JPS5934895A - プルマイシン製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はバチルス属に属する微生物を培養して、その培
養液中に次式 で表わされるプルマイシン（Ｐｒｕｍｙｅｌｎ　）　　
を蓄積サ−１、培養液か【・プルマイシン又はその酸伺
加塙を採取することによってグルマイシンおよびそσ）
酸付加塩を製造する方法に関するものである。

プルマイシン（凍たはＦ−１０ニアｇ物質）は秦藤樹ら
によって発見された細菌やかびの発育を阻止する抗生物
質であシ、ストレプトミセス・カガワエンシス（微工研
菌寄第９５３号）忙よって生産される（特公昭５０−２
９０３７号１日本特Ｗ「第８１９４３９号、ジャーナル
・オプ・アンチビオチクヌ、２４巻、９００負、１９７
１年）。

本発明者は、バクテリヤの生産する新規抗生物質の探索
中忙、東京都杉並区須賀神社境内の土壌試料より分離し
、ＢＭＧ３６６−ＵＦ５株の番号を付した菌株がプルマ
イシンを生産していることを発見し７た。全く同一構造
を有する抗生物質が、ストレプトミセスとバクテリヤの
両者によって生産されることは、きわめて稀なことであ
る・さらに本発明者らによって見いだされたＢＭＧ３６
６−ＵＦ５株は、簡単で安価な培養原料によって培養し
てプルマイシンを生産蓄積できることを見いだして、本
発明を完成した〇 すなわち、本発明は、バチルス属に属するプルマイシン
生産菌を好気的に発育させ・その培養液からプルマイシ
ンまたはその酸付加塩を採取することを特徴とするプル
マイシンまたはその酸付加塩の製造法を要旨とするもの
である。

本発明の方法において用いられるプルマイシン生産菌の
一例は、昭和５５年１１月、微生物化学研究所において
、東京都杉並区須賀神社境内の土＃ｉｉ試料より分離し
たバクテリアで、ＢＭＧ３６６−ＵＦ５株の菌株番号が
付されたーものである。その菌学的性状１１次に示す通
勺である。

■、形態 （１）　　細胞は桿菌−大きさは１．０〜１．２　Ｘ　
２・８〜３．８ミクロンである。

（２）　　細胞の多形性は特に認められない。

（３）　　活発な運動性を示し、周鞭毛を有する０（４
）胞子を有する。その形は卵円形、大きさは０．８〜１
．０　Ｘ　Ｉ−２〜２・０ミクロン、位置は中立（ｃｅ
ｎｔｒａｌ　）・菌体の膨隆は認められない。

また耐熱性である。

（５）　　ダラム染色は陽性である。

（６１非抗酸性である。

２、各秤培地における生育状態 すべて３０′Ｃで試験した。

（１）　　肉汁寒天平板培養 コロー−ｕ光沢のない、不透明な円形で、辺縁は不規則
、色は茶白（ｂｒｏｗｎｉｓｈ　ｗｈｉｔｅ　）を示す
・拡散性色素は認められない。

（２）　　肉汁寒天斜面培養 培地表面に広がって増殖し、不透明で光沢がなく、茶白
（ｂｒｏｗｎｌｓｈ　ｗｈｉｔｅ　）　　を示す。

拡散性色素は認められない。

（３）　　肉汁液体培養 培養後２４時間で培地全体が濁り、２日目には培地表面
に菌膜をつくる。３日目になると、培地表面な菌膜がお
おい、培地の濁りが消失して、試験管底部に菌体が沈澱
してくる・（４）　　肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０℃　で培養すると、培養後２４時間目に穿刺線にそ
って増殖が認められ、２日目からゼラチンの液化が始ま
る。その型は層状である。一方、３０’ｔ　　で培養す
ると、２４時間で表面に菌膜を形成し、ゼラチンの液化
が始する。子の型はやけ多層状である。

（５）　　ミルク培養 リドマスミルク培地に３７ｃ′Ｃて培養すると、培養後
２４時間で凝固が始まり、直ちに完了スル。イブトン化
は、ミルクの凝固完了後始ブリ、培養後８日目に完了し
た。一方ＢＣｐミルクは、培養後２４時間で凝固状態と
な、す、直ちにベグトン化が開始され、５日目に完了し
た。リドマスミルク、ＢＣＰミルクとも反応ｄアルカリ
性である。

