JPS5946594B2 - 固定化生物活性物質及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化生物活性物質及びその製造方法、詳しく
はコラーゲンを担体として生物活性物質、特に酵素ま１
こは抗生物質を化学的に結合せしめることからなる固定
化生物活性物質及びその製造方法に関するものである。

その目的とする所はコラーゲンの具備する特性を活用し
て、効果的に生物活性物質を固定化し、有用な固定化生
物活性物質を提供することにある。

本発明における生物活性物質とは酵素、抗生物質等を包
含するものであるが、便宜上特に酵素の場合について説
明する。

近年、酵素の利用に関する研究や技術が著しく進歩する
と共に酵素の一定化についても種々の方法が提出されて
いる。

共有結合法もその一つで、種々の化学反応を応用するこ
とが検討されているが、概して強固な結合が得られる反
面、調製技術が難かしかつ１こり、固定化処理中に酵素
が失活し１こり、あるいは普遍的に種々の酵素に適用す
ることが難かしいなどの欠点があげられている。

共有結合法の利点を保持しながらこれらの欠点を除くた
めには、極力、酵素が失活を起さない温和な条件下で、
しかも簡単な処理で実施できる結合反応を選ぶことが肝
要なことである。

一方、生物活性物質、特に酵素を固定化するのに適当な
担体としては、一般的に結合容量が大きく、担体表面の
結合部位の分布状況が重要であり、多孔度、電荷の分布
、親水性と疎水性の均衡など担体の組織の状態を考慮す
る必要があり、さらに酵素活性におよぼす影響や化学的
、物理的な安定性などにも充分な配慮が必要である。

本発明者は永年にわ１こりコラーゲンと酵素との関係に
ついて研究し、成る種の酵素がコラーゲン溶液中で安定
に保存されることを見出し、さらに酵素反応をうけるべ
き基質が高分子の場合、基質の内部への滲透や拡散が影
響をうけることを考慮して、コラーゲンを担体とする結
合法による酵素の固定化に成功し１こ。

コラーゲンは動物の結合組織の主成分で、皮膚、骨、鍵
等に広く分布する蛋白質であり、いわゆる「可溶性コラ
ーゲン」と「不溶性コラーゲン」として存在している。

この「不溶性コラーゲン」は蛋白質分解酵素を作用させ
る特公昭３７−１４４２６及び特公昭３７−１３８７１
公報記載の方法あるいは糸状菌から生産される酸性蛋白
質分解酵素を用いる特公昭４４−１１０３７および特公
昭４４−１１７５公報記載の方法によって可溶化される
し、又、アルカリ、硫酸ソーダ及びアミンの共存下で処
理する特公昭４６−１５０３３公報記載の方法によって
も可溶化される。

かくして得られ１こ可溶化コラーゲンの水溶液はいづれ
もコラーゲンが本来の分子構造を保持したま５、単分子
分散の状態で溶解しており、分子の長さは２８００人、
直径１５人、分子量約３０万であり、３本のポリペプチ
ド鎖が二重へリツクス状に巻いている剛体棒状の形をと
っていることが判明している。

又、この溶液力）らはＸ゛天然コラーゲン繊維に近い繊
維を再生することが出来る。

このような繊維再生能は酵素の固定化に際して極めて有
効であるば力）りでなく、適当な強度をもつ１こ種々の
形状、即ち糸状、膜状、塊状、スポンジ状等に成型する
上で極めて好適な性質である。

又、コラーゲンは繊維性の高次構造をとり且つ親水性、
膨潤性が極めて高いので、コラーゲンを用いて酵素を固
定する場合には結合部位が多く、表面積が犬になり、基
質の拡散をよくするので基質や他の因子との接触を容易
にするなど、固定化酵素の反応性を高めるのに有効な環
境条件を提供するし、酵素の安定性を良好に維持するも
のと考えられる。

さらに、コラーゲンはそのペプチド鎖の側鎖としてグル
タミン酸、アスパラギン酸及びそれらのアミド等のカル
ボキシル基を豊富にもっており例えば、牛皮コラーゲン
ではアミノ酸の１０００残基当り１１９残基）、アルギ
ニン、リジン、ヒスチジン等のアミン基もかなり保有し
ている（例えば牛皮コラーゲンではアミノ酸１０００残
基当り８３残基）。

従って共有結合法によって酵素を固定化する場合には対
象とする酵素のアミン基あるいはカルボキシル基との反
応を利用するのに好適である。

一方、コラーゲンは多糖類のうち、アラビアゴム等のへ
テログリカンやアルギン酸、ペクチン質等のグリクロナ
ン、ヒアルカン酸、コンドロイチン硫酸等のムコ多糖類
やカルボキシメチルセルロース等のホモグリカンのカル
ボキシメチル誘導体等と適当な条件の下で非常によく結
合し、コラーゲンと多糖との複合体を形成する。

この複合体は上記のようなコラーゲンの特質に加えて、
さらに多糖の特質である高い親水性や粘性、弾性、皮膜
形成能、保護コロイド性、接層性等が加味されるので、
担体として極めて有利な特徴をもつに至る。

この場合、目的に応じてその結合量を調節することによ
って所期物性の担体婆つくることが可能であるし、また
架橋処理を加えるなどの手段を併用する時には強度も向
上し、酵素の固定化にとって極めて適した担体を提供す
ることができる。

又、コラーゲンを基本組成として適量のセルローズ等の
ホモグリカンを混合したり、架橋を導入するような処理
を組合わせて用いることによって目的に適した機械的強
度やその他の性質をもつコラーゲン複合体をつくること
ができる。

本発明においては、コラーゲンそのものの他に上記のよ
うなコラーゲンと多糖との複合体またはこれらとホモグ
リカン類等の混合物を総称して、単にコラーゲン担体と
呼ぶことにする。

