JPS585661A - 前立腺酸ホスフアタ−ゼアイソザイムの定量方法 - Google Patents
前立腺酸ホスフアタ−ゼアイソザイムの定量方法Info
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- JPS585661A JPS585661A JP57107519A JP10751982A JPS585661A JP S585661 A JPS585661 A JP S585661A JP 57107519 A JP57107519 A JP 57107519A JP 10751982 A JP10751982 A JP 10751982A JP S585661 A JPS585661 A JP S585661A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
酸ホスファターゼ線条くのアイソザイムを含む不均一な
一群の酵素でTo夛、各アイソザイムは一種の組織に特
異性を有する。この組織特異性の結果として、血清中の
組織特異性アイソザイムの定食は、その組織の異常の同
定に役立つ。前立腺癌に伴って血清中の前立腺酸ホスフ
ェ−) (proamttcacid phospha
tes ) (P A P )アイソデイム議度の上昇
をみることについて紘多くの報告がある( R,M、
Tovnaend : Ann、 C11n、 Lab
、 8ci、 7 (5)C254−261、May−
June、 1977 )。
一群の酵素でTo夛、各アイソザイムは一種の組織に特
異性を有する。この組織特異性の結果として、血清中の
組織特異性アイソザイムの定食は、その組織の異常の同
定に役立つ。前立腺癌に伴って血清中の前立腺酸ホスフ
ェ−) (proamttcacid phospha
tes ) (P A P )アイソデイム議度の上昇
をみることについて紘多くの報告がある( R,M、
Tovnaend : Ann、 C11n、 Lab
、 8ci、 7 (5)C254−261、May−
June、 1977 )。
しかしながら、血清中のPAPアイソデイム鎖度の定量
は、前立腺以外の臓器組織からの他の酸ホスファターゼ
の存在の丸めに複雑である。実際。
は、前立腺以外の臓器組織からの他の酸ホスファターゼ
の存在の丸めに複雑である。実際。
甲状腺以外の酸ホスファターゼが通常、血清中にかなシ
の濃度存在する( Ll、 C,ら: :f* Lab
−C11n、M@1.82:446−460(1973
))。
の濃度存在する( Ll、 C,ら: :f* Lab
−C11n、M@1.82:446−460(1973
))。
し九がって、各種起源の酸ホスファターゼの中から、P
APアイソデイムにだけ%異的な定量方法が要求される
。
APアイソデイムにだけ%異的な定量方法が要求される
。
血清中PAP量の測定はこれまでPAPK%異的な基質
、PAPの化学的阻害という方向に向けられてきた。し
かしながら、特異的基質や阻害剤といっても大部分、P
AP以外のアイソザイムとも反応するので、このような
アプローチ拡必ずしも満足できるものではなかった。し
たがって、これまでの方法でa、 C4まった陽性また
紘陰性の試験結果を与え、不適当な治療を招く可能性が
高かつ九。
、PAPの化学的阻害という方向に向けられてきた。し
かしながら、特異的基質や阻害剤といっても大部分、P
AP以外のアイソザイムとも反応するので、このような
アプローチ拡必ずしも満足できるものではなかった。し
たがって、これまでの方法でa、 C4まった陽性また
紘陰性の試験結果を与え、不適当な治療を招く可能性が
高かつ九。
PAPの免疫学的定量方法もいくつか報告されている。
Choa、 B、Kaら(Proc、 Boa、 Ex
p、 Biol。
p、 Biol。
Med、162:396−400(1979))は酵素
活性ならびに硫酸アンモニウム沈殿抗原−抗体複合体中
のλ28工標識PAPの放射活性を測定する定量システ
ムを報告している。この方法によj9.PAPは硫酸ア
ンモニウム沈殿抗原−抗体禎合体の測定によシ定量され
る。しかしながら、この方法では、硫酸アンモニウム沈
殿の非特異的性質によシ、酸ホスファターゼからの高い
パックグラウンドがある。
活性ならびに硫酸アンモニウム沈殿抗原−抗体複合体中
のλ28工標識PAPの放射活性を測定する定量システ
ムを報告している。この方法によj9.PAPは硫酸ア
ンモニウム沈殿抗原−抗体禎合体の測定によシ定量され
る。しかしながら、この方法では、硫酸アンモニウム沈
殿の非特異的性質によシ、酸ホスファターゼからの高い
パックグラウンドがある。
ヒトアルカリホスファターぜの各臓器I!#異性アイソ
デイムの定量において、他のアイソザイムからの妨害の
問題を解決する試みに、二重抗体免疫酵素定量法が報告
されている( Susamanら:J。
デイムの定量において、他のアイソザイムからの妨害の
問題を解決する試みに、二重抗体免疫酵素定量法が報告
されている( Susamanら:J。
Biol、 chem、 245 : 160 (19
68) s (1!hoeら: C1l!1. Che
m、26 : 1854−1859(1980))。い
ずれの場合も、所望のアイソザイムに特異的な抗体を試
験サンプルと反応させ、次の工程で抗体−アイソデイム
複合体を第二の可溶性抗体(抗μmグロブリン)と反応
させる。遠心分離したのち、沈殿について残ったアイソ
デイム活性を測定する。
68) s (1!hoeら: C1l!1. Che
m、26 : 1854−1859(1980))。い
ずれの場合も、所望のアイソザイムに特異的な抗体を試
験サンプルと反応させ、次の工程で抗体−アイソデイム
複合体を第二の可溶性抗体(抗μmグロブリン)と反応
させる。遠心分離したのち、沈殿について残ったアイソ
デイム活性を測定する。
Sussman、 Choeの方法の順に正確になるが
この場合拡第二の可溶性抗体を抗体−アイソデイム複合
体と、定量すべきアイソザイムが完全に沈殿するように
反応させる必要がある。この反応は、温度、−、イオン
強度、時間、タンパク濃度等のような因子に依存する。
この場合拡第二の可溶性抗体を抗体−アイソデイム複合
体と、定量すべきアイソザイムが完全に沈殿するように
反応させる必要がある。この反応は、温度、−、イオン
強度、時間、タンパク濃度等のような因子に依存する。
これらの因子を定量操作においてコントロールすること
