JPS63219389A

JPS63219389A - ジ−ｄ−フラクトシルフラノ−ス１，２′：２，３′ジアンハイドライドの製造法

Info

Publication number: JPS63219389A
Application number: JP5299287A
Authority: JP
Inventors: Kokichi Tamura; 幸吉田村; Takashi Kuramoto; 倉本　隆志; Sumio Kitahata; 北畑　寿美雄
Original assignee: Maruzen Kasei Co Ltd
Current assignee: Maruzen Kasei Co Ltd
Priority date: 1987-03-10
Filing date: 1987-03-10
Publication date: 1988-09-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、酵素を利用してイヌリンよりジーＤ−フラク
トシル７ラノース　１，２’：２，３’　　ジアンハイ
ドライドを製造する方法に関するものである。

従来の技術ノーＤ−７ラクトシルフラ／−ス　１，２’：２．３’
　シアンノ＼イドライド（略称ＤＦ”ＡＩＩ［；構造式
下記）は、７ラクトースに臥たされやかな甘味を有し、
熱に安定であり、また微生物により資化されないという
特長があるため、低カロリー且つ難う練性の甘味料とし
ての利用が期待されている。

従来、ＤＦＡＩを製造する方法としては、アースロバフ
タ−・ウレア７７シエンスが生産するイヌリンフラクト
トランスフェラーゼをイヌリンに作用させる方法があっ
た（特公昭５６・２６４００号）。しかしなが呟アース
ロバクター・ウレアファシェンスのイヌリンフラクトト
ランスフェラーゼ産生力は弱く、この菌を用いる方法に
よってイヌリン７ラクトトランスフエラーゼを経済的に
得ることは困難である。したがって、上記公知方法でも
、アースロバフタ−・ウレア７アシエンスを培養する培
地中に原料のイヌリンを添加しておき、培地中に生産さ
れる酵素をその場で利用してＤＦＡＩ［を生成させる方
法を採用しており、菌培養物から採取した酵素をイヌリ
ンに作用させているわけではない。しかも、アースロバ
フタ−・ウレアファシェンスはイヌリンフラクトトラン
スフェラーゼと共に著量のβ−７ラクトシダーゼを生産
するから、粗酵素液を使用するとＤＦＡＩＩＩよりも７
ラクトースを大量に生成してしまうという問題がある。

これらにより、あるいはアースロバフタ−・ウレアファ
シェンスのイヌリンフラクトトランスフェラーゼに固有
の特性によるものが、ＤＦＡ］’［の生産性はきわめて
低く、しがも種々の培地成分を含む反応液からＤＦＡＩ
ＩＩを単離するのに多段の精製を必要とするという問題
があった。

発明が解決しようとする間　点したがって本発明の目的は、イヌリンを原料として従来
よりも効率よ＜ＤＦＡＩ［を製造する方法を提供し、Ｄ
ＦＡＩＩＩを安価に利用し得るようにすることにある。

問題点を解　するための手段上記目的を達成するため、本発明者らは多くの微生物に
ついてイヌリンフラクトトランスフェラーゼ産生能と酵
素活性の観点からスクリーニングを行い、シェードモナ
ス属に属する一細菌すなわちシュードモナス・フルオレ
ッセンスＭＺＮｏ、９４９（微工研菌寄第９２３５号）
がすぐれた性質を有することを知った。

本発明は上記知見に基づくものであって、シェードモナ
ス属細菌が生産するイヌリンフラクトトランスフェラー
ゼをイヌリンに作用させることを特徴とするものである
。

上記ＭＺＮｏ、９４９株は、広島県尾道市の土壌より分
離されたものであって、その菌学的性質は次のとおりで
ある。

（ａ）　　形態 ■細胞の形および大きさ：　０．５〜０．７Ｊ１ｍＸ２
．０〜３．５１ｍの桿菌 ■運動性：あり。１本以上の極鞭毛を有する。

■胞子：なし ■ダラム染色性：陰性 ■抗酸性：なしくｂ）　　生育 ■肉汁寒天斜面培養：中程度の発育；透明；やや赤味を
帯びる。

■肉汁液体培養：中程度の発育；表面に膜形成。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。

■リドマスミルク：変化しない。

■ＢＣＰミルク：変化しない。

（ｅ）　　生理的性質 ■硝酸塩の還元：する。

■脱窒：　しない。

■ＭＲテスト　：陰性 ■ｖｐテスト　：陰性 ■インドールの生成：なし ■硫化水素の生産：なしくＴＳＩ寒天培地）■デン粉の
加水分解：なし ■クエン酸の利用：あり　（クリステンセン培地）■無
機窒素源の利用：硝酸塩およびアンモニウム塩を利用す
る。

