JPS59178360A - 抗原決定基具有物質測定方法 - Google Patents
抗原決定基具有物質測定方法Info
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- JPS59178360A JPS59178360A JP5149483A JP5149483A JPS59178360A JP S59178360 A JPS59178360 A JP S59178360A JP 5149483 A JP5149483 A JP 5149483A JP 5149483 A JP5149483 A JP 5149483A JP S59178360 A JPS59178360 A JP S59178360A
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- enzyme
- ligand
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
各種疾患に由来する微量成分などを測定する方法に関す
るものである。
るものである。
血清、尿等の体液成分の微量分析は、病気の診断や治療
経過の判定などの有力な手段となっている。そこで、体
液成分を分析する種々の方法が開発され、それらのなか
で免疫学的な分析法が感度及び特異性にすぐれていると
ころから日常の検査に多用されている。
経過の判定などの有力な手段となっている。そこで、体
液成分を分析する種々の方法が開発され、それらのなか
で免疫学的な分析法が感度及び特異性にすぐれていると
ころから日常の検査に多用されている。
抗原と抗体との間の非常に高い親和力を利用したこの免
疫学的分析法には、標識物質として放射性同位元素を用
いたラジオイムノアッセイ、酵素を用いた酵素免疫法等
がある。しかしながら、このうちラジオイムノアッセイ
は放射性同位元素を用いるところから、限られた施設で
の使用、廃液の処理、短かい有効期間など様々な問題を
有している。そこで酵素免疫法が注目を集めているが、
操作性及び感度々どの面でラジオイムノアッセイに省っ
ていた。
疫学的分析法には、標識物質として放射性同位元素を用
いたラジオイムノアッセイ、酵素を用いた酵素免疫法等
がある。しかしながら、このうちラジオイムノアッセイ
は放射性同位元素を用いるところから、限られた施設で
の使用、廃液の処理、短かい有効期間など様々な問題を
有している。そこで酵素免疫法が注目を集めているが、
操作性及び感度々どの面でラジオイムノアッセイに省っ
ていた。
本発明者らは上記のような欠点のない測定方法を開発す
べく種々検討の結果、測定目的物である抗原決定基具有
物質に対する抗体と酵素に対する抗体との結合物に、測
定目的物である抗原決定基具有物質と、前記の酵素に対
する抗体と反応する酵素とを接触させると、抗原決定基
具有物質の量に応じて酵素活性が変イにすることを見出
した。そして、この反応を利用して、抗原決定基具有物
質を高感度で、かつ前述の分離操作を行なわないで〜簡
便に測定しうる全く新規な方法を完成した。その後、本
発明者ら（・まさらに研究を進め、新たに前記の抗原決
定基具有物質に対する抗体を抗原とする第２抗体又は前
記の酵素に対する抗体を抗原とする第２抗体を反応系に
加えれば、抗原決定基具有物質の量に応じて酵素活性が
より鋭敏に変化するようになることを見出し、これに基
いて本発明を完成するに至った。
べく種々検討の結果、測定目的物である抗原決定基具有
物質に対する抗体と酵素に対する抗体との結合物に、測
定目的物である抗原決定基具有物質と、前記の酵素に対
する抗体と反応する酵素とを接触させると、抗原決定基
具有物質の量に応じて酵素活性が変イにすることを見出
した。そして、この反応を利用して、抗原決定基具有物
質を高感度で、かつ前述の分離操作を行なわないで〜簡
便に測定しうる全く新規な方法を完成した。その後、本
発明者ら（・まさらに研究を進め、新たに前記の抗原決
定基具有物質に対する抗体を抗原とする第２抗体又は前
記の酵素に対する抗体を抗原とする第２抗体を反応系に
加えれば、抗原決定基具有物質の量に応じて酵素活性が
より鋭敏に変化するようになることを見出し、これに基
いて本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、検体に含まれる抗原決定基具有物質
と、酵素又は酵素と高分子化合物との結合物と、該抗原
決定基具有物質の抗体に対する第２抗体又（は該酵素の
抗体に対する第２抗体とを、溶液中で該抗原決定基具有
物質の抗体と該酵素の抗体との結合物又は該抗原決定基
具有物質の抗体と該酵素の抗体と高分子化合物との結合
物に接触せしめ、その後前記酵素の活性を測定すること
を特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法に関するも
のである。
と、酵素又は酵素と高分子化合物との結合物と、該抗原
決定基具有物質の抗体に対する第２抗体又（は該酵素の
抗体に対する第２抗体とを、溶液中で該抗原決定基具有
物質の抗体と該酵素の抗体との結合物又は該抗原決定基
具有物質の抗体と該酵素の抗体と高分子化合物との結合
物に接触せしめ、その後前記酵素の活性を測定すること
を特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法に関するも
のである。
本発明方法における測定対象は検体に含まれる抗原決定
基具有物質である。検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿々どである。血清、尿などの場合には、通常
は特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうこ
とができる。
基具有物質である。検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿々どである。血清、尿などの場合には、通常
は特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうこ
とができる。
抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）１は抗原
決定基を−又は二以上有しているものであり、例えば、
各種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、
アルブミン、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等の
ウィルス、バクテリア類、α−７エトプロテイン、癌胎
児性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗
原などである。
決定基を−又は二以上有しているものであり、例えば、
各種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、
アルブミン、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等の
ウィルス、バクテリア類、α−７エトプロテイン、癌胎
児性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗
原などである。
リガンドは、後述する抗体結合物に結合したときにその
後測定する酵素活性に与える影響の大きなものがよく、
その点で分子量が１０万ダルトン以上のものが本発明の
方法に特に好適である。
後測定する酵素活性に与える影響の大きなものがよく、
その点で分子量が１０万ダルトン以上のものが本発明の
方法に特に好適である。
酵素はその抗体が得られるものであればよい。
大部分の酵素は動物体に投与することによってその体内
に抗体を形成するから本発明の方法に使用できる。動物
由来の酵素であっても、異種動物に投与することによっ
て通常抗体を得ることが出来るから例外ではない。醇累
は、活性の測定方法か容易なもののほうか好都合である
。酵素の例としては、グルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ヘギンキナーゼ、α−アミラーゼ、マ
レートデヒドロゲナーゼ、アルカリ性ボスファターゼ、
ベニシリダーゼ、β−ガラクトシグーゼ、タレアチンギ
ナーゼ、リボヌクレアーゼ、ベニシリダーゼなどを撃げ
ることができる。
に抗体を形成するから本発明の方法に使用できる。動物
由来の酵素であっても、異種動物に投与することによっ
て通常抗体を得ることが出来るから例外ではない。醇累
は、活性の測定方法か容易なもののほうか好都合である
。酵素の例としては、グルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ヘギンキナーゼ、α−アミラーゼ、マ
レートデヒドロゲナーゼ、アルカリ性ボスファターゼ、
ベニシリダーゼ、β−ガラクトシグーゼ、タレアチンギ
ナーゼ、リボヌクレアーゼ、ベニシリダーゼなどを撃げ
ることができる。
酵素を後述する抗体の結合物と反応させても活性があま
り変らないときは、酸素を予め高分子化合物と結合させ
て高分子化してから用いるのがよい。高分子ｆヒ合物は
、分子量か１０万グルトン以上でかつ水浴性のものが適
当である。高分子化合物の例としては、可溶性デキスト
ラン、カルボキシメチル化デキストラン、アミノ化デキ
ストラン、アミロース等の多糖類、及びその誘導体ゼラ
チン、ヘモシアニン、フェリチン等の蛋白質、ポリエチ
レングリコールなと；と挙げることができる。これらは
、酵素と結合させた状態で所定の条件を具備していれば
よく、例えば牛血清アルブミンのような比較的低分子の
ものであっても、それを自家重合させるなどして高分子
化したものであってもよい。
り変らないときは、酸素を予め高分子化合物と結合させ
て高分子化してから用いるのがよい。高分子ｆヒ合物は
、分子量か１０万グルトン以上でかつ水浴性のものが適
当である。高分子化合物の例としては、可溶性デキスト
ラン、カルボキシメチル化デキストラン、アミノ化デキ
ストラン、アミロース等の多糖類、及びその誘導体ゼラ
チン、ヘモシアニン、フェリチン等の蛋白質、ポリエチ
レングリコールなと；と挙げることができる。これらは
、酵素と結合させた状態で所定の条件を具備していれば
よく、例えば牛血清アルブミンのような比較的低分子の
ものであっても、それを自家重合させるなどして高分子
化したものであってもよい。
高分子化は、酵素以外に後述する抗体結合物について行
なってもよく、また、酵素及び抗体結合物の両方とも高
分子化してもよい。
なってもよく、また、酵素及び抗体結合物の両方とも高
分子化してもよい。
酵素と高分子化合物との結合方法は双方の官能基を考慮
して決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシ
ル基、水酸基、チオール基・、イミグゾール基、フェニ
ル基などを利用することができ、例えばアミン基相互間
を結合させる場合には、ソイフシアネート法、グルタル
アルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法
等数多く 知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキシル基
をサクシンイミドエステル化する方法のほがカルボッイ
ミド法、ウッドワード試薬法等が知られており、アミン