８、生理的性質（３０℃） （１１硝酸塩の還元：陽性 （２）脱窒反応（長谷用武治編著：微生物の分類と同定
、２２３Ｎ・学会出版セン ター、　　１９７５年の駒形らの方法 によった）：陽性 Ｉｌｌ　　Ｍ　Ｒテスト：陽性 ＋４１ＶＰテスト：陽性 ＋ｒ）１　　インドールの生成：陰性 （６１硫化水スうの生成：陰性 【７１　　デンプンの加水分解：陽性 （８１クエン酸の利用：　ＴＣｏｎｅｒの培地−Ｃｈｒ
ｉｓｔ−ｅｎｓｅｎの培地ともに生育する。

＋９１　　無機窒素源の利用：グルタミン酸ナトリウム
、硝酸ナトリウム−脅〃アンモニウムｔ　カザミノ酸（
Ｖｉｔａｍｉｎ　ｆｒｅｅ　−Ｃａｓａｍｉｎｏ　Ａｅ
ｉｄｇ＋Ｄｌｆｃｏ　）のいずれをも利用する。

０１　　色素の生成：陰性 Ｉ　ウレアーゼ（尿素培地：栄研）：陽性α２　オキシ
ダーゼ：陰性 ０　カタラーゼ：陽性 （１４１生育の１ｒｌＮｊｔｌ（：　ｐＨ５−Ｏ−ｐ１
１９−９１）範囲テ生育を認め、最適ｐｉｔ　ｉ！、　
６．０〜８．０である。また、１００Ｃ〜４５°Ｃの範
囲で生育を認め、最適温度は３０°Ｃ−３７°Ｃである
。

０９　　酸素に対する態度二通性嫌気性Ｎｏ−Ｆテスト
（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ試馳）：発酵型 ＋１７１　　ｇ素化合物の利用：Ｌ−アラビノース。

１〕−キシロース、　Ｄ−グルコース、■〕−マノノー
ス、　Ｄ−フラクトース、　Ｄ−ガラクトース、　麦芽
糖、　ショ糖・　乳糖・トレハロース、　Ｄ−ソルビッ
ト、　Ｄ−マンニット、　イノジット、　グリセリン。

デンプンを利用し、コハク酸ナトリウム。

クエン酸ナトリウム、　エリスリットを利用しなかった
。

Ｕ　　糖類からの酸およびガスの生成 ガスの生成はすべて陰性である。

Ａ培地：ベプト７１０　ｇ、　　ＮａＣｌ２　ｇ、　　
ＩＩＴＢ　Ｏ，００ｇ、’？、ｆｆ製水１ｏｏｏ　ｍｌ
、Ｐ”　’Ｌ２Ｂ培地：　ＮＨ４ＮＯ３１，０、ｌｉ’
　、　　ＫＨ２ＰＯ４１，Ｏｇ、　ＭｇＳＯ４・　７Ｈ
２００，５、ｌｉｔ　、　　ＫＣＩ　Ｏ，２ｊ；ｊ　、
　　ＢＴＩＩ　　Ｏ，００ｇ、ｙ、精ｍ水１０００　ｍ
ｌ、ｐｌ＋　７．２０９　７係ＮＥ　Ｃ／　　における
生育：陽性■　カゼインの加水分解：陽性 以上の性状を要約すると、ＢＭＧ　　３６６−ＵＦ５味
は・通性嫌気性のダラム陽性の有芽胞桿菌で、周鞭毛を
有し、運動性を示す。芽胞は卵円形で中立（ｅｅｎｔｒ
ａｌ　）、耐熱性である。菌体の膨隆は認められず、非
抗酸性である。寒天培地での生　　　。

