JPS5990054A - ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 - Google Patents
ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬Info
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- JPS5990054A JPS5990054A JP20089782A JP20089782A JPS5990054A JP S5990054 A JPS5990054 A JP S5990054A JP 20089782 A JP20089782 A JP 20089782A JP 20089782 A JP20089782 A JP 20089782A JP S5990054 A JPS5990054 A JP S5990054A
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明＆Ｊ：ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、［ｈｃ
ＧＪと略称することもある。）の酵素免疫測定法（以下
、「Ｅ工Ａ」と略称することもある。）に関するもので
ある。
ＧＪと略称することもある。）の酵素免疫測定法（以下
、「Ｅ工Ａ」と略称することもある。）に関するもので
ある。
従来、ｈ ＣＧのｌ′ｉ： Ｉ Ａについては次の２法
が提案されている。
が提案されている。
（１）競合法：酵素で標識した一定量のｈＣＧを含有す
る物質と、未知量のｈｃＧを含有する物質とを抗ｈＣＧ
抗体に対して競合的に結合させ、抗体と結合した酵素の
酵素活性もしくは抗体と結合しなかった酵素の酵素活性
を測定し、その測定結果を、予め既知１七のす、 ＣＧ
において同様にして得られた結果とり１比することによ
り定量を行う方法。
る物質と、未知量のｈｃＧを含有する物質とを抗ｈＣＧ
抗体に対して競合的に結合させ、抗体と結合した酵素の
酵素活性もしくは抗体と結合しなかった酵素の酵素活性
を測定し、その測定結果を、予め既知１七のす、 ＣＧ
において同様にして得られた結果とり１比することによ
り定量を行う方法。
（２）ザンドイツチ法：未知旦のｈＣＧを含有する物質
を、抗ｈＣＧ前、体を用いて固定し、これに酵素で標識
した抗体を結合させて、その酵；に活性をｎ１１）定し
定１号する方法。
を、抗ｈＣＧ前、体を用いて固定し、これに酵素で標識
した抗体を結合させて、その酵；に活性をｎ１１）定し
定１号する方法。
本発明者は、上記（１）の競合法においては特定のβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ標識体と特定の抗体とを用いると
高感度で高特異性の微量定風が可能であることを見出し
た（特開昭５６−１３８２４８号公報参１！α）。寸だ
上記（２）のサンドイツチ法においては、担イ・ト上に
保持された抗体、抗原および標ｎｊ’、ｌｉ剤を結合さ
亡だ抗体を用いるＥＩＡにおいて、担体上に保持される
抗体と標識剤を結合する抗体とが互いに抗原決定部位を
重複しない２種の抗体であり、該抗体のうち一方がＩＣ
Ｇに特異的に反応する抗体であることを特徴とするｈＣ
ＧのＥＩＡが高感度、高精度、高特異性であることを見
出した（特開昭５７−６７８５８号公報参照）。
Ｄ−ガラクトシダーゼ標識体と特定の抗体とを用いると
高感度で高特異性の微量定風が可能であることを見出し
た（特開昭５６−１３８２４８号公報参１！α）。寸だ
上記（２）のサンドイツチ法においては、担イ・ト上に
保持された抗体、抗原および標ｎｊ’、ｌｉ剤を結合さ
亡だ抗体を用いるＥＩＡにおいて、担体上に保持される
抗体と標識剤を結合する抗体とが互いに抗原決定部位を
重複しない２種の抗体であり、該抗体のうち一方がＩＣ
Ｇに特異的に反応する抗体であることを特徴とするｈＣ
ＧのＥＩＡが高感度、高精度、高特異性であることを見
出した（特開昭５７−６７８５８号公報参照）。
しかしながらこれらの方法においてもなお、約０．１．
−２ｍＩＵ 以下の微量ｈＣＧを粘度よく測定すること
はｔ）！ｉ Ｌ ＜ 、悪性腫瘍のより確かな診断と経
過観察あるいは正常人におけるその生理学的意義を決定
する上では、更に感度の高い測定法が必要とされた。
−２ｍＩＵ 以下の微量ｈＣＧを粘度よく測定すること
はｔ）！ｉ Ｌ ＜ 、悪性腫瘍のより確かな診断と経
過観察あるいは正常人におけるその生理学的意義を決定
する上では、更に感度の高い測定法が必要とされた。
本発明者は上記の事情に鑑み、更に検討を重ねたところ
、上記特異抗体を用いるサンドイツチ法によるＥＩＡに
おいて、抗ｈＣＧ抗体を用いてペルオキシダーゼと結合
させることにょシ得られる抗体−酵素標識体が高感度、
高精度の微量定量を可能にすることを見出しだ。これに
基づいてさらに研究をした結果、本発明を完成した。
、上記特異抗体を用いるサンドイツチ法によるＥＩＡに
おいて、抗ｈＣＧ抗体を用いてペルオキシダーゼと結合
させることにょシ得られる抗体−酵素標識体が高感度、
高精度の微量定量を可能にすることを見出しだ。これに
基づいてさらに研究をした結果、本発明を完成した。
本発明は、（１）担体上に保持された抗体、抗原および
標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的測定法にお
いて、担体上に保持される抗体と標識剤を結合させる抗
体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体であ
り、担体上に保持される抗体がヒト絨毛性ゴナドトロピ
ンに特異的に反応する抗体であり、標識剤としてペルオ
キシダーゼを用いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎはＯないし５の！ｌｌ数を、Ｒは化学結合ま
たは２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で
表わされる化合物ＣＩ）で結合させたものを用いること
を特徴とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測
定法および（２）■ペルオキシダーゼと抗体とを一般式 〔式中、ｎはＯないし５の整数を、Ｒは化学結合まだは
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物ＣＩ）で結合させたもの、および■ペルオ
キシダーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重
複せずかつヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に反応す
る抗体を担体上に保持したものを含有するヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンの免疫化学的測定用試薬である。
標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的測定法にお
いて、担体上に保持される抗体と標識剤を結合させる抗
体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体であ
り、担体上に保持される抗体がヒト絨毛性ゴナドトロピ
ンに特異的に反応する抗体であり、標識剤としてペルオ
キシダーゼを用いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎはＯないし５の！ｌｌ数を、Ｒは化学結合ま
たは２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で
表わされる化合物ＣＩ）で結合させたものを用いること
を特徴とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測
定法および（２）■ペルオキシダーゼと抗体とを一般式 〔式中、ｎはＯないし５の整数を、Ｒは化学結合まだは
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物ＣＩ）で結合させたもの、および■ペルオ
キシダーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重
複せずかつヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に反応す
る抗体を担体上に保持したものを含有するヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンの免疫化学的測定用試薬である。
本発明において用いられる担体上に保持された抗体にお
ける担体としては、たとえば、ゲμ粒子（例、アガロ−
スゲμ〔例、セファロース４Ｂ。
ける担体としては、たとえば、ゲμ粒子（例、アガロ−
スゲμ〔例、セファロース４Ｂ。
セファロース６Ｂ（ファ／ｌ／マシア・ファインケミカ
ル社（スエーデン）Ｆり、デキストヲンゲμ〔例、セフ
ァデックスＧ−７５，セファデックスＧ−ｉｏｏ、セフ
ァデックスＧ −２００（ファルマシア・ファインケミ
カル社製） 〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオ
ゲルＰ−３０，バイオゲ）ＶＰ６０．パイオゲ／ｌ／Ｐ
−１００（バイオラッド・ヲポフトリーズ社（米国））
）、−ｔ＝ニルローフ子〔例、アビセ／Ｉ／（脂化成製
）、イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエグー
ルセルロース、カルボキシメチルセ／Ｉ／ロース）’１
．物理的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス珪、ガラスロ
ッド。
ル社（スエーデン）Ｆり、デキストヲンゲμ〔例、セフ
ァデックスＧ−７５，セファデックスＧ−ｉｏｏ、セフ
ァデックスＧ −２００（ファルマシア・ファインケミ
カル社製） 〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオ
ゲルＰ−３０，バイオゲ）ＶＰ６０．パイオゲ／ｌ／Ｐ
−１００（バイオラッド・ヲポフトリーズ社（米国））
）、−ｔ＝ニルローフ子〔例、アビセ／Ｉ／（脂化成製
）、イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエグー
ルセルロース、カルボキシメチルセ／Ｉ／ロース）’１
．物理的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス珪、ガラスロ
ッド。
アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ボリヌチレン球
、ポリスチレン粒子）〕、イオン交換樹脂（例、弱酸性
陽イオン交換樹脂〔例、アンバーフ、イト丁ＲＣ−５０
（ローノ・・ハースン１（米１月）重り）、ゼオカーフ
゛２２６（パームチットト１４（＋！’ｉド、イツ）製
）〕、＠塩基ｔ′１″陰イオン交換樹脂〔例、アンバー
ライトＩ Ｒ−４Ｂ 、ダウエックス３（ダウケミ力）
（ｙ社（米国））ｉ・陽）］）などが挙げられる。
）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ボリヌチレン球
、ポリスチレン粒子）〕、イオン交換樹脂（例、弱酸性
陽イオン交換樹脂〔例、アンバーフ、イト丁ＲＣ−５０
（ローノ・・ハースン１（米１月）重り）、ゼオカーフ
゛２２６（パームチットト１４（＋！’ｉド、イツ）製
）〕、＠塩基ｔ′１″陰イオン交換樹脂〔例、アンバー
ライトＩ Ｒ−４Ｂ 、ダウエックス３（ダウケミ力）
（ｙ社（米国））ｉ・陽）］）などが挙げられる。
木泉明における相体上に保持された抗体における１月＋
Ｑ［、イ゛Ｗ熾ｊ１１１を結合させた１１０体における
抗体とｎ：いに抗原法定部位を重複しない２種の抗体で
あり、ｈ （、’： Ｇに〕ｒ、〒異的にＪτ応する４
−０体でｆ）ｊｌばよい。
Ｑ［、イ゛Ｗ熾ｊ１１１を結合させた１１０体における
抗体とｎ：いに抗原法定部位を重複しない２種の抗体で
あり、ｈ （、’： Ｇに〕ｒ、〒異的にＪτ応する４
−０体でｆ）ｊｌばよい。
％ｉ ｈ ＣＧ Ｋ特２１′Ａ的に反応する抗体ト１．
’１．１１、たとえば■エンドクリノロジー（Ｅｒｏｌ
ｏｃｒｉ ｎｏｌｏｇｙ ）。
’１．１１、たとえば■エンドクリノロジー（Ｅｒｏｌ
ｏｃｒｉ ｎｏｌｏｇｙ ）。
偽１０４巻（１，９７９年）、第３９６頁に記載されて