基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法
）もある。チオール基を利用する場合には、例えばもう
一方の側のカルボキシル基をザクンンイミドエステル化
してこれにシスティンを反応させてチオール基を導入し
、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フェニル基を利用する方法としてはジ
アゾ化法、アルギル化法などがある。結合方法はこれら
の例示に限られるものではなく、このほか例えば［Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｍｒｒ＋ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｊあるいは「酵素抗体測定法」等の成書に記載されて
いる方法のなかから適宜選択して利用することができる
。
して決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシ
ル基、水酸基、チオール基・、イミグゾール基、フェニ
ル基などを利用することができ、例えばアミン基相互間
を結合させる場合には、ソイフシアネート法、グルタル
アルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法
等数多く 知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキシル基
をサクシンイミドエステル化する方法のほがカルボッイ
ミド法、ウッドワード試薬法等が知られており、アミン
基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法
）もある。チオール基を利用する場合には、例えばもう
一方の側のカルボキシル基をザクンンイミドエステル化
してこれにシスティンを反応させてチオール基を導入し
、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フェニル基を利用する方法としてはジ
アゾ化法、アルギル化法などがある。結合方法はこれら
の例示に限られるものではなく、このほか例えば［Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｍｒｒ＋ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｊあるいは「酵素抗体測定法」等の成書に記載されて
いる方法のなかから適宜選択して利用することができる
。
結合比は１：１に限らず、目的に応じて任意の比率をと
ることができることはいうまでもない。反応後は、ケ゛
ル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製を
行ない、必要により凍結乾燥法等で乾燥する。
ることができることはいうまでもない。反応後は、ケ゛
ル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製を
行ない、必要により凍結乾燥法等で乾燥する。
リガンドに対する抗体（以下、抗リガンド抗体という。
）、酵素に対する抗体（以下、抗酵素抗体という。）及
びこれらの第２抗体はいずれも抗体を取得する公知の方
法に準じて取得することができる。例えば兎、山羊、馬
、モルモット、ニワトリなどの温血動物に、リガンドあ
るＶ−は酵素を注射する場合には体重Ｉ Ｋｇ当り０３
〜２■程度、そして抗リガンド抗体あるいは抗酵素抗体
を注射する場合には体重１０当りＯ６３〜２ｍｇ程度を
１〜数回背中皮下、７ノ） ｉ４ ノド、大腿筋等にア
ジ−パントとともに注射して当該動物の体内に抗体を形
成させればよい。この抗体はＩｇＧ ％ 工ｇＭ％
ＩｇＡ等のみでなく、ペプシン等の蛋白分解酵素でｒ
（ａｂ’） ２ 、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどに分解して
用いてもよい。
びこれらの第２抗体はいずれも抗体を取得する公知の方
法に準じて取得することができる。例えば兎、山羊、馬
、モルモット、ニワトリなどの温血動物に、リガンドあ
るＶ−は酵素を注射する場合には体重Ｉ Ｋｇ当り０３
〜２■程度、そして抗リガンド抗体あるいは抗酵素抗体
を注射する場合には体重１０当りＯ６３〜２ｍｇ程度を
１〜数回背中皮下、７ノ） ｉ４ ノド、大腿筋等にア
ジ−パントとともに注射して当該動物の体内に抗体を形
成させればよい。この抗体はＩｇＧ ％ 工ｇＭ％
ＩｇＡ等のみでなく、ペプシン等の蛋白分解酵素でｒ
（ａｂ’） ２ 、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどに分解して
用いてもよい。
抗酵素抗体及びその第２抗体は、酵素と反応することに
よって、酵素活性を完今に阻害するもの、一部阻害する
もの、あるいは全く阻害しないものがあるがそのいずれ
であっても本発明の方法に使用することができる。これ
らの抗体は、前記の７ラグメントであると否とを問わず
、血清からＩｇＧを取得する公知の方法、例えば硫安沈
澱法、イオン交換クロマトグラフィー、ダル濾過、アフ
ィニティークロマトグラフィーなどで適宜精製してから
用いる。
よって、酵素活性を完今に阻害するもの、一部阻害する
もの、あるいは全く阻害しないものがあるがそのいずれ
であっても本発明の方法に使用することができる。これ
らの抗体は、前記の７ラグメントであると否とを問わず
、血清からＩｇＧを取得する公知の方法、例えば硫安沈
澱法、イオン交換クロマトグラフィー、ダル濾過、アフ
ィニティークロマトグラフィーなどで適宜精製してから
用いる。
一方、これらの抗体はモノクローナル抗体として取イ（
すすることもできる。その場合にＩｄ 、マウスにｉ’
