JPS60990B2 - Immobilized biologically active substance and method for producing the same - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化生物活性物質、即ち固定イは酵素と所謂
生理活性物質ならびに微生物菌体及びそれらの製造方法
。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to immobilized biologically active substances, that is, enzymes, so-called physiologically active substances, microorganisms, and methods for producing them.

詳しくは繊維性蛋白質、即ちシェービング肩、ゼラチン
原料屑（コラーゲン質）、ならびに絹（フィブロイン質
）を担体として生物活性物質、即ち酵素、所謂生理活性
物質ならびに微生物菌体を化学的に結合せしめることか
らなる固定化生物活性物質ならびに微生物菌体及びその
製造方法に関するものである。その目的とする所はそれ
ぞれの担体材料の具備する特性を活用して効果的且つ経
済的に生物活性物質ならびに微生物菌体を固定化し、有
用且つ安価な固定化生物活性物質ならびに固定化微生物
菌体を提供することにある。本発明では便宜上特に酵素
及び微生物菌体の場合について説明する。皮革ならびに
その関連工業において、皮質性の石灰床皮「シェービン
グ暦、廃毛、ゼラチン材料屑等が、排出され、原料の約
５０％にものぼるとされる。Specifically, biologically active substances such as enzymes, so-called physiologically active substances, and microbial cells are chemically bonded using fibrous proteins such as shaving shoulders, gelatin raw material waste (collagen substance), and silk (fibroin substance) as carriers. The present invention relates to an immobilized biologically active substance, a microbial cell, and a method for producing the same. The objective is to effectively and economically immobilize biologically active substances and microbial cells by utilizing the properties of each carrier material, and to produce useful and inexpensive immobilized biologically active substances and immobilized microbial cells. Our goal is to provide the following. In the present invention, for convenience, the case of enzymes and microbial cells will be particularly explained. In the leather and related industries, cortical calcareous leather, shavings, waste hair, gelatin material waste, etc. are discharged, and are said to account for about 50% of the raw materials.

又紡績工業等で羊毛屑、絹糸屑が、又畜産製造工業で羽
毛等が副廃物として排出され、種々の処理法や利用法が
検討されているが、なお止むなく廃棄されるものもある
現状にある。一方、酵素又は微生物菌体の固定化に関し
ては近年研究が盛に行われ実用化の検討も進んでいるが
Ｌ実際化に当って固定化に使用する坦体材料のコストも
重要な要因になってくる。本発明者はさきにコラ−ゲン
を担体として化学的な結合法によって生物活性物質の固
定化に成功したが、さらに経済的に実施する方法につい
て検討を重ね、上記のような工業生産において副廃物と
して排出される石灰床皮、シェービング肩、ゼラチン原
料肩（コラーゲン質）、ならびに絹（フィブロィン質）
を迄体として生物活性物質を固定化することに着目して
検討し、酵素等を効果的に固定化する方法を設定するに
至った。又、一方、微生物菌体を固定化する方法に関し
ても、各種の方法について研究を重ねて釆たが、ゼラチ
ン原料層、シェービング層トフィブロィン質等のような
繊維性蛋白質の担体材料のもつ官能基を利用して、誘導
体をつくるか、種々の固定化剤を用いる等の手段によっ
て微生物菌体を化学的に結合させることを検討した結果
、有効に固定化微生物菌体を取得する方法を見出」各種
用途に有用な固定化生物活性物質又は固定化微生物菌体
を経済的に調製することに成功した。本発明は上記した
ような繊維性蛋白質担体を用いて酵素あるいは微生物菌
体を効果的に結合することのできる結合反応に関して研
究を重ねた結果完成されたものである。In addition, wool waste and silk thread waste are generated in the spinning industry, and feathers are generated in the livestock manufacturing industry as by-products.Although various treatment and utilization methods are being considered, there are still some items that have no choice but to be discarded. It is in. On the other hand, research has been actively conducted in recent years regarding the immobilization of enzymes or microbial cells, and consideration of practical application is progressing, but the cost of the carrier material used for immobilization is also an important factor in practical implementation. It's coming. The present inventors previously succeeded in immobilizing biologically active substances using collagen as a carrier through a chemical bonding method. Calcareous skin, shaved shoulders, gelatin raw materials (collagen), and silk (fibroin) are excreted as
We have focused on immobilizing biologically active substances in the body and have developed a method for effectively immobilizing enzymes, etc. On the other hand, as for the method of immobilizing microorganisms, various methods have been studied and found. As a result of considering ways to chemically bind microbial cells using methods such as creating derivatives or using various immobilizing agents, we discovered a method to effectively obtain immobilized microbial cells.'' We succeeded in economically preparing immobilized biologically active substances or immobilized microbial cells useful for various applications. The present invention was completed as a result of repeated research into binding reactions that can effectively bind enzymes or microbial cells using the above-mentioned fibrous protein carrier.