いるような抗体が皐げられる。即ち、Ｉ］ＣＧ−β鎖の
Ｃ末端側のｈｃＧＫ特異的なペプチドと牛アルブミンや
牛チログロブリンなとキャリアー用タンパクとを１−エ
チ／ｌ／−３−（３−ジメチルアミノプロピ／Ｉ／）カ
ルボジイミドなど水溶１°１モカルポジイミドを用いて
得だ縮合物をフロイントの完全アジュバントもしくは不
完全アジュバントと共に人以外の温血動物たとえばウサ
ギに頻回接種して抗体を形成せしめ、これを採取するこ
とによりｈＣＧに特異的に反応する抗面清を得ることが
できる。
いるような抗体が皐げられる。即ち、Ｉ］ＣＧ−β鎖の
Ｃ末端側のｈｃＧＫ特異的なペプチドと牛アルブミンや
牛チログロブリンなとキャリアー用タンパクとを１−エ
チ／ｌ／−３−（３−ジメチルアミノプロピ／Ｉ／）カ
ルボジイミドなど水溶１°１モカルポジイミドを用いて
得だ縮合物をフロイントの完全アジュバントもしくは不
完全アジュバントと共に人以外の温血動物たとえばウサ
ギに頻回接種して抗体を形成せしめ、これを採取するこ
とによりｈＣＧに特異的に反応する抗面清を得ることが
できる。
（わ特開昭５６ １３８２４８に記載されだｈＣＧに特
異的に反応する抗ｂ ＣＧ抗体、すなわち担体」−に不
溶化した一般式〔■〕 ＩＩ−Ｒ，−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−１１ｅ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏ−Ｇｌｎ −ＯＨ（■：）
１ されるペプチドの１４位のＧｌｙを含む１〜１４個の部
分ペプチド４４を表わす。〕で表わされるベフ。
異的に反応する抗ｂ ＣＧ抗体、すなわち担体」−に不
溶化した一般式〔■〕 ＩＩ−Ｒ，−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−１１ｅ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏ−Ｇｌｎ −ＯＨ（■：）
１ されるペプチドの１４位のＧｌｙを含む１〜１４個の部
分ペプチド４４を表わす。〕で表わされるベフ。
チドに抗ｈ Ｃ，（？ ：１元体を含有する体液を接触
させ、ついで特異的に１（促ＩＫされた抗ｈＣＧ抗体を
溶出することにより得られだ抗ｈＣＧ抗体が挙げられる
。
させ、ついで特異的に１（促ＩＫされた抗ｈＣＧ抗体を
溶出することにより得られだ抗ｈＣＧ抗体が挙げられる
。
該ｈｃＧ［特異的に反応する抗体と１〜では、さらに、
■前記一般式〔■〕で表わされるペプチドとキャリア用
タンパクとをグルグルアルデヒド（［ＧＬＡＪと略称す
ることもある。）の存在下に縮合せしめた４ｉ？ｉ合生
成物を人以外の温血動物に接ｌｊｊ、 ｌ、て抗体を形
成せしめ、これを採Ｊ（Ｙすることにより得られた抗体
が挙げられる。
■前記一般式〔■〕で表わされるペプチドとキャリア用
タンパクとをグルグルアルデヒド（［ＧＬＡＪと略称す
ることもある。）の存在下に縮合せしめた４ｉ？ｉ合生
成物を人以外の温血動物に接ｌｊｊ、 ｌ、て抗体を形
成せしめ、これを採Ｊ（Ｙすることにより得られた抗体
が挙げられる。
ここにおいてキャリア用タンパクとは、単独では抗体産
生を誘導することができないベプタイドなどハプテン（
低分子量物質）に対する抗体を産生させるためにハプテ
ンと結合させて用いられるものをいい、その例としては
たとえば牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、牛チ
ログロブリン、破イ（Ｓ風トキソイド、ヘモシアニンお
よびポリアミノ酸などが挙げられる。
生を誘導することができないベプタイドなどハプテン（
低分子量物質）に対する抗体を産生させるためにハプテ
ンと結合させて用いられるものをいい、その例としては
たとえば牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、牛チ
ログロブリン、破イ（Ｓ風トキソイド、ヘモシアニンお
よびポリアミノ酸などが挙げられる。
一般式〔■〕で表わされるペプチドとキャリア用タンパ
クとをＧ ＬＡの存在下に結合さぜるには、公知の方法
〔例、ホルモン・アンド・メタポリツク・リサーチ（ｆ
（ｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｒｅ
−５ｅａｒｃｈ ） 、第８巻（１９７６年） ＋ Ｋ
Ｓ ２４ ｉ頁〕によって実施し得る。一般式〔■〕で
表わされるペプチドとキャリア用タンパクの使用量比＆
、１１対工ないし２ネ１１が適当であり、反応ｐｆＴは
７．３前後が良好な結果を与える場合が多い。また反応
に要する時間は２〜６時間がよい場合が多いが、特に３
時間が適当である。この様にして鋼重した縮合生成物は
常套手段で４℃前後で水に対して透析し、凍結乾燥して
保存することができる。
クとをＧ ＬＡの存在下に結合さぜるには、公知の方法
〔例、ホルモン・アンド・メタポリツク・リサーチ（ｆ
（ｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｒｅ
−５ｅａｒｃｈ ） 、第８巻（１９７６年） ＋ Ｋ
Ｓ ２４ ｉ頁〕によって実施し得る。一般式〔■〕で
表わされるペプチドとキャリア用タンパクの使用量比＆
、１１対工ないし２ネ１１が適当であり、反応ｐｆＴは
７．３前後が良好な結果を与える場合が多い。また反応
に要する時間は２〜６時間がよい場合が多いが、特に３
時間が適当である。この様にして鋼重した縮合生成物は
常套手段で４℃前後で水に対して透析し、凍結乾燥して
保存することができる。
以上の様にして！Ｆ！！造した縮合生成物は人ｊジ外の
温血動物に接種される。−ト紀ｈＣＧに特異的に反応す
る抗体の製４に用いられる人以外の温血動物としては、
たとえば咄乳湛血動’Ｖｎ＋ （例、ウサギ、ヒツジ、
ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ） １
．Ｐｋ８！ （例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ
、ウズラ）などが挙げられる。該縮合生成物を人以外の
＃ｉＡ ｒｆｉｔ動物に接種するノＴ法としては、動物
に１１ｆ ｒ４１−Ｊ−る手１１１合生成物ケよ抗体産
生ずるに有効なＲ）でよく、だとえｖ１ニウサギに１回
２ｒｑを等容量（１ｓｔ）の生ｌｉｐ食１！水およびフ
ロイントの完全アジュバントで乳化して、背部ならびに
後肢掌皮下ＶＣ４週問おきに５回接４・口すると４１″
１、体を産生さぜ（４Ｊる１→合が多い。
温血動物に接種される。−ト紀ｈＣＧに特異的に反応す
る抗体の製４に用いられる人以外の温血動物としては、
たとえば咄乳湛血動’Ｖｎ＋ （例、ウサギ、ヒツジ、
ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ） １
．Ｐｋ８！ （例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ
、ウズラ）などが挙げられる。該縮合生成物を人以外の
＃ｉＡ ｒｆｉｔ動物に接種するノＴ法としては、動物
に１１ｆ ｒ４１−Ｊ−る手１１１合生成物ケよ抗体産
生ずるに有効なＲ）でよく、だとえｖ１ニウサギに１回
２ｒｑを等容量（１ｓｔ）の生ｌｉｐ食１！水およびフ
ロイントの完全アジュバントで乳化して、背部ならびに
後肢掌皮下ＶＣ４週問おきに５回接４・口すると４１″
１、体を産生さぜ（４Ｊる１→合が多い。
このようにして、温血動物中に形成され／こ抗体を拝＋
（ｙする方法としては、たとえばウサギでｔし、通常最
終１ヂξ種後７日から１２［１の間に耳静脈から採血し
、ｊ’ｉｔ心分１心任１て血清として得られる。
（ｙする方法としては、たとえばウサギでｔし、通常最
終１ヂξ種後７日から１２［１の間に耳静脈から採血し
、ｊ’ｉｔ心分１心任１て血清として得られる。
１＋ ＣＧの’ｌ’？異４’ｊ’ｉ’、 ｆ＋の製造に
用いられる担体−ににＣ＋！、持された抗原に干？りる
担体としては、前記し７だ担体と同様のものが挙げらｉ
］る。
用いられる担体−ににＣ＋！、持された抗原に干？りる
担体としては、前記し７だ担体と同様のものが挙げらｉ
］る。
４１１体にｔｔｒ、原もし７〈は抗体を保持さぜるにｔ
、１：、公知の常套手段を応用し１１）るが、たとえば
゛代ｉｔ’ｌｌ ”、ヅ１′５８巻（Ｉｌ、 ９７ ］
イト）、第６９６頁にＨ己市ｙされ。
、１：、公知の常套手段を応用し１１）るが、たとえば
゛代ｉｔ’ｌｌ ”、ヅ１′５８巻（Ｉｌ、 ９７ ］
イト）、第６９６頁にＨ己市ｙされ。
ているプロＪ・シアンｌ、’ｅ 、 Ｇ ｉＩ、 Ａ法
などが挙げられる。まだ１．Ｌす１（ｊ“１易か方法と
１−で物Ｊｌｌ的に４１ｊ住表面に吸着さＷてもよい。
などが挙げられる。まだ１．Ｌす１（ｊ“１易か方法と
１−で物Ｊｌｌ的に４１ｊ住表面に吸着さＷてもよい。
前記一般式（ｖｑ ）で表わされるペプチドの「信イ・
例としてＯ」、だとえＩ（１： ｈ ＣＧ−βのＣ＊端
ペプチド（ＩＸ ） （］ ２３−１４５ ） ＣＨ−
Ａｌａ、−Ｐｒｏ−Ｐｒｃ−Ｐｒｏ−８ｐｒ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｉ、ｐｕ
−Ｐｒｏ−Ｇ］、ｙ−Ｐｒｏ −Ｓ ｅｔ−Ａｓｐ−’
Ｉ’ｈｒ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ
−０１１）が挙げられ、これはたとえば特開昭５６−１
３８２４８号公報に記載の方法により製造することがで
きる。
例としてＯ」、だとえＩ（１： ｈ ＣＧ−βのＣ＊端
ペプチド（ＩＸ ） （］ ２３−１４５ ） ＣＨ−
Ａｌａ、−Ｐｒｏ−Ｐｒｃ−Ｐｒｏ−８ｐｒ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｉ、ｐｕ
−Ｐｒｏ−Ｇ］、ｙ−Ｐｒｏ −Ｓ ｅｔ−Ａｓｐ−’
Ｉ’ｈｒ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ
−０１１）が挙げられ、これはたとえば特開昭５６−１
３８２４８号公報に記載の方法により製造することがで
きる。
木明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に門し略号で表示する場合、それらＶよＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｊ、５ｓｉｏｎ ｏｎ Ｂ
ｉｏ −１ｏｇｉｃａｉ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔ、ｕｒｅ
による略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を次に挙げる。また、アミノ酸
などに関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しな
ければ工４体を示すものとする。
基、その他に門し略号で表示する場合、それらＶよＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｊ、５ｓｉｏｎ ｏｎ Ｂ
ｉｏ −１ｏｇｉｃａｉ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔ、ｕｒｅ
による略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を次に挙げる。また、アミノ酸
などに関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しな
ければ工４体を示すものとする。
Ａｌａ ： アラニン
Ｐｒｏ ： プロリン
Ｓｅｒ ： セリン
Ｔ、、ｅｕ ： ロイシン
Ａｒｇ ： アルギニン
Ｇｕｙ ： グリシン
Ａｑｐ ： アスパラギン酸
Ｔｈｒ ： スレオニン
１１ｅ ： イソロイシン
Ｇｌｎ ： グルタミン
本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチド合成の
公知の常套手段で製造しうる。固イ’ｌ１合成法、Ｍ、
ｉ目合成法のいずれによってもよいが、液相合成法が有
利な場合が多い。そのようなペプチド合成の手段と（７
ては、たとえば” Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、；４
１Ｔ １巻（１９６６）、５ｃｂｒ’６ｄｅｒ ａｎｄ
Ｌｕｂｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｌｃ ｐｒｅｓｓ、 Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ−あるいは″ペプチ