ｉ′ｌｌ記のりガントあるいは酵素をアジュ・ぐントと
ともに数回１復腔等に注射し、牌［戎細胞を取り出して
ポリエチレングリコール等を用いてマウスミエローマ細
胞と融合させる。そして、この融合細胞のなかから当該
抗体を産生ずるものをクローニングによってモノクロー
ン細胞として増殖させ、得られプζモノクローン細胞を
マウス腹腔中で増殖させることによってモノクローナル
抗体を大量に製造することができる。
すすることもできる。その場合にＩｄ 、マウスにｉ’
ｉ′ｌｌ記のりガントあるいは酵素をアジュ・ぐントと
ともに数回１復腔等に注射し、牌［戎細胞を取り出して
ポリエチレングリコール等を用いてマウスミエローマ細
胞と融合させる。そして、この融合細胞のなかから当該
抗体を産生ずるものをクローニングによってモノクロー
ン細胞として増殖させ、得られプζモノクローン細胞を
マウス腹腔中で増殖させることによってモノクローナル
抗体を大量に製造することができる。
抗リガンド抗体と抗酵素抗体との結合方法は前述の酵素
と高分子化合物の結合方法のうち、蛋白質相互を結合さ
せる方法をすべて利用できる。例えば、グルタルアルデ
ヒド法、過ヨウ素酸酸化法、マレイミド法、ジイソシア
ネート法、ベンゾキノン法、カルボッイミド法などを利
用できるＯＣのほか、ＮＨ２基とＳ Ｈ基を結合するＳ
ＰＤＰ法、ＩｇＧの糖鎖と結合性をもつプロティンＡ
等のレクチンを使った方法、還元剤存在下における２種
のＦ（ａ ｂ’） ２のＳＨ基の組替方法なども利用で
きる。結合物は抗リガンド抗体と抗酵素抗体各１単位の
もののみに限らず、各々が数単位づつ結合したもの、あ
るいはさらに結合して高分子化したものであってもよい
。その場合、比率も目的に応じ任意のものであってよい
ことはいうまでもない。
と高分子化合物の結合方法のうち、蛋白質相互を結合さ
せる方法をすべて利用できる。例えば、グルタルアルデ
ヒド法、過ヨウ素酸酸化法、マレイミド法、ジイソシア
ネート法、ベンゾキノン法、カルボッイミド法などを利
用できるＯＣのほか、ＮＨ２基とＳ Ｈ基を結合するＳ
ＰＤＰ法、ＩｇＧの糖鎖と結合性をもつプロティンＡ
等のレクチンを使った方法、還元剤存在下における２種
のＦ（ａ ｂ’） ２のＳＨ基の組替方法なども利用で
きる。結合物は抗リガンド抗体と抗酵素抗体各１単位の
もののみに限らず、各々が数単位づつ結合したもの、あ
るいはさらに結合して高分子化したものであってもよい
。その場合、比率も目的に応じ任意のものであってよい
ことはいうまでもない。
この抗体結合物は、前述の酵素と同様１高分子化合物に
結合させて高分子化したほうがよい場合もある。その場
合は、高分子化合物には前述のもののなかから適宜用い
ればよく、結合方法も前述と同様でよい。この高分子化
は抗体間の結合を行なう前に一方あるいは両方の抗体に
対して行々ってもよく、また、抗体間の結合を行なった
後に行かってもよい。
結合させて高分子化したほうがよい場合もある。その場
合は、高分子化合物には前述のもののなかから適宜用い
ればよく、結合方法も前述と同様でよい。この高分子化
は抗体間の結合を行なう前に一方あるいは両方の抗体に
対して行々ってもよく、また、抗体間の結合を行なった
後に行かってもよい。
抗体結合物及びその高分子化物は、ダル濾過、カチオン
交換樹脂、アニオン交換樹脂などを用いたイオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを適宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍結
乾燥する。
交換樹脂、アニオン交換樹脂などを用いたイオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを適宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍結
乾燥する。
検体に含まれるリガンドと、酵素又はその高分子化物と
、抗すノｊ゛ンド抗体の第２抗体又は抗酵素抗体の第２
抗体とを、溶液中で前記の抗体結合物又はその高分子化
物と接触させる。その際、溶液の温度１６．２０〜４５
℃程度、そしてｐＨは通常４〜８．５程度がフＮ当であ
る。Ｉ））−１を一定に保つために、必要により、リン
酸緩衝液、酢酸緩衝液々どの緩衝液を用いてもよい。酵
素又はその高分子化物、抗リガンド抗体の第２抗体又は
抗酵素抗体の第２抗体及び抗体結合物又はその高分子化
物の適当な（葎は、それらのイ重類、リガンドの才束類
、あるいは接触時の条件などによって異なるので予め試
験をして定めるのがよい。第２抗体は、抗リガンド抗体
の第２抗体又は抗酵素抗体の第２抗体の一方のみを添加
してもよく、また両方添加してもよい。
、抗すノｊ゛ンド抗体の第２抗体又は抗酵素抗体の第２
抗体とを、溶液中で前記の抗体結合物又はその高分子化
物と接触させる。その際、溶液の温度１６．２０〜４５
℃程度、そしてｐＨは通常４〜８．５程度がフＮ当であ
る。Ｉ））−１を一定に保つために、必要により、リン
酸緩衝液、酢酸緩衝液々どの緩衝液を用いてもよい。酵
素又はその高分子化物、抗リガンド抗体の第２抗体又は
抗酵素抗体の第２抗体及び抗体結合物又はその高分子化
物の適当な（葎は、それらのイ重類、リガンドの才束類
、あるいは接触時の条件などによって異なるので予め試
験をして定めるのがよい。第２抗体は、抗リガンド抗体
の第２抗体又は抗酵素抗体の第２抗体の一方のみを添加
してもよく、また両方添加してもよい。
第２抗体の添加晴は、酵素活性を適当に変化きせるのに
必要な量であり、これも酵素、抗体結合物、りがンドの
神類、あるい１は接触時の条件などによって異なるので
予め試験をして定めるのがよい。
必要な量であり、これも酵素、抗体結合物、りがンドの
神類、あるい１は接触時の条件などによって異なるので
