JPS59502065A - グリコシル化インシュリン及びそれを含む糖尿病治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

グリコジル化インシュリン誘導体 発明の経緯 本発明１丁、グリコリル化イノンユリンの調製に関するものである。更に詳細に 汀、本発明はグリコ／ル化イノンユリンの調製及びグリコジル化インシュリンの 調製て使用される新規な中間体に関するものである。 患者の必要て応答する度合の高いインシュリンを糖尿病患者に投与する名神のシ ステムが提案されている。 生物工学の解決方法汀インシュリン注入ボンフ０の設計に向けられている。多数 の糖尿病患者が現在外部バッテリー作動型ポンプを使用している。ポンプは静脈 内又は支下組織内に挿入されるカテーテルに取付けられた針を通じてインシュリ ンを連続的に注入する。その流量は必要とされるイン／ニリンの量に変化が生じ た場合、自動的に調整可能である。そのユニットは通常ベルト上に装架されるか 又は脚にベルト止めされる。 血中のブドウ糖レベル全測定する検出器によって正確に測定はれるイン／ニリン の量を送り出すポンプは今でも実験段階にある。この分野で好結果を住んだ発展 がｌてれて汀いるが、こ八らのボンｆは依然重くて可搬式に汀なり得ない。その 佃の雌点汀、そのシステムが血液の連続的なサンプリング用の装置と、血液中の ７’　トウ糖のレベルを迅速且つ連続的に決定する分析装置と、その分析結果を 分析し最適なインシュリン服用量を決定するコンピューターと、膵臓のベータ細 胞による分泌に近似している様式でイン／ニリン全静脈内に送る注射ボンｆを必 要とする点である。システムの寸法を減少し、その検出器の寿命を伸ばす努力が 行なわれている。ブドウ糖検出器、電源、コンピューター、インシュリン溜め及 びポンプを含むタバコケースの寸法になった／ステムである「ベスト・ポケット 」２２３（１９７９年）で報告している。 現時点における他の障害は血液中のブドウ糖のゐ度を検出−「る正確な埋め込み 式電極が欠けている点である。長期間Ｖｃ亘り患者の血流に皮膚全通じて接続す ると、感染の危険や、凝結といった問題が生ずる。又、凝結したイン／ニリンげ その浴液状態から凝結し又は結晶化し、カくシてイン／ニリン溜め内のインシュ リンの生物学的効力を低減化させるところから相当の問題をかかえている。その 上、凝結したイン／ニリンは注射針内にとどまり、イン／ニリンの流れが注入シ ステムから糖尿病患者へ流れるのを阻止する場合がある。 発明の目的と要約 従って、本発明の目的は、生体インシュリン程迅速には凝結せず、そのため貯蔵 寿命が長くなった半合成イン／ニリンを調製することにある。 （疑給しない半合成イン／ニリンの調製に使用１−る新規な中間化合物を訪１製 することも本発明の目的である。 本発明の更に別１の目的汀血液の糖分のレベルを抑える著しい生物学的効力、ヲ 有するグリコリル化イン／コーリンを調製することにある。 これらの目的及び他の目的は、次の一般式の１つ孕有する新規なグリコゾル化イ ノンユリノによって達成可能である。 及び 式中、ｍは１ないし３のｂ数であり、Ｘ及びＺは異なり、−Ｈ及び−ＯＨから成 る群よシ選択され、−Ｑ−０ １１１ 汀式　−Ｃ−（ＣＨ２）　Ｃ−ｋ有するジカルボキシル酸スベー→ノーー基であ る。上記式でｎげ２ないし６の整数であり、好適には２又は３である。 図面の簡単な説明 図面の第１図なめし第４図は、各５実施例ＩＸ、Ｘ。 Ｘ及び刈に更に報告きれ述べであるクロマトグラフィー試験による浴離性状の線 図を示す。 発明の詳細な説明 プロツリー氏等がサイエンス、２０６．２２３（１９７９年）に開示している如 く、イン／ニリンは麦芽糖と糾合せ得ることが知られている。然し乍ら、との二 楯類とイン／ニリンの誘導体灯血糖値を下げる著しい生物学的効力げ包んら有し ていないことが判明している。 本発明において、イン／ニリンと糾合させる調設された中１￥ｉ１体は全てス被 −サー基に結合されるブドウ糖又はマンノース単糖類から成っている。ス被−ツ 一群汀ジカルボキシル酸、酸無水物又はフェニルアミン又はこれらの組合せの酸 から得らｆする。中間体に次の一般的な構造式を有している。 り、Ｘは−Ｈ，−ＯＨ又げ−ＮＨＣ（ＣＨ２）　ＣＯＨ：　から成る基より選択 した一員であり、Ｚ汀−Ｈ又Ｈ，−ＯＨから成る群の一員である。但し、Ｙが− Ｈである場合、Ｚも−Ｈでなければならす、Ｘに ０ １１　１ｌ −ＮＨＣ（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＨ，てなけれはならない。 Ｘが−ＯＨである場合にはＺげ−１−１でなければならず、でなければならない 。 Ｚが−ＯＲである場合にはＸは−Ｈでなければならず、０　０ なければならない。 この式てｎげ２ないし６の整数である。 ０ １１ｊ］ ｎ　ｉ−ｒ　２又は３の整数でら９、スＡｅ−サーの−Ｃ（ＣＨ２）　”部分汀 コハク酸又汀グルタル無水物から得られる。 ＾４Ｊ掲の構造式で述べた中間体は２つのサブ・グループに分割ｉ］能である。 第１のザブ・グルーニア′はグルコサミン誘導体であり、ここでＺは−Ｈであり 、Ｙは−Ｈであり、Ｘ汀０　０ ＩＩ　ＩＩ ＮＨＣ（ＣＨ２）　ＣＯＨ、であり、ここでｎば２ない（−６の整数である。 第２のザブ・グルーｆげＮ−サクシニル又はＮ−グルタリル−アミド−フェニル −α−Ｄ−グルコー及ヒマンノビラノサイド並びにｐ−インチオシアットフェニ ル−α−Ｄ−グルコ−及びマンノピラノサイドであり、ここでＸ及びＺに異なり 、−Ｈ及び−ＯＨから成り、ｎは２ないし６の整数である。 糖分にスペーサークリコール化中間体を加えたものの論製：・で使用する開始材 料汀グルコサミン及びｐ−二トロフェニルーα−Ｄ−グルコ及ヒマンノビラノサ イドであり、これらは市販きれている。 グルコサミンに直接酸無水物と反し可能であ゛る０好適なスに一す−はサクシニ ノし）及びグルタリルの部分であるので、残りの説明についてにこれらの誘導体 に向けられよう。然し乍ら、適湧な合成によってアジピン酸、ピメリン酸及びス ペリン酸からの４種類の対応する誘導体も利用可能である。 ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ　−クルコ及ヒマンノヒラノサイドが最初定処理さ れてニトロ基金アミン基に還元する。これらは次に、対応するＮ−ザクシニルー 及びＮ−グルタリル誘導体を生成するためコハク酸無水物及びグルタル酸無水物 と反応可能である。 ｐ　−７ミノフェニル−α−Ｄ−グルコー及ヒマンノヒラノサイドは対応するｐ −インチオシアットフェニル−α−Ｄ−グルコ−及びマンノピラノサイドを形成 するようチオホスゲンとも反応出来る。これらの生成物の合成について汀以下に 紗〈実施例で詳細に述べる。 以下に続くグリコノル化中間体灯インノンリンと結合するため使用出来る新規な ビラノザイドの代表的なものである。 Ｄ−７，７ノビラノザイド、ｍ、ｐ、　６５−６６８Ｃｎ＝３ｐ＝（グルタリル アミド）−フェニル−α−Ｄ−マンノピラノサイド、ｍ、ｐ、　Ｉ　３４−１　 ：３６”Ｃｐ−ｆソチオ／アットフェニル−α−Ｄ　−グルコビラｐ−インチオ シアットフェニル−α−Ｄ〜マンノビラノザイド インシュリン分子の構造は良く知られている。その構造汀システィンの二硫化結 合によシ共に結合された２個のポリ被ブチト鎖Ａ及びＢから成っている。Ａ留分 のＮ末端基汀りリ／ン（グＩＪＡ−１）であり、Ｂ留分のＮ末端基はフェニル・ アラニン（ＰｈｅＢ−］）である。両方のＮ−末娼位置には無反応α−アミン基 が含まれている。Ｂ留分のＣ末端基に＠接して遊離ε−アミノ基を有するリジン が存在している。これらの遊１０ 離アミノ基はその最終的な沈澱（でよりイン／ニリン分−子のＣ疑結問題に関係 があると１８しられている。 これらの基を前述したグリコリル化中間体でブロックすることによりイノ／ニリ ンの生物学的効力なめ寸す人きな影響を受けず、凝糺か著しく禁止され又は阻止 さハフつると信じられていた、ぞの仙、グリコ／ル化イノンユリノはり東部の父 は埋込み式の検出装置の必要を伴なわずに、血糖値の変化に直接応答する形で糖 尿后患渚にイノ／ニリンを与える耐薬品性解放機構に貢献する仙の諸行性を有し 得ると伝し「〕ｆＬでいる。 先に示した中間体の反応げスー々−づ−の端望畳、・［おいて力）しボキンル酸 ケアルギルクロ０７オルメー　１・との反応及び混合無水物の生体イノ／ニリン との反応を通しで混合無水物に変換することてより行なわねた。混合されグこ無 水物はアミド結合を介してモノ、；！又（１トリグリコ／ル化インシユリンを生 成すへくイン／ニリン土の１つまたけぞハ以上のＡ、−］、］Ｂ−１又汀Ｂ−２ ≦の遊離下ミノ基と反応する。っ置換の度合汀中間体とイノ／ニリンのモル比及 びｐＨ値を含む反応条件に依存−Ｊ−る。一般υこ中間体とイノ／ニリンのモル 比は２ないし、１０に変１ヒ丁石。反応の目的上、約３−ｙ、７いし９．５のｐ Ｈ値！＋：ｊ囲が好丑しい。 反応か複雑であるためグリコリル化イ／ツユリンをモノ、ジ又はトリ置換誘導体 として生成すること汀稀れであろう。むしろ、混合物か以下の実施例に示され川 　待人■ａ５９−５０２０６５　（６）る如く、得られよう・、 説明の目的上、グリコリル化イノンユリン（グ、３つの部類に分類出来え）。 Ｑ　０ ）１１１ 最初の部頽汀　−Ｃ（ＣＨｚ）−ｃ−のスベー勺−を有し、以下の一般的な＠造 式ケ：Ｈするクルコザミンから診・製されるインノコ−リンである。 式中、ｎは２ないし６の整数てあり、ｍ汀１ないしＩ３の整数であり、グリコリ ル基ＨＡ−］グリノン、Ｂ−フェニルアラニンのα−アミン基又はイノ／ニリン 分子のＢ　−２９１）ジン部分のε−アミノ基１つ訃たけそれ以上を通じてイノ ／ニリンに付着されている。 代表的なイノシュリン汀（クルコサミトカクンニル−）ｍ　イン／ニリン及０（ （グルコサミドクルタリルー篇イノンユリンである。 