は困難であり、8ussman ’p Choeの方法
には、特異的なアイソザイムの正確な定量という点では
限界がある。
は困難であり、8ussman ’p Choeの方法
には、特異的なアイソザイムの正確な定量という点では
限界がある。
本発明は生物学的液体サンプル中のPAPアイソデイム
量を免疫化学的に測定する方法に関する。
量を免疫化学的に測定する方法に関する。
血清PAPアイソデイム濃度の上昇は前立腺癌の存在を
示すものである。
示すものである。
本発明の免疫化学的方法では、二重抗体免疫酵素定量法
を採用する。抗体のひとつは抗体とアミロースの反応生
成物として不溶′化し九抗体である。
を採用する。抗体のひとつは抗体とアミロースの反応生
成物として不溶′化し九抗体である。
本発明の方法によれば試験サンプルを、サンプルのアイ
ソディふと選択的に免疫学的に結合する第一の抗体、お
よび第一の抗体と選択的に免疫学的に結合する第二の不
溶化抗体とインキエペートする。免疫学的反応によって
不溶性の免疫複合体が生成し、これは容易に単離できる
。免疫複合体を単離し、それに含まれるアイソデイム活
性を測定する。
ソディふと選択的に免疫学的に結合する第一の抗体、お
よび第一の抗体と選択的に免疫学的に結合する第二の不
溶化抗体とインキエペートする。免疫学的反応によって
不溶性の免疫複合体が生成し、これは容易に単離できる
。免疫複合体を単離し、それに含まれるアイソデイム活
性を測定する。
免疫グロブリン(IgG ) 、酵素などのタンパクが
固体支持体アミロースに結合し、免疫吸着体として使用
できるIg()−アミロースのような不溶化タンパクを
生成することが明らかにされた。たとえばIgGのよう
なタンパクをアンローとの反応で不溶化すると他の固体
支持体で不溶化したタンパクよシも利点のあることも明
らかにされ九。とくにIgG−アミロースの生成は簡単
な反応で行われるので有利である。アミロースd Ig
Gの結合のために大きな表面積を提供し、またIJg(
)−アミロースの反応生成物は低速の遠心分離で容易に
分離できるが、免疫学的定量のための反応が完結するに
十分な時間、懸濁状態に維持される。
固体支持体アミロースに結合し、免疫吸着体として使用
できるIg()−アミロースのような不溶化タンパクを
生成することが明らかにされた。たとえばIgGのよう
なタンパクをアンローとの反応で不溶化すると他の固体
支持体で不溶化したタンパクよシも利点のあることも明
らかにされ九。とくにIgG−アミロースの生成は簡単
な反応で行われるので有利である。アミロースd Ig
Gの結合のために大きな表面積を提供し、またIJg(
)−アミロースの反応生成物は低速の遠心分離で容易に
分離できるが、免疫学的定量のための反応が完結するに
十分な時間、懸濁状態に維持される。
本発明の方法は、きわめて特異的、迅速、高度に!E確
、再現性を有するという点で従来方法よシはるかに優れ
ていて、非前立腺アイソデイムを含む血清からPAPア
インデイムをIF#^的に単離し、単一されたP人Pア
イソデイム量を特異的に定量できる。
、再現性を有するという点で従来方法よシはるかに優れ
ていて、非前立腺アイソデイムを含む血清からPAPア
インデイムをIF#^的に単離し、単一されたP人Pア
イソデイム量を特異的に定量できる。
本発明の方法は、とくに、生成した反応混合物の免疫複
合体が速やかに沈殿し、アイソデイム活性の一定に利用
できる点が有利である。さらに、免疫複合体を生じる反
応混合物は、温度、・−、イオン強度、時間、タンパク
濃度等の因子に無関係である。これらの因子がないので
、本発明ではそれが原因となる誤差がなく、Fi、るか
に正確にアイソザイムの特異量を定量できる。
合体が速やかに沈殿し、アイソデイム活性の一定に利用
できる点が有利である。さらに、免疫複合体を生じる反
応混合物は、温度、・−、イオン強度、時間、タンパク
濃度等の因子に無関係である。これらの因子がないので
、本発明ではそれが原因となる誤差がなく、Fi、るか
に正確にアイソザイムの特異量を定量できる。
本発明の方法では試験サンプルとして任意の生物学的液
体、たとえばヒトおよび動物の全血、血W1%血清、リ
ンパ液、胆汁、尿、を髄液、痰、汗ならびに糞が使用で
きる。ま次、ヒトおよび動物の組織、九とえば骨格筋、
心臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄、皮膚等からの液体プレバ
レージョンを用いることも可能である。生物学的液体が
好ましい。
体、たとえばヒトおよび動物の全血、血W1%血清、リ
ンパ液、胆汁、尿、を髄液、痰、汗ならびに糞が使用で
きる。ま次、ヒトおよび動物の組織、九とえば骨格筋、
心臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄、皮膚等からの液体プレバ
レージョンを用いることも可能である。生物学的液体が
好ましい。
本発明の試験テンプルとしてとくに好ましい生物学的液
体はヒト血清である。
体はヒト血清である。
本発明は詳しくは他の非前立腺アイソデイムまたは他の
タンパク性物質を含むこともある生物学的液体中のPA
Pアイソデイム量を定量する方法に関する0本発明の方
法は問題の特異的PAPアイソデイムを単離し、ついで
単離PAPアインデイムの酵素活性を測定するものであ
る。
タンパク性物質を含むこともある生物学的液体中のPA
Pアイソデイム量を定量する方法に関する0本発明の方
法は問題の特異的PAPアイソデイムを単離し、ついで
単離PAPアインデイムの酵素活性を測定するものであ
る。
PAPアインデイムの単離は2種の異なる抗体を用いる
ことによル達成される。すなわち生物学的液体と第一の
抗体および第二の抗体を反応混合物中で反応させ、つい
で反応混合物からPAPアインデ・イムな含む免疫複合
体を分離する。
ことによル達成される。すなわち生物学的液体と第一の
抗体および第二の抗体を反応混合物中で反応させ、つい
で反応混合物からPAPアインデ・イムな含む免疫複合
体を分離する。
本発明における第一の抗体は、反応混合物中に溶解し、
PAPアイソデイムの酵素活性を阻害することなくPA
Pアイソ?イムに選択的に結合する任意の抗体である。
PAPアイソデイムの酵素活性を阻害することなくPA
Pアイソ?イムに選択的に結合する任意の抗体である。
第一の抗体は、動物に抗原として精製PAPアイソデイ
ムを注射し、動物から採血して抗体を含む血清を得るこ