予め試験をして定めるのがよい。
抗体結合物とりガント、酵素及び第２抗体との接触時間
はいすね、も、通常は充分に反応しつる程度がよく、例
えば３７℃の場合には２０〜６０分間程度が適当である
。結合物に対するりがンド、酵素及び第２抗体の接触順
序は問うところではなく・いずれが先であってもよく、
あるいは同時であってもよい。
はいすね、も、通常は充分に反応しつる程度がよく、例
えば３７℃の場合には２０〜６０分間程度が適当である
。結合物に対するりがンド、酵素及び第２抗体の接触順
序は問うところではなく・いずれが先であってもよく、
あるいは同時であってもよい。
本発明の方法の場合には、各構成要素がある程度高分子
化されていることが適度の酵素活性変化を確保する点で
好ましく、そのために第２抗体を使用している。この第
２抗体を添加することによって抗体−酵素のマトリック
スが形成され、リガンドの量の増加にともなって２次的
立体障害が強才ってそのためにマトリックスにまき込１
れｌこ酵素活性が低く現われるものと思われる。この効
果は酵素あるいは結合物の高分子化と組み合わせると一
層大きくあられれる。
化されていることが適度の酵素活性変化を確保する点で
好ましく、そのために第２抗体を使用している。この第
２抗体を添加することによって抗体−酵素のマトリック
スが形成され、リガンドの量の増加にともなって２次的
立体障害が強才ってそのためにマトリックスにまき込１
れｌこ酵素活性が低く現われるものと思われる。この効
果は酵素あるいは結合物の高分子化と組み合わせると一
層大きくあられれる。
こｆｔらの接触を行なわせたのちには酵素活性を測定し
て検体中のリガンドの量を算出する。酵素活性の測定方
法は公知の方法に従って行なえばよい。例えば、酵素に
グルコース−６−リン酸脱水累酵素を用（Ｑた場合には
、上記の接触を行なわせた反応系にグルコース−６−リ
ン、設及びＮＡＤＰ＋を含む〕５１コ質溶液を力りえて
反［ｊ＋をせ、生成するＮＡＤＰＨを波長３４０ ｎｍ
の吸光度の増加から求めればよい。
て検体中のリガンドの量を算出する。酵素活性の測定方
法は公知の方法に従って行なえばよい。例えば、酵素に
グルコース−６−リン酸脱水累酵素を用（Ｑた場合には
、上記の接触を行なわせた反応系にグルコース−６−リ
ン、設及びＮＡＤＰ＋を含む〕５１コ質溶液を力りえて
反［ｊ＋をせ、生成するＮＡＤＰＨを波長３４０ ｎｍ
の吸光度の増加から求めればよい。
寸な、−キソキナーゼを用いた場合には、反応系にグル
コニス、ＡＴＰ ’Ｉ ＮＡＤＰ＋及びグルコース−６
−リン酸脱水素酵素を含む基質溶液を加えて反応させ、
やはりＮＡＤＰＨの生成量を測定することによって求め
ればよい。
コニス、ＡＴＰ ’Ｉ ＮＡＤＰ＋及びグルコース−６
−リン酸脱水素酵素を含む基質溶液を加えて反応させ、
やはりＮＡＤＰＨの生成量を測定することによって求め
ればよい。
本発明の方法は、リガンドを特異性高くかつ極めて１高
感度で測定できる。そして、操作力嘱ン；１単であり、
安価かつ容易にリガンドを定量することが可能である。
感度で測定できる。そして、操作力嘱ン；１単であり、
安価かつ容易にリガンドを定量することが可能である。
本発明の方法は、光発明の方法の感度を高めるＣとによ
って実用的価値をさらに高めたものである。
って実用的価値をさらに高めたものである。
以下、実施例を示す。
実施例１
１）抗ヒトＩｇＧモルモットＩｇＧ（α−ｈ ＩｇＧ
）と抗へキソキナーゼモルモッ） ＩｇＧ （α−ＨＫ
ＩｇＧ ）との結合と吻の調製 α−ｈＩ）ｇ０５ｍ９を０．１Ｍリン’ｔＷ緩↑ｙ７，
３液（Ｐｉ−１６，３）ｌ ｍｌに溶解し、２ｍ９／ｍ
ｉノ４− （７１／（ミドメチ／ｌｚ シフ０ヘキサン
ー１−カルボン酸）サクンンイミドエステル（ＣＨＭＳ
）のノオキサン溶液１００μｌを加えて室温で１時間反
応させた。反応液をセファデックスＧ−２５のカラムに
入れ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ６，５の０．１ Ｍ
’Ｊン酸緩衝液でグルｐ過を行なって未反応のＣＨＭ
Ｓを除き、得られた４−マレイミドメチルシクロヘキサ
ン−１−カルボン酸とα−ｈ ＩｇＧとの結合物（ＣＨ
Ｍ化α−ｈ ＩｇＧ ）の溶液を１ｒｔｌｌＫ濃縮した
。
）と抗へキソキナーゼモルモッ） ＩｇＧ （α−ＨＫ
ＩｇＧ ）との結合と吻の調製 α−ｈＩ）ｇ０５ｍ９を０．１Ｍリン’ｔＷ緩↑ｙ７，
３液（Ｐｉ−１６，３）ｌ ｍｌに溶解し、２ｍ９／ｍ
ｉノ４− （７１／（ミドメチ／ｌｚ シフ０ヘキサン
ー１−カルボン酸）サクンンイミドエステル（ＣＨＭＳ
）のノオキサン溶液１００μｌを加えて室温で１時間反
応させた。反応液をセファデックスＧ−２５のカラムに
入れ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ６，５の０．１ Ｍ
’Ｊン酸緩衝液でグルｐ過を行なって未反応のＣＨＭ
Ｓを除き、得られた４−マレイミドメチルシクロヘキサ
ン−１−カルボン酸とα−ｈ ＩｇＧとの結合物（ＣＨ
Ｍ化α−ｈ ＩｇＧ ）の溶液を１ｒｔｌｌＫ濃縮した
。
α−！（Ｋ Ｉｇｏ ５ ｍ９を５ ｍＭ ＥＤＴＡを
含むｐＨ７，５の０、１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液に溶かし
、これに９ ｍｇ／ ｍｌのＳ−アセチルヌルカフ０ト
コハク酸無水物のジメチルスルホキシド溶液１００μｌ
を加えて３７℃で１時間加温した。続いて、ｐｉ−１７
，５の１Ｍヒドロキシルアミン溶液１１０μｌを加えて
３７℃で３０分間放置して反応させた。この反応液をセ
フアゾ、クスＧ−２５を用いてダル濾過し、未反応のＳ
−アセチルメルカプトコハク酸を除去した。このＳ Ｒ
化−α−Ｉ（ＫＩｇＧをｌ ｍｌまで凝縮し、こｉｔに