坦体のアジド誘導体をつくり「次いで低温下で対象とす
る酵素又は菌体と反応させる方法、又は、ィソシアニド
類を用いる手段、例えば担体とジメチルアミノプロピオ
ニト３ルレの共存下で対象とする酵素又は菌体と反応さ
せるか「あらかじめ担体とジメチルアミノプロピオニト
リルを反応させ「次いで対象とする酵素又は繭体と反応
させるという手段をとるか、坦体の酸塩化物をつくりこ
れと酵素又は菌体を反応させ４る手段あるいはＮ−エチ
ル−５ーフェニルイソオキサゾリウム−３′−スルホネ
ート、等カルポジィミド等の縮合試薬を用いて担体と酵
素又は菌体と結合させる手段をとることができる。この
ほか「アセトアミド類、マレィイミド類、ハロゲン化シ
アン類等も固定に用いることができる。さらに種種の試
薬、例えばグルタールアルデヒド又はジアルデヒド澱粉
、ジアルデヒドアルギン酸等あるいはタンニン類などを
用いて酵素又は菌体を結合させる手段もとることができ
る。このほか、試薬としてはへキサメチレンジイソシア
ナートなどのジイソシアナート類、２ーアミノ−４・６
ージクロローＳ−トリアジン、２・４・６ートリクロロ
−Ｓートリアジンなどのトリアジン類、ビスジアゾベン
ジン等のペンジジン類、ニトロフェニル・クロロアセテ
ート、ィソチオシアネート類、ェピクロルヒドリン等を
用いることができる。又、上記した各々の繊維性蛋白質
担体の形態、構造の特質に適当した機械的処理を施して
繊維組織を破壊したり、必要によっては部分水解などの
処理を行って担体の官能基を露出させて酵素又は菌体と
の結合を効果的にしたり、適当した前処理、例えばメチ
ルェステル化などを施すことにより、担体の官能基を化
学的に活性化する方法をとることにより効率よく酵素又
は菌体との結合を行わせることができる。A method in which an azide derivative of the carrier is prepared and then reacted with the target enzyme or bacterial cells at low temperature, or a method using isocyanides, for example, a method in which an azide derivative of the carrier is made and reacted with the target enzyme or bacterial cells in the coexistence of the carrier and dimethylaminopropionite 3 Either the carrier is reacted with dimethylaminopropionitrile in advance and then reacted with the target enzyme or cocoon, or an acid chloride of the carrier is prepared and the enzyme or the microorganism is reacted with the carrier. Alternatively, a method of combining the carrier with the enzyme or bacterial cells using a condensation reagent such as N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonate or carposimide can be taken. In addition, acetamides, maleimides, cyanide halides, etc. can also be used for fixation.Furthermore, various reagents such as glutaraldehyde or dialdehyde starch, dialdehyde alginic acid, etc., or tannins can be used to immobilize enzymes or bacterial cells. In addition, the reagents include diisocyanates such as hexamethylene diisocyanate, 2-amino-4.6
Triazines such as -dichloro-S-triazine and 2,4,6-trichloro-S-triazine, penzidines such as bisdiazobendine, nitrophenyl chloroacetate, isothiocyanates, epichlorohydrin, and the like can be used. In addition, mechanical treatment appropriate to the morphology and structural characteristics of each of the above-mentioned fibrous protein carriers may be applied to destroy the fibrous structure, or if necessary, treatment such as partial hydrolysis may be performed to expose the functional groups of the carrier. Enzyme or bacterial cells can be efficiently bonded to enzymes or bacterial cells by chemically activating the functional groups of the carrier by applying appropriate pretreatment such as methyl esterification. can be combined with

又、担体と種々の多糖類との複合体さらに硬化処理を組
合せたものも、上誌担体と同様に用いることができる。
尚、上記のようにして得られた固定イは酵素又は固定化
菌体にさらに架橋剤その他の固定化剤や紫外線照射、放
射線照射によって強化処理を行ったり、コラーゲン溶液
によるコーティング処理を組合わせた後強化する手段も
とることができる。Further, a complex of a carrier and various polysaccharides, which is further subjected to curing treatment, can also be used in the same manner as the above-mentioned carrier.
In addition, the immobilized cells obtained in the above manner may be further strengthened with enzymes or immobilized bacterial cells using a crosslinking agent or other fixing agent, ultraviolet irradiation, or radiation, or may be coated with a collagen solution. It is also possible to take measures for post-strengthening.

次に具体的態様をあげて説明する。｛１｝ 担体として
水洗して乾燥したシェービング屑、絹、を乾燥メタノー
ル中に懸濁した後「氷冷下で塩素ガスを数分闇通じて飽
和させて室温で１時間程度放置してメチルヱステル化し
た後、メタノールあるいは蒸溜水で充分洗糠す‐る。あ
るいは乾燥メタノール中「 ０．１Ｍ塩酸存在下で０℃
乃至室温の間に保ち「 ５日〜１０日間メチルェステル
化した後、蒸溜水で充分洗糠する。この場合、とくに前
者の方法を用いる時には極めて短時間で、効果的に担体
のメチルェステル化を遂行することができる。このよう
にして得られたメチルェステル化誘導体をメタノール中
あるいは蒸溜水中に懸濁して飽水ヒドラジンを１％乃至
５％になるように添加して室温下で−夜静遣した後、メ
タノールで洗練して乾燥するか、蒸溜水で洗練して担体
のヒドラジドをつくる。このヒドラジドを０．５％乃至
２％の塩酸に懸濁し、４℃以下に氷冷しながら３％亜硝
酸ソーダを終濃度が０．２％乃至１％になる程度に蝿拝
しながら滴下する。５分乃至２０分程度ゆるく礎拝した
後、得られたアジド誘導体を反応液からとりだし、ジオ
キサン次いで蒸溜水で、あるいは蒸溜水又は０．０９Ｍ
程度の食塩水を用いて充分に洗糠する。Next, specific aspects will be described. {1} Washed and dried shaving waste, silk, as a carrier is suspended in dry methanol, saturated with chlorine gas for several minutes under ice cooling, and left at room temperature for about an hour to methylesterify. After that, rinse thoroughly with methanol or distilled water.Or, rinse in dry methanol at 0℃ in the presence of 0.1M hydrochloric acid.
After methylesterification for 5 to 10 days, wash thoroughly with distilled water. In this case, especially when using the former method, methylesterification of the carrier can be effectively accomplished in a very short period of time. The methyl esterified derivative thus obtained is suspended in methanol or distilled water, saturated hydrazine is added to a concentration of 1% to 5%, and the suspension is allowed to stand overnight at room temperature. Purify with methanol and dry or refine with distilled water to prepare a carrier hydrazide. Suspend this hydrazide in 0.5% to 2% hydrochloric acid, and add 3% sodium nitrite while ice-cooling to below 4°C. is added dropwise while stirring until the final concentration is 0.2% to 1%. After stirring gently for about 5 to 20 minutes, the obtained azide derivative is taken out from the reaction solution and mixed with dioxane and then distilled water. , or distilled water or 0.09M
Thoroughly wash the rice bran using a moderate amount of salt water.