とによシ、常法で製造できる。PAPアイソデイムの精
製および精製PAPアイソデイムを抗原として動物に注
射し、第一抗体を含む抗PAP血清を得るには公知の任
意の常法を利用できる。抗PAP血清紘精製する必要は
なく、本発明の方法にそのまま使用できる。精製PAP
アインデイムを用いて得た抗PAP血清は、前立腺組織
以外の組織からの酸ホスファターゼとは反応せず、PA
Pアインデイムと免疫学的に結合してもその酵素活性は
阻害されない、抗PAP血清に含まれる第一の抗体は試
験サンプルのPAPアイソデイムのみと免疫学的に特異
的に結合し、しかも同時1cPAPアイノデイムの酵素
活性には影響しないということである。
ムを注射し、動物から採血して抗体を含む血清を得るこ
とによシ、常法で製造できる。PAPアイソデイムの精
製および精製PAPアイソデイムを抗原として動物に注
射し、第一抗体を含む抗PAP血清を得るには公知の任
意の常法を利用できる。抗PAP血清紘精製する必要は
なく、本発明の方法にそのまま使用できる。精製PAP
アインデイムを用いて得た抗PAP血清は、前立腺組織
以外の組織からの酸ホスファターゼとは反応せず、PA
Pアインデイムと免疫学的に結合してもその酵素活性は
阻害されない、抗PAP血清に含まれる第一の抗体は試
験サンプルのPAPアイソデイムのみと免疫学的に特異
的に結合し、しかも同時1cPAPアイノデイムの酵素
活性には影響しないということである。
第一の抗体を生じさせるために抗原として用いたPAP
アイソデイムは、適当な生物学的液体たとえば前立腺液
、血清または生物学的に新鮮な適当な甲状腺組織から得
ることができる。このアイソザイムの好ましい原料拡動
物の前立腺液または組織であシ、とくにヒ)III立腺
液腺液は組織が好ましい。
アイソデイムは、適当な生物学的液体たとえば前立腺液
、血清または生物学的に新鮮な適当な甲状腺組織から得
ることができる。このアイソザイムの好ましい原料拡動
物の前立腺液または組織であシ、とくにヒ)III立腺
液腺液は組織が好ましい。
第一の抗体を生じさせるためのPAPアイソデイムの高
純度への精製は、非特異的抗体の生成を抑えるためにと
くに重要である。PAPアイソデイム紘このような目的
で本技術分野において認められた任意慣用の精製方法で
精製できる。好ましい精製方法としては、常用技術、九
とえば親和性クロマトグラフィーや電気泳動がある。
純度への精製は、非特異的抗体の生成を抑えるためにと
くに重要である。PAPアイソデイム紘このような目的
で本技術分野において認められた任意慣用の精製方法で
精製できる。好ましい精製方法としては、常用技術、九
とえば親和性クロマトグラフィーや電気泳動がある。
第一の抗体を生じさせるために用いるPAPアイソデイ
ムの純度ならびに生成した抗体の特異性は本技術分野で
最近用いられている方法、たとえば免疫拡散や電気泳動
によって測定できる。PAPアイソデイムの純度を測定
するのに好ましい方法はアクリルアミドグル電気泳動で
ある。
ムの純度ならびに生成した抗体の特異性は本技術分野で
最近用いられている方法、たとえば免疫拡散や電気泳動
によって測定できる。PAPアイソデイムの純度を測定
するのに好ましい方法はアクリルアミドグル電気泳動で
ある。
第一の抗体は本技術分野で用いられている任意の動物に
産生させることができる。とくにを椎動匍、たとえばブ
タ、ウシ、イヌ、ロバ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ラット等
である。ロバ、ヒツジおよびヤギが好ましい。とくに好
ましい動物はヤギである。
産生させることができる。とくにを椎動匍、たとえばブ
タ、ウシ、イヌ、ロバ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ラット等
である。ロバ、ヒツジおよびヤギが好ましい。とくに好
ましい動物はヤギである。
本発明の好ましい態様によれば、第一の抗体唸第−の動
物種としてヤギに、ヒト前立腺組織から得た精製PAP
アイソデイムによシ、慣用の免疫技術で免疫処置して産
生させ、第一の抗体、ヤイ抗−PAPを得る。
物種としてヤギに、ヒト前立腺組織から得た精製PAP
アイソデイムによシ、慣用の免疫技術で免疫処置して産
生させ、第一の抗体、ヤイ抗−PAPを得る。
試験サンプル中に用いられる第一の抗体の量は、サンプ
ル中のPAPアイソデイムに結合するのに十分な量であ
る。第一の抗体は、PAPアインデイムに結合するのに
必要な量よシ過剰にサンプル中に加えると最善の結果が
得られる。各サンプルに必要な抗体量の算出は本技術分
野でよく知られた方法にしたがって実施できる。
ル中のPAPアイソデイムに結合するのに十分な量であ
る。第一の抗体は、PAPアインデイムに結合するのに
必要な量よシ過剰にサンプル中に加えると最善の結果が
得られる。各サンプルに必要な抗体量の算出は本技術分
野でよく知られた方法にしたがって実施できる。
第一の抗体を添加したのち、試験サンプルに不溶化した
第二の抗体を加える。第一の抗体添加後第二の抗体を加
えるまでの時間にはとくに制限線ないが、第一の抗体添
加後少なくとも15分おいて不溶化した第二の抗体を加
えるのが好ましい。
第二の抗体を加える。第一の抗体添加後第二の抗体を加
えるまでの時間にはとくに制限線ないが、第一の抗体添
加後少なくとも15分おいて不溶化した第二の抗体を加
えるのが好ましい。
本発明によれば、第二の抗体をアミロースにアンド結合
させて不溶化した第二の抗体を用いる。
させて不溶化した第二の抗体を用いる。
不溶化された第二の抗体中の第二の抗体は、第一の抗体
に結合したアイソザイムの酵素活性を阻害することなく
第一の抗体に選択的に結合する任意の抗体が使用できる
。不溶化された第二の抗体中の第二の抗体量、第一の抗
体の生産に用いた動物種以外の任意の動物に、本技術分
野でよく知られた任意の方法を轡いて産生させる。すな
わち、第二の抗体は、特異的な第一の抗体を産生させた
動物以外の動物を、第一の抗体の調製に用いた宿主動物
の血液から得たr−グロブリンで免疫処置して製造され
る。第二の抗体は第一の抗体に対して免疫反応性を有し
、複合体を形成する。
に結合したアイソザイムの酵素活性を阻害することなく
第一の抗体に選択的に結合する任意の抗体が使用できる
。不溶化された第二の抗体中の第二の抗体量、第一の抗
体の生産に用いた動物種以外の任意の動物に、本技術分
野でよく知られた任意の方法を轡いて産生させる。すな