第２部類は以下の一般的構造弐を自するｆｃ　クルコー及びマンノビラノザイｌ ”’　ｋ　虐ｔｒ。 人中、Ｘ及びＺに異なり、−Ｈ及び−ＯＨ刀・ら我る群から選択され、ｎは２な いし６の整数てあジ、ｍば１ないしＩ３の整数であり、各クリコ／ル基ｒＪ　Ａ 　−］ググリノンＢ−］フェニルアラニンのα−アミン基父はイン／ニリン分子 のＢ−２９リジン部分のε−アミノ基］つ捷たはそれ以上を通じてアミド結合に よりイノ／ニリンに付着されている。 代表的な化合物に汀〔ｐ−（α−Ｄ−クルコビラノ／ロキン）−フェニル−Ｎ− ザクンナミル〕イノンユリン：Ｃｐ−（α−１）〜クルコビラノンロキン）−７ ］ニル−Ｎ−ゲルタラミル鼎、イン／ニリン；〔ｐ−（α−Ｄ−マンノビラノン ロキ／）−フェニル−Ｎ−サク／ナミル〕□　イノ／ニリン；［ｐ−（α−Ｄ− マンノビシノン■−１キン）−フェニル−Ｎ−クルタラミル乱イノ／コリンが含 捷れる。 スペーサーと結合逝れるクルコー及びマノノピラノサイドが含丑れる。 式中、Ｚ及びＸげ異なり、−１１及び−０１■て構成される群から選択され、ｎ ｌげ１ないし、３の整数でシ）ジ、各グリコリル基汀Ａ−］クリーンＪつα−ア ミツノＩ２、イノ／ニリン分子の１３−２９１１ノン部分のε−アミン基の１丑 たけそれり、上を辿してチン寸了ミド結合によりイン／ニリンに付着されていと ）。 代表的な化合物ンこげ［ｐ−（α−Ｄ−グルコ１ビ′ラノノロキ／）−フェニル −チオカルバモイル−現イノンユリン及びｃｐ−ｃα−Ｄ−マンノビ゛ラノンロ ギ／）−フェニル−チオカルバモイル−〕　インノンリンが含まれる。 本発明に従って訓１製されたクリ二ＩンルイＬイノンユリノに任意の慣用的な方 法即ちす・］−［、筋肉内′５！汀胆膜腔円庄射て糖尿病患者に投力出来ん５． 投Ｊう量はＩ　Ｕ栄位（国際単位）では遊離又は生体インシュリンと同昂に出来 ６つ投与量は患者のＲ「製置に尼して広範に変化するので投与量の顛囲を定める 詞−’Ｊｙは在されないてあろう。この投４　ｆａ決５′Ｅげ患者の和当医の一 １１１訂ｉ　Ｆ　１丁仕られよう。一般に体重６０にりの人（〃二げ１日ｆ：） たり、！　ｖｑ　（ｆ）イン／ニリンの投Ｊプ量が要求される。 以−ｒ゛の実施例は中間体化合物の調製、グリコゾル化イン／ニリンの調製、Ｃ 疑結の禁止又は阻止を行なう当該イノンコリンの生物学的効力と能力を示す。 Ｎ−サク／ニルクルコサミンの調製 クル−１−サーミン１盆夕１盆（０，０５ｍ、］　０．７８　？　）’＋６複蒸 Ｘ）イ水１５ｍｇ及び０．０５　ｍ　トリエチル　アミン（６，９５ｍ１）い＝ 溶解させた。この溶液に撹拌てよりアセトン３７．５ｍｌ中の＝Ｉハク酸無水物 （０，０５ｍ　、　５．７０５９　）を加えた０、その結果得られた混合物を二 層に分離し、光分な量の水を・加えてその両刀の層を１つの浴液にしり

【二。− Ｃ−の溶液を・室益て゛・１時間放置し、反応を完了させ、七の汝、浴液を真空 室内に入れ、粘匣の高い黄色を帯びた濃縮溶液が得らｔしる迄蒸発させた。その 濃縮物を１ｆｌｌｌ’ｉＬ、３倍量の氷酢酸で稀釈し、その結果Ｎ−サク／′ニ ルグルコザミンの白色沈澱物が生成された。その生成物ケろ過によって酢酸溶液 から分離し、エタノールで洗浄し１、次に石油エーテルで洗浄した。その結果得 られた生ｂｖ、物の収率汀３９係であった。その生成物の融点Ｕ］７４−１７５ ’Ｃ４’、分−ｒ−量ｆ１２７９．２６（７）計算セル重量の２．５％内であっ た。その構造と分子毎汀ＩＲ，ＮＭＲ及びＭ　、ｓ　／　Ｇ　Ｃスペクトルて゛ 確認された。 Ｎ−グルタリル　グルコ→Ｊミンの調製グルタル酸無水物を使って実施例１の方 法を追試（−た○生成物の収率ば・１１％であった１、融点汀］９５−１９６° Ｃであったっ清算したモル重量ば２９　：３．２　’７であった１、ＩＲ及びＮ 　Ｍ　Ｒスペク゛トルを使って構造の確ルコビラノサイトの調製 第１段階において、３５０ｒｎｌのメタノール中のｐ−二トロフェニルーα−Ｄ −グルコピラノサイト（１４ｍモル、　４．２１４９　）全ギ酸アンモニウム（ ５６ｍモル、　３．５４　！ｉ’　）及び炭素粒子上のパラジウム全２５℃で混 合−「ることにより還元した。系全体を窒素で４時間洗浄し、しかる後濾過し、 Ｐｉを減圧下で蒸発させた。粗ｐ−アミノフェニルーα−Ｄ−グルコピラノサイ ドをエタノール−水（５０°１）混合物内で再結晶させることにより精製した。 収率ば７１％であった。 融点は］６９−］、７０°Ｃてあった。構造と分子量をＩ　Ｒ及びＭＳ／ＧＣス 綬クトルにりって確認した。実測した分子量は２７１．２７の計算モル重量の２ ．７％以内にあった。 実ｍ例Ｉの方法に従ってｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−グルコビラノザイドをザ ク／ニル酸無水物と反応させて収率５３％のｐ、−（ザク／ニルアミド）−フェ ニル−α−Ｄ−グルコピラノサイト”４生成したつ生成物の融点げ１７８−］８ ０″Ｇであった・構造と分−ｆ量ｉＩＲ，ＮＭＲ及びＭ　Ｓ　／　Ｇ　Ｃスペク トルによって確認した。