスコにおいて4tj ℃でコ時間誘発さ
せた後の細胞7個当シの分子数におけるHIA収率。
hr Ieu pnp thi rns malxal
mtl Sm” trA 6、振と9フラスコにおいて4tj ℃でコ時間誘発さ
せた後の細胞7個当シの分子数におけるHIA収率。
したがって、削除されi?:、B G H暗号化配列の
部分子、有するDNA配列およびそれを特徴とする組換
DNA分子は、牛成長ホルモン状ホリベプチドを高収率
で生産すること?!−1−i」能にし、その収率は同じ
発現ベクターにおいて成熟牛成長ホルモンを暗号化する
DNA配列よシも少なくとも700倍高く、好ましくは
それよシも1000倍商い。さらに、この種の削除は、
yL用方法を用いるfVll製の後に牛における一般的
同化作用剤として、特にこれら動物における成長速度、
体重増加および肉生産を増大させるのに有用な新規な牛
成長ホルモン状ポリベグチドの発現を可能にする。たと
えば、約20%の均質性まで精製した後、特に好適な両
様イー・コIJ MC106/(PL−mu−ΔターB
GH)により生成されるΔターBGHは、標準的ラッテ
のチヒア分析ニおいて天然BGHの成長促進性の約ざ。
部分子、有するDNA配列およびそれを特徴とする組換
DNA分子は、牛成長ホルモン状ホリベプチドを高収率
で生産すること?!−1−i」能にし、その収率は同じ
発現ベクターにおいて成熟牛成長ホルモンを暗号化する
DNA配列よシも少なくとも700倍高く、好ましくは
それよシも1000倍商い。さらに、この種の削除は、
yL用方法を用いるfVll製の後に牛における一般的
同化作用剤として、特にこれら動物における成長速度、
体重増加および肉生産を増大させるのに有用な新規な牛
成長ホルモン状ポリベグチドの発現を可能にする。たと
えば、約20%の均質性まで精製した後、特に好適な両
様イー・コIJ MC106/(PL−mu−ΔターB
GH)により生成されるΔターBGHは、標準的ラッテ
のチヒア分析ニおいて天然BGHの成長促進性の約ざ。
チを示した。
本発明のDNA配列におけるアミン末端蘭除の実際の程
度は、本発明および本発明によ・り得られる新規なりG
H状ポリペプチドの^収率に対し臨界的でない。例数な
ら、削除の程度は使用する発現制御配列または宿主に依
存しうるからである。寧ろ、アミン末端削除は、1)N
A配列が特定の宿主および発現ベクターにおいて、成熟
BGHを暗号化するDNA配列により生成されるよりも
少なくとも約100倍多い、よシ好ましくは少なくとも
約7000倍多い分子/細胞のBGH状ポリペプチドを
生産させるのに充分である。この種のDNA配列および
分析は、本発明の開示および実施例にしたがって当業者
には容易に実施することができる。したがって、この種
のDNA配列、これを含有する組換DNA分子、および
これにより生成される牛成長ボルモン状ポリベズチドは
本発明の一部を構成する。
度は、本発明および本発明によ・り得られる新規なりG
H状ポリペプチドの^収率に対し臨界的でない。例数な
ら、削除の程度は使用する発現制御配列または宿主に依
存しうるからである。寧ろ、アミン末端削除は、1)N
A配列が特定の宿主および発現ベクターにおいて、成熟
BGHを暗号化するDNA配列により生成されるよりも
少なくとも約100倍多い、よシ好ましくは少なくとも
約7000倍多い分子/細胞のBGH状ポリペプチドを
生産させるのに充分である。この種のDNA配列および
分析は、本発明の開示および実施例にしたがって当業者
には容易に実施することができる。したがって、この種
のDNA配列、これを含有する組換DNA分子、および
これにより生成される牛成長ボルモン状ポリベズチドは
本発明の一部を構成する。
本発明の削除を行なうのに使用する実際の方法も臨界的
でない。たとえば、μ已31を用いて削除を行ないかつ
Tで終端する削除を選択する実施例につき説明したが、
他の削除方法も本発明に使用することができる。これら
の方法は、BG)i暗号化配列を開裂させ、開裂された
配列の1部を合成断片で交換し、湛す3/で処理し、T
で終端するもの以外の削除を選択すること。
でない。たとえば、μ已31を用いて削除を行ないかつ
Tで終端する削除を選択する実施例につき説明したが、
他の削除方法も本発明に使用することができる。これら
の方法は、BG)i暗号化配列を開裂させ、開裂された
配列の1部を合成断片で交換し、湛す3/で処理し、T
で終端するもの以外の削除を選択すること。
または、2種の方法の組合せ或いは当条界で知られた他
の削除方法を包含する。
の削除方法を包含する。
勿論、本発明の新規なりNA配列を発現5させかつ本発