わち、第二の抗体は、特異的な第一の抗体を産生させた
動物以外の動物を、第一の抗体の調製に用いた宿主動物
の血液から得たr−グロブリンで免疫処置して製造され
る。第二の抗体は第一の抗体に対して免疫反応性を有し
、複合体を形成する。
不溶化された第二の抗体を生成するのに用いられるアミ
ロースはD−グルー−スのホモポリマーである。アミロ
ース中のD−ゲルコピ2ノース単位はほぼ(1−4)α
−グリコシド結合をとっている。アミロースの分子量は
アミロースの原料によって異なるが、平均分子量は約1
00.000から約1,10肌000である。
ロースはD−グルー−スのホモポリマーである。アミロ
ース中のD−ゲルコピ2ノース単位はほぼ(1−4)α
−グリコシド結合をとっている。アミロースの分子量は
アミロースの原料によって異なるが、平均分子量は約1
00.000から約1,10肌000である。
本発明の方法においては、任意の起源の任意の公知の分
子量のアミロースが使用でき、抗体とアミロースの反応
生成物を与える。抗体とアミロースの反応生成物を製造
する前に、所望によシ、アミロースを任意の慣用方法で
精製してもよい、しかしながら、純度には制限はない、
純度50%から100%のアミ四−スな用いるのが好ま
しい。
子量のアミロースが使用でき、抗体とアミロースの反応
生成物を与える。抗体とアミロースの反応生成物を製造
する前に、所望によシ、アミロースを任意の慣用方法で
精製してもよい、しかしながら、純度には制限はない、
純度50%から100%のアミ四−スな用いるのが好ま
しい。
第二の抗体を九社他のタンパクをアミン結合を軽てアミ
ロースに結合させ、不溶化させた第二の抗体を生成させ
る方法は、ポリサッカライドをタンパクに結合させる任
意の方法によることができる。
ロースに結合させ、不溶化させた第二の抗体を生成させ
る方法は、ポリサッカライドをタンパクに結合させる任
意の方法によることができる。
本発明の好ましい態様では、第二の抗体または他のタン
パクを活性化アミロースに、慣用のシッフの塩基反応を
用いて結合させる( Guthrle、 R。
パクを活性化アミロースに、慣用のシッフの塩基反応を
用いて結合させる( Guthrle、 R。
D、 : Adv、 Carbohydrate Ch
em、 16 : 101 +1961)。
em、 16 : 101 +1961)。
好ましい方法によれば、複数個のD−グルコざラノース
単位を含むアミロースを、α−1,4−結合グルコース
単位を酸化してアミロース−ジアルデヒドを与る酸化剤
、たとえば過ヨウ素酸ナトリウム(N11IO4)で活
性化する。生成したアミロース−ジアルデヒドを次に、
添化した第二の抗体またはタンパクの一級アミノ基と反
応させて、シックの塩基またはアルジミンを生成させる
。このシッフの塩基を還元剤と反応させると、タンパク
とアミロースの間に一級アミノ結合が生成する。この反
応に用いられる慣用の還元剤の中では、一般的に、水素
化ホウ素ナトリウム(NaBH4)のような還元剤の使
用が好ましい、第二の抗体−アミロース生成物の製造操
作は、以下の反応式で示すことができる。反応式中のn
FiD−ゲルコピ2ノース単位が複数個存在すること
を示している。
単位を含むアミロースを、α−1,4−結合グルコース
単位を酸化してアミロース−ジアルデヒドを与る酸化剤
、たとえば過ヨウ素酸ナトリウム(N11IO4)で活
性化する。生成したアミロース−ジアルデヒドを次に、
添化した第二の抗体またはタンパクの一級アミノ基と反
応させて、シックの塩基またはアルジミンを生成させる
。このシッフの塩基を還元剤と反応させると、タンパク
とアミロースの間に一級アミノ結合が生成する。この反
応に用いられる慣用の還元剤の中では、一般的に、水素
化ホウ素ナトリウム(NaBH4)のような還元剤の使
用が好ましい、第二の抗体−アミロース生成物の製造操
作は、以下の反応式で示すことができる。反応式中のn
FiD−ゲルコピ2ノース単位が複数個存在すること
を示している。
アミロース/タンパク結合の反応式
不溶化された抗体の形成には、前述の方法で抗体をアミ
ロースと反応させて、抗体をアミン結合を介してアミロ
ースに結合させる。不溶化された抗体の製造に際しての
アミリースと抗体の量には制限はない、しかしながら、
一般には、抗体1重量部に対してアミロース約1〜約2
00重量部である。使用する抗体1重量部に対してアミ
ロース約8〜約201量部が好ましい。
ロースと反応させて、抗体をアミン結合を介してアミロ
ースに結合させる。不溶化された抗体の製造に際しての
アミリースと抗体の量には制限はない、しかしながら、
一般には、抗体1重量部に対してアミロース約1〜約2
00重量部である。使用する抗体1重量部に対してアミ
ロース約8〜約201量部が好ましい。
本発明によれは、第二の抗体添加IK免疫複合体が生成
すれば、その免疫複合体は本技術分野で公知の任意の方
法によって、サンプル溶液または混合物から分離でき、
生じた沈殿のPAPW#素活性を測定すればよい。本発
明においては、酵素活性を測定するの紘沈殿についてで
ある。
すれば、その免疫複合体は本技術分野で公知の任意の方
法によって、サンプル溶液または混合物から分離でき、
生じた沈殿のPAPW#素活性を測定すればよい。本発
明においては、酵素活性を測定するの紘沈殿についてで
ある。
サンプル溶液から沈殿を分離するのに利用でする慣用方
法中、通常の一過およびクロマトグラフィーが好ましい
。サンプル溶液から沈殿を分離するのにとくに好ましい
方法紘遠心分離し、ついで上澄液を傾瀉する方法で、沈
殿について測定を行えにサンゾル中ctpAptt定量
できる。
法中、通常の一過およびクロマトグラフィーが好ましい
。サンプル溶液から沈殿を分離するのにとくに好ましい
方法紘遠心分離し、ついで上澄液を傾瀉する方法で、沈
殿について測定を行えにサンゾル中ctpAptt定量
できる。
試験サンプルから単離され1pApアイソデイムの活性
の測定は本技術分野でよく知られた慣用方法によって行
われる。この種の方法としては、たとえば@Metho
den der、 anzymatiachen An
alyse″。
の測定は本技術分野でよく知られた慣用方法によって行
われる。この種の方法としては、たとえば@Metho
den der、 anzymatiachen An
alyse″。
B@rgmsyer、 H,U、編、第6版(1974
)、第1巻、145頁以下に記載の比色法、ならびに螢
光法がある。