［相］色素の生成：水溶性、蛍光性の色素を生成する。

■オキシダーゼ：陽性 ■カタラーゼ：陽性０生育の範囲：ｐ８４〜１０で生育する。４℃、２７℃
で生育する。３７℃で生育しない。

■酸素に対する態度：好気性 ■Ｏ−Ｆテスト　：グルコースを酸化する。

（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法）［相］炭水化物の利用：　Ｄ−グルコース、Ｌ−７ラビ
ノース、トレハロース、イノシトール、Ｌ−バリン、ｐ
−ヒドロキシ安息香酸を利用する。シュクロース、ゲラ
ニオール、アセトアミド、エタノールを利用しない。

■アルギニンの脱炭酸：陽性［相］プロトカテキン酸の分解二オルト型の開裂以上の
諸性状をバージエイのマニュアル・オブ・デターミネイ
ティーブ・バクテリオロジー、第８版（１９７４）の記
載と照合することにより、重囲がシュードモナス・フル
オレンセンス［ミグラ　１８９５］であることを確認し
た。

本発明の実施に用いるイヌリンフラクトトランスフェラ
ーゼは、上記ＭＺＮｏ、９４９株で代表されるシュード
モナス属イヌリンフラクトトランスフェラーゼ生産菌を
７ラクトースポリマー含有培地で培養することにより得
られる。７ラクトースのポリマーを酵素誘導基質として
含有させることを除けば、培地として特殊なものは必要
としない。シュードモナス属細菌の培養に通常使用され
る培地、すなわちグルコース等の炭素源および酵母エキ
ス、ペプトン等の有機窒素源、その他硝酸ナトリウム、
硫酸マグネシウム、塩化マンガンなどの黒磯塩類等を基
本成分として適宜組合せたｐＨ５〜８程度の培地を用い
ることができる。培地に含有させる７ラク）−スのポリ
マーとしては、イヌリン、レバン等を用いることができ
、その好適濃度は０．０１〜３０％、特に好ましくは１
〜５％である。培養は、シュードモナス属細菌培養の常
法に従って行うことができる。目的とする酵素は菌体外
に生産される。生産は菌の対数増殖期に始まり、定常期
にほぼ最大生産量に達するので、通常は定常期に達した
あと適当な時期に培養を打切る。培養終了後は直ちに遠
心分離して菌体な除去する。菌体を除いただけの培養液
でも粗イヌリン７ラク））ランス７エラーゼ液として利
用できるが、これを、硫安塩析、限外ろ過、ゲルろ過等
の精製手段を用いる酵素精製の常法に従って精製すれば
、より活性が強く、利用し易いイヌリンフラクトトラン
スフェラーゼを得ることができる。得られるイヌリンフ
ラクトトランスフェラーゼは安定で、冷蔵庫で数カ月間
保存可能であり、冷凍庫中ならば、さらに長期間保存す
ることができる。

上述のようにして得られたイヌリンフラクトトランスフ
ェラーゼの粗酵素液または精製品をイヌリンに作用させ
る場合、好適反応条件は、イヌリン濃度１〜２０％、反
応液ｐＨ５〜８（特に好ましくは５．５〜６．５）、反
応温度２０〜６０″Ｃ（特に好ましくは４０〜５０℃）
である。

反応終了後、１００°Ｃに約１０分間加熱して酵素を失
活させ、生じる沈殿を除去した反応液か呟たとえば活性
炭カラムクロマトグラフィー等により、ＤＦＡＩを得る
ことができる。さらに高純度のものとする必要がある場
合は、たとえば９５％エタノールから結晶化させる。

