JPS5946594B2 - Immobilized biologically active substance and its production method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化生物活性物質及びその製造方法、詳しく
はコラーゲンを担体として生物活性物質、特に酵素ま１
こは抗生物質を化学的に結合せしめることからなる固定
化生物活性物質及びその製造方法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an immobilized biologically active substance and a method for producing the same, and more particularly, to immobilized biologically active substances, particularly enzymes, using collagen as a carrier.
This invention relates to an immobilized biologically active substance which consists of chemically binding an antibiotic and a method for producing the same.

その目的とする所はコラーゲンの具備する特性を活用し
て、効果的に生物活性物質を固定化し、有用な固定化生
物活性物質を提供することにある。The purpose is to utilize the properties of collagen to effectively immobilize biologically active substances and provide useful immobilized biologically active substances.

本発明における生物活性物質とは酵素、抗生物質等を包
含するものであるが、便宜上特に酵素の場合について説
明する。The biologically active substance in the present invention includes enzymes, antibiotics, etc., but for convenience, the case of enzymes will be particularly explained.

近年、酵素の利用に関する研究や技術が著しく進歩する
と共に酵素の一定化についても種々の方法が提出されて
いる。In recent years, research and technology related to the use of enzymes have made significant progress, and various methods have been proposed for stabilizing enzymes.

共有結合法もその一つで、種々の化学反応を応用するこ
とが検討されているが、概して強固な結合が得られる反
面、調製技術が難かしかつ１こり、固定化処理中に酵素
が失活し１こり、あるいは普遍的に種々の酵素に適用す
ることが難かしいなどの欠点があげられている。Covalent bonding is one such method, and the application of various chemical reactions is being considered, but although it generally provides strong bonds, the preparation technique is difficult and difficult, and enzymes may be released during the immobilization process. Disadvantages such as inactivation and difficulty in universal application to various enzymes are cited.

共有結合法の利点を保持しながらこれらの欠点を除くた
めには、極力、酵素が失活を起さない温和な条件下で、
しかも簡単な処理で実施できる結合反応を選ぶことが肝
要なことである。In order to eliminate these disadvantages while retaining the advantages of the covalent bonding method, the enzyme should be conjugated under mild conditions that do not cause deactivation as much as possible.
Furthermore, it is important to select a binding reaction that can be carried out with simple processing.

一方、生物活性物質、特に酵素を固定化するのに適当な
担体としては、一般的に結合容量が大きく、担体表面の
結合部位の分布状況が重要であり、多孔度、電荷の分布
、親水性と疎水性の均衡など担体の組織の状態を考慮す
る必要があり、さらに酵素活性におよぼす影響や化学的
、物理的な安定性などにも充分な配慮が必要である。On the other hand, carriers suitable for immobilizing biologically active substances, especially enzymes, generally have a large binding capacity, and the distribution of binding sites on the carrier surface is important, as well as porosity, charge distribution, hydrophilicity, etc. It is necessary to consider the state of the structure of the carrier, such as the balance between hydrophobicity and hydrophobicity, and also sufficient consideration must be given to the influence on enzyme activity, chemical and physical stability, etc.

本発明者は永年にわ１こりコラーゲンと酵素との関係に
ついて研究し、成る種の酵素がコラーゲン溶液中で安定
に保存されることを見出し、さらに酵素反応をうけるべ
き基質が高分子の場合、基質の内部への滲透や拡散が影
響をうけることを考慮して、コラーゲンを担体とする結
合法による酵素の固定化に成功し１こ。The present inventor has studied the relationship between wrinkled collagen and enzymes for many years, and found that several types of enzymes can be stably preserved in collagen solutions. Considering that permeation and diffusion into the interior of the matrix would be affected, we succeeded in immobilizing the enzyme using a binding method using collagen as a carrier.

コラーゲンは動物の結合組織の主成分で、皮膚、骨、鍵
等に広く分布する蛋白質であり、いわゆる「可溶性コラ
ーゲン」と「不溶性コラーゲン」として存在している。Collagen is a main component of animal connective tissue, and is a protein widely distributed in the skin, bones, keys, etc., and exists as so-called "soluble collagen" and "insoluble collagen."

この「不溶性コラーゲン」は蛋白質分解酵素を作用させ
る特公昭３７−１４４２６及び特公昭３７−１３８７１
公報記載の方法あるいは糸状菌から生産される酸性蛋白
質分解酵素を用いる特公昭４４−１１０３７および特公
昭４４−１１７５公報記載の方法によって可溶化される
し、又、アルカリ、硫酸ソーダ及びアミンの共存下で処
理する特公昭４６−１５０３３公報記載の方法によって
も可溶化される。This "insoluble collagen" is produced by Japanese Patent Publications No. 37-14426 and No. 37-13871, which act on proteolytic enzymes.
It can be solubilized by the method described in the publication or by the method described in Japanese Patent Publication No. 11037/1983 and Japanese Patent Publication No. 1175/1975 using an acidic proteolytic enzyme produced from filamentous fungi, or in the coexistence of an alkali, sodium sulfate, and an amine. It can also be solubilized by the method described in Japanese Patent Publication No. 46-15033.

かくして得られ１こ可溶化コラーゲンの水溶液はいづれ
もコラーゲンが本来の分子構造を保持したま５、単分子
分散の状態で溶解しており、分子の長さは２８００人、
直径１５人、分子量約３０万であり、３本のポリペプチ
ド鎖が二重へリツクス状に巻いている剛体棒状の形をと
っていることが判明している。In each of the aqueous solutions of solubilized collagen thus obtained, collagen retains its original molecular structure and is dissolved in a monomolecularly dispersed state, with a molecular length of 2,800 molecules.
It has been found that it has a diameter of 15 and a molecular weight of approximately 300,000, and is shaped like a rigid rod with three polypeptide chains wound in a double helix.

又、この溶液力）らはＸ゛天然コラーゲン繊維に近い繊
維を再生することが出来る。In addition, this solution can regenerate fibers close to natural collagen fibers.

このような繊維再生能は酵素の固定化に際して極めて有
効であるば力）りでなく、適当な強度をもつ１こ種々の
形状、即ち糸状、膜状、塊状、スポンジ状等に成型する
上で極めて好適な性質である。This ability to regenerate fibers is not only extremely effective in immobilizing enzymes, but also in molding them into various shapes with appropriate strength, such as threads, membranes, lumps, and sponges. This is an extremely favorable property.

又、コラーゲンは繊維性の高次構造をとり且つ親水性、
膨潤性が極めて高いので、コラーゲンを用いて酵素を固
定する場合には結合部位が多く、表面積が犬になり、基
質の拡散をよくするので基質や他の因子との接触を容易
にするなど、固定化酵素の反応性を高めるのに有効な環
境条件を提供するし、酵素の安定性を良好に維持するも
のと考えられる。In addition, collagen has a fibrous higher-order structure and is hydrophilic.
Because of its extremely high swelling property, when enzymes are immobilized using collagen, there are many binding sites and a large surface area, which improves the diffusion of the matrix and facilitates contact with the matrix and other factors. It is believed that it provides effective environmental conditions to increase the reactivity of the immobilized enzyme and maintains good stability of the enzyme.

さらに、コラーゲンはそのペプチド鎖の側鎖としてグル
タミン酸、アスパラギン酸及びそれらのアミド等のカル
ボキシル基を豊富にもっており例えば、牛皮コラーゲン
ではアミノ酸の１０００残基当り１１９残基）、アルギ
ニン、リジン、ヒスチジン等のアミン基もかなり保有し
ている（例えば牛皮コラーゲンではアミノ酸１０００残
基当り８３残基）。Furthermore, collagen has an abundance of carboxyl groups such as glutamic acid, aspartic acid, and their amides as side chains of its peptide chains (for example, in cowhide collagen, there are 119 residues per 1000 amino acid residues), arginine, lysine, histidine, etc. It also contains a considerable amount of amine groups (for example, bovine skin collagen has 83 residues per 1000 amino acid residues).

従って共有結合法によって酵素を固定化する場合には対
象とする酵素のアミン基あるいはカルボキシル基との反
応を利用するのに好適である。Therefore, when an enzyme is immobilized by a covalent bonding method, it is suitable to utilize the reaction with the amine group or carboxyl group of the target enzyme.

一方、コラーゲンは多糖類のうち、アラビアゴム等のへ
テログリカンやアルギン酸、ペクチン質等のグリクロナ
ン、ヒアルカン酸、コンドロイチン硫酸等のムコ多糖類
やカルボキシメチルセルロース等のホモグリカンのカル
ボキシメチル誘導体等と適当な条件の下で非常によく結
合し、コラーゲンと多糖との複合体を形成する。On the other hand, among polysaccharides, collagen is produced by combining heteroglycans such as gum arabic, glycuronans such as alginic acid and pectin, mucopolysaccharides such as hyalkanoic acid and chondroitin sulfate, and carboxymethyl derivatives of homoglycans such as carboxymethyl cellulose under appropriate conditions. It binds very well to the lower part of the body, forming a complex with collagen and polysaccharides.

この複合体は上記のようなコラーゲンの特質に加えて、
さらに多糖の特質である高い親水性や粘性、弾性、皮膜
形成能、保護コロイド性、接層性等が加味されるので、
担体として極めて有利な特徴をもつに至る。In addition to the properties of collagen mentioned above, this complex also has
In addition, the characteristics of polysaccharides such as high hydrophilicity, viscosity, elasticity, film-forming ability, protective colloidal properties, and layering properties are taken into consideration.
This results in extremely advantageous characteristics as a carrier.

この場合、目的に応じてその結合量を調節することによ
って所期物性の担体婆つくることが可能であるし、また
架橋処理を加えるなどの手段を併用する時には強度も向
上し、酵素の固定化にとって極めて適した担体を提供す
ることができる。In this case, it is possible to create a carrier with the desired physical properties by adjusting the amount of binding depending on the purpose, and when cross-linking is used in combination, the strength can be improved and the enzyme can be immobilized. It is possible to provide a carrier that is extremely suitable for

又、コラーゲンを基本組成として適量のセルローズ等の
ホモグリカンを混合したり、架橋を導入するような処理
を組合わせて用いることによって目的に適した機械的強
度やその他の性質をもつコラーゲン複合体をつくること
ができる。In addition, collagen composites with mechanical strength and other properties suitable for the purpose can be created by mixing an appropriate amount of homoglycans such as cellulose with collagen as a basic composition, or by using a combination of treatments such as introducing crosslinking. be able to.

本発明においては、コラーゲンそのものの他に上記のよ
うなコラーゲンと多糖との複合体またはこれらとホモグ
リカン類等の混合物を総称して、単にコラーゲン担体と
呼ぶことにする。In the present invention, in addition to collagen itself, complexes of collagen and polysaccharides as described above, or mixtures thereof with homoglycans, etc., are collectively referred to simply as collagen carriers.