)、第1巻、145頁以下に記載の比色法、ならびに螢
光法がある。
本発明はまた。生物学的液体中のPAPアイソデイムの
存在を定量的に測定す、る診断用試験キットシステムに
関する。試験キットの構成は、(a)PAPアイソデイ
ムと選択的に免疫学的に結合できる抗体を含有する第一
の容器、(b)第一の容器中に含有される抗体と選択的
に免疫学的に結合で−きる第二の抗体をアミロースに結
合させて形成した不溶性抗体を含有する第二の容器、お
よびC)PAPアイソデイムの酵素活性を定量できる基
質試薬である。
存在を定量的に測定す、る診断用試験キットシステムに
関する。試験キットの構成は、(a)PAPアイソデイ
ムと選択的に免疫学的に結合できる抗体を含有する第一
の容器、(b)第一の容器中に含有される抗体と選択的
に免疫学的に結合で−きる第二の抗体をアミロースに結
合させて形成した不溶性抗体を含有する第二の容器、お
よびC)PAPアイソデイムの酵素活性を定量できる基
質試薬である。
診断試験キットシステムの全成分を本発明の方法にし九
がって用いると、非前立腺アインデイムを含む生物学的
液体サンプル中のPAPアイソデイムの酵素活性が、本
技術分野の熟練者によル答易に定量できる。試験キット
は、生物学的液体サンプル中のPAPアイソデイム量の
定量を必要とする診療所、病院、検査室、開業医に適し
ている。
がって用いると、非前立腺アインデイムを含む生物学的
液体サンプル中のPAPアイソデイムの酵素活性が、本
技術分野の熟練者によル答易に定量できる。試験キット
は、生物学的液体サンプル中のPAPアイソデイム量の
定量を必要とする診療所、病院、検査室、開業医に適し
ている。
次に本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する
が、これは本発明の範囲および精神を限定するものでは
ない。
が、これは本発明の範囲および精神を限定するものでは
ない。
A)凍結ヒト前立腺組織100gを0.05Mエチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)と0.01重量%の’I’
vreen 8Qを含むホモジネート溶液中に4℃で加
える。凍結した組織をホモジネート溶液中で約0↓5時
間解凍する。解凍後、塊がなくなるまでゾレンダー中で
ホモジナイズする。ホモジナイズは水浴中の混合物を2
0秒以下で処理して行う。
ジアミン四酢酸(EDTA)と0.01重量%の’I’
vreen 8Qを含むホモジネート溶液中に4℃で加
える。凍結した組織をホモジネート溶液中で約0↓5時
間解凍する。解凍後、塊がなくなるまでゾレンダー中で
ホモジナイズする。ホモジナイズは水浴中の混合物を2
0秒以下で処理して行う。
得られ九ホモジネートを一夜4℃で攪拌する。この混合
物を4℃、16,500X#で1時間遠心分離する。得
られた上澄液約240−を3回、0.9%Naツ含有の
0.005 Mリン酸ナトリウム緩衝液−6,3で(各
d4.OJ)透析する。透析液ははじめの容量約240
゛−から約260−に増加する。
物を4℃、16,500X#で1時間遠心分離する。得
られた上澄液約240−を3回、0.9%Naツ含有の
0.005 Mリン酸ナトリウム緩衝液−6,3で(各
d4.OJ)透析する。透析液ははじめの容量約240
゛−から約260−に増加する。
得られ友透析物を1000idの凍結乾燥フラスコにと
り、ドライアイス−アセトンで急速に凍結して凍結乾燥
の準備をし、−夜で凍結乾燥する。
り、ドライアイス−アセトンで急速に凍結して凍結乾燥
の準備をし、−夜で凍結乾燥する。
得られた凍結乾燥物質を0.9%Naツ含有0.005
Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6,3) 20WLt
−e再生し、これを以下OB)に使用する。
Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6,3) 20WLt
−e再生し、これを以下OB)に使用する。
B)LKBカラムに上述の緩衝液中であらかじめ膨潤さ
せたCon−A 8epharoae 4 B ?’ル
を充填し、ついで液を流さないでカラム中にrルを沈積
させる。得られた充填カラムを上述の緩衝液的400−
で洗浄する。
せたCon−A 8epharoae 4 B ?’ル
を充填し、ついで液を流さないでカラム中にrルを沈積
させる。得られた充填カラムを上述の緩衝液的400−
で洗浄する。
上記入)の再生液を上に調製したLKBカラム上に置く
。カラムに置いたのち、約3時間カラム上に放置し、つ
いで上述の緩衝液8001117を40.0−7時の速
さで通過させる。次に0.005 M !jン酸す)
IJウムと0.9%NaCJの緩衝液−6,3中で別個
にw4製し、活性炭を通してF遇した0、0〜0.3M
マンノース勾配500−をLKBカラムに通じ、流速4
Q、Qd/時で10.011jずつの分画を集める(計
50個の分画な集める)。次に1.0 Mマンノース5
001Lltr、xB力2ムに通し、同様にして計50
個の分画を集める。得られた分画すべてについて、タン
パクおよびPAP活性を試験した。比活性≧2000シ
グマ単位/WgタンパクのPAP活性を含む分画をプー
ルし、0.005Mリン酸ナトリウムと0.9%NaC
Jの緩衝液−6,6に対して透析し、 Am1conp
過装置を用いて濃縮すると、以下のりに使用する濃縮透
析液4.0117が得られる。
。カラムに置いたのち、約3時間カラム上に放置し、つ
いで上述の緩衝液8001117を40.0−7時の速
さで通過させる。次に0.005 M !jン酸す)
IJウムと0.9%NaCJの緩衝液−6,3中で別個
にw4製し、活性炭を通してF遇した0、0〜0.3M
マンノース勾配500−をLKBカラムに通じ、流速4
Q、Qd/時で10.011jずつの分画を集める(計
50個の分画な集める)。次に1.0 Mマンノース5
001Lltr、xB力2ムに通し、同様にして計50
個の分画を集める。得られた分画すべてについて、タン
パクおよびPAP活性を試験した。比活性≧2000シ
グマ単位/WgタンパクのPAP活性を含む分画をプー
ルし、0.005Mリン酸ナトリウムと0.9%NaC
Jの緩衝液−6,6に対して透析し、 Am1conp
過装置を用いて濃縮すると、以下のりに使用する濃縮透
析液4.0117が得られる。
C) Bfichlarの製造システムを用いて7.