前記のＣ１（Ｍ化α−ｈ ＩｇＧの’Ｊ％縮液１ ｍｉ
ｋ加え、４℃で１晩反応させた。この反応液を七フア
クリルＳ−３０Ｑでグル濾過してα−Ｉ（ＫＩｇＧとα
−ｈＩｇＧの結合物（４ｍｇ含有）分画を得た。
含むｐＨ７，５の０、１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液に溶かし
、これに９ ｍｇ／ ｍｌのＳ−アセチルヌルカフ０ト
コハク酸無水物のジメチルスルホキシド溶液１００μｌ
を加えて３７℃で１時間加温した。続いて、ｐｉ−１７
，５の１Ｍヒドロキシルアミン溶液１１０μｌを加えて
３７℃で３０分間放置して反応させた。この反応液をセ
フアゾ、クスＧ−２５を用いてダル濾過し、未反応のＳ
−アセチルメルカプトコハク酸を除去した。このＳ Ｒ
化−α−Ｉ（ＫＩｇＧをｌ ｍｌまで凝縮し、こｉｔに
前記のＣ１（Ｍ化α−ｈ ＩｇＧの’Ｊ％縮液１ ｍｉ
ｋ加え、４℃で１晩反応させた。この反応液を七フア
クリルＳ−３０Ｑでグル濾過してα−Ｉ（ＫＩｇＧとα
−ｈＩｇＧの結合物（４ｍｇ含有）分画を得た。
１１） ヒ ト ＩｇＧ の 定量各種碓１痰
のヒ）ＩｇＧ浴液各５０μノに前記のα−）ＩＫＩｇＧ
−α−ｈＩｇＧ結合物５０結合全５０μｌらにα〜モル
モｙ Ｆ ＩｇＧ −ＩｇＧ血清の１／１００希釈液１
００μｌを加えてから２５℃で１時間加温した。
のヒ）ＩｇＧ浴液各５０μノに前記のα−）ＩＫＩｇＧ
−α−ｈＩｇＧ結合物５０結合全５０μｌらにα〜モル
モｙ Ｆ ＩｇＧ −ＩｇＧ血清の１／１００希釈液１
００μｌを加えてから２５℃で１時間加温した。
これに、ヘキソキナーゼ２５μ１（０４μｇ含有）を加
え、２５℃で３０分間反応させてから、反応液に０．１
Ｍグルコース、０．５ ｍＭ ＡＴＰ 、 ０．２
ｍＭＮＡＤＰ ） ３ ＴＪ ／ｍｌグＩＪ／ ：ｌ
−ス６リン酸脱水紫酵素及び１３．３ ｍＭ ＭｇＣｔ
２を含むｐＨｓ、 ｏの５０ ｍＭ ）リス緩衝心゛液
３ ｍｌを基質溶液として加え、２５℃で波長３４．Ｏ
ｎｍＫおける吸光度の増加を求めたところ、下表に示す
結果が得られた。
え、２５℃で３０分間反応させてから、反応液に０．１
Ｍグルコース、０．５ ｍＭ ＡＴＰ 、 ０．２
ｍＭＮＡＤＰ ） ３ ＴＪ ／ｍｌグＩＪ／ ：ｌ
−ス６リン酸脱水紫酵素及び１３．３ ｍＭ ＭｇＣｔ
２を含むｐＨｓ、 ｏの５０ ｍＭ ）リス緩衝心゛液
３ ｍｌを基質溶液として加え、２５℃で波長３４．Ｏ
ｎｍＫおける吸光度の増加を求めたところ、下表に示す
結果が得られた。
ヒ ト ＩｇＧ （ΔＡ
７ｍ１ｎ）Ｘ１００Ｏ４０ｎｍ Ｏ，６ｔｔｊＪ／ｍｌ ｌ ９．５２
．０ １７．０５．０
１４．１２０．０
１１．３１００
８．５ヒト血清５検体について、各１
０００倍希釈血清各５０ ｔｉｌｌ ｆ用い、上記と同
様に測定した。そして、上表の結果を検量線に用いてＩ
ｇＧの酸度を求めた。一方、これに並行して従来法であ
る５ＲＩＤ法で同じ血清のＩｇＧ濃度を測定した。
７ｍ１ｎ）Ｘ１００Ｏ４０ｎｍ Ｏ，６ｔｔｊＪ／ｍｌ ｌ ９．５２
．０ １７．０５．０
１４．１２０．０
１１．３１００
８．５ヒト血清５検体について、各１
０００倍希釈血清各５０ ｔｉｌｌ ｆ用い、上記と同
様に測定した。そして、上表の結果を検量線に用いてＩ
ｇＧの酸度を求めた。一方、これに並行して従来法であ
る５ＲＩＤ法で同じ血清のＩｇＧ濃度を測定した。
得られた結果を下表に示す。
ＩｇＧ濃度
八８．４１６９／ｍ１ ９．１− ｍ９／ｍｌＢ
１６．１ １７．２Ｃ１１，５１０，３ Ｄ １２．１ １１．８Ｅ
７． ｓ ８．１実施例２ １）抗グルコースー６−ホスフエードプヒドロダナーゼ
マウスＩｇＧ（（χ−Ｇ ６ ＰＤＨＩｇＧ ）のｉ周
卯専抗頑として酵母出御（のＧ ６ ＰＤＨ（オリエン
タル１′孝句工業（株）製〕を用いた。このＧ ６ Ｐ
ＤＨの１’９ ／ ｒｎｌの溶液をフロイントの完全ア
ノユパントと等容混合してエマルジョンとし、そのＱ、
ｌ ｖｒｌを８超令のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に１
週問おき（（３回注躬した。それからさらに１週間後に
尾骨風に５０ ｔｔ＆ ／ ０．１ ｍｌのＧ ６ Ｐ
ＤＨ溶液を注射し、３日後に）卑）菌を４商出した。
１６．１ １７．２Ｃ１１，５１０，３ Ｄ １２．１ １１．８Ｅ
７． ｓ ８．１実施例２ １）抗グルコースー６−ホスフエードプヒドロダナーゼ
マウスＩｇＧ（（χ−Ｇ ６ ＰＤＨＩｇＧ ）のｉ周
卯専抗頑として酵母出御（のＧ ６ ＰＤＨ（オリエン
タル１′孝句工業（株）製〕を用いた。このＧ ６ Ｐ
ＤＨの１’９ ／ ｒｎｌの溶液をフロイントの完全ア
ノユパントと等容混合してエマルジョンとし、そのＱ、
ｌ ｖｒｌを８超令のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に１
週問おき（（３回注躬した。それからさらに１週間後に
尾骨風に５０ ｔｔ＆ ／ ０．１ ｍｌのＧ ６ Ｐ
ＤＨ溶液を注射し、３日後に）卑）菌を４商出した。
この牌臓を摩砕して牌、臓細胞を分離し、ポ’Ｊ エチ
レングリコール１５０（１−用いてマウスミエローマＰ
３Ｕ１と細胞融合させた。
レングリコール１５０（１−用いてマウスミエローマＰ
３Ｕ１と細胞融合させた。
得られた融合細胞を９６１クエルのプレートに分注し、
Ｉ（ＡＴ培地で培養した。各ウェルの細胞をＧ ６ Ｐ
Ｄ）Ｉを固相に固定化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ
法で調べて、Ｇ ６ ＰＤＨに反応性を有するマウスＩ
ｇＧを含むと思われる５ウエルを見出した。
Ｉ（ＡＴ培地で培養した。各ウェルの細胞をＧ ６ Ｐ
