JPS59179094A - トリアゾ−ルデオキシリボヌクレオシドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ　　発明の背景 技術分野 本発明はトリアゾ−ルテオキ／リホヌクレオンドの酵素
を利用する製造法に関するものである。

本発明；こおいてトリアソ〜ルテオキンリボヌクレオノ
トとは構造式〔１〕 ○ （ノド１ て表わされる化合物を意味し、その化さｆ名は１−（２
−ｙ　オ＋ンーβ−Ｄ−エリスロ−ペントフラノンル）
−１，２，４−トリアゾール−３−カルボ４−サミドで
ある。本化合物はＤＮＡおよびＲＮＡウィルスに対して
広範囲で強ノＪな抗ウィルス作用を示Ｊ化合物であるリ
バビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）　　の類似体であり、
それ自身抗ウィルス剤として期待される化合物である。

従来技術 従来、トリアゾールデオキンリボヌクレオンドを製造す
る方法としては、３−メトキソ力ルポニル−１，２，４
−トリアソールまたは３−ノアノー１．２，４．−１−
リアソールとテオギノリホヌクレオンド誘導体とを縮合
した後、メトキンカルボニルノ、Ｌまたはノア７基をカ
ルホキ→ノミト基に変換する方法か知られている（　Ｊ
Ｃａ　ｒｂｏｈｙｄｒａＬｃｓ　−Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、　２（１１，１−３６（
１９７５））。

このような合成法は、反応操作か煩雑であり、収率もよ
（ない。

また、リバビリンのようなトリアソールリホヌクレオン
トを酵素的に、もしくは微η−物を利用して製造する方
法は知られている（！１′４１′昭５０２９７２０号、
特開昭５０−１２３８８２−づおよび特開昭５７−１４
６５９８号参Ｈ＜４　）。しかしなから、トリアソール
デオキノリホヌクレオントの製造には酵素的な方法もし
くは微生物を用いる方法は採用された例はない。

（Ｉｔ）　　発明の概要 本発明者らは、トリアゾールデオキソリボヌクレオント
を、１，２．４−１−リアソール誘導体と２−デオキン
リホース供句体とを基質として酵素の作用によって製造
することに始めて成功し、これに基ついて本発明を完成
した。

本発明は、１，２．４−トリアソール−３−カルホキａ
ｔ　ミＦ　（以下、１トリアゾ一ル化合物」と略称する
こともある。）と２−テオキゾリホース供”３体とをヌ
クレオンドポスｄ−リラーセ源の存在下で反応させ、前
記構造式〔１〕で表わされるトリアソールテオキノリポ
ヌクレオンドを得ることを４′−１ｆ徴とするトリアソ
ールデオキンリポヌクレオンドの製造法を提供するもの
である。

本発明において［ヌクレオノドホスホリラーゼ源−１と
は、１．２．４−１−リアゾール−３−カルホキサミド
と後に定義する２−チオキノリボース（Ｊ（」３体とに
作用し、トリアゾールデオキノリボヌクレオントを勾え
る単独の酵素または複数の酵素群を含イｊし、少なくと
もヌクレオノドホスホリラーゼを含有する物質をいう。

なお、ここで［ヌクレオノドホスホリラーゼ−１とは、
２′−デオキノリボヌクレオンドを加りん酸分解して２
−デオキシ一 リボース−りん酸と核酸塩コ、（とをｈえる作用／Ｊら
びに２−チオキノリボース−１−りん酸とトリアゾール
化合物とよりトリアソールデオキソリホヌクレオシドを
合成する作用を担う酵素をいう。

また、ヌクレオノドホスホリラーゼ源には、ヌクレオン
トホスポリラーセ以外の酵素も含み得る。

これらの酵素は、本発明の反応に際し、たとえは原料化
合物に作用してヌクレオノドポスホリラーゼの基質を生
成するなと本発明の反応に積極的に関与する酵素である
か、または本発明の反応条イ１において本発明の反応を
阻害しない酵素であり得る。反応に積極的に関与する酵
素としては、２−チオキンリボース供与体としてチオキ
ノリボヌクレオチドを使用した場合のホスファターゼか
例示される。