使用する試薬の濃度及び反Ｚ応時間は担体の状態によっ
てさめる。次に１０００以下の温度の下で対象とする酵
素とｐＨ５乃至８．８の０．０則程度の緩衝液中で反応
させる。The concentration of the reagent used and the reaction time depend on the condition of the carrier. Next, it is reacted with the target enzyme at a temperature of 1000° C. or less in a buffer solution having a pH of 5 to 8.8 and having a pH of about 0.0.

２時間乃至２畑時間反応後１０００以下に冷却したＩＭ
食塩を含む０．０８Ｍ程度の緩衝液ついでＺＯ．０机程
度の緩衝液あるいは蒸溜水で洗糠をくりかえし、洗液に
酵素活性がなくなるまで洗練する。IM cooled to below 1000 after reaction for 2 hours or 2 fields.
A buffer solution of about 0.08M containing salt was then added to ZO. Wash the rice bran repeatedly with approximately 0.0 mL of buffer solution or distilled water until the washings have no enzyme activity.

このようにして目的とする園定イ技酵素を得ることがで
きる。（２｝ 担体として水洗して乾燥したシェービン
グ屑または絹をｍと同様にしてメチルェステル化した後
、アジド誘導体をつくり、別に調製した微生物菌体の懸
濁液と４℃付近の温度下で１５乃至２０時間反応させた
後、０．０９Ｍ〜０．０７Ｍ程度の緩衝液で洗液するこ
とにより、菌体の固定化物が得られる。In this way, the desired enzyme can be obtained. (2) After washing and drying shaving waste or silk as a carrier, methylesterify it in the same manner as in step (m), prepare an azide derivative, and mix it with a suspension of microorganisms prepared separately at a temperature of around 4°C for 15 to 30 minutes. After reacting for 20 hours, the cells are washed with a buffer solution of approximately 0.09M to 0.07M to obtain an immobilized bacterial cell.

（３｝ 担体として水洗して乾燥したシェービング肩、
絹をそのままか【１｝のようにしてメチルェステル誘導
体とした後、対象とする酵素溶液を加えて処理した後、
さらにジアルデヒド澱粉やジァルデヒドァルギン酸ある
いはタンニン等の溶液を加えて混和した後、凍結乾燥す
る。(3) Washed and dried shaved shoulders as a carrier,
After making the silk as it is or making it into a methylester derivative as in [1], and treating it by adding the target enzyme solution,
Further, a solution of dialdehyde starch, dialdehyde sparginic acid, tannin, etc. is added and mixed, and then freeze-dried.

乾燥後０．０８Ｍの緩衝液で洗液するか、上記の担体を
対象とする酵素溶液中に浸潰し、４００以下で２乃至２
腕寺間濃縮又は乾燥させた後、ジァルデヒド澱粉溶液や
ジアルデヒドアルギン酸溶液又はタンニン溶液あるいは
グルタルアルデヒド溶液等を加えて数分乃至数時間処理
する。処理後蒸溜水あるいは０。０９Ｍの緩衝液で充分
洗絶することにより目的とする固定化酵素が得られる。After drying, wash with 0.08M buffer or immerse the above carrier in the target enzyme solution, and
After being concentrated or dried, a dialdehyde starch solution, a dialdehyde alginic acid solution, a tannin solution, a glutaraldehyde solution, etc. are added and treated for several minutes to several hours. After treatment, the desired immobilized enzyme can be obtained by thoroughly washing with distilled water or 0.09M buffer.

【４｝ 担体として水洗して乾燥した床皮コラーゲソ又
はシェービング屑、絹をそのままか｛１｝のようにして
メチルェステル化誘導体とした後、対象とする菌体の懸
濁液中に加え、混合した後、ジアルデヒド澱粉溶液やジ
アルデヒドアルギン酸溶液あるいはタンニン溶液を加え
て混和した後、凍結乾燥する。[4] As a carrier, washed and dried bed skin collagen, shaving waste, or silk can be used as is or as a methylesterified derivative as in {1}, and then added to a suspension of target bacterial cells and mixed. After that, a dialdehyde starch solution, a dialdehyde alginic acid solution, or a tannin solution is added and mixed, and then freeze-dried.

乾燥後０．０８Ｍの緩衝液で充分洗液するか、上記の担
体を対象とする菌体懸濁液中に浸潰し、４℃で１夜処理
した後、ジアルデヒド澱粉溶液やジアルデヒドアルギン
酸溶液又はタンニン溶液あるいはグルタルアルデヒド溶
液等を加えて数分乃至数時間処理する。処理後０．０９
Ｍの緩衝液で洗練すれば目的とする固定化菌体が得られ
る。上託したような方法によってシェービング肩をはじ
めとする繊維性蛋白質の恒体に酵素又は微生物菌体を結
合せしめることができ、しかも温和な条件を用いるか、
前処理によって担体を活性化する手段によっているので
酵素活性又は菌体の活性を損うことなく効果的に固定で
きる。After drying, wash thoroughly with a 0.08M buffer solution, or immerse the above carrier in a bacterial cell suspension, treat at 4°C overnight, and then add dialdehyde starch solution or dialdehyde alginate solution. Alternatively, a tannin solution or glutaraldehyde solution is added and treated for several minutes to several hours. 0.09 after treatment
The desired immobilized bacterial cells can be obtained by purification with M buffer. Enzymes or microbial cells can be bound to fibrous protein bodies such as shaving shoulders by the method described above, and using mild conditions;
Since the carrier is activated by pretreatment, it can be effectively immobilized without impairing enzyme activity or bacterial cell activity.