明の新規なポリペプチドを高収率で生産させるには、他
の宿主および発現1ベクターも使用しうることを了解す
べきである。これらの宿主は他の菌株のイー・コリ、な
らびにシュードモナス、ストレフトミセス、バチルス、
酵母およびその他の真菌類の菌株、ならびに8.1物性
および動物性細胞の培養物を包合する。ストレプトミセ
スが特に好適な宿主である。これら宿主において本発明
のDNA配列を発覗、芒せるには、これらDNA配列を
特定の選択Td主に対し適合性の発現ベクター、或いは
上記に使用したようなベクターに挿入する。
明の新規なポリペプチドを高収率で生産させるには、他
の宿主および発現1ベクターも使用しうることを了解す
べきである。これらの宿主は他の菌株のイー・コリ、な
らびにシュードモナス、ストレフトミセス、バチルス、
酵母およびその他の真菌類の菌株、ならびに8.1物性
および動物性細胞の培養物を包合する。ストレプトミセ
スが特に好適な宿主である。これら宿主において本発明
のDNA配列を発覗、芒せるには、これらDNA配列を
特定の選択Td主に対し適合性の発現ベクター、或いは
上記に使用したようなベクターに挿入する。
本発明の方法により作成された微生物および組換DNA
分子は、/りlr2年ざ月/乙日付でメリーランド州ロ
ックビル在のアメリカン−タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託され、かつ下記のBGM−A−Cとして同
定された培養物金側とする: A、 E、 coli K/、2λ(pBGH−(M
at−Ala) )IJ E、 coli K/、2
λ(pBGH−Δ4j(Ser))C,E、 ooli
K/2λ(pBGH−Δ9(Ser))これら培養物
にはそれぞれ寄託番号3り173゜3り/74/および
3り17jが付力された。
分子は、/りlr2年ざ月/乙日付でメリーランド州ロ
ックビル在のアメリカン−タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託され、かつ下記のBGM−A−Cとして同
定された培養物金側とする: A、 E、 coli K/、2λ(pBGH−(M
at−Ala) )IJ E、 coli K/、2
λ(pBGH−Δ4j(Ser))C,E、 ooli
K/2λ(pBGH−Δ9(Ser))これら培養物
にはそれぞれ寄託番号3り173゜3り/74/および
3り17jが付力された。
以上、本発明の多くの実施例につき説明したが、この基
本構成を改変して本発明の方法および組成物を使用しう
る他の具体例を提供しうろことも明らかであろう。した
がって、本発明の範囲はこれら特定実施例のみに限定さ
れないことが了解されよう。
本構成を改変して本発明の方法および組成物を使用しう
る他の具体例を提供しうろことも明らかであろう。した
がって、本発明の範囲はこれら特定実施例のみに限定さ
れないことが了解されよう。
牛成長ホルモン状ポリペプチドを高収率で製造するため
のDNA配列、組換DNA分子および製造方法、ならび
にそれによシ製造される新規なポリペプチドにつき上記
に説明した。これらポリペプチドは牛の成長速度、なら
びに牛における肉生産および品質を同上させるのに有用
である。
のDNA配列、組換DNA分子および製造方法、ならび
にそれによシ製造される新規なポリペプチドにつき上記
に説明した。これらポリペプチドは牛の成長速度、なら
びに牛における肉生産および品質を同上させるのに有用
である。
第7図はB G Hを暗号化する1)NA配列を特徴と
する組換DNA分子の製造方法の7例を示す略図であシ
、 第一図および第3図社中プレ成長ホルモンを暗号化し、
dG切断末端からdC切断開始部まで番号を伺した(ヌ
クレオチド7〜7/3)DNA挿入物のヌクレオチド配
列を示す配列図であり、この配列は推定牛プレ成長ホル
モン信号配列の、26個のアミノ酸のうち、2部個(ア
ミノ酸−23〜−l)と成熟牛成長ホルモンのアミノ酸
の/り7個(アミノ酸l〜/りl)とを含んでおり。 第V図は牛成長ポルモン暗号化領域のアミノ末端暗号化
端部が削除された本発明の1)NA配列の製造方法にお
ける7例を示す説明図であり。 第5図は本発明の新規な牛成長ホルモン状ポリペプチド
の高レベルの発現を可能にするDNA自己列を特徴とし
た本発明による発現1ベクターの製造方法の7例を示す
説明図であり。 第6図は本発明の新規な牛成長ホルモン状ポリペプチド
の高レベルの発現を可能にするIJNA配列を特徴とし
た本発明の発現ベクターの製造方法における他の具体例