Ｄ）Ｉを固相に固定化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ
法で調べて、Ｇ ６ ＰＤＨに反応性を有するマウスＩ
ｇＧを含むと思われる５ウエルを見出した。
この５ウエルの細胞を限界希釈法で希釈してクローニン
グし、ｇＬＩｓＡ法を応用した阻害測定法で調べて、Ｇ
６ ＰＤＨの異なる抗原決定基を認識していると思わ
れる２つの細胞株を得た。
グし、ｇＬＩｓＡ法を応用した阻害測定法で調べて、Ｇ
６ ＰＤＨの異なる抗原決定基を認識していると思わ
れる２つの細胞株を得た。
この細胞株をそれぞれ１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ 培地−
Ｃ増殖式せ、この増殖細胞を予めプリスタンを注射した
Ｂ’ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔へ１０７（ｔ？ｊづつ注入
して、２週間後に腹水約１０ｍ１を採取した。
Ｃ増殖式せ、この増殖細胞を予めプリスタンを注射した
Ｂ’ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔へ１０７（ｔ？ｊづつ注入
して、２週間後に腹水約１０ｍ１を採取した。
この腹水を４５係飽和の硫安で塩析し、生成した沈澱物
を分離した。この沈澱物を少量のリン酸緩衝液ｐｉ（７
０で溶解し、同緩衝液で平衡化した七フアクリルＳ−３
００カラムでグル濾過してＩｇＧ分画を分取した。
を分離した。この沈澱物を少量のリン酸緩衝液ｐｉ（７
０で溶解し、同緩衝液で平衡化した七フアクリルＳ−３
００カラムでグル濾過してＩｇＧ分画を分取した。
こうして得られた異なる抗原決定基を認識している２細
胞株から得た各ＩｇＧを等量づつ混合して、α−Ｇ ６
ＰＤＴ（ＩｇＧとした。
胞株から得た各ＩｇＧを等量づつ混合して、α−Ｇ ６
ＰＤＴ（ＩｇＧとした。
！：） 抗ヒトα−フェトプロテインマウスエｇＧ（
α−ＡＦＰ ＩｇＧ ）の調製 上記と同様の操作により、ヒトα−フェトプロティン（
ＡＦＰ ）に対するマウスのモノクローナル抗体を２種
類得た。各抗体をＩｇＧまで精製し、２種類を混ぜ合わ
せてα−ＡＦＰ ＩｇＧとして使用した。
α−ＡＦＰ ＩｇＧ ）の調製 上記と同様の操作により、ヒトα−フェトプロティン（
ＡＦＰ ）に対するマウスのモノクローナル抗体を２種
類得た。各抗体をＩｇＧまで精製し、２種類を混ぜ合わ
せてα−ＡＦＰ ＩｇＧとして使用した。
１１１） α−ＡＦＰ ＩｇＧとα−Ｇ ６ ＰＤＩ
（ＩｇＧとの結合物の調製 デキストランＴ５００（ファルマシア社製、平均分子量
５０万）５’Ｏｍ９を１７ｎ−ｌの水に溶解し、この溶
液に０．１Ｍ過ヨウ素酸す） ＋）ラム水溶液０．２Ｎ
を加えて４℃で一夜反応させた。これに０．１５廐のエ
チレングリコールを加えて５分間反応させた後１ ｍＭ
酢酸す） ＩＪウム緩衝液（ＰＨ５，０）で平衡化した
セファデックスＧ−２５カラムでグルテ過し、素通り分
画を集めた。この分画にα−ＡＦＰＩｇＧとα−Ｇ ６
ＰＤＴ（ＩｇＧとの混合物２０ダを１０ｍＭ炭酸緩衝
液（ｐＨ９，５）に溶解した溶液を加え、ｐＨを９．５
に調整してから室温で２時間反応させた。
（ＩｇＧとの結合物の調製 デキストランＴ５００（ファルマシア社製、平均分子量
５０万）５’Ｏｍ９を１７ｎ−ｌの水に溶解し、この溶
液に０．１Ｍ過ヨウ素酸す） ＋）ラム水溶液０．２Ｎ
を加えて４℃で一夜反応させた。これに０．１５廐のエ
チレングリコールを加えて５分間反応させた後１ ｍＭ
酢酸す） ＩＪウム緩衝液（ＰＨ５，０）で平衡化した
セファデックスＧ−２５カラムでグルテ過し、素通り分
画を集めた。この分画にα−ＡＦＰＩｇＧとα−Ｇ ６
ＰＤＴ（ＩｇＧとの混合物２０ダを１０ｍＭ炭酸緩衝
液（ｐＨ９，５）に溶解した溶液を加え、ｐＨを９．５
に調整してから室温で２時間反応させた。
０．４チ水素化ホウ素す） ＩＪウム水溶液０．５ ｍ
ｌを加えてさらに４℃で２時間反応させ、この反卯物を
２０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液ｐＨ７、Ｏに対して透析し
た。透析物を七フアクリルＳ−３００カラムでダルｐ過
して高分子部分を分画し、ＡＦＰ ＩｇＧとα−Ｇ６Ｐ
ＤＨＩｇＧとの結合物分画を得た。
ｌを加えてさらに４℃で２時間反応させ、この反卯物を
２０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液ｐＨ７、Ｏに対して透析し
た。透析物を七フアクリルＳ−３００カラムでダルｐ過
して高分子部分を分画し、ＡＦＰ ＩｇＧとα−Ｇ６Ｐ
ＤＨＩｇＧとの結合物分画を得た。
ｉＶ） α−フェトプロティン（ＡＦＰ ）の定量各
種濃度のヒ） ＡＦＰ溶液各５０μｌに前記のα−ＡＦ
ＰＩｇＧ−α−Ｇ ６ ＰＤＨＩｇＧ結合結合面分画５
μｌｌを加え、さらにＧ ６ ＰＤＨを含む家兎抗マ
ウスＩｇＧ ＩｇＧ分画１００μｌを加えてから２５℃
で３０分間加温して反応させた。
種濃度のヒ） ＡＦＰ溶液各５０μｌに前記のα−ＡＦ
ＰＩｇＧ−α−Ｇ ６ ＰＤＨＩｇＧ結合結合面分画５
μｌｌを加え、さらにＧ ６ ＰＤＨを含む家兎抗マ
ウスＩｇＧ ＩｇＧ分画１００μｌを加えてから２５℃
で３０分間加温して反応させた。
反応液にＧ ６ ＰＤＨの基質として、Ｑ、 ５ ｎｈ
Ｍグルフース−６−リン酸、０．５ ｍＭ ＮＡＤＰ及
び２０ ｍＭＭｇＣ１２を含ｔｒ ０． Ｉ Ｍグリシ
ルダリシン緩衝液（Ｐ）１８．５）を加え、２５℃で波
長３４０ ｎｍにおける吸光度の増加を求めたところ、
下表に示す結果が得られた。
Ｍグルフース−６−リン酸、０．５ ｍＭ ＮＡＤＰ及
び２０ ｍＭＭｇＣ１２を含ｔｒ ０． Ｉ Ｍグリシ
ルダリシン緩衝液（Ｐ）１８．５）を加え、２５℃で波