5%アクリルアミドrルを調製する。Btlchler
システム用に以下の緩衝液も調製する。システムの上部
緩衝液として0.014 M酢酸中0.035 Mβ−
79二ンおよび下部緩衝液および溶出緩衝液として0.
056 M酢酸中Oj14Mβ−79=yで@る。
5%アクリルアミドrルを調製する。Btlchler
システム用に以下の緩衝液も調製する。システムの上部
緩衝液として0.014 M酢酸中0.035 Mβ−
79二ンおよび下部緩衝液および溶出緩衝液として0.
056 M酢酸中Oj14Mβ−79=yで@る。
B)における濃縮透析液4.0117に40%ff1l
i1.01およびメチルグリーン染料3滴を加えて混合
する。この温合物をBuchlerシステムの7.5%
アクリルアミドrル上に置を、電気泳動を開始する(1
000ポルト、200ミリアンペア、約1゛6時間)。
i1.01およびメチルグリーン染料3滴を加えて混合
する。この温合物をBuchlerシステムの7.5%
アクリルアミドrル上に置を、電気泳動を開始する(1
000ポルト、200ミリアンペア、約1゛6時間)。
混合物を下部/溶出緩衝液で溶出し、1Q、Qiuの分
画を集める。得られた分画のPAPおよびタンパク活性
を試−する。PAP活性を含む分画をプールし% 0.
01 Mクエン酸緩衝液−6、OK対し一夜透析し、2
回交換を行うと、IPI12の免疫処置に使用できる高
純度のPAPが得られる。高度に精製されたPAPは一
20’Oで保存できる。
画を集める。得られた分画のPAPおよびタンパク活性
を試−する。PAP活性を含む分画をプールし% 0.
01 Mクエン酸緩衝液−6、OK対し一夜透析し、2
回交換を行うと、IPI12の免疫処置に使用できる高
純度のPAPが得られる。高度に精製されたPAPは一
20’Oで保存できる。
12
精製PAPKよるヤギの免疫処置での第一の抗体の産生
ヤヤを免疫処置するための免疫原の生成には、9%11
において得られた0、01 Mクエン酸緩衝液−6,0
中の高純度精製PAPを同容の完全フロインドアジェパ
ン) (M−tuberculosia bacil1
1死菌含有鉱油懸濁液)と混合して0.5ダPAP/1
11の混合物を得る。得られた混合物をホモジナイズし
、免疫原となる水/油エマルジョンを調製する。ヤヤに
連続3週間連続して、2部位の補助領域に免疫原211
111各部位ごとに1−1皮下注射する。不完全フロイ
ンドアジュバントの第二次注射は、−次の注射から2週
問おいて行い、さらに数カ月間。
において得られた0、01 Mクエン酸緩衝液−6,0
中の高純度精製PAPを同容の完全フロインドアジェパ
ン) (M−tuberculosia bacil1
1死菌含有鉱油懸濁液)と混合して0.5ダPAP/1
11の混合物を得る。得られた混合物をホモジナイズし
、免疫原となる水/油エマルジョンを調製する。ヤヤに
連続3週間連続して、2部位の補助領域に免疫原211
111各部位ごとに1−1皮下注射する。不完全フロイ
ンドアジュバントの第二次注射は、−次の注射から2週
問おいて行い、さらに数カ月間。
不完全フロイントアジ−パントの第二次注射を1力月ご
とに続ける。免疫処置後1〜2週ごとにヤギを採血し、
抗血清を得る。
とに続ける。免疫処置後1〜2週ごとにヤギを採血し、
抗血清を得る。
皇i
ロバ抗ヤイIg()血清のグロブリン分画の調製アミロ
ースと結合させるのに用いるロバ抗ヤイ、 IgG血清
のグロブリン分画は、以下の成分および操作によって調
製する。
ースと結合させるのに用いるロバ抗ヤイ、 IgG血清
のグロブリン分画は、以下の成分および操作によって調
製する。
項目 成 分
量a) 市販ロバ抗ヤfIgG血清
5Q[]Mlc) o、o I Mリン酸ナト
リウム緩衝液pH7,4約14J操作: ロバ抗ヤイIgG血清500dを適当な容器に4℃でと
プ、電磁攪拌板上に置く。中等度に攪拌しながら、この
容器に飽和硫酸アンモニウム(b)300−を徐々に加
え、容器の内容物を37.5%飽和にする。容器を4℃
で1時間攪拌したのち、沈殿した抗体を、4℃、120
0)lで30分間遠心分離し、ペレットとして集める。
量a) 市販ロバ抗ヤfIgG血清
5Q[]Mlc) o、o I Mリン酸ナト
リウム緩衝液pH7,4約14J操作: ロバ抗ヤイIgG血清500dを適当な容器に4℃でと
プ、電磁攪拌板上に置く。中等度に攪拌しながら、この
容器に飽和硫酸アンモニウム(b)300−を徐々に加
え、容器の内容物を37.5%飽和にする。容器を4℃
で1時間攪拌したのち、沈殿した抗体を、4℃、120
0)lで30分間遠心分離し、ペレットとして集める。
ペレットを約3501のリン酸塩緩衝液(c)に溶解し
、容量を同じ緩衝液ではじめの容量500−にする。次
に飽和硫酸アンモニウム(b)250117を穏やかに
攪拌しながら、4℃で加え、得られた混合−を63%飽
和にする。
、容量を同じ緩衝液ではじめの容量500−にする。次
に飽和硫酸アンモニウム(b)250117を穏やかに
攪拌しながら、4℃で加え、得られた混合−を63%飽
和にする。
この混合物を4℃で1時間攪拌する。混合物から沈殿し
た抗体を、4℃、1200X、!i+で30分間遠心分
離するとペレット状となる。このペレットを約20ロー
のリン酸塩緩衝液に溶解し、透析袋に移し、リン酸塩緩
衝液に対し4℃で透析する。
た抗体を、4℃、1200X、!i+で30分間遠心分
離するとペレット状となる。このペレットを約20ロー
のリン酸塩緩衝液に溶解し、透析袋に移し、リン酸塩緩
衝液に対し4℃で透析する。
緩衝液を3回かえ(各回4J)、各回最低4時間透析す
る。得られた透析液を炭酸塩−1炭酸塩緩衝液け)で1
回4看に透析する。この最終透析液のタンパク濃度はL
owry法によって定量し、12呼/−、最終容量80
0111に希釈し、以下の例4で活性化アミロースと容
易に結合するロバ抗ヤイIgG血清のグロブリン7ラク
シヨンを得る。
る。得られた透析液を炭酸塩−1炭酸塩緩衝液け)で1
回4看に透析する。この最終透析液のタンパク濃度はL