本発明に用いるコラーゲン担体は次のようなものである
。

１）可溶化コラーゲンからの成型物：不溶性コラーゲン
から酵素処理あるいはアルカリ処理によって可溶化され
た可溶化コラーゲン力）ら、その繊維再生能や凝固性等
を利用して成型されたもの及び硬化処理を併用したもの
。

２）不溶性コラーゲン繊維組織：動物の結合組織を機械
的にとり出し、水洗、石灰漬等の処理によって精製され
た組織（オセインを含む）または皮革工業において生じ
る副産物であるシェービング屑（このシェービング屑は
牛皮をクロム揉しした後、揉した皮を一定の厚さに削る
際に生じる）。

３）不溶性コラーゲン繊維の分散液からの成型物：動物
の結合組織等から精製して得られ１こコラーゲン繊維分
散液またはこれと可溶化コラーゲン溶液との混合物から
成型されたもの及び硬化処理を併用したもの。

４）コラーゲンと多糖との結合による成型物：コラーゲ
ンとへテログリカン、グリクロナン、ムコ多糖やホモグ
リカンの誘導体等をコラーゲンの等電点より低い酸性領
域のｐＨの下で混合して、両者の複合体を生成させ、成
型されたもの及び硬化処理を併用したものである。

用いられる多糖は次のようなものである。

ヘテログリカン：アラビアゴムや植物ゴム及び粘質物等
。

グリクロナン：アルギン酸、ペクチン質等。

ムコ多糖：ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリ
ン及びＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属の莢膜多糖等微生物の生産
する多糖等。

ホモグリカンの誘導体：カルボキシメチルセルロース、
カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルアミロー
ス等。

その他：デキストラン硫酸、カラゲナン、アラビアゴム
のエステル、アルデヒドスターチ、高分子酸。

５）コラーゲンと多糖の混合物からの成型物：コラーゲ
ン繊維分散液と可溶化コラーゲン溶液さらにセルロース
繊維の混合物から成型されたもの及び硬化処理を加えた
もの。

本発明は上記したような特質をもつコラーゲン担体を用
いて酵素を結合法によって固定化する１こめに、温和な
条件下で酵素を効果的に結合することのできる結合反応
に関して研究を重ね１こ結果、完成されたものである。

即ち、コラーゲン担体のアジド誘導体をつくり、次いで
低温下で対象とする酵素と反応させるか、又はコラーゲ
ン担体とジメチルアミノプロピオニトリルの共存下で対
象とする酵素と反応させるか、あるいはあらかじめコラ
ーゲン担体とジメチルアミノプロピオニトリルを反応さ
せ、次いで対象とする酵素と反応させるという手段をと
ることによって酵素とコラーゲン担体との結合体をつく
ることができる。

さらに又、コラーゲン担体の酸塩化物をつくり、これと
酵素を反応させる手段、あるいはＮ−エチル−５−フェ
ニルイソオキサゾリウム−３′−スルホネート等の縮合
試薬を用いてコラーゲン担体のアミノ基と酵素を結合さ
せる手段によっても対象酵素を固定化することができる
。

これらの手段においては非常に温和な条件下で実施する
ことができるし、酵素と反応試薬との接触による影響も
さけられるので、酵素の活性の低下が極めて少く、安全
にしかも安定した固定化酵素を取得できるという知見を
得、本発明の方法を完成したものである。

次に具体的態様をあげて説明する。

（１）水洗して乾燥したコラーゲン担体を乾燥メタノー
ル中に懸濁した後、水冷下で塩素ガスを数分間通じて飽
和させて室温で１時間程度放置してメチルエステル化し
た後、メタノールあるいハ蒸溜水で充分洗滌する。

あるいは乾燥メタノール中、０．１ Ｍ塩酸存在下で０
℃乃至室扁の間ニ保ち、５日間程度メチルエステル化し
た後、蒸溜水で充分洗滌する。

この場合、とくに前者の方法を用いる時には極めて短時
間で、効果的にコラーゲン担体のメチルエステル化を遂
行することができる。

このようにして得られたメチル化誘導体をメタノール中
あるいは蒸溜水中に懸濁して、飽水ヒドラジンを１％乃
至５％になるように添加して室温下で一夜静置した後、
メタノールで洗滌して乾燥する力）、蒸溜水で洗滌して
コラーゲン担体のヒドラジドをつくる。

このヒドラジドを０．５％乃至２％の塩酸に懸濁し、４
℃以下に氷冷しながら３％亜硝酸ソーダを終濃度が０，
２％乃至１％になる程度に攪拌しながら滴下する。

５分から２０分程度ゆるく攪拌しγこ後、この反応液か
ら分って、ジオキサン次いで蒸溜水で、あるいは蒸溜水
又は０．０５Ｍ程度の食塩水を用いて充分に洗滌する。

使用する試薬の濃度及び反応時間は担体の状態によって
きめる。

次に１０℃以下の温度の下で、対象とする酵素とｐＨ５
乃至８．８の０．０５Ｍ程度の緩衝液中で反応させる。

２時間乃至２０時間反応後、１０℃以下に冷却した１Ｍ
食塩を含む０．０５Ｍ程度の緩衝液次いで０．０５Ｍ程
度の緩衝液あるいは蒸溜水で洗滌をくりかえし、洗液に
酵素活性がなくなるまで洗滌する。

このようにして目的とする固定化酵素を得ることができ
る。

（２）水洗して乾燥したコラーゲン担体を対象とする酵
素の水溶液に懸濁する。

酵素溶液の濃度は担体１００部に対し１０〜５０部程度
が程度である。

これに３−ジメチルアミノプロピオニトリルを２０部程
度加えて、反応液のｐＨを６．０乃至６．５に保つ。

１５℃以下の温度の下で６時間乃至２０時間反応させた
後、０．０５Ｍ燐酸緩衝液で洗滌する。

次いで１Ｍ食塩を含む燐酸緩衝液に浸漬した後、引きつ
づき燐酸緩衝液で洗滌する。

（３）水洗して乾燥したコラーゲン担体１００部を蒸溜
水に懸濁し、これに３−ジメチルアミノプロピオニトリ
ルを２０部程度加えてｐＨを６．０乃至６．５に調節し
ながら、室温以下で６時間乃至２０時間反応せしめた後
、０．１Ｍ燐酸緩衝液で洗滌する。