育は不透明で、辺縁は不規則、培地表面にひろがって増
殖する。ゼラチンを液化し、ミルクを凝固ベグトン化す
る。硝酸塩を還元し・脱窒反応陽性・Ｍ　Ｒテスト陽性
、ｖＰテスト陽性である。インドールｆｊ、検出されず
、硫化水嵩を生成しない０デン　　　Ｉゾ、を分解し、
クエン酸を利用するのウレア−ゞ　　　プ反応陽性、オ
キシダーゼ反応陰性・　カタラーゼ反応陽性である。ｐ
ｌ＋５．０〜９．９の範囲で生育し、最　　　・適ｒＩ
Ｉｌ　ｉＪ：　６．０〜８．０である。また、１ｏ０Ｃ
〜４５°Ｃの範囲で生育し、最適温度は３０°Ｃ〜３７
°Ｃである。ブドウ糖を発酵的に分解し、酸を生成する
□糖類からの酸の生成は培地によりやや異なるが、Ｌ−
アラビノース、■）−キシロース、　Ｄ−マンノース、
　Ｄ−ガラクトース、　乳糖、　　Ｄ−ソルビット、　
Ｄ−マンニット、　イノジットからは酸を生成しない。

ガスの生成は、いずれの糖からも認められない。塩化ナ
トＩＪウム濃度が７俤でも生育し、カゼインを分解すル
。

以上の性状をもとに、ＢＭＧ　　３６６−ＵＦ５味を「
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖ＠Ｂａｅｔ−ｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｊ　ｇ　
ｔｈ　５ｄｌｔｉｏｎ　（ＲｌＥ、　Ｂｕｅｈａｎａｎ
　＆　Ｎ。

Ｅ、Ｇｉｂｂｏｎｓ、　Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｌａｍｓ　＆
　Ｗｌｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋Ｂａｌｔ１ｍｏｒ
ｅ、　１９７４　）で検索すると、５３１頁のＢａｃｉ
ｌｌｕｓ　　幌に川すると考えられる。更に１種を険索
するとグルコースからアセトインを生成し１名化ナトリ
ウム濃度が７俤でも生育し、Ｌ−アラビノース、　Ｄ−
キシロース、　Ｄ−マンニットから酸を生成しない種、
すなわちＢａｃｉｌｌｕｌ！Ｉｅｅｒ−ｅｕｓ、　Ｂ、
　ａｎｔｈｒａｃｉ８．　Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ＴＡｉｓが近縁のものと思われる。１３Ｍ０　３６６−
ＵＦ４株（７）ｆ９’状ヲ上記３種と比較すると・次表
のようになる。

この表から明らかなように、ｎＭＧ　　３６６−ＵＦ５
株は、Ｂ、　ｃｅｒｅｕｓ、　Ｂ、　ａｎｔｈｒａｃｉ
ｓ、　Ｂ、　ｔｈ−ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　＃てよ〈
類似している。しかし、Ｂ　ＭＧ　　３６６−ＵＦ５株
は、運動性を有する点で運動性のないＢ、　ａｎｔｈｒ
ａｅｉｓ　　と異ｆ：ｒ−１：ｉ、一方、Ｂ。

ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｌｓは昆虫の病原菌である（１
記のＢｅｒｇｃｙ’ａ　Ｍａｎｕａｌの５３６員参照）
ことからＢＭＧ　　３６６−ＵＦ５株と明確に区別され
る。

従って、ＢＭＧ　　３６６−ＵＦ５株け、Ｂ、　ｅｅ−
ｒｅｕｓ　　に最も近縁の種と考えられた。次に示す表
１ｄ’、”５研究所で保管しているＢ−ｃｅｒｅｕ♂３
菌株と、ＢＭＧ　　３６６−ＵＦ５株を実際に比較検討
した成績である。

１３ＭＧ　　３６６−ＵＦ５株は、ウレアーゼ試験陽性
で、この点のみが２株のＢ、ｃｅｒｅ＋Ｈと異なｐ。

他の１株とｔｉｔ合致している。前に示した表にあるよ
うに、０．ｃｅｒｅｕｇ　　のウレアーゼ反応には疑問
があり、この相違点は問題にするようなものでけないと
考えられる。