得られた固定化酵素固定化菌体はいづれも高い酵素活性
を示すと同時に繊維性蛋白質としての特性を保持してい
るので本発明の固定化酵素又は固定化菌体により、例え
ば酵素反応が連続化できるのをはじめとして種々の領域
に利用することが可能になった。本発明によれば低経費
化されるので諸種の化学工業的利用、分析・計測用、環
境浄化、廃水処理（フェノールの分解、シアンの分解、
アンモニアの硝化等）などの方面に容易に応用できる。
尚、酵素の他の蛋白質、ポリベプチドならびに活性物質
等の他、低分子物質も上記と同様の手段で固定化するこ
とが可能であり、２種類以上の酵素又は菌体を適当な混
合物として同時に固定化することも可能である。又、使
用する担体の形状は特に限定されずに本発明の方法が実
施できる。さらに、以下の実施例は一部の酵素又は微生
物菌体の固定化方法について記載したものであるが、グ
ルコアミラーゼ、Ｑーアミラーゼ、８ーアミラーゼ、プ
ルラナーゼ、イソアミラーゼ〜リゾチーム、インベルタ
ーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ、イソメラーゼ、
ベクチナーゼ、ナリンジナーゼ、へスベリジナーゼ、ヒ
アルロニダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プラス
ミン等のプロテアーゼ類の他、ウレアーゼ、リパーゼ、
ペニシリンアミダーゼ、アシラーゼ、リボヌクレアーゼ
、ウリカーゼ、アスパラギナーゼ、ストレブトキナーゼ
、ウロキナーゼ、トロンビン「グルコースオキシダーゼ
、カタラーゼパーオキシダーゼ、ｄーアミ／酸オキシダ
ーゼ等、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、脱
水素酵素、転移酵素、合成酵素、リアーゼ、リガーゼに
属する多種類の酵素の固定化も又、他の各種類の微生物
の菌体の固定化も同様の技術手段によって達成される。
尚、以下の実施例中に示す酵素活性の単位は次の通りで
ある。The obtained immobilized enzyme-immobilized microbial cells all exhibit high enzymatic activity and at the same time retain the characteristics of a fibrous protein. It has become possible to use it in a variety of areas, including the ability to create According to the present invention, costs are reduced, so it can be used in various chemical industries, for analysis and measurement, environmental purification, wastewater treatment (decomposition of phenol, decomposition of cyanide,
It can be easily applied to fields such as ammonia nitrification, etc.
In addition to enzymes, other proteins, polypeptides, active substances, etc., low-molecular substances can also be immobilized by the same means as above, and two or more types of enzymes or bacterial cells can be immobilized at the same time as an appropriate mixture. It is also possible to convert Furthermore, the method of the present invention can be carried out without any particular limitations on the shape of the carrier used. Furthermore, the following examples describe methods for immobilizing some enzymes or microbial cells; ,
In addition to proteases such as vectinase, naringinase, hesveridinase, hyaluronidase, trypsin, chymotrypsin, and plasmin, urease, lipase,
Penicillin amidase, acylase, ribonuclease, uricase, asparaginase, strebtokinase, urokinase, thrombin, glucose oxidase, catalase peroxidase, d-amino/acid oxidase, etc., hydrolase, isomerase, oxidoreductase, dehydrogenase, transferase Immobilization of various types of enzymes belonging to enzymes, synthetic enzymes, lyases, and ligases, as well as immobilization of cells of various other types of microorganisms, can be achieved by similar technical means.
The units of enzyme activity shown in the following examples are as follows.

グルコアミラーゼは４０午○、１分間にグルコース１０
０仏夕を生成する酵素量；８‐一アミラ−ゼは４０Ｑ○
、６０分間に１の９のマルトースを生成する酵素量：プ
ロテアーゼ類は３０℃、１分間に１ムタのチロシンを生
成する酵素量；ウレアーゼは３０ｑｏ、１分間に生成す
るアンモニア態窒素量からの換算値を示し、８−ガラク
トシダーゼ活性は２８００で１分間にｌｎＭの基質（０
一ｎｉｔｍｐｈｅｎｙｌ８−Ｄ−６ａｌａｃｔｏｓｉｄ
ｅ）を加水分解する酵素量で示した。実施例 １ 製革工程で副生されるシェービング肩を水中に浸潰して
吸水させ、充分に洗総して含有する塩類等の水溶性物質
を除去した後、乾燥し紬断して、できるだけ均一にした
ものを原料とする。Glucoamylase is 40 am○, glucose 10 per minute
The amount of enzyme that produces 0 butsuyu; 8-1 amylase is 40Q○
, the amount of enzyme that produces 1 part of 9 maltose in 60 minutes: For proteases, the amount of enzyme that produces 1 muta of tyrosine per minute at 30°C; for urease, 30 qo, converted from the amount of ammonia nitrogen produced per minute. The 8-galactosidase activity is 2800 and 1 nM substrate (0
-nitmphenyl8-D-6alactosid
e) is expressed as the amount of enzyme hydrolyzed. Example 1 Shaving shoulder, which is a by-product of the tanning process, is soaked in water to absorb water, thoroughly washed to remove water-soluble substances such as salts, dried and cut into pieces as uniformly as possible. The processed material is used as raw material.