ド合成“、泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）に記
載された方法、たとえばアジド法、クロライド法、酸無
水物法、混合無水物法、ＤｃＣ法、活性エステル法、ウ
ッドワード試？１８Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾ
ール法、酸化ｉ７元法、Ｄ ＣＣ／ ７デイテイプ（例
、ｌ０ＩＪ１３ 、 ＩＴＯＢｔ、 。
公知の常套手段で製造しうる。固イ’ｌ１合成法、Ｍ、
ｉ目合成法のいずれによってもよいが、液相合成法が有
利な場合が多い。そのようなペプチド合成の手段と（７
ては、たとえば” Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、；４
１Ｔ １巻（１９６６）、５ｃｂｒ’６ｄｅｒ ａｎｄ
Ｌｕｂｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｌｃ ｐｒｅｓｓ、 Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ−あるいは″ペプチ
ド合成“、泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）に記
載された方法、たとえばアジド法、クロライド法、酸無
水物法、混合無水物法、ＤｃＣ法、活性エステル法、ウ
ッドワード試？１８Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾ
ール法、酸化ｉ７元法、Ｄ ＣＣ／ ７デイテイプ（例
、ｌ０ＩＪ１３ 、 ＩＴＯＢｔ、 。
ＨＯＳ ｕ ）法などがあげられる。
このようにして得られたｈＣＧに特異的に反応する抗体
を担体上に保持するには、公知の常套手段を応用し得る
が、たとえば前記したパ代謝°′。
を担体上に保持するには、公知の常套手段を応用し得る
が、たとえば前記したパ代謝°′。
＠８巻（１９７１年）、椿６９６頁に記載されているゾ
ロムシアン法、ＧＬＡ法などが挙げられる。
ロムシアン法、ＧＬＡ法などが挙げられる。
また、より簡易な方法として物理的に担体表面に吸〃ｔ
させてもよい。
させてもよい。
本発明の測定法でいう抗原としてｔよ、測定対象となる
ｈＣＧをいう。
ｈＣＧをいう。
本発明で用いられる標識剤を結合させた抗体における抗
体は、ｈｃＧに非特異的に反応するものであって、前記
担体上に保持された抗体と互いに抗原決定部位を重複し
ないものが用いられる。
体は、ｈｃＧに非特異的に反応するものであって、前記
担体上に保持された抗体と互いに抗原決定部位を重複し
ないものが用いられる。
該ｈＣＧに非特異的に反応する抗体の例としては、たと
えば、人尿より公知の方法で精製したｈＣＧを、人以外
の温血動物に接種してｈＣＧに列する抗体を形成すしめ
、さらに塩析により得たγ−グロブリン画分を１．１
ＣＧ−βのＣ末端ペプチドを結合させた同相を充てんし
たカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに
４かけて素通り画分を得、さらに１１ＣＧを結合させた
固相を充てんしだカラムを用いるアフィニティークロマ
トグラフィーでれ１１製して得られたり、 Ｌ Ｈなど
類似の（イ９造を有する蛋白ホルモンとも交差反応を示
す抗体などが挙げられる。
えば、人尿より公知の方法で精製したｈＣＧを、人以外
の温血動物に接種してｈＣＧに列する抗体を形成すしめ
、さらに塩析により得たγ−グロブリン画分を１．１
ＣＧ−βのＣ末端ペプチドを結合させた同相を充てんし
たカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに
４かけて素通り画分を得、さらに１１ＣＧを結合させた
固相を充てんしだカラムを用いるアフィニティークロマ
トグラフィーでれ１１製して得られたり、 Ｌ Ｈなど
類似の（イ９造を有する蛋白ホルモンとも交差反応を示
す抗体などが挙げられる。
標識剤であるベットオキシダーゼとしては、種々の起源
のものを用いるととができるが、その例としてはたとえ
ば西洋わさび、パイナツプル、イチジク、旧ｊｌ！ｔ
＋ソラマメおよびトウモロコシなどから得られるペルオ
キシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出された
ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒ
ａｄｌｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）がＫｌましい。
のものを用いるととができるが、その例としてはたとえ
ば西洋わさび、パイナツプル、イチジク、旧ｊｌ！ｔ
＋ソラマメおよびトウモロコシなどから得られるペルオ
キシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出された
ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒ
ａｄｌｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）がＫｌましい。
ベルメキシダーゼと抗体とを結合させる化合物として、
一般式 〔式中、ｎおよびＲ＆よ前記と同意義を有する。〕で）
！（わされる化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わさ
れる２価の６員環状炭化水素残基としてη）１、飽和の
もの、不ｆｊｌ、和のもののいずれでもよい。ｆｉ；］
和の２価の６１［ｙＲ状１・ニジ化水素の例としでは、
たとえば１．２−．１．３−．１．４−シクロヘキシレ
ンが挙げられ、不ｈ’、ｊ和の２価の６ 、ｆｉ ＋３
ｉ状炭化水；ζ残ＪＩＳＯ例として日１、たとえば１．
２−．１．３−．１．４−フェニレンなどが挙げられる
。
一般式 〔式中、ｎおよびＲ＆よ前記と同意義を有する。〕で）
！（わされる化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わさ
れる２価の６員環状炭化水素残基としてη）１、飽和の
もの、不ｆｊｌ、和のもののいずれでもよい。ｆｉ；］
和の２価の６１［ｙＲ状１・ニジ化水素の例としでは、
たとえば１．２−．１．３−．１．４−シクロヘキシレ
ンが挙げられ、不ｈ’、ｊ和の２価の６ 、ｆｉ ＋３
ｉ状炭化水；ζ残ＪＩＳＯ例として日１、たとえば１．
２−．１．３−．１．４−フェニレンなどが挙げられる
。
該化合物ＣＩ）において、ｎとしては１７１＋：いし５
の整数が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価
の６銭環状炭化水素残基が好ましく、特に１，４−シク
ロヘキシレンが好ましい。
の整数が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価
の６銭環状炭化水素残基が好ましく、特に１，４−シク
ロヘキシレンが好ましい。
本発明の方法において用いられる化合物〔■〕ハ、りと
えばザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｔｈ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）第７９巻２３３頁（１９７６年）、Ｈ−ロピアン・
ジャーナル・メブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏ−ｐ
ｎａｎ 、Ｔｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｌｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭
５２−８５１６３号公報、特開昭５２−８５１６４号公
報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造す
ることができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。
えばザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｔｈ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）第７９巻２３３頁（１９７６年）、Ｈ−ロピアン・
ジャーナル・メブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏ−ｐ
ｎａｎ 、Ｔｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｌｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭
５２−８５１６３号公報、特開昭５２−８５１６４号公
報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造す
ることができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。
ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマ
レイミド化合物ＣＩ）と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示す。
レイミド化合物ＣＩ）と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示す。
〕で表わされるサクシンイミド化合物〔■〕とを脱水剤
あるいは脱酸剤の存在下で反応させることによシ製？復
することができる。上記一般式において、ハロゲン原子
としては塩素、臭素などが挙げられ、アルカリ金属原子
としてはたとえばナトリウム、カリウムなどが挙げられ
る。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫
酸。
あるいは脱酸剤の存在下で反応させることによシ製？復
することができる。上記一般式において、ハロゲン原子
としては塩素、臭素などが挙げられ、アルカリ金属原子
としてはたとえばナトリウム、カリウムなどが挙げられ
る。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫
酸。
シンクロへキシルカルボジイミドなどが、脱酸剤として
はたとえばピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられ
る。
はたとえばピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられ
る。
前記化合物ＣＴ［’）は、たとえば特開昭５２−８５１
６４号公報に記載の方法あるいはこれに阜じて製造する
ことができる。たとえば一般式％式％ 〔式中、１１およびＲは前記と同意義を有する。〕で表
わされる化合物（ＩＶ ）を脱水閉環せしめることによ
り得られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無
水ｒｉｌｉ酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）
を用い、温和に加熱することにより反応させることがで
きる。
６４号公報に記載の方法あるいはこれに阜じて製造する
ことができる。たとえば一般式％式％ 〔式中、１１およびＲは前記と同意義を有する。〕で表
わされる化合物（ＩＶ ）を脱水閉環せしめることによ
り得られる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無
水ｒｉｌｉ酸又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）
を用い、温和に加熱することにより反応させることがで
きる。
サラに別法として、ヘルベティカ・キミヵ・アクタ（Ｈ
ｅ１ｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ） 第
５８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法あ
るいｔよこれに準じて製造することができる。たとえば
、一般式 〔式中、Ｚはアルキ／Ｉ／基を示す〕で表わされるＮ−