長３４０ ｎｍにおける吸光度の増加を求めたところ、
下表に示す結果が得られた。
Ｏ叩 ３６．５
５０ ２８．１
１００ ２２．３
２００ １９．８
４００ １６．９
８００ １５．１
ヒト血清５検体について、各５０μｌを用いて上記と同
様に測定を行ない、上表の結果を検量線に用いてＡＦＰ
の濃度を求めた。尚、これと並行して従来法であるＲＩ
Ａ法で同じ血清のＡＦＰの濃度を測定した。
様に測定を行ない、上表の結果を検量線に用いてＡＦＰ
の濃度を求めた。尚、これと並行して従来法であるＲＩ
Ａ法で同じ血清のＡＦＰの濃度を測定した。
得られた結果を下表に示す。
ＡＦＰ濃度
Ａ ２００？’［９１８７７Ｌｌ？８ ６
０ ５３ Ｃ３２０３３４ ＋） ５３０ ’５５１ Ｅ １０５ １１２ 特許出願人 富士臓器製薬株式会社 代理八 升埋十田中駆后
０ ５３ Ｃ３２０３３４ ＋） ５３０ ’５５１ Ｅ １０５ １１２ 特許出願人 富士臓器製薬株式会社 代理八 升埋十田中駆后
Claims (1)
- 検体に含まれる抗原決定基具有物質と、酵素又は酵素と
高分子化合物との結合物と、該抗原決定基具有物質の抗
体に対する第２抗体又は該酵素の抗体に対する第２抗体
とを、溶液中で該抗原決定基具有物質の抗体と該酵素の
抗体との結合物又は該抗原決定基具有物質の抗体と該酵
素の抗体と高分子化合物との結合物に接触せしめ、その
後前記酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決定
基具有物質の測定方法
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5149483A JPS59178360A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定方法 |
| EP84301154A EP0119767B1 (en) | 1983-03-11 | 1984-02-22 | Method of measuring ligands |
| DE8484301154T DE3483620D1 (de) | 1983-03-11 | 1984-02-22 | Verfahren zur bestimmung von liganden. |
| ES530439A ES8605098A1 (es) | 1983-03-11 | 1984-03-09 | Metodo de medir ligandos del tipo de substancias medicinales y constituyentes trazos derivados de diversas enfermedades en fluidos corporales tales como suero sanguineo y orina. |
| US06/588,682 US4621048A (en) | 1983-03-11 | 1984-03-12 | Reagents containing an anti-ligand bound to an anti-enzyme and methods for employing said reagents in an immunoassy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5149483A JPS59178360A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59178360A true JPS59178360A (ja) | 1984-10-09 |
| JPH0377462B2 JPH0377462B2 (ja) | 1991-12-10 |
Family
ID=12888519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5149483A Granted JPS59178360A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59178360A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04506126A (ja) * | 1990-01-02 | 1992-10-22 | モトローラ・インコーポレイテッド | マイクロコンピュータにおける逐次割込み |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
| JPS587561A (ja) * | 1981-06-30 | 1983-01-17 | ザ・ウエルカム・フアウンデ−シヨン・リミテツド | 酵素免疫分析法 |
-
1983
- 1983-03-29 JP JP5149483A patent/JPS59178360A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
| JPS587561A (ja) * | 1981-06-30 | 1983-01-17 | ザ・ウエルカム・フアウンデ−シヨン・リミテツド | 酵素免疫分析法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04506126A (ja) * | 1990-01-02 | 1992-10-22 | モトローラ・インコーポレイテッド | マイクロコンピュータにおける逐次割込み |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0377462B2 (ja) | 1991-12-10 |
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