このような処理を行ったコラーゲン担体を対象酵素と水
溶液中で室温以下で１５５時間程反応させる。

次いで担体を分ち、冷却し７： ０． Ｉ Ｍ燐酸緩衝
液で洗滌した後、一度１Ｍ食塩を含む同緩衝液に浸漬し
た後、引つづき同緩衝液で洗滌をくりかえす。

（４）コラーゲン担体１００部を蒸溜水ま１こは０．０
５Ｍ燐酸緩衝液に懸濁し、Ｎ−エチル−５−フェニルイ
ソオキサゾリウム−３Ｌスルホネ一ト１００部程度を加
え５℃で２時間反応させ、担体を反応液から分離した後
、蒸溜水で洗滌する。

再び蒸溜水または０．０５Ｍ緩衝液に懸濁して、酵素を
加えて、活性化された担体と酵素を２４時間反応させる
。

その後０．０５Ｍ緩衝液で洗滌し、−ｉ、１μ食塩を含
む緩衝液に浸漬した後、引きつづき食塩を含まない緩衝
液で洗滌する。

（５）水洗して乾燥したコラーゲン担体にチオニルクロ
ライドを加え、３０分還流させたのち、室温で放置し、
１日〜２日後、クロロホルムで充分洗滌する。

クロル化された担体の酸塩化物は苛性ソーダ上で乾燥さ
せた後、１０℃以下で酵素と緩衝液中で反応させ、緩衝
液で充分洗滌することにより固定化酵素を得る。

上記したような方法によってコラーゲン担体に酵素を結
合せしめることができ、しかも温和な条件を用いるか、
前処理によって担体を活性化する手段によっているので
、試薬と酵素とが接触しないから、酵素活性を損うこと
なく効果的に固定化できる。

得られた固定化酵素はいづれも高い酵素活性を示すと同
時に、コラーゲン担体の種々の特性を保持しているので
、本発明の固定化酵素により、例えば、酵素反応が連結
化できるのをはじめ、酵素反応を広範に応用することが
可能になつ１こ。

尚、他の蛋白質、ポリペプチドならびに抗生物質あるい
は酵素のエフェクターその他の低分子物質も上記と同様
の手段で固定化することが可能であるが、抗生物質を同
時に固定化することによって固定化酵素の保存中あるい
は使用中における微生物汚染による分解を防止すること
ができる。

又、二種類以上の酵素を同時に固定化することも勿論可
能である。

又、使用するコラーゲン担体の形状は膜状、糸状、粒状
、塊状、スポンジ状等、いづれの形に成型され１こもの
にも本発明の方法が実施できる。

さらに、以下の実施例は一部の酵素の固定化方法につい
て記載しγこものであるが、グルコアミラーゼ、α−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラ
ーゼ、リゾチーム、インベルターゼ、セルラーゼ、ガラ
クトシダーゼ、イソメラーゼ、ペクチナーゼ、ヒアルロ
ニダーゼ、トリプシン、キモトリプシンプラスミン等の
プロテアーゼ類の他、ウレアーゼ、リパーゼ、ペニシリ
ンアミダーゼ、アシラーゼ、リボヌクレアーゼ、ウリカ
ーゼ、アスパラギナーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキ
ナーゼ、トロンビン、グルコースオキシダーゼ、カタラ
ーゼ、パーオキシダーゼ、ｄ −アミノ酸オキシダーゼ
等、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵
素、合成酵素、リアーゼに属する多種類の酵素の固定化
も同様の技術手段によって達成される。

尚、以下の実施例中に示す酵素活性の単位は次の通りで
ある。

プロテアーゼは３０℃、１分間に生成するチロシンμＩ
数；ウレアーゼは３０℃、１分間に生成するアンモニア
態窒素のμｙ数；グルコアミラーゼは４０℃、１分間に
おいてグルコース１００μＩを生成する活性；β−アミ
ラーゼ、α−アミラーゼは３０°０１分間においてグル
コース１００μｇに相当する還元力を生成する活性をい
う。

実施例 １ 成牛の生皮３．０ｉｉ（コラーゲンとして１．３ ｋｙ
金含有を水洗し、さらに５％の食塩水で可溶性物質を除
去して力）ら、常法により酵素処理により脱毛し、水洗
する。

水洗した皮を約１ｏｆｆｌに切断してから、ｐＨ２，５
の塩酸２０１を加えて攪拌しながら、随時塩酸を加えて
ｐｎが３．０になるように調整する。

ｐｎが平衡に達した後、温度が２５°Ｃ以上に上昇せぬ
ようにして、この皮を肉挽機で細断し、細断した皮を攪
拌機に入れ、ｐＨ３，０の塩酸を全重量が２０ｋｇにな
るように加える。

次にペニシリウム・スピニュローサム（Ｐｅｎ１ｃｉｌ
ｌ ｉｕｍｓｐｉｎｕｌｏｓｕｍ ） Ｔ −４（ＡＴ
ＣＣＩ ６３４８ ）より生産される酸性プロテアーゼ
２．５ｇを少量の稀塩酸に溶解して添加する。