本発明に用いるコラーゲン担体は次のようなものである
。The collagen carrier used in the present invention is as follows.

１）可溶化コラーゲンからの成型物：不溶性コラーゲン
から酵素処理あるいはアルカリ処理によって可溶化され
た可溶化コラーゲン力）ら、その繊維再生能や凝固性等
を利用して成型されたもの及び硬化処理を併用したもの
。1) Molded products from solubilized collagen: Molded products using the fiber regeneration ability and coagulability of insoluble collagen, which is solubilized by enzyme treatment or alkali treatment, and hardening treatments. Used together.

２）不溶性コラーゲン繊維組織：動物の結合組織を機械
的にとり出し、水洗、石灰漬等の処理によって精製され
た組織（オセインを含む）または皮革工業において生じ
る副産物であるシェービング屑（このシェービング屑は
牛皮をクロム揉しした後、揉した皮を一定の厚さに削る
際に生じる）。2) Insoluble collagen fibrous tissue: tissue (contains ossein) obtained by mechanically extracting animal connective tissue and purifying it by washing with water, soaking in lime, etc., or shaving waste, which is a byproduct of the leather industry (this shaving waste is made from cowhide) This occurs when the rubbed skin is shaved to a certain thickness after being rubbed with chrome).

３）不溶性コラーゲン繊維の分散液からの成型物：動物
の結合組織等から精製して得られ１こコラーゲン繊維分
散液またはこれと可溶化コラーゲン溶液との混合物から
成型されたもの及び硬化処理を併用したもの。3) Molded product from a dispersion of insoluble collagen fibers: A product molded from a dispersion of collagen fibers obtained by purification from animal connective tissue or a mixture of this and a solubilized collagen solution, and a combination of hardening treatment. What I did.

４）コラーゲンと多糖との結合による成型物：コラーゲ
ンとへテログリカン、グリクロナン、ムコ多糖やホモグ
リカンの誘導体等をコラーゲンの等電点より低い酸性領
域のｐＨの下で混合して、両者の複合体を生成させ、成
型されたもの及び硬化処理を併用したものである。4) Molded product made by combining collagen and polysaccharide: Collagen and heteroglycan, glycuronan, mucopolysaccharide, homoglycan derivatives, etc. are mixed under an acidic pH range lower than the isoelectric point of collagen to form a complex of both. These are those that are produced and molded, and those that are combined with hardening treatment.

用いられる多糖は次のようなものである。The polysaccharides used are as follows.

ヘテログリカン：アラビアゴムや植物ゴム及び粘質物等
。Heteroglycans: gum arabic, vegetable gums, mucilage, etc.

グリクロナン：アルギン酸、ペクチン質等。Glyclonan: alginic acid, pectin, etc.

ムコ多糖：ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリ
ン及びＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属の莢膜多糖等微生物の生産
する多糖等。Mucopolysaccharides: Polysaccharides produced by microorganisms such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate, heparin, and capsular polysaccharides of the genus Rhizobium.

ホモグリカンの誘導体：カルボキシメチルセルロース、
カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルアミロー
ス等。Derivatives of homoglycan: carboxymethylcellulose,
Carboxymethyl starch, carboxymethyl amylose, etc.

その他：デキストラン硫酸、カラゲナン、アラビアゴム
のエステル、アルデヒドスターチ、高分子酸。Others: dextran sulfate, carrageenan, gum arabic ester, aldehyde starch, polymeric acid.

５）コラーゲンと多糖の混合物からの成型物：コラーゲ
ン繊維分散液と可溶化コラーゲン溶液さらにセルロース
繊維の混合物から成型されたもの及び硬化処理を加えた
もの。5) Molded product made from a mixture of collagen and polysaccharide: A product molded from a mixture of collagen fiber dispersion, solubilized collagen solution, and cellulose fibers, and a product subjected to hardening treatment.

本発明は上記したような特質をもつコラーゲン担体を用
いて酵素を結合法によって固定化する１こめに、温和な
条件下で酵素を効果的に結合することのできる結合反応
に関して研究を重ね１こ結果、完成されたものである。The present invention involves the immobilization of enzymes by a binding method using a collagen carrier with the above-mentioned characteristics.The present invention is based on research into a binding reaction that can effectively bind enzymes under mild conditions. As a result, it is complete.

即ち、コラーゲン担体のアジド誘導体をつくり、次いで
低温下で対象とする酵素と反応させるか、又はコラーゲ
ン担体とジメチルアミノプロピオニトリルの共存下で対
象とする酵素と反応させるか、あるいはあらかじめコラ
ーゲン担体とジメチルアミノプロピオニトリルを反応さ
せ、次いで対象とする酵素と反応させるという手段をと
ることによって酵素とコラーゲン担体との結合体をつく
ることができる。That is, an azide derivative of a collagen carrier is prepared and then reacted with the target enzyme at low temperature, or reacted with the target enzyme in the coexistence of the collagen carrier and dimethylaminopropionitrile, or a collagen carrier and the collagen carrier are reacted in advance. A conjugate of an enzyme and a collagen carrier can be produced by reacting dimethylaminopropionitrile and then reacting with the enzyme of interest.

さらに又、コラーゲン担体の酸塩化物をつくり、これと
酵素を反応させる手段、あるいはＮ−エチル−５−フェ
ニルイソオキサゾリウム−３′−スルホネート等の縮合
試薬を用いてコラーゲン担体のアミノ基と酵素を結合さ
せる手段によっても対象酵素を固定化することができる
。Furthermore, an acid chloride of the collagen carrier may be prepared and reacted with an enzyme, or a condensation reagent such as N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonate may be used to form an acid chloride of the collagen carrier. The target enzyme can also be immobilized by means of enzyme binding.

これらの手段においては非常に温和な条件下で実施する
ことができるし、酵素と反応試薬との接触による影響も
さけられるので、酵素の活性の低下が極めて少く、安全
にしかも安定した固定化酵素を取得できるという知見を
得、本発明の方法を完成したものである。These methods can be carried out under very mild conditions, and the effects of contact between the enzyme and the reaction reagent can be avoided, so there is extremely little reduction in enzyme activity and a safe and stable immobilized enzyme can be obtained. The method of the present invention has been completed by obtaining the knowledge that it is possible to obtain the following.

次に具体的態様をあげて説明する。Next, specific aspects will be described.

（１）水洗して乾燥したコラーゲン担体を乾燥メタノー
ル中に懸濁した後、水冷下で塩素ガスを数分間通じて飽
和させて室温で１時間程度放置してメチルエステル化し
た後、メタノールあるいハ蒸溜水で充分洗滌する。(1) The washed and dried collagen carrier is suspended in dry methanol, saturated with chlorine gas for several minutes under water cooling, left at room temperature for about 1 hour to methyl esterify, and then mixed with methanol or Wash thoroughly with distilled water.

あるいは乾燥メタノール中、０．１ Ｍ塩酸存在下で０
℃乃至室扁の間ニ保ち、５日間程度メチルエステル化し
た後、蒸溜水で充分洗滌する。or in the presence of 0.1 M hydrochloric acid in dry methanol.
After methyl esterification for about 5 days at 100°C or room temperature, wash thoroughly with distilled water.

この場合、とくに前者の方法を用いる時には極めて短時
間で、効果的にコラーゲン担体のメチルエステル化を遂
行することができる。In this case, especially when the former method is used, the collagen carrier can be effectively methyl esterified in a very short time.

このようにして得られたメチル化誘導体をメタノール中
あるいは蒸溜水中に懸濁して、飽水ヒドラジンを１％乃
至５％になるように添加して室温下で一夜静置した後、
メタノールで洗滌して乾燥する力）、蒸溜水で洗滌して
コラーゲン担体のヒドラジドをつくる。The methylated derivative thus obtained was suspended in methanol or distilled water, saturated hydrazine was added to the solution to a concentration of 1% to 5%, and the mixture was allowed to stand overnight at room temperature.
The ability to wash with methanol and dry) and distilled water to create hydrazide, a collagen carrier.

このヒドラジドを０．５％乃至２％の塩酸に懸濁し、４
℃以下に氷冷しながら３％亜硝酸ソーダを終濃度が０，
２％乃至１％になる程度に攪拌しながら滴下する。This hydrazide was suspended in 0.5% to 2% hydrochloric acid, and
Add 3% sodium nitrite to a final concentration of 0, while cooling on ice below ℃.
Add dropwise while stirring to an extent of 2% to 1%.

５分から２０分程度ゆるく攪拌しγこ後、この反応液か
ら分って、ジオキサン次いで蒸溜水で、あるいは蒸溜水
又は０．０５Ｍ程度の食塩水を用いて充分に洗滌する。After stirring gently for about 5 to 20 minutes, the reaction solution is thoroughly washed with dioxane and then distilled water, or distilled water or about 0.05M saline solution.

使用する試薬の濃度及び反応時間は担体の状態によって
きめる。The concentration of the reagent used and the reaction time are determined depending on the state of the carrier.

次に１０℃以下の温度の下で、対象とする酵素とｐＨ５
乃至８．８の０．０５Ｍ程度の緩衝液中で反応させる。Next, at a temperature of 10°C or less, add the target enzyme and pH 5.
The reaction is carried out in a buffer solution of about 0.05M to 8.8.

２時間乃至２０時間反応後、１０℃以下に冷却した１Ｍ
食塩を含む０．０５Ｍ程度の緩衝液次いで０．０５Ｍ程
度の緩衝液あるいは蒸溜水で洗滌をくりかえし、洗液に
酵素活性がなくなるまで洗滌する。After reacting for 2 to 20 hours, 1M was cooled to 10°C or less.
Washing is repeated with a buffer solution of about 0.05M containing salt and then with a buffer solution of about 0.05M or distilled water until the washing solution has no enzyme activity.

このようにして目的とする固定化酵素を得ることができ
る。In this way, the desired immobilized enzyme can be obtained.

（２）水洗して乾燥したコラーゲン担体を対象とする酵
素の水溶液に懸濁する。(2) The washed and dried collagen carrier is suspended in an aqueous solution of the target enzyme.

酵素溶液の濃度は担体１００部に対し１０〜５０部程度
が程度である。The concentration of the enzyme solution is approximately 10 to 50 parts per 100 parts of the carrier.

これに３−ジメチルアミノプロピオニトリルを２０部程
度加えて、反応液のｐＨを６．０乃至６．５に保つ。About 20 parts of 3-dimethylaminopropionitrile is added to this to maintain the pH of the reaction solution at 6.0 to 6.5.

１５℃以下の温度の下で６時間乃至２０時間反応させた
後、０．０５Ｍ燐酸緩衝液で洗滌する。After reacting for 6 to 20 hours at a temperature below 15° C., the mixture is washed with 0.05M phosphate buffer.