従って、ＢＭＧ　　３６６−ＵＦ５株をバチルス０セレ
ウス（Ｂａ８月１ｕｓ　ｃｅｒｅｕｇ　）　Ｂ　Ｍ　Ｇ
　　３６６−　Ｕ　Ｆ　５株と同定１７た。なお、ＢＭ
Ｇ　　３６６−ＵＦ５株は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託され（昭和５７年３月１日）その微生物受託
番号【」微工研菌寄第６３９５号（ＦＥＴｔＭ　Ｐ　−
６３９５）である。

本発明のプルマイシンの製造法を実施するに当っては、
ＢＭＧ　　３６６−ＵＦ５株を栄養源含有培地に接種し
て、好気的に発育させることによってグルマイシンをｔ
＠養液中に蓄積させる。栄養源としてはバクテリアの栄
養源として用いられる公知のものを使用できる。例えば
市販されている大豆扮、魚粉、肉エキス、ペプトン、酵
母エキス、Ｎｚ−アミン、硫酸アンモノなどの窒累源お
よび市販されているグリセリン、ブドウ籾１、！？’ｔ
　’６）、マルトースなどの炭水化物、あるいは脂肪な
との炭素源とが使用でき、さらに食塩、炭酸カルシウム
、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、リンｍナトリウム
などの無機塩を添加、使用できる。その他必要に応じて
微月の金属塩を添加することもできる。

これらのものはプルマイシン生産菌が１用し、プルマイ
シンの生産に役立つものであれば良く・公知の培養材料
はすべて使用できる。しかし、本発明者らは、ＢへｉＧ
　　３６６−ＵＩ”５株をグリセリン（３％）、魚粉（
２チ）および炭酸カルシウム（０・２幅）よりなる簡単
で安価な液体培地で培養して充分量のプルマイシンを生
成蓄積せしめることができたり培養流度は生産菌が発育
し、プルマイシンを生産する範回で適用しつるが、好ま
しいのは２５−３７°Ｃである。培養は通常グルマイシ
ンが充分に蓄積するまで継続される。通常２−５日の培
養が行なわれる。

本発明の方法におけるプルマイシンの定量ハ、大腸菌に
一１２株を用いる通常の抗生物質の円筒平板法によって
行なった。標準としたプルマイシン塩酸塩（１，０００
ｕ　／　ｍＷ　）は、２００　ｍｅｇ　／　Ｈｌの濃度
で直径約２２唄の阻止円を示した・培養液中に’＠積さ
れたゾルマイシンは、その塩基性で水溶性の性状から、
カルボキシル基を活性基とするイオン交換体、例えばア
ンバーライ）ＩＲＣ−５０樹脂（米国ローム・アンド・
ハース社製〕やＣＭ−セファデックスＣ−２５（スウェ
ーデン国ファルマシア社製）などを使用するカラムクロ
マトグラフィーによる精製法が最も有効である〇これら
のイオン交換体は、Ｎａ型、に型、ＮＨ４型など適宜使
用され、それらのＨ型との混合型の使用はさらに好まし
く、これらのイオン交換体に吸着したプルマイシンは、
塩酸、硫酸などの無機酸や、塩化ナトリウムなどの無機
塩の水溶液で容易に溶出できる。これらのカラムクロマ
トグラフィー法は、適宜繰返し、または組合わされて使
用される。

プルマイシン精製工程中の塩化ナトリウムなどの無機塩
の除去には、通常のセファデックスＬＨ−２０（ファル
マシア社ＪＩＩＪ　）などのカラムクロマトグラフィー
のほかに、プルマイシン塩酸塩がメタノールに易溶性で
あることから、その乾燥粉末中からプルマイシン塩酸塩
を無水メタノールで抽出する方法が用いられる。

プルマイシンは前述の構造式で明らかな如く１位の立体
配置によシα一体とβ一体が存在する。

プルマイシン塩＃塩を少量のメタノールにとかし放置す
ると、容易にβ一体のプルマイシン２塩酸塩の無色結晶
が析出し、その分解点は１９８−０ ２００°Ｃで、〔α：ｌＤ　＋　Ｉ　Ｉ　５　（ｃ　０
・５　、メタノール）を示す（大判ら：ジャーナル・オ
プ・ケミカル・ソサイテイ・パーキンＩ、、　　１９７
４年、＋６２７頁）。しかし、このβ一体は、他の糖ｎ
と同様に、水溶液中で容易にα一体とβ一体の平衡混合
物となる。プルマイシン（遊離塩基）は薬学的に許容で
きる無機酸例えば、塩酸、硫酸・　リン酸・等あるいは
有機酸例えば酢酸、プロピオン酸、コエン酸１等と常法
で反応させることによって、プルマイシンの酸付加塩と
することができる。