上述のヌクレオノドホスホリラーゼ源は本発明の目的に
合致する限り、起源および反応に際しての形態（可溶性
酵素、固定化酵素、培養物、生菌体、菌体処理物なと）
を問わない。

すなわぢ、細菌、酵母、放線菌、糸状菌、担子菌なとの
微生物（菌類）、動物の臓器もしくは粗織なと、または
植物に由来する前記の酵素含有物を使用でき、特に微生
物由来の酵素含有物が好ましい。最も好ましいスクレオ
シトポスポリラーセ鯨としてブＬ／　ヒバ／７　テｌ）
　ウＡ　（１３ｒｅｖｉｂａｃＬｅｒｉｕｍ）　属に属
する微生物か例示される。

本発明の目的とする酵素活性が特に強い菌株としては、
具体的には４２庫県西宮市の甲子園球場の砂より分離さ
れた。Ａ　Ｔ〜６−７株を挙けることができる。この菌
株の菌学的性質を以下に記載する。

Ａ形態 （１）細胞の形態および大きさ゛短桿状、０８〜１、０
　Ｘ　１．０〜１．２　Ｉｔｍ （２）胞子の形成：なし く３）ダラム染色性：陽性 Ｂ各種培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養（２８°ｃ、４８時間）■集落
の形状二円形（ｃｉｒｃｕｌａｒ）■集落表面の***：
扁平状（Ｆｌａｔ）、　　平滑（３ｍｏ　、ｏ　ｔ　ｈ
　） ■大きさ°２〜４　ｍｍ ■色調：黄色ないし桃黄色 （２）肉汁寒天斜面培養（２８°Ｃ１４８時間）■生育
゛良好 ■生育の形二症状（Ｅ　Ｃ１１ｉ　ｎ　ｕ　ｌ　ａ　ｔ
　ｅ　）（３）肉汁液体培養（２８°Ｃ９４８時間）生
育二表面に閉環（Ｒｉｎｇ）を形成し、やや沈渣（Ｓｅ
ｄｉｍｅｎｔ）を生しる。

（４）肉汁セラチン穿刺培養（２０℃、６ト１間）：層
状（３ｔｒａｉｔｉｆｏｒｍ）　　に液化する。

（５）リトマ゛スミルク培地（２８°Ｃ，４，１ヨ間）
：わずかに凝固し、ペプトン化も見られる。

Ｃ生理的性質 （１）硝酸塩の還元（２８°Ｃ，５日間）　還元性なし
。

（２）硫化水素の生成（２８°ｃ、　　５日間）：生成
しない。

（３）澱粉の加水分解：分解性あり。

（４）カタラーセ：陽性 （５）インドールの生成：生成しない。

（６）ペプトンおよびアルギニンからのアンモニアの生
成；陰性 （７）メチルレットテスト：陰性 ｔ８１　Ｖ　−Ｐテスト：陽性 （９）酸素に対する態度：好気的 （１１）糖類からの酸の生成 陽性：クルコース、マンノース、フラクトース、マルト
ース、サッカロース。

）・レバロース 陰性：アラビノース、キンロース、ガラクトース、ラク
ト−ス、ツルヒツト。

イノノット、クリセリン （１２）生育ｐＨ範囲：ｐＨ６，０〜９０（Ｉ３］生育
最適温度：２５〜３７°Ｃ以上の菌学的性質を、バージ
ニーズ・マニュアル・オフ゛・デイタミ不−テイフ゛・
ノくクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　ｌ）ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）第７版（１９５７年）の分類基準により
検素した。

その結果、ＡＴ−６−７株はほとんと球菌に近い短桿菌
で、ダラム陽性であり、フィラメントを形成ぜす、炭水
化物より酸を生成することよりブレビバクテリウム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株ト同定し
、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）　Ａ　Ｔ−６
−７と命名した。