次いで１Ｍ食塩を含む燐酸緩衝液に浸漬した後、引きつ
づき燐酸緩衝液で洗滌する。Next, it is immersed in a phosphate buffer containing 1M sodium chloride, followed by washing with a phosphate buffer.

（３）水洗して乾燥したコラーゲン担体１００部を蒸溜
水に懸濁し、これに３−ジメチルアミノプロピオニトリ
ルを２０部程度加えてｐＨを６．０乃至６．５に調節し
ながら、室温以下で６時間乃至２０時間反応せしめた後
、０．１Ｍ燐酸緩衝液で洗滌する。(3) Suspend 100 parts of washed and dried collagen carrier in distilled water, add about 20 parts of 3-dimethylaminopropionitrile to adjust the pH to 6.0 to 6.5, and lower the pH to room temperature. After reacting for 6 to 20 hours, the reaction mixture is washed with 0.1M phosphate buffer.

このような処理を行ったコラーゲン担体を対象酵素と水
溶液中で室温以下で１５５時間程反応させる。The collagen carrier treated in this way is reacted with the target enzyme in an aqueous solution at room temperature or below for about 155 hours.

次いで担体を分ち、冷却し７： ０． Ｉ Ｍ燐酸緩衝
液で洗滌した後、一度１Ｍ食塩を含む同緩衝液に浸漬し
た後、引つづき同緩衝液で洗滌をくりかえす。The carrier was then divided and cooled to 7:0. After washing with IM phosphate buffer, immerse once in the same buffer containing 1M sodium chloride, and then repeat washing with the same buffer.

（４）コラーゲン担体１００部を蒸溜水ま１こは０．０
５Ｍ燐酸緩衝液に懸濁し、Ｎ−エチル−５−フェニルイ
ソオキサゾリウム−３Ｌスルホネ一ト１００部程度を加
え５℃で２時間反応させ、担体を反応液から分離した後
、蒸溜水で洗滌する。(4) 100 parts of collagen carrier and 1 cup of distilled water are 0.0
Suspend in 5M phosphate buffer, add about 100 parts of N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3L sulfone, react at 5°C for 2 hours, separate the carrier from the reaction solution, and wash with distilled water. do.

再び蒸溜水または０．０５Ｍ緩衝液に懸濁して、酵素を
加えて、活性化された担体と酵素を２４時間反応させる
。The suspension is resuspended in distilled water or 0.05M buffer, the enzyme is added, and the activated carrier and enzyme are allowed to react for 24 hours.

その後０．０５Ｍ緩衝液で洗滌し、−ｉ、１μ食塩を含
む緩衝液に浸漬した後、引きつづき食塩を含まない緩衝
液で洗滌する。Thereafter, it is washed with a 0.05M buffer, immersed in a buffer containing -i, 1 μm of sodium chloride, and then washed with a buffer that does not contain sodium chloride.

（５）水洗して乾燥したコラーゲン担体にチオニルクロ
ライドを加え、３０分還流させたのち、室温で放置し、
１日〜２日後、クロロホルムで充分洗滌する。(5) Add thionyl chloride to the washed and dried collagen carrier, reflux for 30 minutes, and leave at room temperature.
After 1 to 2 days, wash thoroughly with chloroform.

クロル化された担体の酸塩化物は苛性ソーダ上で乾燥さ
せた後、１０℃以下で酵素と緩衝液中で反応させ、緩衝
液で充分洗滌することにより固定化酵素を得る。The chlorinated acid chloride of the carrier is dried over caustic soda, and then reacted with the enzyme in a buffer solution at 10° C. or below, followed by thorough washing with the buffer solution to obtain the immobilized enzyme.

上記したような方法によってコラーゲン担体に酵素を結
合せしめることができ、しかも温和な条件を用いるか、
前処理によって担体を活性化する手段によっているので
、試薬と酵素とが接触しないから、酵素活性を損うこと
なく効果的に固定化できる。The enzyme can be bound to the collagen carrier by the method described above, and using mild conditions,
Since the carrier is activated by pretreatment, the reagent and the enzyme do not come into contact with each other, so they can be effectively immobilized without impairing enzyme activity.

得られた固定化酵素はいづれも高い酵素活性を示すと同
時に、コラーゲン担体の種々の特性を保持しているので
、本発明の固定化酵素により、例えば、酵素反応が連結
化できるのをはじめ、酵素反応を広範に応用することが
可能になつ１こ。All of the obtained immobilized enzymes exhibit high enzymatic activity and at the same time retain various properties of collagen carriers. Therefore, the immobilized enzymes of the present invention can, for example, link enzyme reactions. This makes it possible to apply enzymatic reactions to a wide range of areas.

尚、他の蛋白質、ポリペプチドならびに抗生物質あるい
は酵素のエフェクターその他の低分子物質も上記と同様
の手段で固定化することが可能であるが、抗生物質を同
時に固定化することによって固定化酵素の保存中あるい
は使用中における微生物汚染による分解を防止すること
ができる。Note that other proteins, polypeptides, antibiotics, enzyme effectors, and other low-molecular substances can also be immobilized by the same means as above, but by simultaneously immobilizing antibiotics, the immobilized enzyme can be immobilized. Decomposition due to microbial contamination during storage or use can be prevented.

又、二種類以上の酵素を同時に固定化することも勿論可
能である。Furthermore, it is of course possible to immobilize two or more types of enzymes at the same time.

又、使用するコラーゲン担体の形状は膜状、糸状、粒状
、塊状、スポンジ状等、いづれの形に成型され１こもの
にも本発明の方法が実施できる。Further, the collagen carrier used can be formed into any shape such as membrane, thread, granule, lump, or sponge, and the method of the present invention can be applied to the collagen carrier.

さらに、以下の実施例は一部の酵素の固定化方法につい
て記載しγこものであるが、グルコアミラーゼ、α−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラ
ーゼ、リゾチーム、インベルターゼ、セルラーゼ、ガラ
クトシダーゼ、イソメラーゼ、ペクチナーゼ、ヒアルロ
ニダーゼ、トリプシン、キモトリプシンプラスミン等の
プロテアーゼ類の他、ウレアーゼ、リパーゼ、ペニシリ
ンアミダーゼ、アシラーゼ、リボヌクレアーゼ、ウリカ
ーゼ、アスパラギナーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキ
ナーゼ、トロンビン、グルコースオキシダーゼ、カタラ
ーゼ、パーオキシダーゼ、ｄ −アミノ酸オキシダーゼ
等、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵
素、合成酵素、リアーゼに属する多種類の酵素の固定化
も同様の技術手段によって達成される。Furthermore, although the following examples describe methods for immobilizing some enzymes, glucoamylase, α-amylase, β-amylase, pullulanase, isoamylase, lysozyme, invertase, cellulase, galactosidase, isomerase, In addition to proteases such as pectinase, hyaluronidase, trypsin, and chymotrypsin plasmin, urease, lipase, penicillin amidase, acylase, ribonuclease, uricase, asparaginase, streptokinase, urokinase, thrombin, glucose oxidase, catalase, peroxidase, d-amino acid oxidase, etc. The immobilization of many kinds of enzymes belonging to , hydrolases, isomerases, oxidoreductases, transferases, synthases, and lyases can also be achieved by similar technical means.

尚、以下の実施例中に示す酵素活性の単位は次の通りで
ある。The units of enzyme activity shown in the following examples are as follows.

プロテアーゼは３０℃、１分間に生成するチロシンμＩ
数；ウレアーゼは３０℃、１分間に生成するアンモニア
態窒素のμｙ数；グルコアミラーゼは４０℃、１分間に
おいてグルコース１００μＩを生成する活性；β−アミ
ラーゼ、α−アミラーゼは３０°０１分間においてグル
コース１００μｇに相当する還元力を生成する活性をい
う。Protease is tyrosine μI produced in 1 minute at 30°C.
Number; urease is the μy number of ammonia nitrogen produced in 1 minute at 30°C; glucoamylase has the activity of producing 100 μl of glucose in 1 minute at 40°C; β-amylase and α-amylase have the ability to produce 100 μg of glucose in 1 minute at 30°C This refers to the activity that generates reducing power equivalent to .

実施例 １ 成牛の生皮３．０ｉｉ（コラーゲンとして１．３ ｋｙ
金含有を水洗し、さらに５％の食塩水で可溶性物質を除
去して力）ら、常法により酵素処理により脱毛し、水洗
する。Example 1 Adult cow rawhide 3.0ii (1.3 ky as collagen)
The gold-containing material is washed with water, further soluble substances are removed with 5% saline solution, hair is removed by enzymatic treatment in a conventional manner, and the material is washed with water.

水洗した皮を約１ｏｆｆｌに切断してから、ｐＨ２，５
の塩酸２０１を加えて攪拌しながら、随時塩酸を加えて
ｐｎが３．０になるように調整する。After washing the skin and cutting it into about 1 offl, pH 2.5
Add 201 ml of hydrochloric acid and adjust the pn to 3.0 by adding hydrochloric acid at any time while stirring.

ｐｎが平衡に達した後、温度が２５°Ｃ以上に上昇せぬ
ようにして、この皮を肉挽機で細断し、細断した皮を攪
拌機に入れ、ｐＨ３，０の塩酸を全重量が２０ｋｇにな
るように加える。After the pn has reached equilibrium, the skin is shredded in a meat grinder without allowing the temperature to rise above 25°C, the shredded skin is placed in a stirrer, and the total weight of hydrochloric acid with a pH of 3.0 is added. Add so that it becomes 20 kg.

次にペニシリウム・スピニュローサム（Ｐｅｎ１ｃｉｌ
ｌ ｉｕｍｓｐｉｎｕｌｏｓｕｍ ） Ｔ −４（ＡＴ
ＣＣＩ ６３４８ ）より生産される酸性プロテアーゼ
２．５ｇを少量の稀塩酸に溶解して添加する。Next, Penicillium spinulosum (Pencil)
lium spinulosum) T-4 (AT
2.5 g of acidic protease produced by CCI 6348) is dissolved in a small amount of dilute hydrochloric acid and added.

混合物を２５℃で２４時間攪拌混合してコラーゲン繊維
を可溶化する。The mixture is stirred and mixed at 25° C. for 24 hours to solubilize the collagen fibers.

次いでフィルタープレスで沖過後、苛性ソーダ水溶液で
ｐＨ７〜８に中和してコラーゲン繊維を再生させる。Next, it is filtered through a filter press, and then neutralized to pH 7 to 8 with a caustic soda aqueous solution to regenerate collagen fibers.

この繊維を遠心分離機で集め水洗する。得られ１こコラ
ーゲン再生繊維をｐＨ３，０の塩酸中に溶解してコラー
ゲン濃度１％のコラーゲン水溶液をつくる。The fibers are collected using a centrifuge and washed with water. One obtained collagen regenerated fiber is dissolved in hydrochloric acid of pH 3.0 to prepare a collagen aqueous solution having a collagen concentration of 1%.