発明の効果本発明の製法は、アースロバフタ−翼組菌培養液中でイ
ヌリンを分解させる従来の製法と違って酵素液とイヌリ
ンを反応させるものであること、用いるイヌリンフラク
トトランスフェラーゼが分離困難なβ−７ラクトシダー
ゼを含有しないこと、などにより、従来法と比べて生産
性および対イヌリン反応収率が着しく高く、反応生成物
からＤＦＡＩを分離するための精製も容易である。

したがって本発明によれば、高品質のＤＦＡＩＩＩを従
来よりもはるかに安価に提供することが可能になる。

ヌ１男以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例　ルレバン　１％、ペプトン　１％、Ｋ２ＨＰ○４０．１％
、ＮａＮ０＝　０．５％、ＭｇＳ○、−７８２００，０
５％、Ｍ　ｎ　Ｃｌ　２・４Ｈ２００，０２％を含むｐ
Ｈ７，０の培地１００ｍ１を５００ｍ１容坂ロコルペン
に入れ、シュードモナス・フルオレッセンスＭＺ　Ｎｏ
、　９４９を植菌し、２８℃で４日間振どう培養した。

培養終了後、遠心分離して培養液から菌体を除き、粗酵
素液を得た。

一方、イヌリンＬｏｇを１０ｍ１の温湯に溶解し、冷後
ｐＨを６．０に調整した。この溶液に上記粗酵素液を加
え、３７℃で５時間反応させた。次いで１００℃に加熱
して酵素を失活させた後、減圧下に１０ｍ１まで濃縮し
た。濃縮液は活性炭カラム（直径５ｃｍ、高さ５０ｃｍ
；粒状活性炭１５０ｇとバイア０スーパーセル１５０ｇ
との混合物を充填）に吸着させ、蒸留水２ｅを流した後
、５％エタノール水溶液で溶出した。

溶出液はＴＬＣにてＤＦＡＩを検出しながら２０ｍ１ご
とに集め、ＤＦＡＩ［溶出フラクション（Ｎｏ、　１０
〜５０）を集めて濃縮乾燥し、粗ＤＦＡＩ［３，０ｇを
得た。次いでこれを９５％エタ／−ルから結晶化させて
、精製ＤＦＡＩ［ＩＯ，５ｇを得た。その［α１ｐは１
３５．０”、融点は１６１℃で、標品とよく一致した。

なお、上記カラム溶出液から７ラクトースは全く検出さ
れなかった。

実施例　２レバンにかえて同量のイヌリンを含有させた培地を用い
たほかは実施例１と同様にして、粗酵素液を得た。次い
でこれに硫安を６０％飽和になるよう加え、生じた沈殿
を遠心分離して集め、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，
０）に溶解し、同緩衝液で２日間透析し、部分精製酵素
液１５ｍ１を得た。

一方、風乾したキクイモの粉砕物５０ｇに２５０１１１
１の水を加え、６０〜７０℃に加温して１時間撹拌する
ことによりイヌリンを抽出した。得られた抽出液に水酸
化カルシウム１ｇを加え、生じた沈殿をろ別した。得ら
れたろ液２４０ｍ１を、そのｐＨを６　、０　Ｆ：調整
してから、上記酵素液と混合し、３７℃で１０時間反応
させた。以下、実施例１と同様に処理して、結晶化ＤＦ
ＡＩＩＩ　１．０ｇを得た。ソノ［ｆｆ１ｉ’　ハ１３
５，０°、融点は１６１℃で、標品とよく一致した。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）シュードモナス属細菌が生産するイヌリンフラク
トトランスフェラーゼをイヌリンに作用させることを特
徴とするジ−Ｄ−フラクトシルフラノース１，２′：２
，３′ジアンハイドライドの製造法。
（２）シュードモナス・フルオレッセンスＭＺＮｏ．９
４９（微工研菌寄第９２３５号）が生産するイヌリンフ
ラクトトランスフェラーゼを用いる特許請求の範囲第１
項記載の製造法。