実測し、た分子量に３７１．３４の割算七ル重届−の２ ％以内にあった。 実施例■ ｐ−（グルタリルアミド）−フェニル−α−Ｄ−クルコビラノザイトの調製 ザク／ニル酸無水物の代わりにクルタル酸無水物を使って実施例■の方法否：追 試した。ｐ−（クルタリル＝アミド〕−フェニル−α−Ｄ−グルコビラノザイト を収率６３係で生成し、その融点に１６７−１６８°Ｃであった。構造をＩＲス 被りｌ・ルて僅［誌した、計算セル重量０・コ３８５．３７てあった。 ンノピラノザイドの調製 最初に実施例■て概説した方法を使ってｐ−ニトロソＪごルーα−Ｄ−マンノビ ラノザイｉ・をｐ−アミノフコ−二Ａ−α−Ｄ−マンノビラノザイトに還元した 。、生成物の収率は９１％て、生成物は］　５０−］　］５３　”Ｃで浴融した 。構造ばＩ　Ｒス綬りトルで確認した。 こうし７で？４％られたｐ−アミノフェニル−α−Ｄ　−−＝ｒンノピラノザイ トを実施例■で説明した方法でザク／ニル酸無水物と反応させて収率６７％の融 点６５−６６℃のｐ−（ｆクンニルアミド）−フェニル−α−Ｄ−マンノピラノ サイドを生成した。構造と分子量ｋＩＩ尤。 Ｍ　Ｎ　Ｒ、Ｍ　’Ｓ　／　Ｇ　Ｃス波りトルを使って砕紹［−だ１、実ｉｌ］ ｌｌ　した分子Ｎ月３７１．３４の計算分イ量の、２％以内であった。 実施例■ ｐ　（７／’ルタリルアミト）−フェニル−α−Ｉ）−マンノピラノサイドの＞ 　ＨＡ 実施例Ｖで概説した方法に従いクルタル酸無水物をサクノニ酸無水物と置換した 。その結果得られたｐ　−（グルタリルアミド）−フェニル−α−Ｄ−マンノピ ラノサイドが浴融点＋　３４−　］　３６℃で収率７５％で生成された。刷算に よる分子量ば：３８５．：’ｌ　７であった。 構造をＩＲスペクトルで確認した。 実施例Ｗ ｐ−イノチオノアットフェニル−α−Ｄ−グルコピラノサイドの調製 ８０％水性エタノール中のｐ−（アミノフェニル）−α−Ｄ−グルコピラノサイ ドの溶液にチオホスゲン（Ｃ３ＣＩ２　）の過剰モルが追加された。室温で反応 が実施σれ、数分ｔ’ｉ７１で完了した。結晶性生成物が得ｒ３れた。計算によ る分子量汀３　］　３．３であった。 実施例■ ｐ−イノチオンアットフェニル−α−Ｄ−マンノピラノサイドの調製 ｐ−イノチオノアントフェニル−α−Ｄ−マンノピラノサイドを生成するためｐ −（アミノフェニル）−α−Ｄ−マンノピラノザイドを対応するグルコピラノサ イドと置換するよう実施例■の方性ヲ適用出来る。 グルコサミン又はｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−グルコー及ヒマンノビラノサイ ドとサクシニル酸及ヒクルタル酸無水物の前述した組合せを合成したものを確認 するため以下の試験を利用した。赤外線分光光度計（ヘソクマン・ミクロラボ６ ２０ＭＸコンピユーテイング赤外分元光度計）がアミド結合の存在を検出するこ とによりアミン基と無水物の間の反応全決定するため使用された。０．５％（ｗ ／ｗ）ＫＢｒ＜レットとして試料が準備されたつ反応前のアミン基の存在は１６ ５０−　］　５８０ローＩＫおけるＮ−Ｈ伸張帯域により検出された。対応する ｐ−二トロフェニル誘導体の還元により調製されたｐ−アミノフェニル誘導体は 還元反応が完了したことを示す１５８０　ｃｍ−”及び１３３０ｃｍ−”でＮ− ０伸張帯域を示さなかった。アミド結合の生成は１６６０　ｃｍ−”におけるＣ ＝Ｏ伸張帯域と１６００ｃｆｎ”にお汀るＮ−Ｈ曲はモードの存在によジ示され た。通常ノ二りｔ体力ルボキンルＣ−０伸張帯域°も約］７２５１ｍ　−１附近 で見られた○これらのデータげアミノとジカルボギンル酸無水物反応体との間の 結合反応の完了を示す明確なアミド帯域を確認する。 ＤＥＣＰＤＰ　］１／３４コンピューターと、インターフェース状態にあるＬＫ Ｂ　９０００Ｓ　ＭＳ／ＧＣ分元光度針元光度計分子量がｈ′ｆｓ　−ａ　ｃス ペクトルで形成された。炭水化物誘導体の揮発性はヒドロキシル及びカルボキシ ル酸基のトリメチルシリル誘導体を使って高められた。全ての実施例（において トリメチルノリル誘導体の観測された分子１１」算された理論値の２．５±０． ５以内であった。 １ −ＮＩ（Ｃ（ＣＨｚ　）２　Ｃ０ＯＨの部分の存在汀ＪＯＥＬ　ＪＮＭ−Ｆ”Ｘ ２７０フーリア　トランスフオームＮＭＲ分光元度計を使用してプロトンＭ　Ｎ 　Ｒスペクトルにより確認された。試料（グＤ２０内に溶解され、ナトリウム２ ．２−ジメチル−２−ンラ被ンタンー５−スルホン酸塩（Ｄ　Ｓ　Ｓ’　）が内 部基準成分として使用された。例えばｐ−（→ノークシニルアミドーα−Ｄ−グ ルコピラノサイド）においてはサクシニル部分内のメチレン基のプロトン信号が 三重項としてδ＝２．７１にて観測された。ピーク・エリアはサクンニル部分の メチレン　ゾロトン４個を表わしているプロトンの個数に比例していた。 溶融点は毛管溶融点法によって測定された。 