この溶液を脱泡した後、深さ１ｃＩｒＬのアクリル樹脂
製容器に流しこみ、２５℃で通風しながら乾燥させ、コ
ラーゲン膜をつくる。After defoaming this solution, it is poured into an acrylic resin container with a depth of 1 cIrL and dried at 25° C. with ventilation to form a collagen film.

次いでこのコラーゲン膜を１０％食塩、１％硫酸アンモ
ニア、燻液０．５％力）らなるｐＨ１０の水溶液に１時
間浸漬して硬化処理を行った後、水洗して乾燥すること
により硬化されたコラーゲン膜が得られる。Next, this collagen film was hardened by immersing it in an aqueous solution of pH 10 consisting of 10% salt, 1% ammonia sulfate, and 0.5% smoke solution for 1 hour, followed by washing with water and drying. A collagen membrane is obtained.

得られ１こ膜１ｇをとり、乾燥メタノール１５０ｍ１中
に懸濁し、水浴中で冷却しながら塩素ガスを２分間通じ
て飽和させ１こ後、飽和状態のまま室温で１時間静置す
る。Take 1 g of the obtained membrane, suspend it in 150 ml of dry methanol, and saturate the suspension with chlorine gas for 2 minutes while cooling in a water bath.After that, the suspension is allowed to stand still at room temperature for 1 hour in a saturated state.

次いでメタノールで充分洗滌してメチル化誘導体を得る
。Next, the methylated derivative is obtained by thorough washing with methanol.

このメチル化誘導体を１９０ｒｒＬｌのメタノール中に
懸濁して飽水ヒドラジン（８０％溶液）を１０ｍ１添加
して室温下で一夜静置した後、メタノールで洗滌し、乾
燥する。This methylated derivative was suspended in 190 rrLl of methanol, 10 ml of saturated aqueous hydrazine (80% solution) was added, and the suspension was allowed to stand overnight at room temperature, washed with methanol, and dried.

得られ１こコラーゲン膜のヒドラジドを２％塩酸１００
ｍ１に懸濁して４℃以下に氷冷し攪拌しながら、３％亜
硝酸ソーダ溶液１５ＴｒＬｌを滴下する。The hydrazide of the obtained collagen membrane was dissolved in 2% hydrochloric acid 100%
15 TrL of a 3% sodium nitrite solution was added dropwise while cooling the suspension in ice-cooled water to below 4°C and stirring.

そのまま１０分間ゆるく攪拌した後、膜を引き上げ、ジ
オキサン次いで蒸溜水で充分洗滌することによってコラ
ーゲン膜のアジド誘導体が得られる。After stirring gently for 10 minutes, the membrane is taken out and thoroughly washed with dioxane and then distilled water to obtain an azide derivative of collagen membrane.

次にこのアジド誘導体を４℃の下で０．０５Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ８，５）に２．５ ｍｐ／ｍｌあるいは５．０
ｍｙ ／―の濃度に対象とする各種酵素（第１表に示
す）を含有する溶液１００ｄ中に浸漬して１５時間反応
させる。Next, this azide derivative was added to 0.05M phosphate buffer (pH 8.5) at 4°C at a concentration of 2.5 mp/ml or 5.0 mp/ml.
It is immersed in 100 d of a solution containing various target enzymes (shown in Table 1) at a concentration of my/- and reacted for 15 hours.

反応終了後、膜を引き上げｐＨ４，０の蒸溜水で洗滌後
、１Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ５，５）
、０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０）あるいは０．０
５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）に浸漬した後、食塩を
含まない上記と同じ組成の緩衝液を用いて、洗液に酵素
活性がなくなるまで洗滌すると対象とする各酵素の結合
し１こ固定化酵素膜が得られる。After the reaction was completed, the membrane was pulled up and washed with distilled water of pH 4.0, and then washed with 0.05M phosphate buffer (pH 5.5) containing 1M sodium chloride.
, 0.05M phosphate buffer (pH 8,0) or 0.0
After immersing in 5M) Lys buffer (pH 8,0), washing with a buffer containing no salt and having the same composition as above until there is no enzyme activity in the washing solution will remove the binding of each enzyme of interest. An immobilized enzyme membrane is obtained.

各酵素膜の示す酵素活性は下記第１表の通りである。The enzyme activity exhibited by each enzyme membrane is shown in Table 1 below.

実施例 ２ 成牛の牛皮を水洗し脱毛し１こ後、さらに水洗してから
コラーゲン層をとり肉挽機で冷却しながら細かに破砕し
てから、１０倍量の０．５ Ｎ苛性ソーダ、１６％硫酸
ソーダ、０．２モル七ツメチルアミンを含有する混合水
溶液中に入れ、よく攪拌した後、２週間放置する。Example 2 After washing the hide of an adult cow with water and dehairing it, it was further washed with water, the collagen layer was removed, and it was finely crushed while cooling in a meat grinder, and then 16 times the volume of 0.5N caustic soda was added. % sodium sulfate and 0.2 mol of methylamine, stir well, and leave for 2 weeks.

次いで酢酸にてｐＨ７，０に中和し１こ後水洗し、水洗
後酢酸にてｐＨ４，０以下に保ち、充分攪拌することに
よってコラーゲンを可溶化する。Next, the mixture is neutralized to pH 7.0 with acetic acid, washed once with water, and after washing with water, the pH is maintained at 4.0 or below with acetic acid, and the collagen is solubilized by stirring thoroughly.

次にフィルタープレスで濾過した後、苛性ソーダ溶液で
ｐＨ５６としてコラーゲン繊維を再生させる。Next, after filtering with a filter press, the pH is adjusted to 56 with a caustic soda solution to regenerate collagen fibers.

この繊維を遠心分離機で集め水洗する。The fibers are collected using a centrifuge and washed with water.

得られ１こコラーゲン再生繊維をｐＨ３，０の塩酸中に
溶解してコラーゲン濃度１％のコラーゲン水溶液をつく
る。One obtained collagen regenerated fiber is dissolved in hydrochloric acid of pH 3.0 to prepare a collagen aqueous solution having a collagen concentration of 1%.

この溶液に苛性ソーダ水溶液を加えてｐＨ５，６とし、
１％のジアルデヒドスターチ水溶液をコラーゲン量に対
して５％になるように添加し、脱泡した後、深さ１ｃＴ
Ｌのアクリル樹脂製容器に流しこみ、２０℃で通風しな
がら乾燥させることにより、ジアルデヒドスターチで硬
化され１こコラーゲン膜を得る。Add a caustic soda aqueous solution to this solution to adjust the pH to 5.6,
Add 1% dialdehyde starch aqueous solution to a concentration of 5% based on the amount of collagen, defoamer, and then remove to a depth of 1 cT.
The mixture is poured into a L-sized acrylic resin container and dried at 20° C. with ventilation, thereby being hardened with dialdehyde starch to obtain a single collagen film.

得られ１こ膜ＩＩをとり以下、実施例１の方法と全く同
様の操作によって、コラーゲン膜のアジド誘導体をつク
リ、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、トリプシン及び
ウレアーゼと反応させ、各々の酵素の結合し１こ固定化
酵素膜を得る。The obtained membrane II was taken and the azide derivative of the collagen membrane was reacted with trichloride, β-amylase, α-amylase, trypsin and urease in exactly the same manner as in Example 1, and the enzymes of each enzyme were reacted. A single immobilized enzyme membrane is obtained.

各酵素膜の１ｄ当りの酵素活性はβ−アミラーゼ１．４
単位、α−アミラーゼ０．６５単位、トリプシン３８単
位、ウレアーゼ７．０単位であった。The enzyme activity per 1 d of each enzyme membrane is β-amylase 1.4
units, α-amylase 0.65 units, trypsin 38 units, and urease 7.0 units.

実施例 ３ 実施例１の方法に従って酸性プロテアーゼによって可溶
化され１こコラーゲンの１％水溶液と実施例２の方法に
よってアルカリ溶液中で可溶化され１こコラーゲンの１
％水溶液を、ｐ）（６の条件下で前者７部に対し後者３
部の割合で混合する。Example 3 A 1% aqueous solution of 1% collagen solubilized with acidic protease according to the method of Example 1 and 1% aqueous solution of 1% collagen solubilized in an alkaline solution according to the method of Example 2.
% aqueous solution, p) (7 parts of the former to 3 parts of the latter under conditions of 6)
Mix in the following proportions.

この混合溶液を脱泡し１こ後、深さ１ｃｒｒＬのアクリ
ル製樹脂容器に流しこみ、２０℃で通風しながら乾燥さ
せ、コラーゲン膜をつくる。After defoaming this mixed solution, it is poured into an acrylic resin container with a depth of 1 crrL and dried at 20° C. with ventilation to form a collagen film.

次いで、このコラーゲン膜を蒸溜水にて湿らせ１こ後３
０Ｗの紫外線灯を用いて２０ｃｒＩＬの距離力）ら２０
分間、紫外線を照射した。Next, this collagen membrane was moistened with distilled water for 1 hour and 3 hours later.
Using a 0W ultraviolet lamp, a distance of 20crIL) and 20
It was irradiated with ultraviolet light for a minute.

照射後、５％食塩水溶液に浸漬した後、流水で２０分間
水洗した後乾燥することにより強度の向上しγこコラー
ゲン膜が得られる。After irradiation, the film is immersed in a 5% saline solution, washed with running water for 20 minutes, and then dried to obtain a gamma-collagen film with improved strength.

得られ１こ膜１ｇをとり、以下実施例１の方法と全く同
様の操作によって、コラーゲン膜のアジド誘導体をつく
つ１こ後、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、トリプシ
ン及びウレアーゼと反応させ、各々の酵素の結合し１こ
固定化酵素膜を得る。1 g of the obtained membrane was taken, and an azide derivative of collagen membrane was prepared in the same manner as in Example 1. After that, it was reacted with β-amylase, α-amylase, trypsin and urease, and each The enzyme is bound to obtain an immobilized enzyme membrane.

各々酵素膜の酵素活性は各酵素膜１ｄ当りβ−アミラー
ゼ１．５単位、α−アミラーゼ０．５単位、トリプシン
４単位、ウレアーゼ８．０単位である。The enzyme activities of each enzyme membrane were 1.5 units of β-amylase, 0.5 units of α-amylase, 4 units of trypsin, and 8.0 units of urease per 1 d of each enzyme membrane.

実施例 ４ 成牛皮を洗滌しフレツシングマシンで裏打ちした後、常
法により脱毛する。Example 4 Adult cowhide is washed and lined with a fletching machine, and then hair is removed in a conventional manner.