混合物を２５℃で２４時間攪拌混合してコラーゲン繊維
を可溶化する。

次いでフィルタープレスで沖過後、苛性ソーダ水溶液で
ｐＨ７〜８に中和してコラーゲン繊維を再生させる。

この繊維を遠心分離機で集め水洗する。得られ１こコラ
ーゲン再生繊維をｐＨ３，０の塩酸中に溶解してコラー
ゲン濃度１％のコラーゲン水溶液をつくる。

この溶液を脱泡した後、深さ１ｃＩｒＬのアクリル樹脂
製容器に流しこみ、２５℃で通風しながら乾燥させ、コ
ラーゲン膜をつくる。

次いでこのコラーゲン膜を１０％食塩、１％硫酸アンモ
ニア、燻液０．５％力）らなるｐＨ１０の水溶液に１時
間浸漬して硬化処理を行った後、水洗して乾燥すること
により硬化されたコラーゲン膜が得られる。

得られ１こ膜１ｇをとり、乾燥メタノール１５０ｍ１中
に懸濁し、水浴中で冷却しながら塩素ガスを２分間通じ
て飽和させ１こ後、飽和状態のまま室温で１時間静置す
る。

次いでメタノールで充分洗滌してメチル化誘導体を得る
。

このメチル化誘導体を１９０ｒｒＬｌのメタノール中に
懸濁して飽水ヒドラジン（８０％溶液）を１０ｍ１添加
して室温下で一夜静置した後、メタノールで洗滌し、乾
燥する。

得られ１こコラーゲン膜のヒドラジドを２％塩酸１００
ｍ１に懸濁して４℃以下に氷冷し攪拌しながら、３％亜
硝酸ソーダ溶液１５ＴｒＬｌを滴下する。

そのまま１０分間ゆるく攪拌した後、膜を引き上げ、ジ
オキサン次いで蒸溜水で充分洗滌することによってコラ
ーゲン膜のアジド誘導体が得られる。

次にこのアジド誘導体を４℃の下で０．０５Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ８，５）に２．５ ｍｐ／ｍｌあるいは５．０
ｍｙ ／―の濃度に対象とする各種酵素（第１表に示
す）を含有する溶液１００ｄ中に浸漬して１５時間反応
させる。

反応終了後、膜を引き上げｐＨ４，０の蒸溜水で洗滌後
、１Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ５，５）
、０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０）あるいは０．０
５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）に浸漬した後、食塩を
含まない上記と同じ組成の緩衝液を用いて、洗液に酵素
活性がなくなるまで洗滌すると対象とする各酵素の結合
し１こ固定化酵素膜が得られる。

各酵素膜の示す酵素活性は下記第１表の通りである。

実施例 ２ 成牛の牛皮を水洗し脱毛し１こ後、さらに水洗してから
コラーゲン層をとり肉挽機で冷却しながら細かに破砕し
てから、１０倍量の０．５ Ｎ苛性ソーダ、１６％硫酸
ソーダ、０．２モル七ツメチルアミンを含有する混合水
溶液中に入れ、よく攪拌した後、２週間放置する。

次いで酢酸にてｐＨ７，０に中和し１こ後水洗し、水洗
後酢酸にてｐＨ４，０以下に保ち、充分攪拌することに
よってコラーゲンを可溶化する。

次にフィルタープレスで濾過した後、苛性ソーダ溶液で
ｐＨ５６としてコラーゲン繊維を再生させる。

この繊維を遠心分離機で集め水洗する。

得られ１こコラーゲン再生繊維をｐＨ３，０の塩酸中に
溶解してコラーゲン濃度１％のコラーゲン水溶液をつく
る。

この溶液に苛性ソーダ水溶液を加えてｐＨ５，６とし、
１％のジアルデヒドスターチ水溶液をコラーゲン量に対
して５％になるように添加し、脱泡した後、深さ１ｃＴ
Ｌのアクリル樹脂製容器に流しこみ、２０℃で通風しな
がら乾燥させることにより、ジアルデヒドスターチで硬
化され１こコラーゲン膜を得る。

得られ１こ膜ＩＩをとり以下、実施例１の方法と全く同
様の操作によって、コラーゲン膜のアジド誘導体をつク
リ、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、トリプシン及び
ウレアーゼと反応させ、各々の酵素の結合し１こ固定化
酵素膜を得る。

各酵素膜の１ｄ当りの酵素活性はβ−アミラーゼ１．４
単位、α−アミラーゼ０．６５単位、トリプシン３８単
位、ウレアーゼ７．０単位であった。

実施例 ３ 実施例１の方法に従って酸性プロテアーゼによって可溶
化され１こコラーゲンの１％水溶液と実施例２の方法に
よってアルカリ溶液中で可溶化され１こコラーゲンの１
％水溶液を、ｐ）（６の条件下で前者７部に対し後者３
部の割合で混合する。

この混合溶液を脱泡し１こ後、深さ１ｃｒｒＬのアクリ
ル製樹脂容器に流しこみ、２０℃で通風しながら乾燥さ
せ、コラーゲン膜をつくる。

次いで、このコラーゲン膜を蒸溜水にて湿らせ１こ後３
０Ｗの紫外線灯を用いて２０ｃｒＩＬの距離力）ら２０
分間、紫外線を照射した。

照射後、５％食塩水溶液に浸漬した後、流水で２０分間
水洗した後乾燥することにより強度の向上しγこコラー
ゲン膜が得られる。

得られ１こ膜１ｇをとり、以下実施例１の方法と全く同
様の操作によって、コラーゲン膜のアジド誘導体をつく
つ１こ後、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、トリプシ
ン及びウレアーゼと反応させ、各々の酵素の結合し１こ
固定化酵素膜を得る。