なお、以上の菌株の同定帰属はバージニーズ・マニュア
ル・オフ・デイタミ不−テイフ゛・ノークテリオロジー
第７版によるものであり、分類ノ人準の変更なとにより
、異なる分類基準によってこれらの菌株の同定帰属か行
われた場合には、他種あるいは他属に属することもあり
得るか、本発明において上記のごとく命名された微生物
は、少なくとモ本発明の目的とするヌクレオシドホスホ
リラーゼ源として使用することかでき、かつ前記の菌学
的性質もしくはこれと均等の蘭学的性質を基本的に有す
る微生物を包含し、一義的に特定され得るものである。

この菌株について、昭和５６年通商産業省告示第１７８
　ｒｒに従って工業技術院微生物工業技術研究所に対し
て寄託申請を行い、昭和５７年１月１３０（＝Ｉけて受
１托され、受託番号として微工研菌寄第６３０５写−（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−６３０５）か例与されている。か他の
例示菌株としては ブレビバクテリウム・インペリアレ（Ｂ、　ｉｍｐｅｒ
ｉａｌｅ）ＡＴＣＣ８８６５ を例示することかできる。

また、　ｉｉｆ記の菌株から、紫外線、Ｘ線、ｒ線の照
射なとの物理的処理もしくは二）・ロソクアニノンなと
による薬剤処理なと、一般的変異誘導法による誘発突然
変異または自然の原因に起因する自然突然変異によって
誘導された変異株も、ヌクレオシドホスホリラーゼ源と
しての酵素活性を失わない限り、本発明に使用される。

さらに、前記のような好適な菌株から７４１られたヌク
レオシドホスホリラーゼ源としての酵素の遺伝子かブレ
ビバクテリウム属以外の微生物に取り込まれ、そのよう
な形質が発現するに至った場合、′このような微生物は
ブレビバクテリウム属と均等とみなされるへきである。

本発明に使用する菌体等を調製するために、これらの微
生物を培養するに際しては、使用される培地および培養
法は、これらの微生物が生育する限り、特に限定されな
い。

培地としてはこれらの微生物が資化可能な炭素源および
窒素源を適当量含有し、必要に応してｊｌｌＩ機塩、微
量発育促進物質、消泡剤なとを添加したものか使用され
る。具体的には、炭素源として（：ｌ、グルコ−ス、フ
ラクトース、マルトース、リポース、サッカロース、澱
粉、澱粉加水分解物、糖畜、廃糖蜜なとの糖類もしくは
その脂肪酸エステルなとの誘導体、麦、鼓、米なとの天
然炭水化物、マンニトール、メタノール、エタノールな
とのアルコール類、クルコン酸、ピルビン酸、酢酸、ク
エン酸ナトの脂肪酸類、ノルマルパラフィン、ケロンン
ナトの炭化水素類、グリシノ、クルタミン酸、グルタミ
ン、アラニン、アスパラギンなとのアミノ酸類なと、−
・般的ブよ炭素源より使用する微生物の資化性を考慮し
て一種または二種以上を適宜に選択して使用すればよい
。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵１ｄエキス
、乾燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン
、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステイープリカー
、コノトンシー　ドミールないしその加水分解物、フィ
ツシュミールないしその加水分解物、その他の動物。

植物、微生物の加水分解物なとの有機窒素化合物、アン
モニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、りん酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウ
ムなとの硝酸塩、尿素なと無機窒素化合物より使用微生
物の資化性を考慮し、一種または二種以上を適宜に選択
して使用する。さらに、ｄｉｉｉ機塩として微量のマク
イ・ンウム、マンカン、Ｖｌ、亜鉛、銅、ナトリウム、
カルノウム、カリウムなとのりん酸塩、塩酸塩、硫酸塩
、炭酸塩、硝酸塩、酢酸塩なとの一種または二種以−に
を適宜添加し、必要に応して植物油、界面活性剤なとの
消泡剤、ビタミンＢ１．　Ｂ２、ニコチン酸、パントテ
ン酸、ビオチン、ｐ−アミン安息香酸なとり微量発育促
進物質を添加してらよい。また、栄養要求を同時に示す
微生物を使用する場合、当然その生育を満足させる物質
を培地に添加しなりれはならない。