脱毛し１こ皮は約３０ｎＸ３０ｃｍに切断して洗滌しｆ
こ後、２％の水酸化石灰溶液を３倍量加え、２０’Ｃで
３日間石灰漬を行う。After removing hair, cut the skin into approximately 30nx30cm pieces and wash them.
After this, three times the amount of 2% hydroxide lime solution is added, and liming is carried out at 20'C for 3 days.

石灰漬後水洗し、１％食塩を含む硫酸水溶液で中和し水
洗する。After liming, wash with water, neutralize with an aqueous sulfuric acid solution containing 1% common salt, and wash with water.

この皮を２％乳酸水溶液に１０℃で５日間浸漬し膨潤さ
せる。This skin is immersed in a 2% lactic acid aqueous solution at 10° C. for 5 days to swell.

次いでこの膨潤し１こ皮を肉挽機で切断し、更にローラ
ーを通して個々のコラーゲン繊維に解組織した薄紙状物
を得る。Next, this swollen husk is cut with a meat grinder, and then passed through a roller to obtain a thin paper-like material which is disassembled into individual collagen fibers.

この薄紙状物に０．５％乳酸水溶液を加え混合機で充分
に混合してコラーゲン濃度３％のコラーゲン繊維分散液
をつくる。A 0.5% lactic acid aqueous solution is added to this paper-like material and thoroughly mixed with a mixer to prepare a collagen fiber dispersion having a collagen concentration of 3%.

一方前記と同様に洗滌、裏打ち、脱毛；洗滌し１こ成牛
皮を肉挽機で細断し、微細化する。On the other hand, washing, lining, and hair removal are carried out in the same manner as above; one washed adult cowhide is shredded using a meat grinder to make it fine.

次いで食塩水及び冷水でくり力）えし洗滌する。Then, wash with salt water and cold water.

洗滌後の微細皮を攪拌機に入れ、塩酸を加えてｐＨ３，
０とし１こ後、実施例１で用いγこペニシリウム・スピ
ニュローサムの生産する酸性プロテアーゼか、アスペル
ギルス・ニガーの生産する酸性プロテアーゼを加えて２
５°Ｃ１５時間混合攪拌してコラーゲン繊維を溶解する
。After washing, put the fine skin in a stirrer and add hydrochloric acid to adjust the pH to 3.
After adding 0 and 1, acidic protease produced by γ-penicillium spinulosum used in Example 1 or acidic protease produced by Aspergillus niger was added.
Mix and stir at 5°C for 15 hours to dissolve collagen fibers.

次いで、得られた溶液を濾過後、苛性ソーダ水溶液でｐ
Ｈ７〜８に中和し、コラーゲン繊維を再生させる−０こ
の再生繊維を遠心分離機で集め水洗する。Next, the obtained solution was filtered, and then purified with an aqueous solution of caustic soda.
Neutralize to H7-8 and regenerate collagen fibers -0 The regenerated fibers are collected with a centrifuge and washed with water.

この再生繊維を０．５％乳酸水溶液中に溶解してコラー
ゲン濃度３％のコラーゲン水溶液をつくる。The regenerated fibers are dissolved in a 0.5% lactic acid aqueous solution to prepare a collagen aqueous solution having a collagen concentration of 3%.

上記の３％コラーゲン繊維分散液７０重量部と３％コラ
ーゲン溶液３０重量部を混合機中で混和し、さらにホモ
ゲナイザーで均一にして、脱泡して製膜用原液をつくる
。70 parts by weight of the above 3% collagen fiber dispersion and 30 parts by weight of the 3% collagen solution are mixed in a mixer, homogenized using a homogenizer, and defoamed to prepare a stock solution for film forming.

原液は環状細隙０．８ｍｍ直径１６３１１にのノズルよ
り毎分８ｍの速度で２０°Ｃの２３％食塩水中に吐出し
凝固せしめ管状体をつくる。The stock solution was discharged from a nozzle with an annular slit of 0.8 mm in diameter at a speed of 8 m/min into a 23% saline solution at 20°C and coagulated to form a tubular body.

この凝固管状体を燻液２％、食塩１０％、酢酸０．３５
％、酢酸ソーダ７．８％の溶液中に３０分間浸漬しＴこ
後、流水で洗滌する。This coagulated tubular body was mixed with 2% smoke solution, 10% common salt, and 0.35% acetic acid.
%, sodium acetate solution for 30 minutes, and then rinsed with running water.

次いでこの管状体を３５％グリセリン水溶液と接触せし
めてから、３０℃の乾燥器内で管状体の内部に１００ｍ
１ｒＬ水柱の圧力で空気を吹きこみ４０分間乾燥する。Next, this tubular body was brought into contact with a 35% glycerin aqueous solution, and then a 100 m
Blow air at a pressure of 1 rL water column and dry for 40 minutes.

次に管状体に耐層するグリセリンを水洗し再び３０℃に
て管状体内部に１００ｍｍ水柱の圧力で空気を吹きこみ
乾燥する。Next, the glycerin coated on the tubular body is washed with water, and air is blown into the tubular body at a pressure of 100 mm of water at 30° C. to dry it again.

この乾燥管状体そのままの膜、あるいは切り開いてシー
ト状にし１こ膜１ｇをとり、以下実施例１の方法と全く
同様の操作によって、コラーゲン膜のアジド誘導体をつ
くり、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、トリプシン
、アルカリ性プロテアーゼ及びウレアーゼと反応させ、
各各の酵素の結合し１こ固定化酵素膜を得る。Take 1 g of this dried tubular membrane as it is, or cut it open and make it into a sheet, and use the same procedure as in Example 1 to prepare an azide derivative of collagen membrane, and prepare β-amylase, glucoamylase, and trypsin. , reacted with alkaline protease and urease,
Each enzyme is bound to obtain an immobilized enzyme membrane.

各酵素膜ＩＣＩ？Ｌの示す酵素活性はβ−アミラーゼ１
．８単位、グルコアミラーゼ１．０単位、トリプシン５
単位、アルカリ性プロテアーゼ２．５単位、ウレアーゼ
９．０単位であった。Each enzyme membrane ICI? The enzyme activity indicated by L is β-amylase 1
．． 8 units, glucoamylase 1.0 units, trypsin 5
unit, alkaline protease 2.5 units, and urease 9.0 units.

実施例 ５ 実施例４の方法と同様の操作によって調製した３％コラ
ーゲン繊維分散液７０部と３％コラーゲン溶液１５部に
精製セルロース微細繊維１５部を固体濃度が３％になる
ように添加混合し、充分混和した後、さらにホモゲナイ
ザーで均一に分散させ、真空脱泡して製膜用原液をつく
る。Example 5 15 parts of purified cellulose fine fibers were added and mixed to 70 parts of a 3% collagen fiber dispersion and 15 parts of a 3% collagen solution prepared by the same procedure as in Example 4 so that the solid concentration was 3%. After thoroughly mixing, the mixture is further uniformly dispersed using a homogenizer and degassed under vacuum to prepare a stock solution for film formation.

この原液を用いて実施例４の方法と同様の操作によって
乾燥した管状のコラーゲン・セルロース混合物の膜を得
る。Using this stock solution, a dried tubular membrane of collagen/cellulose mixture is obtained by the same operation as in Example 4.

この乾燥管状体そのままの膜あるいは管状体を切り開い
てシート状にした膜４ｇをとり乾燥メタノール４５０ｍ
１中に懸濁し、水浴中で冷却しながら塩素ガスを３分間
通じて飽和させた後、飽和状態のまま室温で１時間静置
する。Take 4 g of the dried tubular body as it is or cut the tubular body open and make a sheet, and add 450 m of dry methanol.
1 and saturated with chlorine gas for 3 minutes while cooling in a water bath, and then allowed to stand still in the saturated state at room temperature for 1 hour.

次に蒸溜水を用いて充分に洗滌してメチル化誘導体を得
る。Next, the methylated derivative is obtained by thoroughly washing with distilled water.

このメチル化誘導体を５７０１ｒＬｌの蒸溜水中に懸濁
して飽水ヒドラジン（８０％溶液）を３０ｒｒＬｌ添加
して室温下で一夜放置し１こ後、蒸溜水で洗滌して乾燥
する。This methylated derivative is suspended in 5,701 rLl of distilled water, 30rrLl of saturated hydrazine (80% solution) is added, and the suspension is left at room temperature overnight, after which it is washed with distilled water and dried.

得られたヒドラジド誘導体を２％塩酸２００ＴｆＬｌに
懸濁して４℃以下に氷冷し、攪拌しながら３％亜硝酸ソ
ーダ溶液５０′ｒｎｌを滴下する。The obtained hydrazide derivative is suspended in 200 TfLl of 2% hydrochloric acid, cooled on ice to below 4°C, and 50'rnl of 3% sodium nitrite solution is added dropwise with stirring.

そのまま１０分間ゆるく攪拌しｆこ後、膜を引き上げ、
冷水で洗滌することによってアジド誘導体が得られる。After stirring gently for 10 minutes, remove the membrane.
The azide derivative is obtained by washing with cold water.

このアジド誘導体を４℃の下で、対象とする酵素（第２
表に示す）を２．５■／ＴＬｌの濃度で含有する０、０
５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０）に浸漬して１５時間反応
させる。This azide derivative was heated to 4°C and the target enzyme (second
0,0 containing (shown in the table) at a concentration of 2.5/TLl
It is immersed in 5M phosphate buffer (pH 8,0) and reacted for 15 hours.

酵素含有緩衝液は担体として供し１こ膜に対して５０倍
量を用いた。The enzyme-containing buffer solution was used as a carrier and was used in an amount of 50 times per membrane.

反応終了後、膜を引き上げてｐＨ４，０の蒸溜水で洗滌
し１こ後、１Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ
５，５又はｐＨ７，０又はｐＨ８，０）に浸漬し、次い
で食塩を含まない上記燐酸緩衝液を用いて洗液に酵素活
性がなくなるまで洗滌することにより対象とする各酵素
の結合し１こ固定化酵素膜が得られる。After the reaction, the membrane was taken out and washed with distilled water at pH 4.0. After 1 hour, it was washed with 0.05M phosphate buffer (pH
5.5 or pH 7.0 or pH 8.0), and then washed with the above phosphate buffer containing no salt until the washing solution has no enzyme activity, thereby binding each enzyme of interest. An immobilized enzyme membrane is obtained.

各酵素膜の酵素活性は第２表の通りである。The enzyme activity of each enzyme membrane is shown in Table 2.

このキモトリプシン膜を湿潤状態で１０℃で保存し、随
時活性の測定をくり返えし１こ結果を第１図に示し１こ
が、１ケ月９０％以上の酵素活性が保持されＴこ。This chymotrypsin membrane was stored in a humid state at 10°C, and the activity was repeatedly measured from time to time.The results are shown in Figure 1, and the enzyme activity was maintained at more than 90% for one month.