各々酵素膜の酵素活性は各酵素膜１ｄ当りβ−アミラー
ゼ１．５単位、α−アミラーゼ０．５単位、トリプシン
４単位、ウレアーゼ８．０単位である。

実施例 ４ 成牛皮を洗滌しフレツシングマシンで裏打ちした後、常
法により脱毛する。

脱毛し１こ皮は約３０ｎＸ３０ｃｍに切断して洗滌しｆ
こ後、２％の水酸化石灰溶液を３倍量加え、２０’Ｃで
３日間石灰漬を行う。

石灰漬後水洗し、１％食塩を含む硫酸水溶液で中和し水
洗する。

この皮を２％乳酸水溶液に１０℃で５日間浸漬し膨潤さ
せる。

次いでこの膨潤し１こ皮を肉挽機で切断し、更にローラ
ーを通して個々のコラーゲン繊維に解組織した薄紙状物
を得る。

この薄紙状物に０．５％乳酸水溶液を加え混合機で充分
に混合してコラーゲン濃度３％のコラーゲン繊維分散液
をつくる。

一方前記と同様に洗滌、裏打ち、脱毛；洗滌し１こ成牛
皮を肉挽機で細断し、微細化する。

次いで食塩水及び冷水でくり力）えし洗滌する。

洗滌後の微細皮を攪拌機に入れ、塩酸を加えてｐＨ３，
０とし１こ後、実施例１で用いγこペニシリウム・スピ
ニュローサムの生産する酸性プロテアーゼか、アスペル
ギルス・ニガーの生産する酸性プロテアーゼを加えて２
５°Ｃ１５時間混合攪拌してコラーゲン繊維を溶解する
。

次いで、得られた溶液を濾過後、苛性ソーダ水溶液でｐ
Ｈ７〜８に中和し、コラーゲン繊維を再生させる−０こ
の再生繊維を遠心分離機で集め水洗する。

この再生繊維を０．５％乳酸水溶液中に溶解してコラー
ゲン濃度３％のコラーゲン水溶液をつくる。

上記の３％コラーゲン繊維分散液７０重量部と３％コラ
ーゲン溶液３０重量部を混合機中で混和し、さらにホモ
ゲナイザーで均一にして、脱泡して製膜用原液をつくる
。

原液は環状細隙０．８ｍｍ直径１６３１１にのノズルよ
り毎分８ｍの速度で２０°Ｃの２３％食塩水中に吐出し
凝固せしめ管状体をつくる。

この凝固管状体を燻液２％、食塩１０％、酢酸０．３５
％、酢酸ソーダ７．８％の溶液中に３０分間浸漬しＴこ
後、流水で洗滌する。

次いでこの管状体を３５％グリセリン水溶液と接触せし
めてから、３０℃の乾燥器内で管状体の内部に１００ｍ
１ｒＬ水柱の圧力で空気を吹きこみ４０分間乾燥する。

次に管状体に耐層するグリセリンを水洗し再び３０℃に
て管状体内部に１００ｍｍ水柱の圧力で空気を吹きこみ
乾燥する。

この乾燥管状体そのままの膜、あるいは切り開いてシー
ト状にし１こ膜１ｇをとり、以下実施例１の方法と全く
同様の操作によって、コラーゲン膜のアジド誘導体をつ
くり、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、トリプシン
、アルカリ性プロテアーゼ及びウレアーゼと反応させ、
各各の酵素の結合し１こ固定化酵素膜を得る。

各酵素膜ＩＣＩ？Ｌの示す酵素活性はβ−アミラーゼ１
．８単位、グルコアミラーゼ１．０単位、トリプシン５
単位、アルカリ性プロテアーゼ２．５単位、ウレアーゼ
９．０単位であった。

実施例 ５ 実施例４の方法と同様の操作によって調製した３％コラ
ーゲン繊維分散液７０部と３％コラーゲン溶液１５部に
精製セルロース微細繊維１５部を固体濃度が３％になる
ように添加混合し、充分混和した後、さらにホモゲナイ
ザーで均一に分散させ、真空脱泡して製膜用原液をつく
る。

この原液を用いて実施例４の方法と同様の操作によって
乾燥した管状のコラーゲン・セルロース混合物の膜を得
る。

この乾燥管状体そのままの膜あるいは管状体を切り開い
てシート状にした膜４ｇをとり乾燥メタノール４５０ｍ
１中に懸濁し、水浴中で冷却しながら塩素ガスを３分間
通じて飽和させた後、飽和状態のまま室温で１時間静置
する。

次に蒸溜水を用いて充分に洗滌してメチル化誘導体を得
る。

このメチル化誘導体を５７０１ｒＬｌの蒸溜水中に懸濁
して飽水ヒドラジン（８０％溶液）を３０ｒｒＬｌ添加
して室温下で一夜放置し１こ後、蒸溜水で洗滌して乾燥
する。

得られたヒドラジド誘導体を２％塩酸２００ＴｆＬｌに
懸濁して４℃以下に氷冷し、攪拌しながら３％亜硝酸ソ
ーダ溶液５０′ｒｎｌを滴下する。

そのまま１０分間ゆるく攪拌しｆこ後、膜を引き上げ、
冷水で洗滌することによってアジド誘導体が得られる。

このアジド誘導体を４℃の下で、対象とする酵素（第２
表に示す）を２．５■／ＴＬｌの濃度で含有する０、０
５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０）に浸漬して１５時間反応
させる。

酵素含有緩衝液は担体として供し１こ膜に対して５０倍
量を用いた。

反応終了後、膜を引き上げてｐＨ４，０の蒸溜水で洗滌
し１こ後、１Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ
５，５又はｐＨ７，０又はｐＨ８，０）に浸漬し、次い
で食塩を含まない上記燐酸緩衝液を用いて洗液に酵素活
性がなくなるまで洗滌することにより対象とする各酵素
の結合し１こ固定化酵素膜が得られる。

各酵素膜の酵素活性は第２表の通りである。

このキモトリプシン膜を湿潤状態で１０℃で保存し、随
時活性の測定をくり返えし１こ結果を第１図に示し１こ
が、１ケ月９０％以上の酵素活性が保持されＴこ。

又、グルコアミラーゼ膜を０．１モル燐酸緩衝液（ｐＨ
５，５）中、２０℃で保存し、随時活性の測定をくり返
えした成績を第２図に示し１こが、１ケ月以上活性の低
下が認められなか？た。