アルコキシカルボニルマレイミド（Ｖ〕と、一般式 ％式％［） 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミ２７酸〔■〕とを反応させて、一般式 〔式中、ｎに−よびＲは前記と同意斡を有する。〕で表
わされるマレイミド化合物〔■１〕を得る。７次に一般
式〔■〕で表わされるサクシンイミド化合物［：■〕を
加え先に述ベプこと同様の脱水側もしくは脱酸剤の存在
下で反応させることによりルシ造することができる。
ｅ１ｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ） 第
５８巻（１９７５年）５３１頁に記載されている方法あ
るいｔよこれに準じて製造することができる。たとえば
、一般式 〔式中、Ｚはアルキ／Ｉ／基を示す〕で表わされるＮ−
アルコキシカルボニルマレイミド（Ｖ〕と、一般式 ％式％［） 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミ２７酸〔■〕とを反応させて、一般式 〔式中、ｎに−よびＲは前記と同意斡を有する。〕で表
わされるマレイミド化合物〔■１〕を得る。７次に一般
式〔■〕で表わされるサクシンイミド化合物［：■〕を
加え先に述ベプこと同様の脱水側もしくは脱酸剤の存在
下で反応させることによりルシ造することができる。
上記一般式〔ｖ〕で表わされる化合物において２で表わ
されるアルさルとしては、たとえＩＩ：ｌ’メチノド′
、エチルがりｊｔげられる、。
されるアルさルとしては、たとえＩＩ：ｌ’メチノド′
、エチルがりｊｔげられる、。
ペルオキシダーゼに化合物〔１〕を反応さぜるＩｐｌ
ｌ：ｔ、、両者をｐＨ約６ないし８のＰ両液中で約１０
ないし５０１〕の湿度で約１０分ないし２４時間反応さ
ぜることによって行なわれる。該緩衝液としては、たと
えばｐＨ７，０の帆ＩＭリン酸緩ｔ１’ｊｔイ疋、 、
ｐｌＴ （ｉ、 ３のｏ、ｒ＋ｓｉΔリン酸緩衝液など
が挙げられる１、 このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ
のＮ’ｌ’！ ｆｌｔＷは、たとえばゲルクロマトグラ
フィーなどにより行なうことができる。該ゲルクロマト
グラフィーを行なう１際に用いられる担併とし−ｃ ｒ
ｔｔ、 ？ｃ トＪ−ｉｔセファデックスＧ−２５（フ
ァルマシア・ファインケミカル社（スエーデン＞製〕。
ｌ：ｔ、、両者をｐＨ約６ないし８のＰ両液中で約１０
ないし５０１〕の湿度で約１０分ないし２４時間反応さ
ぜることによって行なわれる。該緩衝液としては、たと
えばｐＨ７，０の帆ＩＭリン酸緩ｔ１’ｊｔイ疋、 、
ｐｌＴ （ｉ、 ３のｏ、ｒ＋ｓｉΔリン酸緩衝液など
が挙げられる１、 このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ
のＮ’ｌ’！ ｆｌｔＷは、たとえばゲルクロマトグラ
フィーなどにより行なうことができる。該ゲルクロマト
グラフィーを行なう１際に用いられる担併とし−ｃ ｒ
ｔｔ、 ？ｃ トＪ−ｉｔセファデックスＧ−２５（フ
ァルマシア・ファインケミカル社（スエーデン＞製〕。
バイオゲルＰ−２（１：バイオ・ラッド・ラボラトリー
ズ社（米国）製〕などが挙げられる。
ズ社（米国）製〕などが挙げられる。
マレイミド化ペルオキシダーゼを抗ｈＣＧ抗体と反応さ
せる場合、抗ｈＣＧ抗体Ｉ４Ｇあるいはペプシン分解し
て得られたＦ（ａビ）２両分を、メルカプトエチルアミ
ン）：ｊｌの存在下でＪ′供元し、ゲルクロマトグラフ
ィーによって精製された抗ｈＣＧ抗体Ｉ ｇ Ｇ モｌ
−，＜＆：ｔ、Ｆａｂ’とマレイミド化ペルオキシダー
ゼとを反応させる。
せる場合、抗ｈＣＧ抗体Ｉ４Ｇあるいはペプシン分解し
て得られたＦ（ａビ）２両分を、メルカプトエチルアミ
ン）：ｊｌの存在下でＪ′供元し、ゲルクロマトグラフ
ィーによって精製された抗ｈＣＧ抗体Ｉ ｇ Ｇ モｌ
−，＜＆：ｔ、Ｆａｂ’とマレイミド化ペルオキシダー
ゼとを反応させる。
該反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし４０しの湿度
で、約１ないし４８時間反応させることにより行なうこ
とができる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ６，（ｌ
の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０
．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。
で、約１ないし４８時間反応させることにより行なうこ
とができる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ６，（ｌ
の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０
．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。
このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体は、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどによシ精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲ／１／ＡＣＡ ４４Ｃ
Ｌ Ｋ Ｂ社（スエーデｙ）ｔＭ）、セファクリルＳ−
２００（ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）製〕などが埜けられる。
たとえばゲルクロマトグラフィーなどによシ精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲ／１／ＡＣＡ ４４Ｃ
Ｌ Ｋ Ｂ社（スエーデｙ）ｔＭ）、セファクリルＳ−
２００（ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）製〕などが埜けられる。
本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。
まず、■二担体に保持された抗体に、４１ｊ１定すべき
ｈＣＧ含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った
後これに前記で得られたペルオキシダーゼと抗ｈＣＧ抗
体■ｇＧもしくはＦ’ａｂ’との結合物を加えて反応さ
せる。
ｈＣＧ含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った
後これに前記で得られたペルオキシダーゼと抗ｈＣＧ抗
体■ｇＧもしくはＦ’ａｂ’との結合物を加えて反応さ
せる。
本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるｈＣＧ
を含む被検試料としては、尿、血清、血漿、旬液あるい
Ｖ、１：各抽臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿、
、＋ｎｔ清および血漿が繁用される。
を含む被検試料としては、尿、血清、血漿、旬液あるい
Ｖ、１：各抽臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿、
、＋ｎｔ清および血漿が繁用される。
■： ■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基
質を加え、生じた物質の吸光度もしくは螢光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。。
質を加え、生じた物質の吸光度もしくは螢光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。。
■二 上記■−■の操作を既知量のｈＣＧの標準簿液に
列し予め行ない、ｈＣＧと吸光度もしくは螢光強度との
関係を標準曲線として作成しておく。
列し予め行ない、ｈＣＧと吸光度もしくは螢光強度との
関係を標準曲線として作成しておく。
■： 未知ｆｉｔのｈＣＧを含む分析対象物について得
られた吸光度もしくは螢光強度を標準曲線にあてはめ、
分析対象物中のｈＣＧ含量をｆｉ％ｌ定する。
られた吸光度もしくは螢光強度を標準曲線にあてはめ、
分析対象物中のｈＣＧ含量をｆｉ％ｌ定する。
本発明のサンドインチ法によるｈｃＧの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとしては、主として、 （１）担体上に保持された抗体。
法に用いられる定量用キットとしては、主として、 （１）担体上に保持された抗体。
（２）本発明方法によ勺得られたペルオキシダーゼで標
識化された抗体フラグメン） （Ｆａｂ’）。
識化された抗体フラグメン） （Ｆａｂ’）。
（３）標準ｈＣＧ。
（４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛崩潰アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシンａ＋ ｐａｒ 液が
挙げられる。）。
に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた約
１０％ヒツジ血清および約１％牛崩潰アルブミン（以下
、ＢＳＡと略称することもある。）を含むｐＨ約６ない
し９のリン酸緩衝液またはグリシンａ＋ ｐａｒ 液が
挙げられる。）。
（５）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その−
例どして螢光法の場合、酵素基質としてｐ−・ハイドロ
キシフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩ｉ町面）および酵素反応
停止液が挙げられる。
例どして螢光法の場合、酵素基質としてｐ−・ハイドロ
キシフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩ｉ町面）および酵素反応
停止液が挙げられる。
上記のキットは例えば下記の方法により使用することが
できる。
できる。
標準ｂ ＣＧもしくは被検液約１０ないし２００Ｉ１７
１に紙糸１≦（４）を加えて希釈し、一定職の試薬（１
）を加えて約０ないし４０℃で約１ないし４８時間反応
させる。担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし７３
００μｋを加えたのち、約Ｏないし４０ ｔＥで反応さ
せる。約１ないし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上
に結合しているペルオキシダーゼ活性を測定する。即ち
ペルオキシダーゼの糸質Ｍ約１０〜１０００１を加えて
約２０〜４０℃で約（）、２〜２４時間反応させたのち
、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは螢光
強度を測定する。
１に紙糸１≦（４）を加えて希釈し、一定職の試薬（１
）を加えて約０ないし４０℃で約１ないし４８時間反応
させる。担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし７３
００μｋを加えたのち、約Ｏないし４０ ｔＥで反応さ
せる。約１ないし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上
に結合しているペルオキシダーゼ活性を測定する。即ち
ペルオキシダーゼの糸質Ｍ約１０〜１０００１を加えて
約２０〜４０℃で約（）、２〜２４時間反応させたのち
、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは螢光
強度を測定する。
本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の臨
床検査室において簡単な操作でｈＣＧの痛感度測定が可
能となる。
床検査室において簡単な操作でｈＣＧの痛感度測定が可
能となる。
本発明の試→１ｊ≦を用いると、他の類似したホルモン
（たとえばｈ Ｌ １１ 二黄体形成ホルモン）からの
妨害を受けることなく瞳めて高感度かつ正確にｈＣＧを
測定できるので、絨毛性ＩＷ￥瘍やその他のｈＣＧ産生
腫瘍などの診断、予後管理などにも極めて有用な手段を
提供するものである。
（たとえばｈ Ｌ １１ 二黄体形成ホルモン）からの
妨害を受けることなく瞳めて高感度かつ正確にｈＣＧを
測定できるので、絨毛性ＩＷ￥瘍やその他のｈＣＧ産生
腫瘍などの診断、予後管理などにも極めて有用な手段を
提供するものである。