又、グルコアミラーゼ膜を０．１モル燐酸緩衝液（ｐＨ
５，５）中、２０℃で保存し、随時活性の測定をくり返
えした成績を第２図に示し１こが、１ケ月以上活性の低
下が認められなか？た。In addition, the glucoamylase membrane was soaked in a 0.1M phosphate buffer (pH
Figure 2 shows the results of 5,5) storage at 20°C and repeated measurement of activity at any time.No decrease in activity was observed for 1 month or more. Ta.

又、β−アミラーゼ膜を用いて酵素反応を反覆くり返え
し１こ成績を第３図に示したが、酵素活性の変化はタカ
）つ１こ。In addition, the enzymatic reaction was repeated using a β-amylase membrane, and the results are shown in Figure 3, but the change in enzyme activity was very small.

実施例 ６ 実施例１の方法と同様の操作によって調製したコラーゲ
ンの１％水溶液５０Ｔｎｌに蒸溜水４５ｍＡ’を加え、
攪拌しつつ、カルボキシメチルセルロースの１％水溶液
５ｒｎｌを混合液のｐＨが４．０付近にあるように点検
しながら、徐々に添加する。Example 6 45 mA' of distilled water was added to 50 Tnl of a 1% aqueous solution of collagen prepared by the same procedure as in Example 1,
While stirring, gradually add 5 rnl of a 1% aqueous solution of carboxymethylcellulose, checking that the pH of the mixture is around 4.0.

かくするとコラーゲンとカーボキシメチルセルロースの
複合体が形成され繊維状の複合体の分散した液が得られ
る。In this way, a complex of collagen and carboxymethyl cellulose is formed, and a liquid in which the fibrous complex is dispersed is obtained.

又、同様の手段によって、コラーゲンの１％水溶液５０
ｍ１に蒸溜水４５ｍ１を加え、攪拌下にヒアルロン酸の
２％水溶液５ｒｒＬｌを徐々に添加してコラーゲンとヒ
アルロン酸の複合体を形成せしめる。Also, by the same means, 50% collagen aqueous solution
45 ml of distilled water is added to ml, and while stirring, 5 rr Ll of a 2% aqueous solution of hyaluronic acid is gradually added to form a complex of collagen and hyaluronic acid.

得られ１こコラーゲンと多糖の複合体を含む溶液を脱泡
した後、深さ１ｃｎＬ、巾１０ｃＩＩＬ、長さ１０ｃｒ
ｆＬのアクリル樹脂製容器に入れ２５℃で通風しながら
乾燥させ、コラーゲンとカーボキシメチルセルロースあ
るいはコラーゲンとヒアルロン酸の結合した膜をつくる
。After defoaming the obtained solution containing the collagen and polysaccharide complex, it was made to have a depth of 1 cnL, a width of 10 cIIL, and a length of 10 cr.
The mixture is placed in a fL acrylic resin container and dried at 25°C with ventilation to form a film in which collagen and carboxymethylcellulose or collagen and hyaluronic acid are combined.

このようにして得た膜５００■を夫々実施例１の方法と
全く同様の操作によって、コラーゲン膜のアジド誘導体
をつくった後、対象とする酵素（第３表に示す）と反応
させ、各々の酵素と結合したコラーゲン・カルボキシメ
チルセルロース複合体あるいはコラーゲン・ヒアルロン
酸複合体の固定化酵素膜を得る。Azide derivatives of collagen membranes were prepared from 500 μm of the membranes obtained in this manner in exactly the same manner as in Example 1, and then reacted with the target enzymes (shown in Table 3). An immobilized enzyme membrane of a collagen/carboxymethylcellulose complex or a collagen/hyaluronic acid complex bound to an enzyme is obtained.

酵素膜の酵素活性は第３表の通りである。The enzyme activity of the enzyme membrane is shown in Table 3.

実施例 ７ 成牛皮を太鼓中で水洗し、フレツシングマシンで裏打し
た後、脱毛用酵素剤の溶液に浸漬して毛根をゆるめ、脱
毛機で脱毛する。Example 7 After washing adult cow hide with water in a drum and lining it with a fletching machine, it is immersed in a solution of an enzyme for depilation to loosen the hair roots, and the hair is removed with a depilation machine.

脱毛した皮を約３０ｃｒｒＬ×３０ｃｒＩＬに切断して
洗滌後、２％の水酸化石灰溶液中に浸漬する。The depilated skin is cut into approximately 30 crrL x 30 crIL, washed, and then immersed in a 2% lime hydroxide solution.

その後、太鼓中で水洗して付層石灰を除去し、１％食塩
水を含む塩酸溶液で中和して水洗するとコラーゲン繊維
の組織のままの精製生皮が得られる。Thereafter, the layered lime is removed by washing in a drum, neutralized with a hydrochloric acid solution containing 1% saline, and washed with water to obtain purified rawhide with collagen fiber structure intact.

この生皮を用いて実施例５の方法と同様の操作によって
アジド誘導体をつくり、β−アミラーゼあるいはグルコ
アミラーゼと反応させると、これらの酵素の結合した組
織状の固定化酵素が得られる。Using this rawhide, an azide derivative is prepared in the same manner as in Example 5 and reacted with β-amylase or glucoamylase to obtain a tissue-like immobilized enzyme containing these enzymes.

これらのもの１ｇの示す酵素活性はβ−アミラーゼ３０
０単位、グルコアミラーゼ２１０単位であった。The enzyme activity of 1g of these is β-amylase 30
0 units, glucoamylase 210 units.

実施例 ８ 実施例７と同様に洗滌、裏打ち、脱毛及び洗滌して得１
こ生皮を順次小さなりリアランスを有するプレートを備
え１こ肉挽機で数回細切し、微細化する。Example 8 Washing, lining, hair removal and washing in the same manner as in Example 7.
The rawhide is shredded several times using a meat grinder equipped with plates having a small clearance.

この微細皮をさらに食塩水及び冷水で洗滌して精製した
後、塩酸水溶液に懸濁してコラーゲン濃度２％のコラー
ゲン繊維分散液をつくる。This fine skin is further purified by washing with saline and cold water, and then suspended in an aqueous hydrochloric acid solution to prepare a collagen fiber dispersion having a collagen concentration of 2%.

これに１％アルデヒドスターチ水溶液をコラーゲン量に
対して２％の割合で添加混合してアクリル樹脂製やアル
ミニウム製等の容器に流しこみ、そのまま凍結乾燥して
コラーゲン濃度に応じ１こ密度の繊維状の成型物を得る
。Add and mix a 1% aldehyde starch aqueous solution at a ratio of 2% to the amount of collagen, pour into a container made of acrylic resin or aluminum, and freeze-dry as it is to form a fiber with a density of 1% depending on the collagen concentration. Obtain a molded product.

この成型物を用いて実施例１の方法と同様の操作によっ
てアジド誘導体をつくり、β−アミラーゼあるいはグル
コアミラーゼと反応させる、と、これら酵素の結合した
組織状の固定化酵素が得られる。Using this molded product, an azide derivative is prepared in the same manner as in Example 1, and is reacted with β-amylase or glucoamylase to obtain a tissue-like immobilized enzyme containing these enzymes.

これらのもの１ｇの示す酵素活性はβ−アミラーゼ４２
０単位、グルコアミラーゼ２７０単位であった。The enzyme activity exhibited by 1 g of these substances is β-amylase 42
0 units, glucoamylase 270 units.

実施例 ９ 実施例４の方法と同様の操作によって調製したコラーゲ
ン再生繊維をｐＨ３，０の塩酸溶液に溶解してコラーゲ
ン濃度２％のコラーゲン水溶液をつくる。Example 9 Collagen regenerated fibers prepared by the same procedure as in Example 4 are dissolved in a hydrochloric acid solution of pH 3.0 to prepare a collagen aqueous solution with a collagen concentration of 2%.

この溶液を濾過し、脱泡した後、吐出口の直径０．５ｍ
ｍのノズルから長さ５０ｃＩＩＬの円筒に入れた３０％
芒硝水溶液（ｐＨ１０）中に毎分１．２ｍ力）ら１．５
ｍの速さで押し出す。After filtering this solution and defoaming, the diameter of the discharge port is 0.5 m.
30% from a nozzle of m into a cylinder of length 50 cIIL
1.2 m/min) in aqueous sodium sulfate solution (pH 10)
Push out at a speed of m.

凝固した糸をローラーに誘導して凝固浴（３０％芒硝水
溶液（ｐＨ１０））を通過させた後、捲取る。The coagulated thread is guided to a roller, passed through a coagulation bath (30% aqueous sodium sulfate solution (pH 10)), and then wound up.

捲取られた糸は１０％食塩、１％硫酸アンモニア、燻液
０．５％からなる水溶液（ｐＨ１０）に１時間浸漬した
後、水洗して乾燥する。The wound thread is immersed in an aqueous solution (pH 10) consisting of 10% salt, 1% ammonia sulfate, and 0.5% smoke for one hour, then washed with water and dried.

このようにして作られ１こコラーゲン糸４ｇをとり、乾
燥メタノール４８０ＩＩＬｌと濃塩酸４ｄを加え２０℃
で５日間以上静置した後、メタノールで洗滌してメチル
化誘導体を得る。Take 4 g of one collagen thread made in this way, add 480 IIL of dry methanol and 4 d of concentrated hydrochloric acid, and heat at 20°C.
After standing for 5 days or more, the mixture is washed with methanol to obtain a methylated derivative.

このメチル化誘導体を用いて実施例５の方法と全く同様
の操作によってアジド化し、このアジド誘導体を４℃の
下でβ−アミラーゼかグルコアミラーゼと反応させ、こ
れらの結合した固定化酵素糸を得る。Using this methylated derivative, azide is carried out in exactly the same manner as in Example 5, and this azide derivative is reacted with β-amylase or glucoamylase at 4°C to obtain an immobilized enzyme thread in which these are bound. .

これらの酵素糸の１ｇが示す酵素活性はβ−アミラーゼ
糸は４５０単位、グルコアミラーゼは３００単位であっ
た。The enzyme activity exhibited by 1 g of these enzyme threads was 450 units for β-amylase thread and 300 units for glucoamylase.

実施例 １０ 実施例１の方法と同様の操作によってコラーゲン濃度１
％のコラーゲン水溶液をつくり、この溶液に１％アルデ
ヒドスターチ水溶液をコラーゲン１００部に対して２部
の割合で添加混合して、アクリル樹脂製又はガラス製等
の容器に流しこみ、そのま５凍結乾燥して、コラーゲン
濃度に応じた密度のスポンジ状の成型物を得る。Example 10 A collagen concentration of 1 was obtained by the same procedure as in Example 1.
% collagen aqueous solution, add and mix 1% aldehyde starch aqueous solution to this solution at a ratio of 2 parts to 100 parts collagen, pour into a container made of acrylic resin or glass, and freeze-dry as is. A sponge-like molded product having a density corresponding to the collagen concentration is obtained.