培養は、前記培地成分を含何する液体培地中で振盪培養
、通気撹拌培養、静置培養、連続培養なとの通常の培養
法より使用微生物に適した培養法を選択して行う。

培養条件は、使用微生物および培地の種類により適宜選
択すればよいが、通常は培養開始のｐＨを約６〜８に調
整し、約２５〜３５°Ｃの６１４度条件下で培養を行う
。培養期間は使用微生物の生育に十分な時間であれはよ
（、通常１〜３０間である。

以」二のように微生物を培養した後、得られた培養物、
培養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離などの通常の
方法によって集菌した生菌体、または生菌体に適宜な処
理を施して得られる菌体処理物ヲ本発明におけるヌクレ
オンドポスポリラーセ源として使用できる。ここで、培
養物とは培養後の培地と培養菌体か未分離の状態のもの
をいう。

また、菌体処理物とは、乾燥菌体、細胞膜・壁変性菌体
、破砕菌体、固定化菌体、菌体抽出物、本発明の１」的
とするヌクレオンドホスホリラーセ源としての醇索活性
を有する菌体抽出物の蛋白買置菌体処理物を得るための
方法を以下に例示する。

ずｌＪわち、ｑ）生菌体に対し、たとえは凍結融解処理
、凍結乾燥処理、通風乾燥処理、アセトン乾燥処理、酸
性ないしアルカリ性下における加温処理、磨砕処理、超
音波処理、浸透圧差処理なとの物理的処理手段、もしく
はたとえば、リゾチーム、細胞壁溶解酵素なとの酵素処
理、トルエン、キルン、ブチルアルコール（ブタノール
）なとのｔ容媒もしくは界面活性剤との接触処理なとの
化学的ないし生物化学的処理を単独もしくは組み合せて
施すことにより、また、■菌体抽出物に対し、たとえば
塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、各種ク
ロマトグラフ処理、透析処理などの酵素分離精製手段を
単独もしくは組み合せて施すことにより、さらに、■生
菌体、菌体抽出物もしくはその精製物に包括処理、架橋
処理、担体への吸着処理などの酵素固定化手段を施すこ
とにより菌体処理物を得ることかできる。

反応基質 本発明の酵素反応における反応ＪＡ質は１，２゜４−ト
リアゾール−３−カルボキサミ）・および２−チオキン
リボース供与体である。

１．２．４−）リアノ゛−ルー３−カルホキサミドは遊
離型またはナトリウム塩なとの塩のいす２ｔも使用てき
る。

本発明において［２−チオキンリボース供ＪＪ体１とは
、ヌクレオンドホスホリラーゼ源の作用により、１．２
．４−１リアゾ〜ルー３−カルボキサミドのＮ１位に２
′−チオキ／リポース残基を転移しうる２−チオキンリ
ボース誘導体である。すなわち、「２−チオキンリボー
ス供与体」という用語は、ヌクレオンドホスホリラーゼ
の基ＴＩとなり、その直接の作用によってトリアソール
化合物に２−チオキノリポース残基を与え得る化合物を
意味するたりてｌｊ　＜　、スクレオントボス十すラー
ゼ源に含まれる上記以外の酵素の作用によって上記のに
うなヌクレオントオスポリラーゼの直接の基質に変換さ
れ得る化合物も意味する。