以下に、参考例νよび実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。
具体的に説明する。
参考例／
抗体の製造
人尿よシ公知の方法で糖製した約１４１，０ＯＯＩＵ７
膚ｇのｈ ＣＧ １πｇを牛］Ｊ１１食塩水ｌＮｔに溶
ｆＩｎシ、これにフロイントの完全アジュバント（Ｆ’
ｒｅｕｎイ８ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａ、ｄｊｕｖａ、ｎｔ
、、 ”免疫の生化学“′、橘ら著、共立出版株式会社
（１９６７年） ’ｌ］ ｉ ｍｔを加えてよく混和し
乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内および背部
皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週毎に５回行な
い最終免疫後１週間で採血しパイロットアッセイを実施
しだ。その結果、ｈＣＧ−βのＣ末☆１ｉｉｌペプチド
〔ＩＸ〕にも親和性をもつ抗血清Ｎ３０５Ｂを得た。
膚ｇのｈ ＣＧ １πｇを牛］Ｊ１１食塩水ｌＮｔに溶
ｆＩｎシ、これにフロイントの完全アジュバント（Ｆ’
ｒｅｕｎイ８ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａ、ｄｊｕｖａ、ｎｔ
、、 ”免疫の生化学“′、橘ら著、共立出版株式会社
（１９６７年） ’ｌ］ ｉ ｍｔを加えてよく混和し
乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内および背部
皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週毎に５回行な
い最終免疫後１週間で採血しパイロットアッセイを実施
しだ。その結果、ｈＣＧ−βのＣ末☆１ｉｉｌペプチド
〔ＩＸ〕にも親和性をもつ抗血清Ｎ３０５Ｂを得た。
参考例λ
特異抗ｈＣＧ抗体のＵ；ジ造
ｈＣＧ−ρのＣ末端ペプチド（ＩＸ ） ５ Ｍｅを０
．５Ｍ ＮａＣ１を含む帆ＩＭ ＮａＨＣＯ３８ｗｔに
溶解し、予めＮ／ｉ、０ＯＯＨＣＩで洗浄したブロムシ
アン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・ファイン
・ケミカルズ社ｑｉｊｊ ） ｌ ｑに加え、５℃で一
夜１５討゛Ｖした。反応終了後同じ０．５ＭＮａＣ１を
含む０．ＩＭＮａ、ｆｌＣＯ３で十分に洗浄し、次いで
）ＩＣＩでｐＨ８にｆ１１１’ｌｌ生′斗した０、５Ｍ
エクノーノ１／アミン１０＋／をン后加して室温で１
時間反応させた後、（１） ｉ ＭＮＡ、Ｃ１を含む０
．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０） 、 （２）Ｉ ＭＮ
ａＣｌを含む（，１，１−Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ３，０
）および（３）０゜１．５ＭＮ几０１を含む０．０２Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐｌＴ ８．０） で順次洗浄しカラ
ムに充）１（シだ。
．５Ｍ ＮａＣ１を含む帆ＩＭ ＮａＨＣＯ３８ｗｔに
溶解し、予めＮ／ｉ、０ＯＯＨＣＩで洗浄したブロムシ
アン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・ファイン
・ケミカルズ社ｑｉｊｊ ） ｌ ｑに加え、５℃で一
夜１５討゛Ｖした。反応終了後同じ０．５ＭＮａＣ１を
含む０．ＩＭＮａ、ｆｌＣＯ３で十分に洗浄し、次いで
）ＩＣＩでｐＨ８にｆ１１１’ｌｌ生′斗した０、５Ｍ
エクノーノ１／アミン１０＋／をン后加して室温で１
時間反応させた後、（１） ｉ ＭＮＡ、Ｃ１を含む０
．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０） 、 （２）Ｉ ＭＮ
ａＣｌを含む（，１，１−Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ３，０
）および（３）０゜１．５ＭＮ几０１を含む０．０２Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐｌＴ ８．０） で順次洗浄しカラ
ムに充）１（シだ。
参考例／で得られた抗血清Ｎ ３０５ Ｂ ８ ｖｌｌ
を１゜５ｇの無水硫酸ナトリウムを用いて塩析洗眼させ
、得られだｒ−グロブリン画分を上記のペプチド〔ＩＸ
）結合セファロース４Ｂカラム（０，９ｘ４ｃｍ）にイ
ー１しだ。
を１゜５ｇの無水硫酸ナトリウムを用いて塩析洗眼させ
、得られだｒ−グロブリン画分を上記のペプチド〔ＩＸ
）結合セファロース４Ｂカラム（０，９ｘ４ｃｍ）にイ
ー１しだ。
０、１５Ｍ ＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（
ｐ）（８，０） でカラムを洗浄し、ｈＬＨ（黄体形
成ホルモン）、ｈＦ’ｓＨ（卵胞刺激ホルモン）および
ｈ Ｔ Ｓ Ｈ（甲状腺刺激ホルモン）と交差反応する
抗ｂＣＧ抗体を除去した。次いで０．１７Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）で溶出することによってｈＣ
Ｇ−βのＣ末端ペプチド（ＴＸ）と強い親和性をもつ特
異抗体Ｎ３０５ＢＳを得だ（蛋白量１．２ｆｆｙ）。
ｐ）（８，０） でカラムを洗浄し、ｈＬＨ（黄体形
成ホルモン）、ｈＦ’ｓＨ（卵胞刺激ホルモン）および
ｈ Ｔ Ｓ Ｈ（甲状腺刺激ホルモン）と交差反応する
抗ｂＣＧ抗体を除去した。次いで０．１７Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）で溶出することによってｈＣ
Ｇ−βのＣ末端ペプチド（ＴＸ）と強い親和性をもつ特
異抗体Ｎ３０５ＢＳを得だ（蛋白量１．２ｆｆｙ）。
参考例３
抗ｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（ＴＸ’）抗体の製１ｉ
ｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（ＩＸ ：） ２５ Ｍｆ
および牛チログロブリン（ＢＴＧと略称する）５（１＆
を０．２Ｍリン酸緩術両液ｐＨ７，３）４肩ｔに溶解し
、５％ＧＬＡ水溶液４１１を加えて室温で３時間１１テ
？ｌ’後、４℃で透析（水２ ｐ Ｘ ４ ） ＬＳＩ
Ｉ結乾燥して免疫原を得た。このｈｃＧ−βのＣ末端ペ
プチド〔■〕−ＢＴＧ縮合物１．５ツを半押食塩水０゜
７５ ｔｅｌに溶解し、これにフロイントの完全アジュ
バント（Ｆｒｅ＋、＋ｎ＃ ３ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａ
ｄｊｕｖａｎｔ、 ） ０．７５ａｔを加えて」：〈混
和し、乳剤を作り、これをウーリーギの向火１（，１部
筋肉内および背部皮下数ケ所に注ル１しだ。Ｉ；Ｊ、ｊ
二の操作を４Ｊ周おきＶＣ４回行ない最終免役後ｌｉｔ
・：３間で１゛１−而１２、遠心分１：リトして抗ｍ１
清を採取し抗ｈＣＧ−βｔｙ）ｃ末＋に１Ａｉ ヘ−ｆ
チ）−（ＴＸ ） ニ対する；Ｉ７Ｉ：ＪｒｌｌＪ＋ｌ
ｆ Ｎ ３１３ Ｂを得た。
および牛チログロブリン（ＢＴＧと略称する）５（１＆
を０．２Ｍリン酸緩術両液ｐＨ７，３）４肩ｔに溶解し
、５％ＧＬＡ水溶液４１１を加えて室温で３時間１１テ
？ｌ’後、４℃で透析（水２ ｐ Ｘ ４ ） ＬＳＩ
Ｉ結乾燥して免疫原を得た。このｈｃＧ−βのＣ末端ペ
プチド〔■〕−ＢＴＧ縮合物１．５ツを半押食塩水０゜
７５ ｔｅｌに溶解し、これにフロイントの完全アジュ
バント（Ｆｒｅ＋、＋ｎ＃ ３ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａ
ｄｊｕｖａｎｔ、 ） ０．７５ａｔを加えて」：〈混
和し、乳剤を作り、これをウーリーギの向火１（，１部
筋肉内および背部皮下数ケ所に注ル１しだ。Ｉ；Ｊ、ｊ
二の操作を４Ｊ周おきＶＣ４回行ない最終免役後ｌｉｔ
・：３間で１゛１−而１２、遠心分１：リトして抗ｍ１
清を採取し抗ｈＣＧ−βｔｙ）ｃ末＋に１Ａｉ ヘ−ｆ
チ）−（ＴＸ ） ニ対する；Ｉ７Ｉ：ＪｒｌｌＪ＋ｌ
ｆ Ｎ ３１３ Ｂを得た。
次いでＩ’ｒ、 ＋ｆｉｔ ｉｉ’すＮ３１３１３を常
法により硫酸アンモニウムで塩析させて得たγ−グロブ
リン画分を２〃゛９のｈＣＧを結合させたセファロース
４Ｂカラム（１ｒ（径０．９（・ｍ、長さ４ｃｍ）に付
した。
法により硫酸アンモニウムで塩析させて得たγ−グロブ
リン画分を２〃゛９のｈＣＧを結合させたセファロース
４Ｂカラム（１ｒ（径０．９（・ｍ、長さ４ｃｍ）に付
した。
０、１５Ｍ ＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩向液（
ｐｎｓ、ｏ）でカラムをｌ；シ浄し、次いで０．１７Ｍ
グリシン−１１，ｘ酸μ両液（ｐｒ＋２．３）で溶出す
ることによって、ｈ （／ ＧにＹ［（、和性の高い特
異抗体Ｎ３１３ＢＳを調ＳＩＩすした。
ｐｎｓ、ｏ）でカラムをｌ；シ浄し、次いで０．１７Ｍ
グリシン−１１，ｘ酸μ両液（ｐｒ＋２．３）で溶出す
ることによって、ｈ （／ ＧにＹ［（、和性の高い特
異抗体Ｎ３１３ＢＳを調ＳＩＩすした。
参考例り
非１１．．ｉ醪へ抗ｈ ＣＧ抗体の製造宍考例／で得ら
れた抗血清Ｎ ３ Ｑ ５ Ｂについて硫酸アンモニウ
ム塩析し、５ｍｙのｈ ＣＧ−βのＣ末ｒ＜７１ｉペプ
チド〔■Ｘ〕を結合させたセファロース４Ｂカヲム（直
↑予０．９Ｃｍｌ廼さ４ｃｍ）のアフイニディークロマ
トグヲフイーで素通りする抗体画分を調製した。次いで
この抗体画分を２■のｈＣＧヲ結合させたセファロース
４Ｂカラム（ｉＮ 径０．９（・ｍ、長さ４ｃｍ）に付
した。、０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ８，０）でカラムを洗浄し、次いで５ Ｍ
Ｍｇｃ：ｔ２ で溶出することによってｈＣＧに親和性
の高い非特異抗体Ｎ３０５ＢＧを調製した。
れた抗血清Ｎ ３ Ｑ ５ Ｂについて硫酸アンモニウ
ム塩析し、５ｍｙのｈ ＣＧ−βのＣ末ｒ＜７１ｉペプ
チド〔■Ｘ〕を結合させたセファロース４Ｂカヲム（直
↑予０．９Ｃｍｌ廼さ４ｃｍ）のアフイニディークロマ
トグヲフイーで素通りする抗体画分を調製した。次いで
この抗体画分を２■のｈＣＧヲ結合させたセファロース
４Ｂカラム（ｉＮ 径０．９（・ｍ、長さ４ｃｍ）に付
した。、０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ８，０）でカラムを洗浄し、次いで５ Ｍ
Ｍｇｃ：ｔ２ で溶出することによってｈＣＧに親和性
の高い非特異抗体Ｎ３０５ＢＧを調製した。
実施例／
（１）マレイミド基の導入
６１”ｆの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガー
マンハイム社（西ドイツ）１す！〕をＩＭｔの０．１Ｍ
リン酸ｓ ＊ｒ を夜（ｐＨ７，０）にｒ’ｃ＋ Ｍし
、５０１’（１のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとか
した結合試目１； Ｍ Ｍ Ｃ（一般式〔■〕において
、ｎ−１，Ｒ＝シク■」へ・Ｘシレンである化合物）４
．８ｆｆｙを加えて３（ｌで６０分間ｖｄ拌しながら反
応させた。
マンハイム社（西ドイツ）１す！〕をＩＭｔの０．１Ｍ
リン酸ｓ ＊ｒ を夜（ｐＨ７，０）にｒ’ｃ＋ Ｍし
、５０１’（１のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとか
した結合試目１； Ｍ Ｍ Ｃ（一般式〔■〕において
、ｎ−１，Ｒ＝シク■」へ・Ｘシレンである化合物）４
．８ｆｆｙを加えて３（ｌで６０分間ｖｄ拌しながら反
応させた。
生成した沈ｌ殴を遠心分離して除去し、上清をセファデ
ックスＧ−２５０カラム（１，０×４５ｒ圃）にｊＱ
Ｌ、０．１．Ｍ！］ン酸緩術７ｔｅで溶出さ止だ。タン
パクを含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて２ＪＩ
＆宿した。このようにしてｉｉ＋、＋１１製した７１ノ
イミｌ゛化ペルオキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ
１分子を）たり導入されたマレイミド基の数は１．０〜
１．２個であった（ペルオキシダーゼの分子紙を４０．
０００．蛸霜ｏｒ１ｍ ＝ ２２．７５として計算）。
ックスＧ−２５０カラム（１，０×４５ｒ圃）にｊＱ
Ｌ、０．１．Ｍ！］ン酸緩術７ｔｅで溶出さ止だ。タン