を示す説明図である。 図面のl9書(内容に変更なし) cDNA Pβ(yHIO13 p86N22θ FIG。 各A曜1百り■孜 FIG、 6 −に2筺定饗饗お] Pθ6〃−Δ9第1頁の続き 9Int、 C1,3識別記号 庁内整理番号(C
I2 P 21102 CI2 R1/19 ) 676
0−48(C12N 15100 C12R1/19 ) 6760
−4B−f 沼に ネ市 j、E ’i”’7;’
(’、、I)1011〆拝II 、’+ 8 (1−/
/月zi−1特許庁長官 若杉 和 夫 1股 1、重性の表示 117(1] 58年特61願 第1411857 ’
=32、発明の名称 3、ン市11:を′4゛るンず 事+’lとの関係 特g’r+I!幀ノ、4、代
哩 人 6、袖山の内容
する組換DNA分子の製造方法の7例を示す略図であシ
、 第一図および第3図社中プレ成長ホルモンを暗号化し、
dG切断末端からdC切断開始部まで番号を伺した(ヌ
クレオチド7〜7/3)DNA挿入物のヌクレオチド配
列を示す配列図であり、この配列は推定牛プレ成長ホル
モン信号配列の、26個のアミノ酸のうち、2部個(ア
ミノ酸−23〜−l)と成熟牛成長ホルモンのアミノ酸
の/り7個(アミノ酸l〜/りl)とを含んでおり。 第V図は牛成長ポルモン暗号化領域のアミノ末端暗号化
端部が削除された本発明の1)NA配列の製造方法にお
ける7例を示す説明図であり。 第5図は本発明の新規な牛成長ホルモン状ポリペプチド
の高レベルの発現を可能にするDNA自己列を特徴とし
た本発明による発現1ベクターの製造方法の7例を示す
説明図であり。 第6図は本発明の新規な牛成長ホルモン状ポリペプチド
の高レベルの発現を可能にするIJNA配列を特徴とし
た本発明の発現ベクターの製造方法における他の具体例
を示す説明図である。 図面のl9書(内容に変更なし) cDNA Pβ(yHIO13 p86N22θ FIG。 各A曜1百り■孜 FIG、 6 −に2筺定饗饗お] Pθ6〃−Δ9第1頁の続き 9Int、 C1,3識別記号 庁内整理番号(C
I2 P 21102 CI2 R1/19 ) 676
0−48(C12N 15100 C12R1/19 ) 6760
−4B−f 沼に ネ市 j、E ’i”’7;’
(’、、I)1011〆拝II 、’+ 8 (1−/
/月zi−1特許庁長官 若杉 和 夫 1股 1、重性の表示 117(1] 58年特61願 第1411857 ’
=32、発明の名称 3、ン市11:を′4゛るンず 事+’lとの関係 特g’r+I!幀ノ、4、代
哩 人 6、袖山の内容
Claims (9)
- (1) 牛成長ホルモン状ポリペプチドを製造するに
際し、発現制御配列に作用結合されたnu記ポリペプチ
ドを暗号化するDNA配列からなる組換DNA分子によ
シ形質転換された宿主を培養し、前記DNA配列は成熟
中成長ホルモンを暗号化するDNA配列からアミン末端
を削除してなりかつ前記DNA配列は成熟中成長ホルモ
ンを暗号化するDNA配列よシも少なくとも100倍高
い収率で前記ポリペプチドを生産し、次いで1III記
ポリペプチドを回収することを特徴とする牛成長ホルモ
ン状ポリペプチドの製造方法。 - (2)DNA配列をpBGH−Δ/、pBGH−Δ弘p
B G H−Δりの牛成長ホルモン関連挿入物、なら
びに成熟中成長ホルモンを暗号化するDNA配列から7
ミノ末端が削除されかつ成熟中成長ホルモンを暗号化す
るI)NA配列よりも少なくともioo倍^い収率にて
牛成長ホルモン状ポリベグチドを生産さぜうるその他の
DNA挿入物よシなる群から選択することを特徴とする
特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (3) DNA配列は、成熟中成長ホルモンを暗号化
するDNA配列よシも少なくとも1000倍高い収率に
て牛成長ホルモン状ポリペプチドを生産させうろことを
特徴とする特許請求の範囲第1項または第2項記載の方
法。 - (4)牛成長ホルモン状ポリペプチドはBGHのMe
tPh c−AAS〜AA Ipl、BGHのF’he
−AA、+++AA、、、、BGHのMetSerLe
u −AA 6〜AA 19 +、BGHのSe r−
Leu−AA6〜AA191b BGHのMetLeu
−AA6〜AA1p、。 S e r −AA q〜AA I 91、BGHの5
er−AA9〜AAll、BGHのMe t −AA
? 〜AA 1. 、 、 BGilのAA9〜AA
+ 91 のポリペプチドならひにDNA配列により
、1Ilf号化されるポリペプチドよりなる群から選択
されs HiJ記DNA配列は成熟中成長ホルモンを暗
号化するL)NA配タリからアミノ末端が削除されかつ
成熟中成長ホルモンを暗号化するI) N A配列よシ