具体的には２７−チオキノリポヌクレオンド、２′−チ
オキンリボスクレオチドもしくは２−チオキノリボース
−１−りん酸、またはこれらの塩類か挙げられる。

２′−チオキノリポヌクレオシドとしては、２′−デオ
キソアノノン、２′−チオキンイノンノ、２′−デオキ
ソグアノノン、２′−チオキノノチノン、チミジン、２
′−チオキンウリノンか挙けられ、２′−チオキノリホ
ヌクレオチドとしては、」二記２′−デオキノリホヌク
レオンドの３′位および／または５′位におけるモノり
ん酸エステル、）りん酸エステル　、トリりん酸エステ
ルか全て含まれるか、代表例としては、２′−チオキ／
アゾ７ノノー５′−モノりん酸、２′−チオキンアデノ
ノン−５′−ノりん酸、２′−デオキソアノノン５’　
−ｈりりん酸、２′−チオキンイノノン−５′−モノり
ん酸、２′−チオキ／イノンンー５′−ノりん酸、２′
−チオ−１ノイノノン−５′−トリりん酸、２′−チオ
キハアノノンー５′−モノりん酸、２′−チオキノグア
ノノン−５′−ジりん酸、２′−デオキソグアノノン−
５′−トリりん酸、２′−チオキノノチンンー５′−モ
ノりん酸、２′−チオキノノチンンー５′−ノりん酸、
２′−チオキノソチジンー５′−トリりん酸、チミジン
−５′−モノりん酸、チミノンー５′−ノりん酸、チミ
ジン−５′−トリりん酸、２′−チオキ／ウリンンー５
′−モノりん酸、２′−チオキンウリジン−５′−７り
ん酸、２′−チオキノウリノン−５’　−１−リりん酸
なとの遊離型またはナトリウム塩なとのアルカリ塩が挙
げられる。

反応基質溶液 本発明の酵素反応に使用される基質ｍ　ｉｔ＆は、基本
的には前記の反応基質が水性媒体に溶解もしくは懸濁し
た水性液である。

水性液中には少なくともトリアゾール化合物および前記
の２−チオキンリホース供与体の一種または二種以上を
含有し、これらの反応基質のほかに、りん酸イオン供！
ｊ系、有機溶媒、界面活性剤、金属塩類、補酵素類、酸
、塩基、糖類なと酵素反応を促進する物質、妨害酵素活
性を阻害する物質、反応基質の溶解性を向上させる物質
、酵素と反応基質の接触を向」ユさせる物質等を含有し
ていてもよい。また、使用微生物か資化しつる前記のよ
うな培地成分を含有していてもよい。

水性媒体としては、水または酵素反応に好適な各種緩衝
液（りん酸緩画成、イミダソール−塩酸緩衝液、ヘロナ
ールー塩酸緩衝液、ｌ・リス−塩酸緩衝液なと）を用い
ることかできる。

りん酸イオン供与系としては、水叶媒体中でりん酸イオ
ンに解離しうるもののいずれを用いてもよ（、たとえは
遊離型りん酸そのもの、無機りん酸塩、たとえはナトリ
ウム、カリウムなとのアルカリ金属、カル７ウム、マク
ネシウムなとのアルカリ土類金属、アンモニウムとの塩
か好適に使用される。また、りん酸イオン供与系として
は、酵素反応の基質溶液中でりん酸イオンを遊離しつる
系、たとえば各種りん酸エステル誘導体とボスファター
セのわ１み合せ、ヌクレオチドとヌクレオチダーゼの組
み合せ、核酸塩基およびリボース−１＝りん酸もしくは
２−チオキノリホース−１−りん酸とホスホリラーゼと
の組み合せなとを利用することかできる。

以」二のようなりん酸供与系は酵素反応に際して系外か
ら添加されたものであってもよく、使用微生物の成分と
して含有されているものであってもよい。すなわち、酵
素反応に利用しつる形態である限り、」１記の物質の単
独もしくは二ｒＣｒｒ　ｙ−１＝を組み合せた系を、ま
たは」−記の物質をＬｑ　’（］する微生物菌体もしく
はその菌体処理物を本発明の酵素反応に際して反応液に
別途添加してもよく、ヌクレオンドオスポリラーゼ源に
含有さ才しているこれらの物質をそのまま利用してもよ
い。

有機溶媒としては、たとえはメタノール、エタノール、
プロパツール、ブタノール、アセトン′、メチルエチル
ケトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒドロフラン、
ジオキサン、ジメチルスルホキット アミ＋・、２−工トキノエタノールなとか例示される。