パクを含む両分を分取し、コロジオン膜を用いて２ＪＩ
＆宿した。このようにしてｉｉ＋、＋１１製した７１ノ
イミｌ゛化ペルオキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ
１分子を）たり導入されたマレイミド基の数は１．０〜
１．２個であった（ペルオキシダーゼの分子紙を４０．
０００．蛸霜ｏｒ１ｍ ＝ ２２．７５として計算）。
（２）マレイミド化ペルオキシダーゼと抗ｂ ＣＧ 抗
体（Ｆ’ａｂ’ フラグメント）との複合体の’Ｊ’
！ ’ｌＮｔ２ｇ考例クチ得られり抗体Ｎ ３０５ ■
３ Ｇ ５ ｒｌｆに０゜１りのペプシンを加え３０′
Ｃで一夜反応後、セファデックスＧ−１５０カラム（直
ｆ＋、２ 、５ｃｍ 、 μさ５５ｃ＋ｎ）で粘イ（（
支）した。得られたト九体Ｆ’（ａ、ｂ’）２画分を２
−メルカプトエチノνアミンで還元１．、セファデック
スＧ−２５０カラムによるゲルクロマトグラフィーで粘
イ（・すしてウザギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’フラグメン
ト）を得た。
体（Ｆ’ａｂ’ フラグメント）との複合体の’Ｊ’
！ ’ｌＮｔ２ｇ考例クチ得られり抗体Ｎ ３０５ ■
３ Ｇ ５ ｒｌｆに０゜１りのペプシンを加え３０′
Ｃで一夜反応後、セファデックスＧ−１５０カラム（直
ｆ＋、２ 、５ｃｍ 、 μさ５５ｃ＋ｎ）で粘イ（（
支）した。得られたト九体Ｆ’（ａ、ｂ’）２画分を２
−メルカプトエチノνアミンで還元１．、セファデック
スＧ−２５０カラムによるゲルクロマトグラフィーで粘
イ（・すしてウザギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’フラグメン
ト）を得た。
上＾１屓１）でｒｔ！−Ｊ 製したマレイミド化ペルオ
キシダーゼ１．５八′ｑを０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐａ
ｒ ６． （１）０．１５＊ｌに溶解し、先に得た抗ｈ
ｃＧ抗体（ｒａｂ’フヲグメント）１．８ｆｆｆをとか
した５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ０．１５＊ｌを
加えて４ｔＥで２０時間反応させた。反応後、ウルトロ
ゲｌ Ａ ｃ Ａ４４を充てんしたカラム（１，５ｘ４
５ｃｍ）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（６，５）で溶出させた。溶出
液の２８０の吸光度ならびに酵素活性を測定した。ペル
オキシダーゼとウザギ抗ｈＣＧ抗体（ｐａｂ’フラグメ
ント）との用合体が生成していることを、以下の方法で
確認した。
キシダーゼ１．５八′ｑを０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐａ
ｒ ６． （１）０．１５＊ｌに溶解し、先に得た抗ｈ
ｃＧ抗体（ｒａｂ’フヲグメント）１．８ｆｆｆをとか
した５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ０．１５＊ｌを
加えて４ｔＥで２０時間反応させた。反応後、ウルトロ
ゲｌ Ａ ｃ Ａ４４を充てんしたカラム（１，５ｘ４
５ｃｍ）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（６，５）で溶出させた。溶出
液の２８０の吸光度ならびに酵素活性を測定した。ペル
オキシダーゼとウザギ抗ｈＣＧ抗体（ｐａｂ’フラグメ
ント）との用合体が生成していることを、以下の方法で
確認した。
まず、Ｉ′ｉ１′素活性の測定はギルバルトらの方法〔
アナリテイカル・り゛ミスドリー（Ａｎａ］ｙｔｉｃａ
ｌＣｈｃ＋ｍ１ｓｔｒｙ ） 、第４０巻（１９ｆｉ８
年）、 １．２５６頁〕で行なった。即ち、溶出ｒｔｔ
の各フラクションを０．１％ウシ血清アルブミンを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で１８００倍に希
釈した。この１０ ｐ、ｅ に０．１％ウシ血清アルブ
ミンを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ［（５
，０）’Ａ’−ＩＦ−１’ｉγしたＱ、５！’、５ｐ−
ハイドロキシフェニル酸ｌ’！’、： ０ 、２５ｍｌ
を加えて混合し３０１〕で５分間インキュベートした。
アナリテイカル・り゛ミスドリー（Ａｎａ］ｙｔｉｃａ
ｌＣｈｃ＋ｍ１ｓｔｒｙ ） 、第４０巻（１９ｆｉ８
年）、 １．２５６頁〕で行なった。即ち、溶出ｒｔｔ
の各フラクションを０．１％ウシ血清アルブミンを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で１８００倍に希
釈した。この１０ ｐ、ｅ に０．１％ウシ血清アルブ
ミンを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ［（５
，０）’Ａ’−ＩＦ−１’ｉγしたＱ、５！’、５ｐ−
ハイドロキシフェニル酸ｌ’！’、： ０ 、２５ｍｌ
を加えて混合し３０１〕で５分間インキュベートした。
次に帆０１％過酸化水素０．０５ｎ／を加えで３０Ｃで
２０分反応させた。０．１Ｍグリシン緩（町液（ｐＨＩ
Ｏ，３）２．５がｔを加えて酵素Ｊ女一応を停止トさＶ
、 １． ／ＩＱ／ｎｉのキニンの螢光強度を１００と
し励Ａ’４ ）Ｙ、３２０ｎｍにおける４ ０５ ｎｍ
の螢光ｌ１ｊＧ度を測定しメζ。結果を第１図に示す。
２０分反応させた。０．１Ｍグリシン緩（町液（ｐＨＩ
Ｏ，３）２．５がｔを加えて酵素Ｊ女一応を停止トさＶ
、 １． ／ＩＱ／ｎｉのキニンの螢光強度を１００と
し励Ａ’４ ）Ｙ、３２０ｎｍにおける４ ０５ ｎｍ
の螢光ｌ１ｊＧ度を測定しメζ。結果を第１図に示す。
第１図において、−〇−は２８０ｎｍにおける吸光度ｆ
、１−Ｑ］、ペルオキシダーゼ活性（螢光強パ〔として
）をそれぞれ示す。フラクション３８イ」近においてペ
ルオキシダーゼと（九ｈ Ｃ（？ 抗体（Ｆ’ＦＬｔ／
フラグメント）との複合体の生成が極めて良好であると
とが分かつプこ。
、１−Ｑ］、ペルオキシダーゼ活性（螢光強パ〔として
）をそれぞれ示す。フラクション３８イ」近においてペ
ルオキシダーゼと（九ｈ Ｃ（？ 抗体（Ｆ’ＦＬｔ／
フラグメント）との複合体の生成が極めて良好であると
とが分かつプこ。
（３）抗体結合同和の調製
ポリスチレン珪（直径４ 、８ ｍｍ 、 Ｐｒｅｃｉ
ｓｉｏｎＰＩＦＵｓｔｉｃｓ Ｂｑ、１１ Ｃｏ、
、 Ｃｈｉｃａｇｏ 、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ、
） １ ５ ０ ０個に、参考［？ｌＩ 、２あ
るいは３．に記載の特異抗ｈ ＣＧ抗体Ｎ ３０５ Ｂ
ＳあるいはＮ３１３ＢＳの１５ＩＩｇ／ＴＷ！ ０
．ＯＩＭＮａＣｌ−０，ＯＩＭリン酸緩衝ｒｌＺ（ｐＨ
８，０） １００ｍｌを加え５１Ｓで−イタインキュ
ベートし７た。０．１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸
緩衝（（５＜ ｐＨ７，０）で洗浄したのち、用時まで
冷所保存した。
ｓｉｏｎＰＩＦＵｓｔｉｃｓ Ｂｑ、１１ Ｃｏ、
、 Ｃｈｉｃａｇｏ 、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ、
） １ ５ ０ ０個に、参考［？ｌＩ 、２あ
るいは３．に記載の特異抗ｈ ＣＧ抗体Ｎ ３０５ Ｂ
ＳあるいはＮ３１３ＢＳの１５ＩＩｇ／ＴＷ！ ０
．ＯＩＭＮａＣｌ−０，ＯＩＭリン酸緩衝ｒｌＺ（ｐＨ
８，０） １００ｍｌを加え５１Ｓで−イタインキュ
ベートし７た。０．１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸
緩衝（（５＜ ｐＨ７，０）で洗浄したのち、用時まで
冷所保存した。
（４）ＥＩＡ
ＥＩＡ用の試す（５とし７て以下のものを用いた。
（ｉ）実）血例／（２）で得られたペルオキシダーゼと
つ田ギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆ’ａｂ’ フラグメント）と
の１．１１合体 （め 実施例／（３）で得られた抗ｈＣＧ抗体片）り作
ボリスヂレン球 （３１１＋’Ｗ 準ｈ ＣＧ 、 ）梵’ｊ ンイ
７ｃ）Ｉ Ｌ Ｈ（４）緩衝液Ｂｉ １．０％正常ヒ
ツジ血ｉ’ｉＪｆ ＋ １％ウシ血ｉ？ｆｆアルブミン
、０．１ ’ｉ’ｌ； ＮａＮ ３ ．０−１５ ＭＮ
Ａ、Ｃ］を含むｐ［Ｔ ７．３の帆Ｑ２Ｍリン酸緩衝液
■ ペルオキシダーゼ活性測定に・２］４要な試薬０゜
０２％過酸化水素と帆１５％０−フエニレンジアミンヲ
含むｐＨ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウ
ム緩衝液および反応停止液（ＩＮ−塩酸） １則 定 緩？＋６ｒどｉＷＲ２００ｐＨ中でｈＣＧもしくはｈＬ
Ｉ−１とウサギＪ７’Ｆ、 ｂ ｃ ｔ； １％作ポリ
スチレン球とを室ン晶で１０間反応させた。ポリスチレ
ンはを洗浄後、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ＭＵＧ抗体
（Ｆａｂ’ フラグメント）複合体３００ ｐ１８
を加えて４℃で１目間反応させたのら、ポリスチレン球
を洗ｌ￥１し、これに０．０２％ｉ１％酸化水素と０．
１５％０−フェニレンジアミンを含む０．】λ４クエン
酸−リン酸二ナトリウｌ−緩怠１フイタ（ｐＨ，４，＞
＜ ） ５００１’ｌを加えて９２品で４０分間放ｔ１
イし、ＩＮ塩酸２ｔｔｔｆを添加して反応を１′：ｒ止
さぜ、４９２ ｎｍにおける吸光度を１１・、’：’）
ｊＹ、 １．／イー１１ン）１（曲線７針了Ｌ＋た。そ
れぞれの（゛貰ンｑ〜曲糸′処を４合２図に示し／ζ。
つ田ギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆ’ａｂ’ フラグメント）と
の１．１１合体 （め 実施例／（３）で得られた抗ｈＣＧ抗体片）り作
ボリスヂレン球 （３１１＋’Ｗ 準ｈ ＣＧ 、 ）梵’ｊ ンイ
７ｃ）Ｉ Ｌ Ｈ（４）緩衝液Ｂｉ １．０％正常ヒ
ツジ血ｉ’ｉＪｆ ＋ １％ウシ血ｉ？ｆｆアルブミン
、０．１ ’ｉ’ｌ； ＮａＮ ３ ．０−１５ ＭＮ
Ａ、Ｃ］を含むｐ［Ｔ ７．３の帆Ｑ２Ｍリン酸緩衝液
■ ペルオキシダーゼ活性測定に・２］４要な試薬０゜
０２％過酸化水素と帆１５％０−フエニレンジアミンヲ
含むｐＨ４，８の０．１Ｍクエン酸−リン酸二ナトリウ
ム緩衝液および反応停止液（ＩＮ−塩酸） １則 定 緩？＋６ｒどｉＷＲ２００ｐＨ中でｈＣＧもしくはｈＬ
Ｉ−１とウサギＪ７’Ｆ、 ｂ ｃ ｔ； １％作ポリ
スチレン球とを室ン晶で１０間反応させた。ポリスチレ
ンはを洗浄後、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ＭＵＧ抗体
（Ｆａｂ’ フラグメント）複合体３００ ｐ１８
を加えて４℃で１目間反応させたのら、ポリスチレン球
を洗ｌ￥１し、これに０．０２％ｉ１％酸化水素と０．
１５％０−フェニレンジアミンを含む０．】λ４クエン
酸−リン酸二ナトリウｌ−緩怠１フイタ（ｐＨ，４，＞
＜ ） ５００１’ｌを加えて９２品で４０分間放ｔ１
イし、ＩＮ塩酸２ｔｔｔｆを添加して反応を１′：ｒ止
さぜ、４９２ ｎｍにおける吸光度を１１・、’：’）
ｊＹ、 １．／イー１１ン）１（曲線７針了Ｌ＋た。そ
れぞれの（゛貰ンｑ〜曲糸′処を４合２図に示し／ζ。
第２図中、＋ はＮ ３０５ Ｂ Ｓ記ｉ合ボリヌチレ
ン球でのｈ ＣＧの標準曲線を、−〇−＆Ｊ、Ｎ５Ｑ５
ＢＳ結合ボリスチｌ／ン球での）１Ｌ ”ｒｌ （ＤＪ
ｌ１５？”Ｑ’、曲線を、＋ｐｐＨ：３１．３ Ｂ Ｓ
結ａホリヌチレン球でのｈＣＧの、÷ はＮ ３１３
＋’ＩＳ結合ポリスチレン球でのｈ Ｔ、 Ｈの４：
酊（Ｌ！−曲線をそれぞれ示す。
ン球でのｈ ＣＧの標準曲線を、−〇−＆Ｊ、Ｎ５Ｑ５
ＢＳ結合ボリスチｌ／ン球での）１Ｌ ”ｒｌ （ＤＪ
ｌ１５？”Ｑ’、曲線を、＋ｐｐＨ：３１．３ Ｂ Ｓ
結ａホリヌチレン球でのｈＣＧの、÷ はＮ ３１３
＋’ＩＳ結合ポリスチレン球でのｈ Ｔ、 Ｈの４：
酊（Ｌ！−曲線をそれぞれ示す。
このように、本発明の測定方法はｈＣＧに特異的かつ高
感度であり、ｈＬｆ（とけ交差反応を示さなかった。
感度であり、ｈＬｆ（とけ交差反応を示さなかった。
実施例λ 短時間法
標準ｈＣＧ、実施例Ｘ（２）で得られたペルオキシダー
ゼ−抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’ フラグメント）複合体