このもののクロム含有はＣｒ２０３として２．８％であ
った。このシヱ−ビング暦２夕を乾燥メタノール中に懸
濁して氷浴中で冷却しながら塩素ガスを２分間通じ飽和
させた後、そのまま１時間静置するか、乾燥メタノール
３００のＺに懸濁し、濃塩酸３の上を加え、２０００〜
２５ｑｏで１０日間静遣した後、メタノールで充分洗縦
することによってシェービング屑のメチルェステル誘導
体をつくる。得られたメチルェステル誘導体をヒドラジ
ンヒドラートの５％メタノール溶液中に浸潰し、２０ｏ
ｏで１夜静潰した後、メタノールで洗液、乾燥してヒド
ラジド誘導体をつくる。これを４℃以下に氷冷した２％
塩酸２００の‘に懸濁し、境梓しながら３％亜硝酸ソ−
ダ溶液６０机を滴下する。その後１０分間ゆるく燈拝し
て反応させた後、ジオキサン次いで蒸溜水で充分洗族し
てァジド誘導体をつくる。次にこのアジド誘導体を４℃
の下で０．０８Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）に次にあげ
る各酵素を０．５％含む溶液１０物【中に浸簿して１５
時間反応させる。反応終了後、液と分って蒸溜水で洗縦
後、ＩＭ食塩を含む０．０９Ｍ燐酸緩衝液（ｐｆ１５．
５又はｐＨ８．０）あるいは０．０８Ｍトリス緩衝液（
ｐＨ８．０）の浸潰して塩類液処理をした後、食塩を含
まない上記と同じ組成の緩衝液を用いて洗液することに
よって対象とする各酵素の結合した固定イは酵素を得た
。得られた固定化酵素の示す酵素清閏ま固定化したシェ
ービング屑１夕当り、固定づ化８−アミラーゼは６７単
位、固定化グルコアミラーゼは５の単位、固定化キモト
リプシンは３５８単位「 固定化パパインは１２母単位
、ウレアーゼは３０単位であった。実施例 ２０ 絹布
１夕を充分洗孫した後、風乾したものを乾燥メタノール
３６０の‘に浸潰し、濃塩酸３のとを加えて２５ｑ０１
０日間静贋した後、実施例１と同様の操作によって絹布
のアジド誘導体をつくり「 ３−アミラーゼ、キモトリ
プシン、バパィンと反応させづて、各酵素の結合した固
定イは酵素を得た。The chromium content of this material was 2.8% as Cr203. This sieving calendar was suspended in dry methanol and saturated with chlorine gas for 2 minutes while being cooled in an ice bath, and then allowed to stand for 1 hour, or suspended in 300% dry methanol. , add 3 parts of concentrated hydrochloric acid, 2000 ~
After standing at 25 qo for 10 days, a methyl ester derivative of shaving waste is prepared by washing thoroughly with methanol. The obtained methyl ester derivative was immersed in a 5% methanol solution of hydrazine hydrate and heated at 20oC.
After crushing overnight at o, the mixture is washed with methanol and dried to produce a hydrazide derivative. 2% of this was ice-cooled to below 4°C.
Suspend in 200% hydrochloric acid and add 3% nitrous acid solution while stirring.
Add 60 drops of Da solution. Thereafter, the mixture was allowed to react slowly for 10 minutes, and then thoroughly washed with dioxane and then distilled water to prepare an azide derivative. Next, this azide derivative was heated at 4°C.
10 solutions containing 0.5% of each of the following enzymes in 0.08M phosphate buffer (pH 8.5) under
Allow time to react. After the reaction is complete, the liquid is separated and washed with distilled water, followed by 0.09M phosphate buffer (pf15.
5 or pH 8.0) or 0.08M Tris buffer (
After soaking and treating with a saline solution (pH 8.0), the enzymes were washed with a buffer containing no salt and having the same composition as above to obtain immobilized enzymes bound to each enzyme of interest. The enzyme concentration of the obtained immobilized enzymes per immobilized shaving waste was 67 units for immobilized 8-amylase, 5 units for immobilized glucoamylase, and 358 units for immobilized chymotrypsin. had 12 mother units, and urease had 30 units.Example 20 A piece of silk cloth was thoroughly washed for 1 night, then air-dried and soaked in 360 g of dry methanol, and 3 g of concentrated hydrochloric acid was added to give 25 g01.
After standing still for 0 days, an azide derivative of silk cloth was prepared by the same procedure as in Example 1, and reacted with 3-amylase, chymotrypsin, and vapain to obtain immobilized enzymes bound to each enzyme.

各固定イは酵素の示す酵素活性は固定化Ｂ−アミラーゼ
は８．５単位、固定化キモトリプシンは３９単位、固定
化パパィンは１の単位である。実施例 ３ ０ 実施例１と同機に操作して得たシェービング肩のメ
チルェステル誘導体２０肌‘をとり、これに対象とする
酵素の１％溶液５０肌を加え、充分混合し、さらにタン
ニン（ワットル又はケブラコ）の水溶液を終濃度が１％
になるように加えて燈拝したタ後、凍結乾燥する。The enzymatic activity of each immobilized enzyme is 8.5 units for immobilized B-amylase, 39 units for immobilized chymotrypsin, and 1 unit for immobilized papain. Example 3 0 Take 20 pieces of methylester derivative skin from a shaved shoulder obtained by operating the same machine as in Example 1, add 50 pieces of a 1% solution of the target enzyme, mix thoroughly, and add tannin (wattles or Quebraco) aqueous solution with a final concentration of 1%
After adding it to the desired temperature, it is freeze-dried.