反応方法 本発明の反応は、前記の酵素源、すなわちヌクレオンド
ホスホリラーゼ源と反応基質とを水性媒体中で接触させ
ることにより達成される。

接触力法は、酵素源の形態に応して適宜に選択すれはよ
いか、通常、酵素源を反応基質溶液に歴濁もしくは溶解
し、好ましくは加温しなから撹拌もしくは振盪するバッ
チ方式、または酵素源を必要に応して適当な担体、助剤
、吸着剤と混和し、もしくはこれらに担持させてカラム
に充填し、反応基質ｍ　ｉｉ＆を通液するカラム方式な
とか適用される。なお、ノ・ノチ方式の場合には反応後
、菌体等を濾過（加圧濾過、真空濾過なとを含む。）、
遠心分離、沈降分離、凝集分離なと通常の方法によって
集菌し、反応基質溶液と接触させることによって繰り返
し使用することかできる。固定化ヌ．クレオンドホスホ
リラーゼ源によるカラム方式の場合は、菌体等の分離操
作は必要ないか、同様に繰り返し、もしくは連続的に酵
素反応に使用することかできる。また、前記したように
、使用微生物の培養に際し、培地中に反応基質を添加し
、酵素源と反応基質を反応させる方〃、も本発明に採用
しつる。

反応基質および酵素源の濃度もしくは添加「ＩＸ反応に
際し、反応液の基質濃度は特に制限されるものではなく
、反応温度における使用水性媒体に対する各基質の飽和
濃度以下の基質濃度か通ｎ採用されるか、反応基質溶液
に添加された前記の有機溶媒なとにより基質濃度を増大
させることもてきる。また、反応液中に飽和濃度以上の
各基質を）ｙ濁状態で存在させ、反応の進行に従って各
基質を溶解させることもてきる。また、各基質を反応中
に逐次添加し、適当ａ度に保つこともてきる。

各基質を添加し、溶解させる場合、基質濃度はトリアソ
ール化合物またはその塩については通常５−　２　０　
０　ｍＭ程度、好ましくは１　０　−　１　０　０　ｍ
Ｍ程度であり、２−チオキンリボース供与体については
通猟１〜８　０　０　ｍＭ程度、好ましくは１〜１　５
　０　ｍＭ程度である。

酵素源の使用量は微生物の種類、その使用形態、反応効
イく、経済性なとを考慮し、当業者か予備実験等によっ
て容易に決定できるものである。

反応条件 本発明の反応の条件は、反応基質が菌体等の作ヅオＡＺ
去９ 用ｊこよって反応し、効率よ＜［・リアソールヌクレオ
ントか生成する条件てあれは使用微生物の非増殖条件下
であれ増殖条件下であれ特に限定されない。しかしなか
ら、使用微生物の非増殖条件下における反応か特に効率
か良い。

微生物の非増殖条件下で反応に供する方法としては、酵
素反応温度を使用微生物か増殖できない温度範囲（たた
し、本発明の反応に関与する酵素か失活しない温度範囲
）に設定する方法、使用微生物菌体をあらかしめ前記の
とおり物理的、化学的ないし生物化学的に処理すること
によって微生物を増殖できない状態にした後、反応に供
する方法、反応に際して、たとえばトルエンなとの使用
微生物の増殖を阻害する物質を反応基質溶液に添加する
方法なとを単独にあるいは組み合せて採用すればよいか
、特に反応温度を操作する方法か最も効果的で簡便であ
る。

本発明の反応は２８〜８０°Ｃの範囲において進行する
が、実用性を考慮すれば３７〜７０°Ｃの範囲か好まし
く、特に４０〜６５°Ｃか最適である。

反応基質溶液の液性は、通常ｐＨ４〜１０、好ましくは
ｐＨ６〜８の範囲に保たれれはよく、反応中にｐＨか変
動するときは、塩酸、硫酸、りん酸なとの酸または水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アンモ
ニアカスなとのアルカリを用いて好ましいＩ）Ｈ範囲に
補正すればよ０゜反応時間は、反応基質の目的物への変
換率を確認しなから決定すればよいか、通常ノ＼ノチ方
式では２〜４５時間程度、好ましくは２４〜３６時間程
度反応させればよく、カラム方式ではノ＼ノチカ式に準
して適当な条件を設定して反応させれはよい。