この成型物を用いて実施例１の方法と同様の操作によっ
てアジド誘導体をつくり、β−アミラーゼあるいはグル
コアミラーゼと反応させ、これらの酵素の結合したスポ
ンヂ状の固定化酵素が得られる。Using this molded product, an azide derivative is prepared in the same manner as in Example 1 and reacted with β-amylase or glucoamylase to obtain a sponge-like immobilized enzyme bound to these enzymes.

これらのＩＩが示す酵素活性はβ−アミラーゼ４３５単
位、グルコアミラーゼ２８０単位であった。The enzyme activities exhibited by these IIs were 435 units of β-amylase and 280 units of glucoamylase.

実施例 １１ 実施例１の方法と同様の操作によって調製したコラーゲ
ンの６％水溶液を脱泡した後、注射筒につめ直径２１ｎ
１１Ｌの管口から食塩１０％、硫酸アンモニア１％、燻
液１％の混合溶液（ｐＨ１０）中に滴下するとコラーゲ
ンが粒状に凝固する。Example 11 After defoaming a 6% collagen aqueous solution prepared by the same method as in Example 1, a syringe with a diameter of 21 nm was inserted into the syringe.
When dripped into a mixed solution (pH 10) of 10% common salt, 1% ammonia sulfate, and 1% liquid smoke from the mouth of an 11L tube, the collagen coagulates into particles.

これを水洗し風乾する。Wash this with water and air dry.

又は上記のコラーゲン水溶液を内径２朋程度のガラス管
につめ総線量０．１〜１０Ｍγ（メガレントゲン）のγ
線照射を行い、ゲル化したコラーゲンをとり出して水洗
した後風乾する。Alternatively, the above collagen aqueous solution is packed in a glass tube with an inner diameter of approximately 2 mm and the total dose is 0.1 to 10 Mγ (megaroentgen).
After irradiation with radiation, the gelled collagen is taken out, washed with water, and air-dried.

この乾燥物を３朋〜５朋のブロック状に切断するか、粉
砕機で砕片とする。This dried product is cut into 3 to 5 blocks, or crushed into pieces using a pulverizer.

このようにして得られた粒状又はブロック状、砕片状の
成型物を用いて実施例１の方法と同様の操作によってア
ジド誘導体をつくり、β−アミラーゼ又はグルコアミラ
ーゼの結合した粒状乃至はブランク状の固定化酵素を得
る。Using the granular, block-shaped, or crushed molded product obtained in this way, an azide derivative is prepared in the same manner as in Example 1, and a granular or blank-shaped product containing β-amylase or glucoamylase is prepared. Obtain immobilized enzyme.

得られた粒状物１ｇの示す酵素活性はβ−アミラーゼ３
５０単位、グルコアミラーゼ２３０単位であり、ブロッ
ク状のもの１ｇの示す酵素活性はβ−アミラーゼは３０
０単位、グルコアミラーゼは２５０単位であった。The enzyme activity of 1 g of the obtained granules is β-amylase 3.
50 units of glucoamylase, 230 units of glucoamylase, and the enzyme activity shown by 1 g of the block-shaped product is 30 units of β-amylase.
0 units, and glucoamylase was 250 units.

実施例 １２ 実施例５の方法と同様の操作によって調製した膜状のコ
ラーゲン担体をメチル誘導体としたもの５００■を１６
ｒｒＬｌの蒸溜水に懸濁し、３−ジメチルアミノプロピ
オニトリル０．２１ｒＬｌとアセトアルデヒド０．１
ｍＪを添加し、０．５Ｎ塩酸でｐＨを６．０〜６．５に
調整し、１５℃で２０時間静置する。Example 12 500μ of a methyl derivative of a membrane-like collagen carrier prepared by the same procedure as in Example 5 was mixed with 16
Suspend in rrLl of distilled water, add 0.21rLl of 3-dimethylaminopropionitrile and 0.1rLl of acetaldehyde.
mJ was added, the pH was adjusted to 6.0 to 6.5 with 0.5N hydrochloric acid, and the mixture was allowed to stand at 15°C for 20 hours.

その後、担体を０．１ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）で
充分洗滌する。Thereafter, the carrier is thoroughly washed with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5).

洗滌を終えたもの３００■相当をとり、β−アミラーゼ
あるいはキモトリプシン１００７７１ｐを含有する水溶
液１０ＴｒＬｌに浸漬してｐＨ６，０〜６．５に保つよ
う点検しながら、２０℃で１５時間反応させる。A portion equivalent to 300 μm of the washed product is taken and immersed in 10 TrL of an aqueous solution containing 100,771 p of β-amylase or chymotrypsin and reacted at 20° C. for 15 hours while checking to maintain the pH at 6.0 to 6.5.

その後０．１ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）で３回洗滌
する。Thereafter, it is washed three times with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5).

次いで１Ｍ食塩を含む０．１ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ５，
５）に浸漬した後、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ５，５）
で洗滌する。Next, 0.1 M phosphate buffer (pH 5,
5) After soaking in 0.1M phosphate buffer (pH 5,5)
Wash with water.

このようにしてβ−アミラーゼあるいはキモトリプシン
の結合した固定化酵素膜が得られる。In this way, an immobilized enzyme membrane to which β-amylase or chymotrypsin is bound is obtained.

その１ｄの示す酵素活性はβ−アミラーゼ膜で０．７５
単位、キモトリプシン膜では１．５単位であった。The enzyme activity shown by 1d is 0.75 in β-amylase membrane.
unit, and 1.5 units for the chymotrypsin membrane.

実施例 １３ 実施例５の方法と同様の操作によって調製した膜状のコ
ラーゲン担体をメチル誘導体としたもの３００■をβ−
アミラーゼあるいはキモトリプシン１００ダを含有する
水溶液１０Ｉｎｌに懸濁する。Example 13 300 μm of a methyl derivative of a membrane-like collagen carrier prepared by the same procedure as in Example 5 was used as β-
Suspend in 10 Inl of an aqueous solution containing 100 Da of amylase or chymotrypsin.

これに３−ジメチルアミノプロピオニトリルを０、１
ｍｌ及びアセトアルデヒドを０．０５Ｍ加えて、この混
合液のｐＨを６．０〜６．５に調整しながら、１５℃で
１５時間保つ。Add 0,1 3-dimethylaminopropionitrile to this.
ml and 0.05M of acetaldehyde are added and the pH of the mixture is adjusted to 6.0-6.5 while being kept at 15°C for 15 hours.

その後０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）を用いて３
回洗滌した後、１Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（
ｐＨ５，５）に浸漬する。Then, using 0.05M phosphate buffer (pH 7,5),
After washing twice, 0.05M phosphate buffer containing 1M sodium chloride (
pH 5.5).

次いで０．０５Ｍ燐酸緩衝液で洗滌する。このようにし
てβ−アミラーゼあるいはキモトリプシンの結合した固
定化酵素膜が得られる。Then wash with 0.05M phosphate buffer. In this way, an immobilized enzyme membrane to which β-amylase or chymotrypsin is bound is obtained.

これらの膜１ｄの示す酵素活性はβ−アミラーゼ膜で０
．５〜０．７単位、キモトリプシン膜では０．９８単位
であった。The enzyme activity exhibited by these membranes 1d is 0 for the β-amylase membrane.
．． 5 to 0.7 units, and 0.98 units for chymotrypsin membranes.

尚、このβ−アミラーゼ膜について酵素反応を１０回に
わたって反覆くり返えし１こ成績を第４図に示し１こが
、酵素活性の変動は受力１つた０ 実施例 １４ 実施例５の方法と同様の操作によって調製し１こ膜状の
コラーゲン担体を同様の操作でメチル化誘導体としたも
の２００■にチオニルクロライド１．０Ｉｎｌを加え、
４０分還流させた後室温で２４時間装置した後、クロロ
ホルムで充分洗滌する。The enzyme reaction was repeated 10 times on this β-amylase membrane, and the results are shown in Figure 4. However, there was only one change in enzyme activity.Example 14 Method of Example 5 1.0 Inl of thionyl chloride was added to 200 μl of a membrane-like collagen carrier prepared by the same procedure as above and made into a methylated derivative by the same procedure.
After refluxing for 40 minutes, the mixture was kept at room temperature for 24 hours, and then thoroughly washed with chloroform.

次いで苛性ソーダ上で乾燥させた後、β−アミラーゼあ
るいはウレアーゼ５０ｍｇを含有する０、０５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ８，０ｐ＝ ０．０５ ） ２０ｍｌに浸
漬し、４℃で２４時間反応させた。After drying over caustic soda, it was immersed in 20 ml of 0.05M Tris buffer (pH 8.0p=0.05) containing 50 mg of β-amylase or urease, and reacted at 4°C for 24 hours.

次いで０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ５，５）で充分洗滌す
ることによりβ−アミラーゼあるいはウレアーゼの結合
した固定化酵素膜を得１こ。Then, by washing thoroughly with 0.1M phosphate buffer (pH 5.5), an immobilized enzyme membrane with β-amylase or urease bound thereto was obtained.

これらの膜１ｃＩ？Ｌが示す酵素活性はβ−アミラーゼ
膜で０．７〜１．２単位、ウレアーゼ膜では７，５単位
であった。These membranes 1cI? The enzyme activity exhibited by L was 0.7 to 1.2 units in the β-amylase membrane and 7.5 units in the urease membrane.

実施例 １５ 実施例５の方法と同様の操作によって調製した膜状のコ
ラーゲン担体２００Ｔｎ９を２０ＴｒＬｌの蒸溜水に懸
濁し、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−
３′−スルホネート（ウソドワーズ試薬Ｋ）２００■を
加え、水中（５℃）で２時間反応させた後、蒸溜水で洗
滌する。Example 15 Membrane-like collagen carrier 200Tn9 prepared by the same procedure as in Example 5 was suspended in 20TrLl of distilled water, and N-ethyl-5-phenylisoxazolium-
Add 200 μl of 3'-sulfonate (Usodoise Reagent K), react in water (5°C) for 2 hours, and then wash with distilled water.

次いでこれをキモトリプシンあるいはトリプシン２５■
を含む水溶液５ｍｌに浸漬して、４°Ｃで２４時間反応
させる。This is then treated with chymotrypsin or trypsin 25■
The sample was immersed in 5 ml of an aqueous solution containing the following, and reacted at 4°C for 24 hours.

その後、０．０５Ｍ燐酸緩衝液で洗滌してキモ） １プ
シンあるいはトリプシンの結合し１こ固定化酵素膜を得
た。Thereafter, the membrane was washed with 0.05M phosphate buffer to obtain an immobilized enzyme membrane with psin or trypsin bound thereto.