次に、本発明の方法を実施例によって説明する。

実施例１ 寒天斜面培地に培養したＢＭＧ　　３６６−ＵＦ５株（
微工研菌寄第６３９５号）の菌体を滅菌水１２０ｍｅＫ
懸濁した。その１・５−を、グリセリン３・０９ｇ１魚
粉２・Ｏ俤、旋酸カルシウム０．２チ（４Ｎ水酸化ナト
リウムに−１７，４に調整）からなる液体培地１１０ｍ
ｆ！を入れた５　００　ｒｎｉの三角フラスコに接種し
、２７°Ｃで３日間回転振盪培養（毎分１８０回転）し
た。三角フラスコ２０個の培養液を集め濾過して２，０
００＃Ｉｌの炉液（ｐＨ６，８，４０４ｕ　／　ｒｙ、
　）を得た。このｒ液を、アンバーライ）ＩＲＣ−５０
（４０％　Ｎｎ型）２３０ｍｌをつめた塔にかけて抗生
物質を吸着せしめ、水洗後（＋、０００ｒｔｅ　）　０
・４Ｎ塩酸で溶出した。活性溶出液３９０　ｍｌを集め
て減圧０縮し・　１３ｇの固体（４０ｕ／〜）を待た。

これを２０　ｍｌのメタノールで抽出し、減圧にＩ縮し
て７・２５ｇの粗粉末（ｇ　ｌ　ｕ　／　ｍｙ　）を得
た・これを０・２Ｍ塩化ナトリウム６□ｔにとかし、０
−２Ｍｊ３化ナトジナトリウム化したＣＭ−セファチッ
クｘ　Ｃ−２５（２００ｍｌ　）の塔にがり、０．２Ｍ
塩化ナトリウム６００．７！で洗浄後、０・４Ｍ［化ナ
トリウム６００　ｍｌで溶出した。活性溶出液３９０ｍ
ｇを集めて減圧濃縮し、残渣を２０　ｍｅのメタノール
で抽出し、抽出液を減圧濃縮して、１．２４ｇの粗粉末
（３４３ｏ　／　１７ｆ　）を得た６との粗粉末を２ｍ
７Ｉの水にとかし、０．４ＭＪ３化す）　ＩＪウムで平
衡化したＣＭ−セファデック、ｘ　Ｃ２５（９０ｍｌ　
）　（７）塔にかけ、０・４Ｍ塩化ナトリウムで溶出し
た。活性溶出液２００ｄを集めて減圧ｇ＋縮（〜、残渣
を１５ｍ１のメタノールで抽出し、抽出液を減圧濃縮し
て８７１〜の粗粉末（５０５１１／■）を得た。これを
１０−のメタノールにとかし、セファデックスＬＨ２０
（９０ｍｌ　）の塔にかけ、メタノールで展開した０活
性溶出液２５ｍｇを集めて、減圧濃縮し、６２９ＷＶの
粉末（７０６υ／確）を得た（培養ｐ液からの収車５５
％）。

この粉末３１０りをメタノール１σＩＶｃとかし、−夜
冷蔵庫に放置すると無色結晶が析出した（４０ｒｒｑ、
　　１，０００　ｏ　／　Ｗ　）。この結晶［ｒｎｐ　
Ｉｇ’？　−１９２゜５ Ｃ１Ｃ’〕１）　４−　ｌ１１０（ｃ　Ｉ＋　　メタノ
ール〕〕は、プルマイシン２塩酔塩のβ体に一致した。

−５′ｌ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １・　ノぐチルス属に屈するゾルマイシン生産菌を好気
   的に発育させ、その培養液からプルマイシンまたはその
   酸付加塩を採取することを特徴とするプルマイシンまた
   けその酸付加塩の製造法。