、および実施例／（３）で得られだ抗ｈＣＧ抗体Ｎ３０
５ＢＳ結合ポリスチレン球１個を２５％正常ヒツジ血清
、１％ウシ血清アルグミン、０．００２％メルチオレー
） 、 ０．１５Ｍ ＮａＣ１を含む０゜（）２Ｍリン
酸緩蓮１液（ｐＨ７，０） ３００１１１３ 中で同
１１．’？に混合して４℃１日間反応させたのち、ポリ
スヂレンボー／Ｉ／を洗浄し、実施例／（４）に示した
方法でペルオキシダーゼ活性を測定した。第３図に示し
たように、良好なｈｃａの標準曲線を与えた。
ゼ−抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’ フラグメント）複合体
、および実施例／（３）で得られだ抗ｈＣＧ抗体Ｎ３０
５ＢＳ結合ポリスチレン球１個を２５％正常ヒツジ血清
、１％ウシ血清アルグミン、０．００２％メルチオレー
） 、 ０．１５Ｍ ＮａＣ１を含む０゜（）２Ｍリン
酸緩蓮１液（ｐＨ７，０） ３００１１１３ 中で同
１１．’？に混合して４℃１日間反応させたのち、ポリ
スヂレンボー／Ｉ／を洗浄し、実施例／（４）に示した
方法でペルオキシダーゼ活性を測定した。第３図に示し
たように、良好なｈｃａの標準曲線を与えた。
実施例３
ｍ−マレイミドベンシイ）Ｖ−Ｎ−ハイドロキシサクシ
ンイミド（Ｍ Ｂ Ｓ ）による結合法西洋わさびべｙ
ｖＡキシダーゼ〔ベーリンガーマンハイム社（西ドイツ
）製：］ ６ ”’（／を０．１Ｍリン酸緩衝１１グ（
ｐＨ７，０）に溶解し、５０ｐＡのＮ。
ンイミド（Ｍ Ｂ Ｓ ）による結合法西洋わさびべｙ
ｖＡキシダーゼ〔ベーリンガーマンハイム社（西ドイツ
）製：］ ６ ”’（／を０．１Ｍリン酸緩衝１１グ（
ｐＨ７，０）に溶解し、５０ｐＡのＮ。
「−ジメチルホルムアミドにとかした結合ｇ ４％ Ｍ
ｎ５（一般式ＣＩ）においてｎ＝０ ＋ Ｒ＝フェニレ
ンである化合物）４．８ＦＩＩｙを加えて２５℃で３０
分間トノ１押しながら反応させた。次に反応生成物をセ
ファデックスＧ−２５０カラム（１，０×４５ｃｍ）に
通し、０．０５Ｍ酢酸緩衝ｒ＋１ （ｐＨ！５．０ ）
で溶出した。タンパクを含む両分を分取し、コロジオン
Ｓを用いて７１■宿した。このようにして得だマレイミ
ド化ペルオキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子
あたり導入されたマレイミド基の数＆、ｔ（１，６８〜
０．７８であった。
ｎ５（一般式ＣＩ）においてｎ＝０ ＋ Ｒ＝フェニレ
ンである化合物）４．８ＦＩＩｙを加えて２５℃で３０
分間トノ１押しながら反応させた。次に反応生成物をセ
ファデックスＧ−２５０カラム（１，０×４５ｃｍ）に
通し、０．０５Ｍ酢酸緩衝ｒ＋１ （ｐＨ！５．０ ）
で溶出した。タンパクを含む両分を分取し、コロジオン
Ｓを用いて７１■宿した。このようにして得だマレイミ
ド化ペルオキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子
あたり導入されたマレイミド基の数＆、ｔ（１，６８〜
０．７８であった。
春考例りでイ）られたｔｆｃ体Ｎ ３０５ Ｂ Ｇ ５
ｆｆｆＫＯ。
ｆｆｆＫＯ。
１１・′グのペプシンを加え３０℃で一夜反応後、セフ
ァデックスＧ−１５０カラム（直径２．５Ｃｍｌ長さ５
５ｃｍ）で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’）２ｉｉ
［ｑ分ヲ２−メルカプトエチルアミンで還元し、セファ
デックスＧ−２５０カラムによるゲルクロマトグラフィ
ーで精製してウサギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆ ａｂ’ フラ
グメント）を絹製した。抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’ フ
ラグメント）１．７Ｍ１７をとかした５ｍＭニゲ−レン
ジアミン四Ｃ（トド俊ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，０） ０．１５ｆ！Ｉを、先に調製
し７だマレイミド化ペルオキシダーゼ１６５岬の０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ０．１５＃Ｉｔに加え
て４℃で２０時間反応させた。反応後、ウルトロゲ／Ｌ
／ＡＱＡ４４を充てんしたカラム（１，，５Ｘ４５ｃｍ
）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、Ｑ、１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＦ１６．５）で溶出させ、ペルオキシダ
ーゼ−ウサギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’フラグメント）複
合体を得た。
ァデックスＧ−１５０カラム（直径２．５Ｃｍｌ長さ５
５ｃｍ）で精製した。得られた抗体Ｆ（ａｂ’）２ｉｉ
［ｑ分ヲ２−メルカプトエチルアミンで還元し、セファ
デックスＧ−２５０カラムによるゲルクロマトグラフィ
ーで精製してウサギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆ ａｂ’ フラ
グメント）を絹製した。抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’ フ
ラグメント）１．７Ｍ１７をとかした５ｍＭニゲ−レン
ジアミン四Ｃ（トド俊ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，０） ０．１５ｆ！Ｉを、先に調製
し７だマレイミド化ペルオキシダーゼ１６５岬の０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ０．１５＃Ｉｔに加え
て４℃で２０時間反応させた。反応後、ウルトロゲ／Ｌ
／ＡＱＡ４４を充てんしたカラム（１，，５Ｘ４５ｃｍ
）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、Ｑ、１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＦ１６．５）で溶出させ、ペルオキシダ
ーゼ−ウサギ抗ｈＣＧ抗体（Ｆａｂ’フラグメント）複
合体を得た。
本複合体を実／ｉｍ例／（２） 、 （４１に示した方
法に従って検定したところ、同相への非特墨的吸着が極
めて小さく、高感度を与えることが分った。
法に従って検定したところ、同相への非特墨的吸着が極
めて小さく、高感度を与えることが分った。
Ｅ工Ａにおける試薬としては、以下のものを用いた。
■ 実施例Ｚ（３）で得られた抗ｈＣＧ抗体ｔＪ ３０
５ＢＳ結合ポリスチレン球 ■ 実施例３で得られたペルオキシダーゼとウサギ抗ｈ
ＣＧ抗体（ｒａ、ｂ’ フラグメント）との複合体 ■ イ・ツ１ンｉ７’（ｈ ＣＧ ■ 緩衝面Ｂ（実１（Ｉｉ例バ４）参照〕■ ベルオＡ
シダーゼ活性測定に必要な試薬０．５％ｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸を含むｐＨ５，０の酢酸緩両液、０．０
１％過酸化水素水および反応停止液（ｐ）１１０．３の
０．１Ｍグリシン緩雨液） 実施例’Ｉ、 ｈＣＧの特異免疫化学的測定用キッ
トおよびｈＣＧの測定 下記のｈ に Ｇ免疫化学的測定用キットを用い、前記
の操作法に従って正常人、卵巣摘出患者、***期婦人、
妊婦および絨毛癌摘出患者の血漿中のに＋ ＣＧ ｉ１
度を測定した。
５ＢＳ結合ポリスチレン球 ■ 実施例３で得られたペルオキシダーゼとウサギ抗ｈ
ＣＧ抗体（ｒａ、ｂ’ フラグメント）との複合体 ■ イ・ツ１ンｉ７’（ｈ ＣＧ ■ 緩衝面Ｂ（実１（Ｉｉ例バ４）参照〕■ ベルオＡ
シダーゼ活性測定に必要な試薬０．５％ｐ−ハイドロキ
シフェニル酢酸を含むｐＨ５，０の酢酸緩両液、０．０
１％過酸化水素水および反応停止液（ｐ）１１０．３の
０．１Ｍグリシン緩雨液） 実施例’Ｉ、 ｈＣＧの特異免疫化学的測定用キッ
トおよびｈＣＧの測定 下記のｈ に Ｇ免疫化学的測定用キットを用い、前記
の操作法に従って正常人、卵巣摘出患者、***期婦人、
妊婦および絨毛癌摘出患者の血漿中のに＋ ＣＧ ｉ１
度を測定した。
ｈＣＧの免投化学的測定キット
（１）実施例／（３）で得られる１個あたり約１１１ｅ
のｈｃａｑ・、ν異抗体で感作した直径４．８ｎｎｎの
ポリスチレン球 （２）実施例バ２）で得られるペルオキシダーゼ４ｔ％
ｎｒｆｔｌ抗１ｃＧ抗体複合体 （３） ０〜１０ Ｑ ｍ ＩＵの標準ｈｃａ（４）
上記（１） 、 （３）の試薬および被検試料の希釈に
用いる緩衝液ＢＣ実施例／（４）参照〕 （５）０−フェニレンジアミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ； Ｏ
−１％ウシ血清アルブミン、０．００２％メルチオレー
トを含むｐＨ７，５のＯ，ＩＭ！Ｊン酸緩衝液（７）上
記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ ； ０．０２％過酸
化水素帆００２％メルチオレートを含むｐＨ４゜８の０
．１Ｍクエン酸緩術両 液８）停止液；ＩＮ塩酸 （９）コントロール血清（正常ヒツジ血清）操作法 被検試料５０ｐｌに試薬（４） ２５０ Ｉｌｌおよび
試薬（１）１個を添加し、室温で１日間反応させた。ポ
リスチレン球を水洗後、試薬（６）で希釈した試薬（２
）３００１１１Ｃ複合体として約３ｏｎｇ）を添加し、
４して１日間反応させた。ポリスチレン球を水洗し、試
薬（７）で溶解した０、１５％（Ｄ試薬（５） ５００
Ｉｌｌを加えて室温で４０分間反応させたのち、ＩＮ
塩酸１．５＊ｉ！ＩＣ添加して反応を停止させ、４９２
ｒｉｍの吸光度を測定した。別に標準ｈＣＧ溶液につ
いては、試薬（４）２００ Ｉｌｌ 、コントロー／
Ｌ／血清５０１１Ｊおよび試薬（１）１個を加えて−ｌ
二記と同一操作を行ない標準曲線を作成した。
のｈｃａｑ・、ν異抗体で感作した直径４．８ｎｎｎの
ポリスチレン球 （２）実施例バ２）で得られるペルオキシダーゼ４ｔ％
ｎｒｆｔｌ抗１ｃＧ抗体複合体 （３） ０〜１０ Ｑ ｍ ＩＵの標準ｈｃａ（４）
上記（１） 、 （３）の試薬および被検試料の希釈に
用いる緩衝液ＢＣ実施例／（４）参照〕 （５）０−フェニレンジアミン （６）上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液Ｃ； Ｏ
−１％ウシ血清アルブミン、０．００２％メルチオレー
トを含むｐＨ７，５のＯ，ＩＭ！Ｊン酸緩衝液（７）上
記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ ； ０．０２％過酸
化水素帆００２％メルチオレートを含むｐＨ４゜８の０
．１Ｍクエン酸緩術両 液８）停止液；ＩＮ塩酸 （９）コントロール血清（正常ヒツジ血清）操作法 被検試料５０ｐｌに試薬（４） ２５０ Ｉｌｌおよび
試薬（１）１個を添加し、室温で１日間反応させた。ポ
リスチレン球を水洗後、試薬（６）で希釈した試薬（２
）３００１１１Ｃ複合体として約３ｏｎｇ）を添加し、
４して１日間反応させた。ポリスチレン球を水洗し、試
薬（７）で溶解した０、１５％（Ｄ試薬（５） ５００
Ｉｌｌを加えて室温で４０分間反応させたのち、ＩＮ
塩酸１．５＊ｉ！ＩＣ添加して反応を停止させ、４９２
ｒｉｍの吸光度を測定した。別に標準ｈＣＧ溶液につ
いては、試薬（４）２００ Ｉｌｌ 、コントロー／
Ｌ／血清５０１１Ｊおよび試薬（１）１個を加えて−ｌ
二記と同一操作を行ない標準曲線を作成した。
上記方法により、正常人、卵巣摘出患者、***より１婦
人、好ＩＪｉ４および絨毛癌摘出患者の血清中のｌ〕Ｃ
Ｇ濃度を測定した。結果は第１表に示される。
人、好ＩＪｉ４および絨毛癌摘出患者の血清中のｌ〕Ｃ
Ｇ濃度を測定した。結果は第１表に示される。
正常人直情 １ ０．２０２
０、２５ ３ ０．３５ ４ ０．１８ ５ ０．２７ ３ ０．５４ ４ ０．２８ ！−，０，７７ 被検試料 ｈ ｃ ａ 濃度（ｍ Ｉ Ｕ／ｉ
ｌｌ ）２ ０．１９ ３ ０、２５ 妊婦面清 ］、 １．０００２
３４．０００ ３ １８ 、０００ ２９．８ ３５．３ 第１表の結果から明らかなように、正常者を含め極微量
の血清ｈＣＧがｈＬＨなどの４１１似したホルモンの交
差反応を受けることなく測定できる。
０、２５ ３ ０．３５ ４ ０．１８ ５ ０．２７ ３ ０．５４ ４ ０．２８ ！−，０，７７ 被検試料 ｈ ｃ ａ 濃度（ｍ Ｉ Ｕ／ｉ
ｌｌ ）２ ０．１９ ３ ０、２５ 妊婦面清 ］、 １．０００２
３４．０００ ３ １８ 、０００ ２９．８ ３５．３ 第１表の結果から明らかなように、正常者を含め極微量