これらの膜１ｃＩｌの示す酵素活性はキモトリプシン膜
１．０単位、トリプシン膜Ｑ、６単位であつＴこ。The enzyme activity exhibited by these membranes 1cIl is 1.0 units of chymotrypsin membrane, 6 units of trypsin membrane Q, and T.

実施例 １６ 実施例５の方法と同様の操作によって調製した膜状のコ
ラーゲン担体のアジド誘導体２０即づつをストレプトマ
イシン、ジヒドロストレプトマイシン及びクロラムフェ
ニコールをそれぞれ２■を含有するトリス緩衝液（μ＝
０．２５、ｐＨ８，０）中に４℃下で２０時間浸漬し
た後、蒸溜水で洗滌をくりかえすことにより、これらの
抗生物質を固定化し１こコラーゲン担体を得た。Example 16 20 pieces of the azide derivative of a membrane-like collagen carrier prepared by the same procedure as in Example 5 were added to a Tris buffer (μ=
0.25, pH 8.0) for 20 hours at 4°C, and then washed repeatedly with distilled water to immobilize these antibiotics and obtain one collagen carrier.

バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ ）を被検菌としてブイヨン寒天平板上での抗菌
テストを行うと、上記３種類の膜はいづれも抗菌力を示
す。Bacillus subtilis (Bacillus 5ubti)
When an antibacterial test was carried out on a bouillon agar plate using M.lis ) as the test bacterium, all three types of membranes exhibited antibacterial activity.

さらに、一回検定の培養を行つ１こ後、抗生物質固定膜
を水洗して、再び検定の培養するという操作を４回くり
かえし１こが、抗菌力が保持され、くりかえし使用が可
能であることを認めた。Furthermore, after carrying out one assay culture, the antibiotic-immobilized membrane was washed with water and the assay culture was repeated four times.The antibacterial activity was maintained and it could be used repeatedly. admitted that.

又、全（同様な操作で、前記のアジド誘導体を生体内で
脱炭酸作用やアミノ酸の脱アミ７作用に関与するビオチ
ン２１ｖを含有する０、３３Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０
）に浸漬してビオチン固定膜を得た。In addition, in a similar manner, the above azide derivative was added to a 0.33 M phosphate buffer (pH 7.0) containing biotin 21v, which is involved in decarboxylation and amino acid deamidation in vivo
) to obtain a biotin-fixed membrane.

この膜はビオチン欠除培地寒天上でラクトバチルス・ア
ラビノザス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒａ−ｂ
ｉｎｏｓｕｓ ）の生育帯を発現した。This membrane was grown on Lactobacillus ara-b on biotin-deficient medium agar.
inosus) growth zone.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は本発明の方法で製造した固定化キモトリプシン
−コラーゲン膜の酵素活性の経時変化を示すグラフであ
る。 第２図は本発明の方法で製造した固定化グルコアミラー
ゼ−コラーゲン膜の酵素活性の経時変化を示すグラフで
ある。 第３図は本発明の方法で製造し１こ固定化β−アミラー
ゼ−コラーゲン膜の使用反応回数に関する酵素活性の変
化を示すグラフである。 第４図は本発明の方法で製造し１こ固定化β−アミラー
ゼ−コラーゲン膜の使用反応回数に関する酵素活性の変
化を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing changes over time in the enzyme activity of an immobilized chymotrypsin-collagen membrane produced by the method of the present invention. FIG. 2 is a graph showing changes over time in the enzyme activity of the immobilized glucoamylase-collagen membrane produced by the method of the present invention. FIG. 3 is a graph showing changes in enzyme activity with respect to the number of reactions in which a single immobilized β-amylase-collagen membrane produced by the method of the present invention is used. FIG. 4 is a graph showing changes in enzyme activity with respect to the number of reactions in which a single immobilized β-amylase-collagen membrane produced by the method of the present invention is used.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ （イ）可溶化コラーゲン水溶液：（Ｏ）不溶性コラ
ーゲン繊維の水分散物；（ハ）前記（イ）および（０）
の混合物；（へ）コラーゲンと多糖との複合体；および
（ホコラーゲンと多糖との混合物からなる群から選択さ
れる材料の成型物であるコラーゲン担体とこのコラーゲ
ン担体に共有結合により結合した生物活性物質とからな
る固定化生物活性物質。 ２ 前記多糖がホモグリカン、ヘテログリカン、グリク
ロナン、ムコ多糖、およびホモグリカンのカルボキシメ
チル誘導体から選択される前記特許請求の範囲第１項記
載の固定化生物活性物質。 ３ 生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第１項ま
１こは第２項記載の固定化生物活性物質。 ４ 生物活性物質が抗生物質である特許請求の範囲第１
項または第２項記載の固定化生物活性物質。 ５ コラーゲン担体が膜状、糸状、粒状、塊状およびス
ポンジ状から選択される形状である特許請求の範囲第１
項、第２項、第３項または第４項記載の固定化生物活性
物質。 ６ コラーゲン担体をメタノール中に懸濁し、この懸濁
液に塩素ガスを吹込むかまたは塩酸を添加してコラーゲ
ン担体をメチルエステル化し、このメチルエステル化コ
ラーゲン担体を飽水ヒドラジンと反応させてコラーゲン
担体のヒドラジドを生成し、このヒドラジドと生物活性
物質とを反応させこれを共有結合丈テ名とからなる固定
化生物活性物質の製造方法。 Ｔ 生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第６項記
載の固定化生物活性物質の製造方法。 ８ コラーゲン担体が膜状、糸状、”粒状、塊状および
スポンジ状から選択される形状である特許請求の範囲第
６項の固定化生物活性物質の製造方法。 ９ コラーゲン担体を水に懸濁しこれに３−ジメチルア
ミノプロピオニトリルを添加して室温以下の温度で反応
させ次いでこの処理済みのコラーゲン担体と固定化すべ
き生物活性物質とを反応させるか、またはコラーゲン担
体を水に懸濁した後３−ジメチルアミノプロピオニトリ
ルおよび固定化すべき生物活性物質を同時に添加してコ
ラーゲン担体と室温以下の温度で反応させることからな
る固定化生物活性物質の製造方法。 １０生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第９項記
載の固定化生物活性物質の製造方法。 １１ コラーゲン担体が膜状、糸状、粒状、塊状およ
びスポンジ状から選択される形状である特許請求の範囲
第９項記載の固定化生物活性物質の製造方法。 １２ コラーゲン担体を水性媒体に懸濁させ、これにＮ
−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３７−ス
ルホネートを添加することによってコラ−ゲン担体と反
応させ、次いで処理されたコラーゲン担体と固定化すべ
き生物活性物質とを反応させることからなる固定化生物
活性物質の製造方法。 １３生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第１２項
記載の固定化生物活性物質の製造方法。 １４ コラーゲン担体が膜状、糸状、粒状、塊状およ
びスポンジ状力）ら選択される形状である特許請求の範
囲第１２項記載の固定化生物活性物質の製造方法。 １５ コラーゲン担体をチオニルクロライドに添加し
て反応させ、得られたクロル化コラーゲン担体と生物活
性物質とを水性媒体中で反応することからなる固定化生
物活性物質の製造方法。 １６生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第１５項
記載の固定化生物活性物質の製造方法。 １７ コラーゲン担体が膜状、糸状、粒状、塊状および
スポンジ状から選択される形状である特許請求の範囲第
１５項記載の方法。[Scope of Claims] 1 (a) Solubilized collagen aqueous solution: (O) an aqueous dispersion of insoluble collagen fibers; (c) the above (b) and (0)
a collagen carrier which is a molded material selected from the group consisting of a mixture of collagen and a polysaccharide; and a mixture of a collagen and a polysaccharide; 2. An immobilized biologically active substance according to claim 1, wherein the polysaccharide is selected from homoglycans, heteroglycans, glycuronans, mucopolysaccharides, and carboxymethyl derivatives of homoglycans. 3 Claims 1 and 1 are the immobilized biologically active substances according to claim 2, in which the biologically active substance is an enzyme. 4 Claim 1, in which the biologically active substance is an antibiotic.
Immobilized biologically active substance according to item 1 or 2. 5. Claim 1, wherein the collagen carrier has a shape selected from membrane-like, thread-like, granular, lump-like, and spongy-like.
Immobilized biologically active substance according to item 1, 2, 3 or 4. 6. Suspend the collagen carrier in methanol, methyl esterify the collagen carrier by blowing chlorine gas into this suspension or add hydrochloric acid, and react the methyl esterified collagen carrier with saturated hydrazine to form the collagen carrier. A method for producing an immobilized biologically active substance, which comprises producing a hydrazide, reacting the hydrazide with a biologically active substance, and covalently bonding the hydrazide with a biologically active substance. T. The method for producing an immobilized biologically active substance according to claim 6, wherein the biologically active substance is an enzyme. 8. The method for producing an immobilized biologically active substance according to claim 6, wherein the collagen carrier has a shape selected from membrane-like, thread-like, granular, block-like, and sponge-like. 9. The collagen carrier is suspended in water, and Either by adding 3-dimethylaminopropionitrile and reacting at a temperature below room temperature and then reacting the treated collagen carrier with the bioactive substance to be immobilized, or by suspending the collagen carrier in water and then 3- A method for producing an immobilized biologically active substance comprising simultaneously adding dimethylaminopropionitrile and the biologically active substance to be immobilized and reacting with a collagen carrier at a temperature below room temperature.10 Claims in which the biologically active substance is an enzyme A method for producing an immobilized biologically active substance according to claim 9. 11. The immobilized biologically active substance according to claim 9, wherein the collagen carrier has a shape selected from membrane-like, thread-like, granular, lump-like, and sponge-like. Method for producing a substance. 12 A collagen carrier is suspended in an aqueous medium, and N
- an immobilization agent consisting of reacting with a collagen carrier by adding ethyl-5-phenylisoxazolium-37-sulfonate and then reacting the treated collagen carrier with the bioactive substance to be immobilized. Method for producing active substances. 13. The method for producing an immobilized biologically active substance according to claim 12, wherein the biologically active substance is an enzyme. 14. The method for producing an immobilized biologically active substance according to claim 12, wherein the collagen carrier has a shape selected from membrane-like, thread-like, granular, block-like, and sponge-like. 15. A method for producing an immobilized biologically active substance, which comprises adding a collagen carrier to thionyl chloride and reacting it, and reacting the obtained chlorinated collagen carrier with a biologically active substance in an aqueous medium. 16. The method for producing an immobilized biologically active substance according to claim 15, wherein the biologically active substance is an enzyme. 17. The method according to claim 15, wherein the collagen carrier has a shape selected from membrane-like, thread-like, granular, lump-like, and spongy-like.