ジカルボリル酸無水物を利用するｉ１ｊ述のグルコース及びマノノース誘導体の 収率汀約３９７いし９１％の間で変動した。収率の変動げ再結晶化のための限定 された溶媒（エタノール−水混合物）の使用に起因すると思われるっ収率は再結 晶化方法に対して適当な溶媒を選択することにより増加享せねばならない。 前述したグリコシルアミドカルボキシル酸の誘導体とインシュリンとの再結合作 用は混合された無水物が反応混合物かＣ）分離されないような混合無水物法を通 じて実行される、グリコシルアミドカルボキシル酸はイノブチルクロロギ酸塩と の反応（でより混合無水物・て変換きれ、子の結果生じる混合無水物にアミド結 合を形成するためイノ／ニリン分子からの遊離アミン基と反応する。この方法に ついてに一般にアーランガー氏（１９６６）に説明きれている。 グリコノルアミドカルボキシル酸銹導体とインツユリンとの反応に対しイン／ニ リン分子上で利用可能な１次→ノーイト汀３つあり、イン／ニリンにこれらの誘 導体の１つ、２つ又け３つにより結合可能である。これらの第１」用可能なザイ ｈ　Ｋ汀りリノン（Ｇｌｙ　Ａ’−１）の（γ−アミン基、フェニルアラニン（ Ｐｈｅ　Ｂ−］　）　及？Ｊイン／ニリン分仔のリジン（Ｌｙｓ　Ｂ−２９）の ε−アミノ基が含まｌしる。これらの基のｐＫａｐｐ値１ｆｆＧ１ｙ八−１に対 し８．０．　Ｐｈｅ　Ｂ−］に２↑し６，７及びＬｙｓＢ−２９ｉｃ　７ｊ＋し ］］、２Ｔ、３，６゜イノンユリン汀ｐＨ値が烏過きると変性するのでＴ、　ｙ 　ｓ　１３　＝２　ｑ部分のε−アミン基を反応性の低いプロトン化状態に維持 するためグリコシルーアミド−カルボキシル酸とインシュリンとの間の結合汐応 ＯｐＨ値は７．５と１０との間、好適には９．５が選択された、従って、ｃｌｙ Ａ−１及びＰｈｅ　Ｂ−］位置のα−アミン基σｊ次反応サイトとして考えられ る。然し乍ら、三置換グリコリル化イノンユリンはイノブチルクロロギ酸塩によ る無水物のイ＋成中に生成されたＨＣｌを錯化するため添加された核性の高い） 　ＩＪ　−Ｎ−ブチルアミノ全使用することによりＬｙｓ　Ｂ−２９部分からの 遊離ε−アミノ基が脱プロトン化により生成可能であるところがち前掲の方法に よっても生成出来る。又、ヘングーノンーー・ノセルバノ・・式に茫つキｐＨ個 ’　９．５で、ＬｓｙＢ−２９の６−アミン基の約２％が遊離又は脱７０ロトン 化の形態てイ衡状態に在る。従ってかなりな量の三置換グリコジル化イノンユリ ンを調製出来る。然し乍ら、選択されたｐＨ値、即ち９．５及びそのｐＨ値でｃ ｌｙＡ−］及びＰｈｅＢ−］の反応性の高い遊離アミン基のためグリコ／ル化イ ン／ニリンに主として三置換及び三置換銹導体の混合物となろう。若干の一置換 体も存在し得る。 以下の実施セ１］において汀、反応しなかったイン／ニリンがＣｏｎ−Ａ（コン カナバリン−Ａ）と結合されたセ・・ローズ小球体を有するカラムを使って親第 １クロマトクラフィーによってグリコリル化インシコリンから除去される。 Ｃｏｎ−−Ａは糖類に対し結合親和力を有してｂることか知られている。それ故 、インシュリンに結合てれるグリコシル部分が多くなればなる程、グリコジル化 インシュリンがクロマトクラフィー　カラム内のＣｏｎ−Ａに対し結合きれる童 が多くなる。従って、反応を惹さなかったインツユリンげモノ−、ジー及びトリ ーグリコリル化イン／ユリノかこの順序で続くカラムを介して最初に溶離される ことになろう。 これは一般て正しい。然し乍ら、一部のグリコジル化誘導体に未反応イン／ニリ ンと共にカラムかち浴離さ′ｉ］ることかある。 以下の実施例１ｆｆｃｏｎ−Ａとの親和クロマトグラフィーで未反応イン／ニリ ンをグリコ／ル化イノンユリンから分離する方法の典型的なものである。 実施例■ Ｎ−サタンニルグルコザミンの調製 結合イン／ニリン（グルコサミノサクノニル　インシュリン） 生型インツユリン（８７，７７マイクロ　モル５００ｒｒｂｑ　）　ｋ蒸留水と 、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）の等容積混合物の２００　ｍｅ中て溶解し 、０．Ｉ　Ｎ水酸化ナトリウムてｐＨ値９．５に調整し、次に氷の槽内で冷却シ タ。Ｎ−ザクシニルグルコースアミン、（８００マイクロ　モル）ヲ各＼トリー Ｎ−ブチルアミン及びインブチルクロΩギ酸塩の８００マイクロ　モルを含有す るＤ　Ｍ　Ｆの溶液内で溶解し、Ｏ’ＣＫ２Ｏ分間保持した。）　リーＮ−ブチ ルアミン］、６ｍモルをこの溶液に付加し、次に撹拌により混合してイン／ニリ ン浴液とした。こうして精製はれた反応混合物は０．Ｉ　Ｎ水酸化ナトリウムで ９５のｐＨ値に調整され、０℃に１時間保持されたつ次（（混合物な室温で一昼 夜保たれ、次に、未反応Ｎ−サタンニルグルコサミンを除去するため蒸留水に対 し２日間、半透性膜を通じて透析された。蒸留水け４℃に保持され、４時間毎て 交換された。 透析膜の内側に残留するグリコジル化インシュリンは親液化され、以下に説明す るトリス−バッファー溶液中で溶解された。