も少なくとも100倍高い収率にてrfiJ記ポリペグ
チドを生産しうろことを特徴とする特許請求の範囲第1
項乃至第3項のいずれかに記載の方法。 - (5)牛成長ホルモン状ポリペプチドを暗号化するDN
A配列と発現制御配列とからなシ、前記DNA配列は前
記発現制御配列に作用結合されかつ成熟中成長ホルモン
を暗号化するDNA配列からアミノ末端が削除されると
共に成熟中成長ホルモンを暗号化するDNA配列よシも
少なくとも100倍高い収率にて適当な宿主において前
記牛成長ホルモン状ポリペプチドを生産しうろことを特
徴とする組換DNA分子− - (6) p B GIl−Δ/、pBGH−ΔII(
Sor)、pBGH−ΔP、pBGH−Δり(Ser)
、pBGH−Δり、ならびに成熟中成長ホルモンを暗号
化するL)NA配列からアミノ末端が削除芒れかつ成熟
中成長ホルモンを暗号化するDNA配列よシも少なくと
も100倍高い収率にてn11記牛成長ホルモン状ポリ
ペプチドを生産しうるD N A挿入物を有する組換D
NA分子よルなる群から選択されることを特徴とする特
許請求の範囲第!項Re載の組換DNA分子。 - (7)発現制御配列が主系、す」系、ファージλの主要
オペレータおよびプロモータ領域、fd被覆蛋白質の制
御領域、原始核もしくは成熟核細胞およびそのウィルス
の遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列
、ならびにそれらの組合せよりなる群から選択されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第5項または第6現記戦
の組換DNA分子。 - (8)式:BG)fのMe tPh e−AA3〜AA
191、BGHのPbe−AA5〜AA1.、、BGH
のMetSerLeu−AA6〜AA1p1、BGHの
5erLeu−AA6、AA、、、、 BGnのfシe
t Le 1l−AA、、〜AA、、、、BGHのL
eu−AA6〜AA、91、BGHのMetSer−A
A9〜AA199、BG)Iの5er−AA? 〜AA
B1.BGHのM e L −A A ? 〜AA、、
、、BGHのAA、〜AA191のポリペプチド、成熟
中成長ホルモンを暗号化するDNAから7ミノ末端が削
除され、かつ牛成長ホルモンを暗号化するDNA配列よ
りも少なくとも700倍高い収率でポリペプチドを生産
しうるDNA配列により暗号化されるその他のポリペプ
チド、ならびに前記ポリペプチドの断片および誘導体よ
りなる群から選択される牛成長ホルモン状ポリペプチド
。 - (9)式 BGHのΔ4e t−AA、 〜AA1Hお
よびBGHのAA9〜AA j 9 +のポリペプチド
よりなる群から選択されることを特徴とする特許請求の
範囲第r項記載のポリペプチド。 (1o)%許請求の範囲第1r項または第り項目ピ載の
ポリペプチドよシなる群から選択されるポリペプチドに
よって行なうこと?特徴とする動物の処理方法。 Ql) 特許1ffi求の範囲第g項またVi、第2
項B【2戦のポリペプチドよりなる群から選択されろポ
リペプチド金%徴とする動物処理用組成物。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8223695 | 1982-08-17 | ||
GB8223695 | 1982-08-17 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5963197A true JPS5963197A (ja) | 1984-04-10 |
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Country Status (12)
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EP (1) | EP0103395A3 (ja) |
JP (1) | JPS5963197A (ja) |
AU (1) | AU568597B2 (ja) |
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DD (1) | DD212982A5 (ja) |
DK (1) | DK375283A (ja) |
ES (1) | ES8502476A1 (ja) |
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NZ (1) | NZ205212A (ja) |
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