又、β−アミラーゼ膜を用いて酵素反応を反覆くり返え
し１こ成績を第３図に示したが、酵素活性の変化はタカ
）つ１こ。

実施例 ６ 実施例１の方法と同様の操作によって調製したコラーゲ
ンの１％水溶液５０Ｔｎｌに蒸溜水４５ｍＡ’を加え、
攪拌しつつ、カルボキシメチルセルロースの１％水溶液
５ｒｎｌを混合液のｐＨが４．０付近にあるように点検
しながら、徐々に添加する。

かくするとコラーゲンとカーボキシメチルセルロースの
複合体が形成され繊維状の複合体の分散した液が得られ
る。

又、同様の手段によって、コラーゲンの１％水溶液５０
ｍ１に蒸溜水４５ｍ１を加え、攪拌下にヒアルロン酸の
２％水溶液５ｒｒＬｌを徐々に添加してコラーゲンとヒ
アルロン酸の複合体を形成せしめる。

得られ１こコラーゲンと多糖の複合体を含む溶液を脱泡
した後、深さ１ｃｎＬ、巾１０ｃＩＩＬ、長さ１０ｃｒ
ｆＬのアクリル樹脂製容器に入れ２５℃で通風しながら
乾燥させ、コラーゲンとカーボキシメチルセルロースあ
るいはコラーゲンとヒアルロン酸の結合した膜をつくる
。

このようにして得た膜５００■を夫々実施例１の方法と
全く同様の操作によって、コラーゲン膜のアジド誘導体
をつくった後、対象とする酵素（第３表に示す）と反応
させ、各々の酵素と結合したコラーゲン・カルボキシメ
チルセルロース複合体あるいはコラーゲン・ヒアルロン
酸複合体の固定化酵素膜を得る。

酵素膜の酵素活性は第３表の通りである。

実施例 ７ 成牛皮を太鼓中で水洗し、フレツシングマシンで裏打し
た後、脱毛用酵素剤の溶液に浸漬して毛根をゆるめ、脱
毛機で脱毛する。

脱毛した皮を約３０ｃｒｒＬ×３０ｃｒＩＬに切断して
洗滌後、２％の水酸化石灰溶液中に浸漬する。

その後、太鼓中で水洗して付層石灰を除去し、１％食塩
水を含む塩酸溶液で中和して水洗するとコラーゲン繊維
の組織のままの精製生皮が得られる。

この生皮を用いて実施例５の方法と同様の操作によって
アジド誘導体をつくり、β−アミラーゼあるいはグルコ
アミラーゼと反応させると、これらの酵素の結合した組
織状の固定化酵素が得られる。

これらのもの１ｇの示す酵素活性はβ−アミラーゼ３０
０単位、グルコアミラーゼ２１０単位であった。

実施例 ８ 実施例７と同様に洗滌、裏打ち、脱毛及び洗滌して得１
こ生皮を順次小さなりリアランスを有するプレートを備
え１こ肉挽機で数回細切し、微細化する。

この微細皮をさらに食塩水及び冷水で洗滌して精製した
後、塩酸水溶液に懸濁してコラーゲン濃度２％のコラー
ゲン繊維分散液をつくる。

これに１％アルデヒドスターチ水溶液をコラーゲン量に
対して２％の割合で添加混合してアクリル樹脂製やアル
ミニウム製等の容器に流しこみ、そのまま凍結乾燥して
コラーゲン濃度に応じ１こ密度の繊維状の成型物を得る
。

この成型物を用いて実施例１の方法と同様の操作によっ
てアジド誘導体をつくり、β−アミラーゼあるいはグル
コアミラーゼと反応させる、と、これら酵素の結合した
組織状の固定化酵素が得られる。

これらのもの１ｇの示す酵素活性はβ−アミラーゼ４２
０単位、グルコアミラーゼ２７０単位であった。

実施例 ９ 実施例４の方法と同様の操作によって調製したコラーゲ
ン再生繊維をｐＨ３，０の塩酸溶液に溶解してコラーゲ
ン濃度２％のコラーゲン水溶液をつくる。

この溶液を濾過し、脱泡した後、吐出口の直径０．５ｍ
ｍのノズルから長さ５０ｃＩＩＬの円筒に入れた３０％
芒硝水溶液（ｐＨ１０）中に毎分１．２ｍ力）ら１．５
ｍの速さで押し出す。

凝固した糸をローラーに誘導して凝固浴（３０％芒硝水
溶液（ｐＨ１０））を通過させた後、捲取る。

捲取られた糸は１０％食塩、１％硫酸アンモニア、燻液
０．５％からなる水溶液（ｐＨ１０）に１時間浸漬した
後、水洗して乾燥する。

このようにして作られ１こコラーゲン糸４ｇをとり、乾
燥メタノール４８０ＩＩＬｌと濃塩酸４ｄを加え２０℃
で５日間以上静置した後、メタノールで洗滌してメチル
化誘導体を得る。

このメチル化誘導体を用いて実施例５の方法と全く同様
の操作によってアジド化し、このアジド誘導体を４℃の
下でβ−アミラーゼかグルコアミラーゼと反応させ、こ
れらの結合した固定化酵素糸を得る。

これらの酵素糸の１ｇが示す酵素活性はβ−アミラーゼ
糸は４５０単位、グルコアミラーゼは３００単位であっ
た。

実施例 １０ 実施例１の方法と同様の操作によってコラーゲン濃度１
％のコラーゲン水溶液をつくり、この溶液に１％アルデ
ヒドスターチ水溶液をコラーゲン１００部に対して２部
の割合で添加混合して、アクリル樹脂製又はガラス製等
の容器に流しこみ、そのま５凍結乾燥して、コラーゲン
濃度に応じた密度のスポンジ状の成型物を得る。