の血清ｈＣＧがｈＬＨなどの４１１似したホルモンの交
差反応を受けることなく測定できる。
まだ、絨毛癌摘出者の予後管理においても、治癒の判定
に極めて有効である。
に極めて有効である。
第１図は実施例／で得られたペルオキシダーゼとウサギ
抗ｈＣＧ抗体（Ｆ’ａｂ’ フラグメント）との反応
生成物のゲルクロマトグラフィーにおける溶出パターン
を、第２図は実施例１においてペルオキシダーゼ標Ｒｔ
’ｆｋ抗ｈＣＧ抗体（ｒａｂ’ フラグメント）とｈ
ＣＧ特異的抗体結合ポリスチレン球とを用いるＥＩＡの
ｈＬＨの標準曲線を、第３図は実〃亀例！で得られた同
時アラ七イ法におけるｈＣＧの標準曲線をそれぞれ表わ
す。 ；１！′ｌ ｌノ１ フラクション集、 竿 ？ 艮′１ ｈＣＧ ｆｍｌＵ／ｍｆ）
抗ｈＣＧ抗体（Ｆ’ａｂ’ フラグメント）との反応
生成物のゲルクロマトグラフィーにおける溶出パターン
を、第２図は実施例１においてペルオキシダーゼ標Ｒｔ
’ｆｋ抗ｈＣＧ抗体（ｒａｂ’ フラグメント）とｈ
ＣＧ特異的抗体結合ポリスチレン球とを用いるＥＩＡの
ｈＬＨの標準曲線を、第３図は実〃亀例！で得られた同
時アラ七イ法におけるｈＣＧの標準曲線をそれぞれ表わ
す。 ；１！′ｌ ｌノ１ フラクション集、 竿 ？ 艮′１ ｈＣＧ ｆｍｌＵ／ｍｆ）
Claims (2)
- （１）担体上に保持された抗体、抗原および標識剤を結
合させた抗体を用いる免疫化学的測定法において、相体
上に保持される抗体と標識剤を結合さぜる抗体とが互い
に抗原決定部位を重複しない２種の抗体であり、担体上
に保持される抗体がヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的
に反応する抗体であり、標識剤としてベルオギシダーゼ
を用いとれと抗体とを一般式 〔式中、ｎ ｉｊ： ０ないし５の整数を、Ｒは化学結
合または２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す１
．〕で表わされる化合物で結合させたものを用いること
を特徴とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測
定法。 - （２）■ベルオキシダーゼと抗体とを一般式〔式中、ｎ
はＯないし５の整数を、Ｒは化学結合または２価の６員
環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされる化合
物で結合させたもの、および■べ／Ｉ／メキシダーゼに
結合さ忙る抗体と互いに抗原決定部位を重複せずかつヒ
ト絨毛性ゴナドトロピンに特異的に反応する抗体を担体
上に保持し７だものを含有するヒト絨毛性ゴナドトロピ
ンの免疫化学的測定用試桑。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20089782A JPS5990054A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
| DE8383111327T DE3376508D1 (en) | 1982-11-15 | 1983-11-12 | Immunochemical assay of human chorionic gonadotropin and reagent therefor |
| EP19830111327 EP0109078B1 (en) | 1982-11-15 | 1983-11-12 | Immunochemical assay of human chorionic gonadotropin and reagent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20089782A JPS5990054A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5990054A true JPS5990054A (ja) | 1984-05-24 |
| JPH038512B2 JPH038512B2 (ja) | 1991-02-06 |
Family
ID=16432066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20089782A Granted JPS5990054A (ja) | 1982-11-15 | 1982-11-15 | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0109078B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5990054A (ja) |
| DE (1) | DE3376508D1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59176675A (ja) * | 1983-03-26 | 1984-10-06 | Eiken Kagaku Kk | 酵素免疫測定用試薬 |
| JPS6117065A (ja) * | 1984-07-04 | 1986-01-25 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの測定試薬 |
| JPS62135770A (ja) * | 1985-07-31 | 1987-06-18 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ−ロイキン−２の測定法，測定用試薬，抗体および複合体 |
| JPS636462A (ja) * | 1986-06-26 | 1988-01-12 | Konica Corp | パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 |
| JPS6371654A (ja) * | 1986-09-12 | 1988-04-01 | Konica Corp | パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 |
| JPH02231566A (ja) * | 1989-01-17 | 1990-09-13 | Eastman Kodak Co | 酵素標識レセプター組成物、診断キット、およびリガンド測定法への利用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4657853A (en) * | 1984-09-14 | 1987-04-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassays utilizing covalent conjugates of polymerized enzyme and antibody |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
| JPS5285163A (en) * | 1975-12-11 | 1977-07-15 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Preparation of malenimide derivatives |
| JPS5716355A (en) * | 1980-04-25 | 1982-01-27 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| JPS57184970A (en) * | 1981-05-08 | 1982-11-13 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method for hcg |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK159276C (da) * | 1980-03-31 | 1991-02-18 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fremgangsmaade til isolering af specifikke antistoffer og enzym-immunbestemmelsesmetode med anvendelse af det isolerede antistof |
| DE3174064D1 (en) * | 1980-10-15 | 1986-04-17 | Takeda Chemical Industries Ltd | Method for immunochemical assay and kit therefor |
-
1982
- 1982-11-15 JP JP20089782A patent/JPS5990054A/ja active Granted
-
1983
- 1983-11-12 DE DE8383111327T patent/DE3376508D1/de not_active Expired
- 1983-11-12 EP EP19830111327 patent/EP0109078B1/en not_active Expired
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5285163A (en) * | 1975-12-11 | 1977-07-15 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Preparation of malenimide derivatives |
| JPS5272284A (en) * | 1975-12-12 | 1977-06-16 | Dainippon Pharmaceutical Co | Enzymeeimmunoassay reagent |
| JPS5716355A (en) * | 1980-04-25 | 1982-01-27 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| JPS57184970A (en) * | 1981-05-08 | 1982-11-13 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method for hcg |
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|---|---|---|---|---|
| JPS59176675A (ja) * | 1983-03-26 | 1984-10-06 | Eiken Kagaku Kk | 酵素免疫測定用試薬 |
| JPS6117065A (ja) * | 1984-07-04 | 1986-01-25 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの測定試薬 |
| JPS62135770A (ja) * | 1985-07-31 | 1987-06-18 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ−ロイキン−２の測定法，測定用試薬，抗体および複合体 |
| JPS636462A (ja) * | 1986-06-26 | 1988-01-12 | Konica Corp | パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 |
| JPS6371654A (ja) * | 1986-09-12 | 1988-04-01 | Konica Corp | パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 |
| JPH02231566A (ja) * | 1989-01-17 | 1990-09-13 | Eastman Kodak Co | 酵素標識レセプター組成物、診断キット、およびリガンド測定法への利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3376508D1 (en) | 1988-06-09 |
| JPH038512B2 (ja) | 1991-02-06 |
| EP0109078A1 (en) | 1984-05-23 |
| EP0109078B1 (en) | 1988-05-04 |
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