その結果生じた溶液灯中に存在する バクテリアの除去のためろ過により滅菌された。 その滅菌された生成物をセファローズ４Ｂ（ミズーリー州セントルイスのシグマ 　ケミカル社）に結合された市販のＣｏｎＡ（コンカナバリン−Ａ）の小球体を 含有する２、５Ｘ６０ｃｒｎのカラム上に設置した。未反ファー溶離ｒｉ、を使 用してカラムから除去された。溶離液ばｐＨ値が７．４であり、４℃に維持され た。流量は７２−７時に維持され、７．０−の留分が集められ、イン／ニリンの 存在に対しＵＶスペクトルにょ夛Ａ２７６ｎｍで分析された。フェノール−硫酸 検査を利用した４、　８０　ｎ、ｍにおける糖分の比色計による測定も一部のＮ −ザクシニルグルコサミン結合インシュリンの存在を示した。 第１図に示す如く、約１０５分後に未反応イアツユリン（成分１）すべてが２７ ６ｎｍ［おいてＵＶスペクトルにより監視されて集められていた。その時点で０ ．１ｍ　α−メヂルーＤ−マンノピラノサイドが溶離液としてトリス−バッファ ー浴ｇに加えられ、その流量が７２　ｍｌ／時に保持された。約２００分後にＮ −ザク／ニルグルコサミン結合インシュリンから成る成分２のすべてが第１図に も示される如く集められた。 Ｃｏｎ−Ａに対するグルコサミン部分の固有の低結合力汀遊離インシュリンと成 分］内のグリコジル化インシュリンの混合溶離液のためであると考えられていた 。 ４８０ｎｍにおける成分２内のグリコジル化インシュリンの低い吸着性が原因で 置換度合は測定出来なかった。 成分２内のグリコジル化インシュリンは血糖（Ｗｋ下げる能力を測定するため凍 結乾燥された。 対応するＮ−グルタリル　グルコサミン結合インシュリン（クルコサミノ・グル タリル・イン／ニリン）が同様の様式で調製された。 実施例Ｘ ルコビラノサイト結合イノンユリンの＞　ＮＣｐ−（（γ−Ｄ−クルコヒ０う／ ンロキ／′）−フェニル−Ｎ−サクンナミル　インシュリン〕実施例Ｘの方法が 実施例■からのｐ−（サクシニルレア。ミド）−フェニル−α−Ｄ−グルコピラ ノサイドを生型インシュリンと反応させるため追試された。その結果を第２図に 示す。第２図の成分】ば４・８０　ｎｍにお（グるフェノール−硫酸法により実 証された遊離インツユリンと一部のグリコジル化インシュリンで構成すれた。成 分２及び３に集められ、インシュリンに対する２　７６　ｎｍと同様、グリコリ ル基の存在に対しフェノール硫酸法により検査された。成分３を分離するのに必 蚤な溶離液の量が多いため、成分３げインシュリン上のグリコリル基が成分２よ り多く含有していたことが予測出来る。成分２及び３の曲線の下側の領域は各’ 、　５８．９％及び４１．１％であった。成分２は主としてジグリコ／ル置換イ ンシュリンであり、成分３汀主としてトリグリコジル置換誘導体であった。従っ て結合された成分２及び３内に含有されているインシュリン上のグリコジル誘導 体の平均個数である帆５８９×２＋０．４１　］Ｘ３＝２．４　］　１が得られ た。この置換度合はイン／ニリン分子あたり２．３のグリコリル基を示すフェノ ール硫酸検査に固有のものであった。フェノール硫酸試験の詳細についてはジコ ーボア氏等のアナリテイカル・ケミストリー２８．３５０（］　９９５６年に説 明しである。 集合成分２及び３が組合されて溶離液除去のため透析された後、精製生成物であ るα−メチル−Ｄ−マンノピラノサイドは生物学的試験のため凍結乾燥された。 同じ方法により対応するｐ−（グルタリルアミ下）−フェニル−α−Ｄ−グルコ ピラノサイド結合インンノンＪ　ン［：　ｐ−α−Ｄ−／ルコピラノンロキン） −フェニル−Ｎ−グルタルアミル　インシユリン〕か評製すｐ−（サクシニル７ ミド）−フェニル−α−Ｄ　−７７ノビラノサイド結合インシュリンの調製〔ｐ −（α−Ｄ−マンノヒラノンロキノ）−フェニル−Ｎ　−サクシナミル　インシ ュリン〕実施例Ｘに概説した方法を行ない、その溶離体の形状全第３図に示す。 成分］はフェノール−硫酸検査が陰性であったため、未反応遊離インシユリンで あった。 成分２及び３の組合せのためイン７ュリンに付着したグリコジル基の平均度合は フェノール硫酸検査にょシ２．５であった。成分２及び３に対する曲線の下側の 領域は各＼３４％及び６６％で前述の試験結果と筈に比較される２６６の平均置 換度を示している。 精製した凍結乾燥生成’Ｆ／ｉ全血糖降下試験のため保持した。 対応するｐ−（グルタリルアミド）−フェニル−α−Ｄ−マンノピラノサイド結 合インシュリン）ｐ−（α−Ｄ−マンノピラノ／ロキン）−フェニル−Ｎ−１’ ルタルアミル　インシユリン〕がル・℃製され、前述の方法により精製された。 実施何店 ｐ−（α−Ｄ−グルコヒラノンロギ／）−フェニル−チオカルバモイル　インシ ュリンの調製実施例Ｗから得「）れたｐ−（インチオンアットフェニル）−α− Ｄ−グルコビラ５ノザイド（３５５，０８マイクロ　モル）をピリジノ３部と水 １部の５℃の溶液内で浴解し、そのｐＨ値ｆＯ，］　ＮａＯＨで８．