この成型物を用いて実施例１の方法と同様の操作によっ
てアジド誘導体をつくり、β−アミラーゼあるいはグル
コアミラーゼと反応させ、これらの酵素の結合したスポ
ンヂ状の固定化酵素が得られる。

これらのＩＩが示す酵素活性はβ−アミラーゼ４３５単
位、グルコアミラーゼ２８０単位であった。

実施例 １１ 実施例１の方法と同様の操作によって調製したコラーゲ
ンの６％水溶液を脱泡した後、注射筒につめ直径２１ｎ
１１Ｌの管口から食塩１０％、硫酸アンモニア１％、燻
液１％の混合溶液（ｐＨ１０）中に滴下するとコラーゲ
ンが粒状に凝固する。

これを水洗し風乾する。

又は上記のコラーゲン水溶液を内径２朋程度のガラス管
につめ総線量０．１〜１０Ｍγ（メガレントゲン）のγ
線照射を行い、ゲル化したコラーゲンをとり出して水洗
した後風乾する。

この乾燥物を３朋〜５朋のブロック状に切断するか、粉
砕機で砕片とする。

このようにして得られた粒状又はブロック状、砕片状の
成型物を用いて実施例１の方法と同様の操作によってア
ジド誘導体をつくり、β−アミラーゼ又はグルコアミラ
ーゼの結合した粒状乃至はブランク状の固定化酵素を得
る。

得られた粒状物１ｇの示す酵素活性はβ−アミラーゼ３
５０単位、グルコアミラーゼ２３０単位であり、ブロッ
ク状のもの１ｇの示す酵素活性はβ−アミラーゼは３０
０単位、グルコアミラーゼは２５０単位であった。

実施例 １２ 実施例５の方法と同様の操作によって調製した膜状のコ
ラーゲン担体をメチル誘導体としたもの５００■を１６
ｒｒＬｌの蒸溜水に懸濁し、３−ジメチルアミノプロピ
オニトリル０．２１ｒＬｌとアセトアルデヒド０．１
ｍＪを添加し、０．５Ｎ塩酸でｐＨを６．０〜６．５に
調整し、１５℃で２０時間静置する。

その後、担体を０．１ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）で
充分洗滌する。

洗滌を終えたもの３００■相当をとり、β−アミラーゼ
あるいはキモトリプシン１００７７１ｐを含有する水溶
液１０ＴｒＬｌに浸漬してｐＨ６，０〜６．５に保つよ
う点検しながら、２０℃で１５時間反応させる。

その後０．１ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）で３回洗滌
する。

次いで１Ｍ食塩を含む０．１ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ５，
５）に浸漬した後、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ５，５）
で洗滌する。

このようにしてβ−アミラーゼあるいはキモトリプシン
の結合した固定化酵素膜が得られる。

その１ｄの示す酵素活性はβ−アミラーゼ膜で０．７５
単位、キモトリプシン膜では１．５単位であった。

実施例 １３ 実施例５の方法と同様の操作によって調製した膜状のコ
ラーゲン担体をメチル誘導体としたもの３００■をβ−
アミラーゼあるいはキモトリプシン１００ダを含有する
水溶液１０Ｉｎｌに懸濁する。

これに３−ジメチルアミノプロピオニトリルを０、１
ｍｌ及びアセトアルデヒドを０．０５Ｍ加えて、この混
合液のｐＨを６．０〜６．５に調整しながら、１５℃で
１５時間保つ。

その後０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）を用いて３
回洗滌した後、１Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（
ｐＨ５，５）に浸漬する。

次いで０．０５Ｍ燐酸緩衝液で洗滌する。このようにし
てβ−アミラーゼあるいはキモトリプシンの結合した固
定化酵素膜が得られる。

これらの膜１ｄの示す酵素活性はβ−アミラーゼ膜で０
．５〜０．７単位、キモトリプシン膜では０．９８単位
であった。

尚、このβ−アミラーゼ膜について酵素反応を１０回に
わたって反覆くり返えし１こ成績を第４図に示し１こが
、酵素活性の変動は受力１つた０ 実施例 １４ 実施例５の方法と同様の操作によって調製し１こ膜状の
コラーゲン担体を同様の操作でメチル化誘導体としたも
の２００■にチオニルクロライド１．０Ｉｎｌを加え、
４０分還流させた後室温で２４時間装置した後、クロロ
ホルムで充分洗滌する。

次いで苛性ソーダ上で乾燥させた後、β−アミラーゼあ
るいはウレアーゼ５０ｍｇを含有する０、０５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ８，０ｐ＝ ０．０５ ） ２０ｍｌに浸
漬し、４℃で２４時間反応させた。

次いで０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ５，５）で充分洗滌す
ることによりβ−アミラーゼあるいはウレアーゼの結合
した固定化酵素膜を得１こ。

これらの膜１ｃＩ？Ｌが示す酵素活性はβ−アミラーゼ
膜で０．７〜１．２単位、ウレアーゼ膜では７，５単位
であった。

実施例 １５ 実施例５の方法と同様の操作によって調製した膜状のコ
ラーゲン担体２００Ｔｎ９を２０ＴｒＬｌの蒸溜水に懸
濁し、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−
３′−スルホネート（ウソドワーズ試薬Ｋ）２００■を
加え、水中（５℃）で２時間反応させた後、蒸溜水で洗
滌する。