乾燥後、０．０９Ｍ燐酸緩衝液で洗練することにより、
各酵素の固定化酵素を得た。得られた固定イ蛇酵素１夕
の示す酵素活性は例えば６ーアミラーゼは３５単位、グ
ルコアミラーゼは３山単位、バパインは１３の単位、キ
モトリプシンは１７山単位であった。実施例 ４ シェービング肩を実施例１のように操作してメチルェス
テル誘導体としたもの１０ｗ‘をとり、以下のような各
酵素の１％溶液２０私中に混じ、４℃下で減圧乾燥する
。After drying, by refining with 0.09M phosphate buffer,
Immobilized enzymes were obtained for each enzyme. The enzyme activity of the obtained immobilized snake enzyme was, for example, 35 units for 6-amylase, 3 units for glucoamylase, 13 units for vapain, and 17 units for chymotrypsin. Example 4 Take 10 w' of methyl ester derivative prepared from the shaved shoulder as in Example 1, mix it with 20 w of 1% solution of each enzyme as shown below, and dry under reduced pressure at 4°C.

次いでグルタルアルデヒド１％溶液を加えて５分間処理
するか、ジアルデヒド澱粉の２．５％溶液を加えて２時
間処理する。処理後蒸溜水で充分洗練することにより各
酵素の固定化酵素を得た。得られた固定化酵素１夕の示
す酵素活性の一例をあげると８ーァミラーゼは４５単位
、グルコアミラーゼは３４単位、パパィンは１００単位
、キモトリプシンは１９山単位、トリプシンは１８５単
位、アルカリプロテアーゼは１８０単位「ウレアーゼは
２５筆位である。実施例 ５ 製革工程からの石灰床皮を水洗して石灰を除去し、１％
食塩を含む酸性溶液で中和して水洗した後、さらに酸性
溶液に浸潰して膨潤した皮を切断し、解組織したものを
原料とした、この原料について実施例１と同様に操作し
てメチルェステル誘導体とした後、アジド誘導体をつく
る。A 1% solution of glutaraldehyde is then added and treated for 5 minutes, or a 2.5% solution of dialdehyde starch is added and treated for 2 hours. After the treatment, immobilized enzymes of each enzyme were obtained by thoroughly refining with distilled water. Examples of enzyme activities exhibited by the obtained immobilized enzymes are 8-amylase: 45 units, glucoamylase: 34 units, papain: 100 units, chymotrypsin: 19 units, trypsin: 185 units, and alkaline protease: 180 units. "Urease is about 25 strokes. Example 5 Limebed leather from the tanning process is washed with water to remove lime, and 1%
After neutralizing with an acidic solution containing salt and washing with water, the swollen skin was further immersed in an acidic solution and then cut and disintegrated. This raw material was used in the same manner as in Example 1 to obtain methyl ester. After making it into a derivative, an azide derivative is made.

一方、下記したような生産塔地で培養して得たェツシェ
リヒァコリ（Ｅｓｃｈｅｒ℃ｈｉａｃｏｌｉｓｐ．）の
菌体ならびにミクロコツカスラクチス（Ｍにｒｏｃｏｃ
ｃ瓜ｌａｃｔｉｓ）およびサツカロミセス フラギリス
（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｆｒａｇｉＩＳ）の菌体
の１％懸濁液（０．０７Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ６．５）と
４℃付近で１５乃至２０時間反応させた後、０．０７Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）で洗液することにより、それ
ぞれの菌種の菌体を結合した固定化菌体を得た。これら
の固定化菌体の活性の指標として８ーガラクトシダーゼ
活性を測定すると、ェッシェリヒアコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ
）固定化菌体１汎ま２８８０乃至３２０山単位の活性を
示した。さらに、固定化菌体にＩＭ食塩を含む燐酸緩衝
液を加え塩類処理をした後も活性の低下は見られなかっ
た。又、ミクロコツカスラクチス（Ｍ．ｌａｃｔＳ）固
定化菌体では２５０の単位、サツカロミセス フラギリ
ス（Ｓａｃｃｈ．ｆｒａざｌｉｓ）固定化菌体は４０山
単位を示した。次に、得られた固定化菌体を同じ燐酸緩
衝液中、２０００下で保存して随時測定をくりかえした
結果の１例（ェッシェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）固
定化菌体）を第１図に示したが、活性の低下は少〈、４
０日以上活性は保持された。以下に培養条件を示す。On the other hand, the bacterial cells of Escherchiacolisp. obtained by culturing in the production site as described below and Micrococcus lactis (M. rococlisp.
After reacting with a 1% suspension (0.07M phosphate buffer, pH 6.5) of bacterial cells of C. lactis and Saccharomyces fragilis at around 4°C for 15 to 20 hours, 0.07M
By washing with phosphate buffer (pH 6.5), immobilized bacterial cells containing the cells of each bacterial species were obtained. When 8-galactosidase activity was measured as an indicator of the activity of these immobilized bacterial cells, E. coli
) It showed an activity of 2,880 to 320 cells per immobilized bacterial cell. Further, no decrease in activity was observed even after the immobilized bacterial cells were treated with salts by adding a phosphate buffer containing IM saline. Furthermore, the microbial cells immobilized with M. lactis showed 250 units, and the microbial cells immobilized with Saccharomyces fragilis showed 40 units. Next, the obtained immobilized bacterial cells were stored in the same phosphate buffer under 2,000 ℃, and measurements were repeated as needed. An example of the results (immobilized Escherichia coli (E. coli) bacterial cells) is shown in Figure 1. However, the decrease in activity was small (4)
Activity was maintained for more than 0 days. The culture conditions are shown below.