owry法によって定量し、12呼/−、最終容量80
0111に希釈し、以下の例4で活性化アミロースと容
易に結合するロバ抗ヤイIgG血清のグロブリン7ラク
シヨンを得る。
豊土
例3の操作で製造したロバ抗ヤイエga血清のグロブリ
ン分画をアミロースに結合させるために、まず、アミロ
ースを以下の工111〜16によって活性化する。
ン分画をアミロースに結合させるために、まず、アミロ
ースを以下の工111〜16によって活性化する。
1、アミロース20gを脱イオン水苔5QQllJを含
む4個の1J遠沈管にそれぞれとる。添加中および添加
後、電磁攪拌器で攪拌する。脱イオン水を加えて遠沈管
に容量いっばいにする。
む4個の1J遠沈管にそれぞれとる。添加中および添加
後、電磁攪拌器で攪拌する。脱イオン水を加えて遠沈管
に容量いっばいにする。
2、各遠沈管を室温で1時間攪拌し、アミロースを膨潤
させる。
させる。
3、各遠沈管を2500)lで5分間遠心分離して膨潤
アミロースを遠心分離する。
アミロースを遠心分離する。
4、各遠沈管の上澄液を傾瀉し、台管のペレットを工程
5に移す。
5に移す。
5、台管に脱イオン水1Jを加えて、ペレットを再懸濁
する。
する。
6、工程6.4および5をさらに2回くシ返して、計4
回洗浄する。
回洗浄する。
入 水にペレットを再懸濁し、−夜室温で水中にペレッ
トを放置し、翌日遠心分離し、傾瀉し、残った最終ペレ
ットを工119に移す。
トを放置し、翌日遠心分離し、傾瀉し、残った最終ペレ
ットを工119に移す。
8、メタ過ヨウ素酸ナトリウム25.68 Fを脱イオ
ン水700117に溶解し、容量を800−とする。
ン水700117に溶解し、容量を800−とする。
9、工1i7からの最終ペレットを各管中、工程8で製
造したメタ過ヨウ素酸(0,15M)200−に再懸濁
する。
造したメタ過ヨウ素酸(0,15M)200−に再懸濁
する。
10、工程9で再懸濁し九ペレットを室温で2時間、穏
やかに攪拌する。
やかに攪拌する。
11、エチレングリコール(液体> 49.661を脱
イオン水300−と混合する。脱イオン水で容量400
−とする。エチレングリコール添加前に遠心分離しない
。
イオン水300−と混合する。脱イオン水で容量400
−とする。エチレングリコール添加前に遠心分離しない
。
12.1程10で2時間攪拌したのちに、工程11で調
製した2Mエチレングリコールiooyを4個の6管に
加え、管の内容物を室温で穏やかに60分間攪拌する。
製した2Mエチレングリコールiooyを4個の6管に
加え、管の内容物を室温で穏やかに60分間攪拌する。
。
16、工程2の遠沈管を5分間、2500XNで遠心分
離する。6管を傾瀉し、ペレットを分離する。
離する。6管を傾瀉し、ペレットを分離する。
14、工l!13のペレットを別個に、炭酸塩−重炭酸
塩緩衝液(例6の(1)IJに再懸濁し、15〜60分
攪拌する。
塩緩衝液(例6の(1)IJに再懸濁し、15〜60分
攪拌する。
15、工程15および14をさらに2回〈シ返す。
16、上澄液を傾瀉し、例3の方法によって製造したロ
バ抗ヤイIgG血清のグロブリン分画と結合できる活性
化アミロースを含むペレットが得られる。
バ抗ヤイIgG血清のグロブリン分画と結合できる活性
化アミロースを含むペレットが得られる。
例5
0バ抗ヤイIg()血清のグロブリン分画と活性化アミ
ロースの結合 ロバ抗ヤイIgG血清のグロブリン分画(例3の方法で
調製)の活性化アミロース(例4の方法で調製)への結
合は、以下の成分および操作によって行われる。
ロースの結合 ロバ抗ヤイIgG血清のグロブリン分画(例3の方法で
調製)の活性化アミロース(例4の方法で調製)への結
合は、以下の成分および操作によって行われる。
活性化7 i o−2膨f14デル40〇−1(例4)
ロバ抗ヤギエgG8001111゜
2 (例6)
リン酸塩緩衝化食塩水 約27゜6 (PB
S)pH7,4 4水素化ホウ素ナトリウム 0.895
ウシ血清アルブミン 4.896 ナ
トリウムアジド 1.6g操作 1、活性化アミロースの各ペレット(乾燥重量20g1
例4の方法で調製し、100−に膨潤)を含む4個の各
遠沈管にロバ抗ヤギrgG (例3で調製)12■/l
lj%2001111jを加え、アミロースとIgGを
結合させる。
S)pH7,4 4水素化ホウ素ナトリウム 0.895
ウシ血清アルブミン 4.896 ナ
トリウムアジド 1.6g操作 1、活性化アミロースの各ペレット(乾燥重量20g1
例4の方法で調製し、100−に膨潤)を含む4個の各
遠沈管にロバ抗ヤギrgG (例3で調製)12■/l
lj%2001111jを加え、アミロースとIgGを
結合させる。
2、結合紘攪拌下に56〜48時間、室温で行う。
6、管を5分間2500)lで遠心分離する。
4.6管の上澄液のタンパクを280の0.D。
でチェックする。
5、リン酸塩緩衝食塩水80011JK水素化ホウ素ナ
トリウム0.8gを加える。
トリウム0.8gを加える。
6、アンロース−タンパクを含む工程3の4個の遠沈管
のそれぞれに、水素化ホウ素ナトリウム溶液20011
jを加える。得られた懸濁液を室温で1時間穏やかに攪
拌する。
のそれぞれに、水素化ホウ素ナトリウム溶液20011
jを加える。得られた懸濁液を室温で1時間穏やかに攪
拌する。
7、工程6の懸濁液を攪拌後、得られた6管の還元アミ
ロース−タンパクデルを工程3と同様にして遠心分離し
、上澄液は捨てる。
ロース−タンパクデルを工程3と同様にして遠心分離し
、上澄液は捨てる。
8.6管のデルをリン酸塩緩衝食塩水で1Jとし、再懸
濁し−fi−グルを室温で10〜20分攪拌する。
濁し−fi−グルを室温で10〜20分攪拌する。
96 攪拌後、))aルを工程3のようにして遠心分
離する。上澄液を捨て、工程3および9を2回〈ル返す
。
離する。上澄液を捨て、工程3および9を2回〈ル返す
。
10、ibれた各管中の4個のアミロース−タンパクペ
レットをそれぞれPB8200−に再懸濁し、2ぷにな
るまで洗液と交換し、アミ四−スータンパク懸濁液を得
る。