分離精製 反応後、必要に応して菌体等を濾過、遠心分離、の方法
またはこれを応用して行えばよく、たとえはイオン交換
クロマトクラフィー、吸着クロマトクラフィー、分配ク
ロマトクラフィー、ゲル濾過法なと各種のクロマトクラ
フィー、向流分配、向流抽出なと二液相間の分配を利用
する方法、濃縮。

冷却１有機溶媒添加なと溶解度の差を利用する方法なと
の一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜に組み合
せて行えはよい。

分析 本発明の実施例においてトリアソールテオキノリポヌク
レオントおよび１．２．４−１−リアゾール−３−カル
ボキサミドの分析は高速液体クロマトグラフィーによっ
て行った。以下に示す装置および条件で分析すると、ト
リアゾ−ルチオキンリボヌクレオンドは保持時間９００
分例近に、１゜２．４．−トリアソール−３−カルホキ
→ノーミドは保持時間４６４分付近に溶出され、険１１
）線よりそれぞれの量を算出てきる。

装置：島原高速液体りロマトクラフＬＣ−３Ａ型（■島
原製作所製） カラム　マイクロ・ホンタパノク＜ｔｌＢＯＮＤＡＰＡ
Ｋ）Ｃｔ　ｓ　、　４６ｍｍＸ　２５０　”　（日本ウ
ォーターズリミテノト社製）溶出剤：２％アセトニトリ
ルを含む２　Ｏｎ１Ｍトリス−塩酸緩衝液（Ｉ）Ｈ７，
５） 流速：１ｍ１１分 測定波長＋　２２５１ｍ カラム操作温度　室温 以下、実施例をもって本発明をより具体的に説明するか
、これは実施の一聾様を示ずものてあって、本発明の範
囲を制限するものではない。

実施例 １５％酵母エキス培地５４にブレビバクテリウム・アセ
チリカムＡＴ−６−７（微上研菌寄第６３０５弓）の前
培養液２５０　ｍｌを接種し、２８０Ｇ、２４時間培養
した。培養液より遠心分離によって菌体を分離した。

１．２．４−トリアソール−３−カルボキサミド４．４
８８！７．２゛−チオキノウリンンおよびりん酸−カリ
ウム２．７２２’／を溶解した基質溶液（ｐＨ７，０）
　　１．　ｅ　ニｌ記湿菌体６０ｑを添加し、４５°Ｃ
て２４時間反応した。この反応液を分析したところ、ト
リアゾ−ルテオキノリホヌクレオンドの生成率は９２４
５％であった。なお、ここで生成率とは片料の１．２．
４．−）リアソール−３−カルボキサミド）こ対する生
成したトリアソールチオキノリボヌクレオシトのモル百
分率である。

反応液から菌体を分離後、この溶液をｐＨ１１，５に調
整し、生成した沈澱を遠心分離によって除去した。この
溶液を陰イオン交換樹脂（塩素型）４００　ｍｌのカラ
ムを通過させた。通過液と水洗液を合してｐＨ５，８に
調整し、活性炭４００πｌのカラムに吸容さぜた。これ
を水洗後、０２５％アンセニアヲ含む２０％エタノール
ｍ　液８．２００　ｗｌ、（ｇｃｖｊて溶出したつこの
溶液を濃縮して５００ｍ１とし、ｐＨｉ　Ｏ，Ｏに調整
後、陰イオン交換樹脂（硼酸型）５０ゴに通液した。通
過液と水洗液を合し、再度活性炭カラムＩこ吸着、溶出
後、１０．０ｔｅｌに濃縮し、凍結乾燥を行い、６．８
４０ｇのトリアソールチオキンリボヌクレオンドを得た
。

特許出願人　（６７７）ヤマサ醤油株式会社１網昭５９
−１７９０９４（８）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．２．４−トリアソール−３−カルボキサミドと２−
   デオキンリボース供与体とをヌクレオンドホスホリラー
   セか源の存在下で反応させ、（１４造式（１） て表わされるトリアゾールデオキソリボヌクレオシドを
   得ることを特徴とするトリアゾ−ルデオキシリボヌクレ
   オンドの製造法。