Ｅｓｃｈｅｒにｈｉａｃ帆の生産培地および培養条件べ
プトン ３．０タ′そ（Ｎ比
）２Ｓ０４ ２．０夕／そＫＨ２
Ｐ〇４ ３‐０夕／そＮａ
２ＨＰ〇４ ６・０タ′そ
ＮａＣ１ ３‐０タ′そ
ＭｇＳ〇４・７日２〇 ○‐０５タ
′そＦｅＳ〇４・７日２〇
５のｏ′そビタミンＢ．・ＨＣＩ塩 ０
．５の９′〆乳 糖 ８．
０タ′そｐＨ７．２、３０００、５幼時間Ｍｉｃｒｏｃ
ｏｃｃｕｓｌａｃｔＳの生産塔地および培養条件べプト
ン １０タ′夕酵母エキス
５夕／夕ＫＨ２Ｐ〇４
２．５夕／夕酷酸ソーダ
１０夕／そ乳糖 １０夕
／そアスコルビン酸 １夕／そ ｐＨ６．８３０００、４細寿間 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｈａｇｌｉｓの生産塔地お
よび培養条件べプトン ２０
タ′そ酵母エキス １０夕／そ
乳 糖 ２０夕／そｐＨ５
‐５３０℃、７２時間実施例 ６ 実施例１と同様に操作して得たシェービング肩のアジド
誘導体をとり、実施例５と同様にして調製したェッシェ
リヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ミクロコツカス ラク
チス（Ｍ．ｌａｃｔｉｓ）ならびにサツカロミセス フ
ラギリス（Ｓａｃｃｈ．ｆｒａｇｉｌｂ）の菌体の１％
懸濁液（０．０７Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ６．５）と４℃付
近で、時々損拝しつつ２加時間反応させた後、０．０７
Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ６．５で洗撤して、それぞれの菌体
の結合した固定化菌体を得た。Production medium and culture conditions for hiac sails on Escher Beptone 3.0 T'so (N ratio) 2S04 2.0 T/So KH2
P〇4 3-0 Evening/SoNa
2HP〇4 6.0 ta'soNaC1 3-0 ta'soMgS〇4.7 days 20 ○-05 ta'soFeS〇4.7 days 20
5 o' so vitamin B.・HCI salt 0
．． 5-9' Lactose 8.
Microc
OccuslactS production site and culture conditions Beptone 10T' yeast extract
5 evening/evening KH2P〇4
2.5 Yu / Yuku acid soda
Saccharomyceshaglis production area and culture conditions Beptone 20
Ta'so yeast extract 10 yen/Soy milk sugar 20 yen/So pH 5
-530°C, 72 hours Example 6 The azide derivative of shaving shoulder obtained in the same manner as in Example 1 was taken, and the azide derivative of Escherichia coli (E. coli), Micrococcus lactis (M. lactis) and 1% of the bacterial cells of Saccharomyces fragilis (Sacch.fragilb)
After reacting with the suspension (0.07 M phosphate buffer, pH 6.5) at around 4°C for 2 hours with occasional stirring, 0.07
The cells were washed with M phosphate buffer, pH 6.5, to obtain immobilized cells to which the respective cells were bound.

これらの固定化菌体の活性は、１夕当りの示す８−ガラ
クトシダーゼ活性として、ェッシェリヒア コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）は９５山単位、ミクロコツカス ラクチス（
Ｍ．ｌａｃｔｉｓ）は８４８単位、サツカロミセス フ
ラギリス（Ｓａｃｃｈ．ｆｒａざＩＳ）は１７の単位で
あった。実施例 ７実施例２と同様に調製した絹につい
て、実施例６と同様に操作して、それぞれのェツシェリ
ヒアコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の固定化菌体を調製する。The activity of these immobilized bacterial cells is expressed as the 8-galactosidase activity per night of Escherichia coli (E.
coli) has 95 mountain units, and Micrococticus lactis (
M. lactis) had 848 units, and Saccharomyces fragilis (Sacch. fragilis) had 17 units. Example 7 Silk prepared in the same manner as in Example 2 is operated in the same manner as in Example 6 to prepare immobilized E. coli cells.

得られた固定化菌体１夕の示す活性は１１３山単位の８
ーガラクトシダーゼ活性であった。実施例 ８ 実施例５と同様の操作で、床皮のメチルェステル誘導体
２０泌を実施例５と同様にして準備したェツシェリヒア
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はミクロコツカス ラクチス
（Ｍ．ｌａｃｔｉｓ）の１．５％の菌体懸濁液（０．０
８Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ６．５）１５の‘中に加え「 ４
℃下でよく鷹梓混合した後、ジアルデヒド澱粉溶液を２
％量加えて、ｐＨを７．５とし均一に混和した後、凍結
乾燥する。The activity exhibited by the obtained immobilized bacterial cells was 8 in 113 mountain units.
-galactosidase activity. Example 8 In the same manner as in Example 5, 1.5% of methylester derivative 20 secreted from the floor skin of E. coli or M. lactis prepared in the same manner as in Example 5 was used. Bacterial cell suspension (0.0
8M phosphate buffer, pH 6.5)
After mixing thoroughly at ℃, add 2 ml of dialdehyde starch solution.
% amount, and after adjusting the pH to 7.5 and mixing uniformly, freeze-drying.