次いでこれをキモトリプシンあるいはトリプシン２５■
を含む水溶液５ｍｌに浸漬して、４°Ｃで２４時間反応
させる。

その後、０．０５Ｍ燐酸緩衝液で洗滌してキモ） １プ
シンあるいはトリプシンの結合し１こ固定化酵素膜を得
た。

これらの膜１ｃＩｌの示す酵素活性はキモトリプシン膜
１．０単位、トリプシン膜Ｑ、６単位であつＴこ。

実施例 １６ 実施例５の方法と同様の操作によって調製した膜状のコ
ラーゲン担体のアジド誘導体２０即づつをストレプトマ
イシン、ジヒドロストレプトマイシン及びクロラムフェ
ニコールをそれぞれ２■を含有するトリス緩衝液（μ＝
０．２５、ｐＨ８，０）中に４℃下で２０時間浸漬し
た後、蒸溜水で洗滌をくりかえすことにより、これらの
抗生物質を固定化し１こコラーゲン担体を得た。

バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ ）を被検菌としてブイヨン寒天平板上での抗菌
テストを行うと、上記３種類の膜はいづれも抗菌力を示
す。

さらに、一回検定の培養を行つ１こ後、抗生物質固定膜
を水洗して、再び検定の培養するという操作を４回くり
かえし１こが、抗菌力が保持され、くりかえし使用が可
能であることを認めた。

又、全（同様な操作で、前記のアジド誘導体を生体内で
脱炭酸作用やアミノ酸の脱アミ７作用に関与するビオチ
ン２１ｖを含有する０、３３Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０
）に浸漬してビオチン固定膜を得た。

この膜はビオチン欠除培地寒天上でラクトバチルス・ア
ラビノザス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒａ−ｂ
ｉｎｏｓｕｓ ）の生育帯を発現した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で製造した固定化キモトリプシン
−コラーゲン膜の酵素活性の経時変化を示すグラフであ
る。 第２図は本発明の方法で製造した固定化グルコアミラー
ゼ−コラーゲン膜の酵素活性の経時変化を示すグラフで
ある。 第３図は本発明の方法で製造し１こ固定化β−アミラー
ゼ−コラーゲン膜の使用反応回数に関する酵素活性の変
化を示すグラフである。 第４図は本発明の方法で製造し１こ固定化β−アミラー
ゼ−コラーゲン膜の使用反応回数に関する酵素活性の変
化を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ （イ）可溶化コラーゲン水溶液：（Ｏ）不溶性コラ
   ーゲン繊維の水分散物；（ハ）前記（イ）および（０）
   の混合物；（へ）コラーゲンと多糖との複合体；および
   （ホコラーゲンと多糖との混合物からなる群から選択さ
   れる材料の成型物であるコラーゲン担体とこのコラーゲ
   ン担体に共有結合により結合した生物活性物質とからな
   る固定化生物活性物質。 ２ 前記多糖がホモグリカン、ヘテログリカン、グリク
   ロナン、ムコ多糖、およびホモグリカンのカルボキシメ
   チル誘導体から選択される前記特許請求の範囲第１項記
   載の固定化生物活性物質。 ３ 生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第１項ま
   １こは第２項記載の固定化生物活性物質。 ４ 生物活性物質が抗生物質である特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の固定化生物活性物質。 ５ コラーゲン担体が膜状、糸状、粒状、塊状およびス
   ポンジ状から選択される形状である特許請求の範囲第１
   項、第２項、第３項または第４項記載の固定化生物活性
   物質。 ６ コラーゲン担体をメタノール中に懸濁し、この懸濁
   液に塩素ガスを吹込むかまたは塩酸を添加してコラーゲ
   ン担体をメチルエステル化し、このメチルエステル化コ
   ラーゲン担体を飽水ヒドラジンと反応させてコラーゲン
   担体のヒドラジドを生成し、このヒドラジドと生物活性
   物質とを反応させこれを共有結合丈テ名とからなる固定
   化生物活性物質の製造方法。 Ｔ 生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第６項記
   載の固定化生物活性物質の製造方法。 ８ コラーゲン担体が膜状、糸状、”粒状、塊状および
   スポンジ状から選択される形状である特許請求の範囲第
   ６項の固定化生物活性物質の製造方法。 ９ コラーゲン担体を水に懸濁しこれに３−ジメチルア
   ミノプロピオニトリルを添加して室温以下の温度で反応
   させ次いでこの処理済みのコラーゲン担体と固定化すべ
   き生物活性物質とを反応させるか、またはコラーゲン担
   体を水に懸濁した後３−ジメチルアミノプロピオニトリ
   ルおよび固定化すべき生物活性物質を同時に添加してコ
   ラーゲン担体と室温以下の温度で反応させることからな
   る固定化生物活性物質の製造方法。 １０生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第９項記
   載の固定化生物活性物質の製造方法。 １１ コラーゲン担体が膜状、糸状、粒状、塊状およ
   びスポンジ状から選択される形状である特許請求の範囲
   第９項記載の固定化生物活性物質の製造方法。 １２ コラーゲン担体を水性媒体に懸濁させ、これにＮ
   −エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３７−ス
   ルホネートを添加することによってコラ−ゲン担体と反
   応させ、次いで処理されたコラーゲン担体と固定化すべ
   き生物活性物質とを反応させることからなる固定化生物
   活性物質の製造方法。 １３生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第１２項
   記載の固定化生物活性物質の製造方法。 １４ コラーゲン担体が膜状、糸状、粒状、塊状およ
   びスポンジ状力）ら選択される形状である特許請求の範
   囲第１２項記載の固定化生物活性物質の製造方法。 １５ コラーゲン担体をチオニルクロライドに添加し
   て反応させ、得られたクロル化コラーゲン担体と生物活
   性物質とを水性媒体中で反応することからなる固定化生
   物活性物質の製造方法。 １６生物活性物質が酵素である特許請求の範囲第１５項
   記載の固定化生物活性物質の製造方法。 １７ コラーゲン担体が膜状、糸状、粒状、塊状および
   スポンジ状から選択される形状である特許請求の範囲第
   １５項記載の方法。