ＯＫ調整し た。生型インシュリン（１７７，５４マイクロ　モル。 ］ｇｍ）ｋピリジン−水の溶媒を使って調整しグルコビラノザイド溶液と組合せ た。その組合された溶液を５℃でｐＨ値８．ＯＫ　］時時間待し、次に室温で一 昼夜放置した。次に、ｐ−（α−Ｄ−グルコビラノンロキン）−フェニル−チオ カルバモイル　インシュリンから成る反応生成物を実施例■と同様凍結乾燥して 未反応ｐ−（インチオンアットフェニル）−α−１）　−クルコビラノサイドを 除去し、残りの生成物を凍結乾燥し、トリノ・バッファー内にて溶解し、実施例 ■の場合と同様、Ｃｏｎ−Ａセホラーゼ４Ｂカラム上の親和クロマトグラフィー に提供した。流量に４℃において２６ｒｎｌ／時であり、５．０ｒｎｌの留分が 集められた。溶離液の性状を第４図に示す。成分１σ遊離インシュリンとグリコ ジル化インシュリンの両方を含有し、成分２汀インシュリン分予めたり１．５グ リコノル基の平均値を有すル１）−（α−Ｄ−１’ルコビラノンロキン）−フェ ニル−チオカルバモイル　インシュリンで構成すれてｌＡ７’（っ成分２からの 生成物ばα−メチル−Ｄ−マンノピラノサイト浴離ｔＶｊ、全除去するため透析 され、次に生物学的試験のため凍結乾燥でれた。 実施例Ｘｍ 凝結試験 遊離インシュリン又は生体インシュリンに関連ある諸問題の１つはイン７ュリン が凝結し最終的には浴液状態から結晶化し、こうしてその生物学的効力を失なう 傾向がある。φである。グリコジル化イノンユリンの場合、この傾向はインシュ リン内のＱｌ”、ｙ、Ａ−］、Ｐｈｅ　Ｂ−］及びＬｙｓ　Ｂ−２９の活性アミ ノサイトの部分かグリコジル基の結合反応によってブロックされるので著しく減 少される。 グリコジル化インシュリンとの比較による遊離インシュリンを使った塊状凝結に 関する検討が２つの方法により行なわれた。塊状凝結に関する検討では各種水溶 液とイン７ュリンの”１　ｍ？／ｍｅ　ｆ含有するグリコノル化インノユリノ浴 液が凝結が目視される迄又は２週間迄］　５５．５　ｒｐｍ　て偵拌された。別 の試験においては、回しインシュリン弁度を含有する浴液をポリウレタン（バイ オマー）上に析出はせ、顕微鏡で凝結の観察を行なった。その結果は以下の通り である。 凝結に要する時間 解糖インシュリン 塊状　２−３０　２週間　２週間　２週間ポリウレタン　１−２日　゛２週間　 ２週間　８臼Ａ＝ｐ（α−Ｄ−グルコピラノンロキン）−フェニル−Ｎ−サクシ ナミル　イン７ュリン Ｂ＝ｐ（α−Ｄ−マンノビラノンロキノ）−フェニル−Ｎ−サクシナミル　イン シュリン Ｃ＝ｐ　（α−Ｄ−グルコピラノンロギン）−フェニル−チオカルバモイル　イ ノシュリン グリコジル化インシュリンは凝結に対しては遊離イン／ニリンより安定性が高く 、従って貯蔵寿命が良くなることが前述の結果から明らかである。 グリコジル化インシュリンの生物学的活性本明細書で説明したグリコジル化イン シュリンの生物学的活性が血糖降下試験により測定され、市販のイノツユリン製 剤及び対照液と比較された。この試験において、普通の実験用ラットヲモデルに して２０時間絶食させた。基準となる血糖値を測定した後、遊離又はグリコ／ル 化イノンユリンのいずれか一方の１　ｍｙｌｋｑｋＭ膜腔内のルート１通じて注 入した。各ラット内の血糖値を注入後２０分紀三って比色計によυｒｆ１１１定 した。。 その結果について以下の表に掲げる。 本明細書で説明した如く、調製済みの７種類のグリコリル化インシュリンは全て 皿糖値を降下させる生物学的に著しい効力を有していることが前掲の内容から明 らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｊ）次の構造式 の−員であり、Ｚ（グーＨ又は−ＯＨ力・ら成る群の一員であり、但しＹが−Ｈ の場合、Ｚも−Ｈで彦ければなＸが−ＯＨである場合、Ｚ（グー■でなければな らず、Ｚが−０１−Ｉである場合、Ｘに−Ｈてなければならす、ＯＯ １１１ ２）　Ｚが−Ｈであ、す、Ｙが−Ｈであり、Ｘが−ＮＨＣ（ＣＨ２）ｎ　−Ｃ０ ）Ｉであり、ここてｎが２ないし６の整数になっているような請求の範囲第１） 項に記載の化合物。 ３）　ｎが２であり、構造式 を有する請求の範囲第２）項て記載の化合物。 ４）　ｎが３であり、構造式 も有するようにした請求の範囲第２）項に記載の化合物。 ５）　Ｘ及びＺが異なっており、−Ｈ及び−０ｌ１−Ｉから成り、ｎが２ないし ６の整数になっている請求の範囲第１）項に記載の化合物。 ６）Ｚか一■であυ、Ｘが−ＯＲであり、Ｙが第５）項に記載の化合物。 ７）　Ｚか−Ｈであり、Ｘか一０ｉ（であり、Ｙが第５）項に記載の化合物。 ８）　Ｚが−Ｈであり、Ｘが−ＯＨであり、Ｙかに記載の化合物。 ９）　Ｚが一〇Ｈ′Ｔ：あり、Ｘが−Ｈであり、Ｙが第５）項に記載の化合物。 １０）Ｚが−ＯＨであり、Ｘか−Ｈであジ、Ｙがｄ１ｈ囲第５）項に記載の化合 物。 ］］）　Ｚ　カーＯＨＴ６　’Ｉ、Ｘが−ＨＴ、ｉＱ、Ｙが項に記載の化合物。 １２）次の構造式 を有するグリコリル化インツユリン。〔式中ｎが２ないし６の整数であり、ｍが ］な？Ｌ３の整数であり、クリコ／ル基がＡ−１グリシン、Ｂ−１１フエニルア ラニンのα−アミノ基又はインシュリン分子のＢ−２９リジン部分のε−了ミノ 基〕つまたけそれ以上を通じてインツユリンに付着される。〕 】３）ｎが２になっている言請求の範囲第１．２　）項に記載のグリコモノンイ ンシュリン。 ］＝１）ｎが３である請求の範囲第１２）項に記載のグリコリル化イノンユリン 。 １５）次の構造式 を有するグリコジル化インシュリン。〔０式中Ｘ及びＺが異なり−Ｈ及び−ＯＨ から成る群より選択され、ｎが２ないし６の整数であり、ｍが１ないし３の整数 で６ あり、各グリコリル基がＡ−１グリシン、Ｂ−］フェニルアラニンのα−アミノ 基１つまたはそれ以上又はインシュリン分子のＢ−２９リジン部分のε−アミン 基を介してアミド結合によりインシュリンに付着している。〕 １６）Ｚが−ＨＴあり、Ｘが−ＯＨであり、ｎが２、特許請求の範囲第１５）項 に記載のグリコリル化イノンユリン。 １７）Ｚが−Ｈであり、Ｘが−ＯＨであり、ｎが３である請求の範囲第１５）項 に記載のグリコモノンインシュリン。 １８）Ｚが−ＯＨであり、Ｘが−Ｈであり、ｎが２、特許請求の範囲第１５）項 に記載のグリコ７ル化インシユリン。 １９）Ｚが−ＯＨであり、Ｘが−Ｈであり、ｎが３であるようにした請求の範囲 第１５）項に記載のグリコ７ル化インシュリン。 ２０）次の構造式 □□□？有するグリコジル化インシュリン０、〔式中Ｚ及びＸが異η９、−Ｈ及 び−ＯＨから成る群か１つ選択さえＬｌｍが１ないし３の整数であり、各グリコ リル基がＡ−１りＩＪ　ジン、Ｂ−１フエニル・アラニンのα−アミノ基１種類 以上又はインシュリン分イのＢ　−２９１）ジン部分のと一アミン基を通じてチ 万了ミド結合によυインツユリンに付着している。、〕 ２１）Ｚが−Ｈであジ、Ｘか一０ｌ（であるようにしたＪ請求の範囲第２０）項 に記載のグリコジル化インシュリン。 ２２）Ｚが一〇Ｈであり、Ｘか−■１であるようにｊ−た請求の範囲第２０）項 に記載のグリコ／ル化インニリン。 ２３）次の構造式 全有するグリコリル化イノンユリンの有効所定ｍを糖尿病患者に投与することを 含む糖尿病患者における血糖値を降下させる方法。［式中ｎが２ないし６の整数 てあり、ｍが］ないし３の整数てあり、グリコリル基Ｉｆｆ　Ａ　−１／’　Ｉ Ｊノン、Ｂ−１フエニルアラニンのα−アミノ基の１つまたけそれ以寸、又（１ ４７７３９７分子のＢ２９１Ｊジン部分のε　−アミノ基テ１１１１じで製剤的 に計容出来る千ヤリア内にてイ寸けらｔ）る、っ　〕２・Ｉ）り゛リコノル化イ ンシュリンの有効量が患者０”）必要量士基Ｃ・こして決定されている請求の範 囲第２３）項に記載の方法５． ２５）ｎが２である側木の範囲第２４）項に記載の方法。 ２６）ｎが３である請求の範囲第２４）項に記載の方法。 ２７）次の構造式 を有するグリコリル化イノンユリンの有効量全製剤的に許容出来るキャリア内に て前記患者に投与することから成る糖尿病患者の血糖値を降下させる方法。〔式 中Ｘ及びＺが異１９、−Ｈ及び−ＯＨから成る群より選択され、ｎが２ないし６ の整数であり、ｍが１ないし３の整数てあり、各グリコリル基がＡ−１グリシン 、Ｂ−１フエニルアラミンのα−アミノ基１　ｍａｍ上’を通じ又にイン／ニリ ン分子のＢ−２９リジン部分のε−アミン基全通じてアミド結合てよりインシュ リンに付着−される。〕 ２８）グリコリル化イン７ユリンの有効量が患者の必要量を基にして決定でれて いる請求の範囲第２７）項て記載の方法。 ２９）ＺがＨで８９、Ｘが−０１−１であり、ｎが３であるようにした請求の範 囲第２８）項に記載の方法。 ３０）　Ｚが−Ｈであり、Ｘか−ＯＨであり、ｎが２であるようにした請求の範 囲第２８）項に記載の方法。 ３］）　Ｚが−ＯＨであジ、Ｘが−Ｈてあり、ｎが２であるようにした請求の範 囲第２８）項に゛記載の方法。 ３２）Ｚが−ＯＨそあり、Ｘが−Ｈであり、ｎが；３であるようにした請求の範 囲第２８）項Ｖこ記載の方法。 ：３３）　−ｉ　Ｍｌｌ的に許容出来るキャリア内で次の構造式を有するグリコ リル化イノンユリンの有効量を前記患者に投与することから成る糖尿病患者の血 糖値全降下させる方法。〔式中Ｚ及びＸが異なり、−Ｈ及び−ＯＲから成る群よ り選択され、ｍが１ないし３の整数であり、各グリコリル！ｌ；Ａ−］グリシン 、Ｂ−１フエニルアラニンのα−アミノ基１種類以上又にインシュリン分子のＢ −２９リジン部分のε−アミン基を通じてチオアミド結合によりインシュリンに 伺着している。〕３４）グリコジル化インシュリンの有効量が患者の必要量を基 に決定されている請求の範囲第３３）項に記載の万伍。 ３５）Ｚが−Ｈでり９、Ｘが−ＯＨであるようにした請求の範囲第３４）項に記 載の方法。 ：３６）Ｚが−ＯＨであジ、Ｘが−ＨであるようにしたＪ請求の範囲第３４）項 に記載の方法。