乾燥後、充分洗修することにより、それぞれの菌種の固
定化菌体を得た。得られた固定化菌体１夕の示す活性は
ェツシェリヒアコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）固定化菌体では２
２０■単位、ミクロコッカス ラクチス（Ｍ．ｌａｃｔ
ｉｓ）固定化菌体では１２０山単位のＢ−ガラクトシダ
ーゼ活性であった。実施例 ９ 実施例８と同様の床皮のメチルェステル譲導体２０の‘
を実施例７と同様の操作によって調製したェツシェリヒ
ア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はミクロコツカス ラクチ
ス（Ｍ．ｌａｃｔｉｓ）の１．５％の菌体懸濁液（０．
０８Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ６．５）１５必中に加え、４℃
下でよく摺梓混合した後、タンニン（ワットル又はケブ
ラコ）の水溶液を１％量加え、均一に混和した後、凍結
乾燥する。After drying, the cells were thoroughly washed to obtain immobilized bacterial cells of each bacterial species. The activity exhibited by the obtained immobilized bacterial cells was 2 for E. coli immobilized bacterial cells.
20 units, Micrococcus lactis (M.lactis)
is) B-galactosidase activity was 120 peaks in the immobilized bacterial cells. Example 9: Preparation of methyl ester conductor 20 in the same manner as in Example 8.
A 1.5% cell suspension of E. coli or M. lactis prepared by the same procedure as in Example 7 (0.
08M phosphate buffer, pH 6.5), added to 150ml, and heated at 4℃
After thoroughly mixing with a slurry, 1% aqueous solution of tannin (wattle or quebraco) is added, mixed uniformly, and freeze-dried.

乾燥後、充分水洗することによって、それぞれの菌種の
固定化菌体を得た。得られた固定化菌体１夕の示す活性
は８−ガラクトシダーゼを指標とすると、例えばヱッシ
ェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｊ）固定化菌体では１００
山単位、ミクロコッカス ラクチスでは８０山単位であ
つた。実施例 １０ 実施例８と同様の処理によって調製した床皮のメチルェ
ステル誘導体１０の‘を実施例７と同様の操作によって
準備したェッシェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はミ
クロ．コッカス ラクチス（Ｍ．ｌａｃｔｉｓ）の１
．５％菌体懸濁液（０．０８Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ６．５
）１０の‘中に加え、４℃下でよく混合した後、１夜放
置する、その後グルタルアルデヒド溶液を１％量加えて
、ｐＨを７．５として１０分間処理した後、水洗を充分
行った後、凍結乾燥して固定化菌体を得た。After drying, the cells were thoroughly washed with water to obtain immobilized bacterial cells of each bacterial species. When the activity of the obtained immobilized bacterial cells is 8-galactosidase, for example, in the case of E. colj immobilized bacterial cells, the activity is 100%.
In Micrococcus lactis, there were 80 mountain units. Example 10 The methylester derivative 10' of floor skin prepared by the same treatment as in Example 8 was applied to Escherichia coli (E. coli) or Micro. 1 of Coccus lactis
．． 5% bacterial cell suspension (0.08M phosphate buffer, pH 6.5
) After mixing well at 4°C and leaving overnight, 1% glutaraldehyde solution was added to adjust the pH to 7.5 and treated for 10 minutes, followed by thorough washing with water. Thereafter, the cells were freeze-dried to obtain immobilized bacterial cells.

得られた固定化菌体１夕の示す８ーガラクトシダーゼ活
性はェッシェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）固定化菌体
で１００３単位、ミクロコツカス ラクチス（Ｍ．ｌａ
ｃｔｉｓ）固定化菌体で７５０単位であった。The 8-galactosidase activity exhibited by the immobilized bacterial cells obtained was 1003 units for Escherichia coli (E. coli) and 1003 units for Micrococcus lactis (M. la
ctis) was 750 units for immobilized bacterial cells.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は本発明実施例５の方法で製造した固定化ェッシ
ェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｊ）の保存時の活性低下を
示すグラフである。 オー図FIG. 1 is a graph showing the decrease in activity of immobilized E. colj produced by the method of Example 5 of the present invention during storage. O diagram

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ シエービング屑、生皮粉砕物、絹フイブロインから
なる群から選択される繊維性蛋白質担体と該担体に化学
的に結合させた酵素または微生物菌体とから成る固定化
生物活性物質。 ２ シエービング屑、生皮粉砕物、絹フイブロインから
なる群から選択される繊維性蛋白質担体をメタノール中
に懸濁し、この懸濁液に塩素ガスを吹込むかまたは塩酸
を添加して該担体をメチルエステル化し、該メチルエス
テル化担体を飽水ヒドラジンと反応させて該担体のヒド
ラジドを生成し、更に該ヒドラジドと酵素または微生物
菌体とを反応させて化学的に結合させることからなる固
定化生物活性物質の製造方法。 ３ 前記担体をメタノールに懸濁する前またはメチルエ
ステル化した後、アルデヒドと反応させることを特徴と
する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 前記担体をメタノールに懸濁する前またはメチルエ
ステル化した後、タンニンと反応させることを特徴とす
る特許請求の範囲第２項記載の方法。[Scope of Claims] 1. An immobilized biologically active substance comprising a fibrous protein carrier selected from the group consisting of shaving waste, crushed rawhide, and silk fibroin, and an enzyme or microbial cell chemically bonded to the carrier. . 2. A fibrous protein carrier selected from the group consisting of shaving waste, crushed rawhide, and silk fibroin is suspended in methanol, and chlorine gas is blown into this suspension or hydrochloric acid is added to transform the carrier into methyl ester. an immobilized biologically active substance, which comprises reacting the methyl esterified carrier with saturated hydrazine to produce a hydrazide of the carrier, and further reacting the hydrazide with an enzyme or a microbial cell to chemically bond the carrier. manufacturing method. 3. The method according to claim 2, characterized in that the carrier is reacted with an aldehyde before being suspended in methanol or after being methyl esterified. 4. The method according to claim 2, characterized in that the carrier is reacted with tannin before being suspended in methanol or after being methyl esterified.