レットをそれぞれPB8200−に再懸濁し、2ぷにな
るまで洗液と交換し、アミ四−スータンパク懸濁液を得
る。
11、ウシ血清アルブミン4.8gおよびナトリウムア
ジド1.6gをPB81QQ−に攪拌下に加える。この
溶液をアミロース−タンパク懸濁液に加える。
ジド1.6gをPB81QQ−に攪拌下に加える。この
溶液をアミロース−タンパク懸濁液に加える。
12、アミロース−タンパク懸濁液にPBSを加えて5
%水性懸濁液、最終容量1600−とする。
%水性懸濁液、最終容量1600−とする。
例6
生物学的液体サンプル中のPAP活性は以下の操作によ
シ定量する。
シ定量する。
A)試験血清サンプルまたは対照2004をピペットで
試験管にとる。水ゾ2ンクとして蒸留水2004を他の
試験管に加える。例2の方法で得られ九ヤイ抗−PAP
血清204を6管に加える。得られた混合物を混合した
のち、室温で15分間インキエベートする。よく攪拌し
たアミn−スータンパク懸濁液(例5の方法で調製)2
00超を6管に加える。試験管を混合し、室温で15分
間インキエベートさせる。0.9%食塩水(蒸留水10
00−に対し塩化ナトリウム9.0L)3.oNlを6
管に加え、管を混合する。6管を1500)lで10分
間遠心分離し、上澄液を傾瀉して除去すると、以下のB
)に用いる同相ペレット含有試験管が得られる。
試験管にとる。水ゾ2ンクとして蒸留水2004を他の
試験管に加える。例2の方法で得られ九ヤイ抗−PAP
血清204を6管に加える。得られた混合物を混合した
のち、室温で15分間インキエベートする。よく攪拌し
たアミn−スータンパク懸濁液(例5の方法で調製)2
00超を6管に加える。試験管を混合し、室温で15分
間インキエベートさせる。0.9%食塩水(蒸留水10
00−に対し塩化ナトリウム9.0L)3.oNlを6
管に加え、管を混合する。6管を1500)lで10分
間遠心分離し、上澄液を傾瀉して除去すると、以下のB
)に用いる同相ペレット含有試験管が得られる。
B)PAP発色基質溶液を、Worthingtonチ
モールフタレイン七ノリン酸エステルナトノリン酸エス
テルナトリウム1バイアルjを加えて調製する。フラス
コを靜かにまわして、基質を完全に溶解させる。この基
質溶液は2〜8℃で60日間、18〜26℃で2日間保
存できる。この基質溶液の温度を室温まで上昇させる。
モールフタレイン七ノリン酸エステルナトノリン酸エス
テルナトリウム1バイアルjを加えて調製する。フラス
コを靜かにまわして、基質を完全に溶解させる。この基
質溶液は2〜8℃で60日間、18〜26℃で2日間保
存できる。この基質溶液の温度を室温まで上昇させる。
A)の同相ペレットを含む試験管を37℃の水浴に浸し
、5分間放置平衡化させる。次にPAP比色基質溶液0
.5dを固相ぺVットを含む各試験管に加える。次に各
試験管を混合し、第一の試験管(サンプル管)K基質を
添加したのち、67℃で60分間インキエベートする。
、5分間放置平衡化させる。次にPAP比色基質溶液0
.5dを固相ぺVットを含む各試験管に加える。次に各
試験管を混合し、第一の試験管(サンプル管)K基質を
添加したのち、67℃で60分間インキエベートする。
30分の終わフに、アルカリ性Worthing−to
n溶液を台管に加え、混合し、15001’で10分関
連心分離する。得られた台管の上澄液の吸光度をスペク
トロメーターにより 590 nmで測定する。
n溶液を台管に加え、混合し、15001’で10分関
連心分離する。得られた台管の上澄液の吸光度をスペク
トロメーターにより 590 nmで測定する。
C) B)において使用し+pAp発色基質溶液は以
下のようにして製造する。
下のようにして製造する。
サンプルまたは対照中のPAP濃度を知るには慣用のW
orthingtonチモールフタレイン希釈液を調製
して標準曲線を作る。血清サンプルまたは対照の吸光度
から水ブランクの吸光度を差引き、補正した吸光度によ
って標準曲線からPAPの濃度を読む。
orthingtonチモールフタレイン希釈液を調製
して標準曲線を作る。血清サンプルまたは対照の吸光度
から水ブランクの吸光度を差引き、補正した吸光度によ
って標準曲線からPAPの濃度を読む。
代理人 浅 村 皓
手続補正書(自制
昭和57年8月1b日
特許庁長官殿
1、事件の表示
昭和57年特許願第107519 号−2、発明の名
称 前立腺酸ホスファターゼアイソデイムの定量方法3、補
正をする者 事件との関係 特許出願人 4、代理人 5、補正命令の日付 昭和 年 月 日 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象 明細書
称 前立腺酸ホスファターゼアイソデイムの定量方法3、補
正をする者 事件との関係 特許出願人 4、代理人 5、補正命令の日付 昭和 年 月 日 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象 明細書
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)生物学的液体サンプル中の前立腺酸ホスファター
ゼアインデイムを定量するにめたシs ”)サンプルを
(1)本アイノデイムの酵素活性を阻害することなくサ
ンプルの本アインデイムを選択的に免疫学的に結合する
可溶性の第一の抗体および(it)本アイソデイムの酵
素活性を阻害することなく第一の抗体と選択的に免疫学
的に結合する第二の抗体をアミロースに結合させて形成
させた不溶化抗体とインキユベートして、アイソデイム
ー第一の抗体−第二の抗体および第一の抗体−第二の抗
体を含有する免疫複合体の混合物を沈殿として得s b
)免疫複合体を含む沈殿を単一しs c)沈殿中のアイ
ソデイム活性を測定することを特徴とする定量、方法 (2)生物学的液体サンプルは血清である特許請求の範
囲第1項記載の定量方法 (3)纂−の抗体はヤイ抗前立腺酸ホスファターゼであ
シ第二の抗体はロバ抗ヤギIgGである特許請求の範囲
第1項および第2項のいずれか一つに記載の定量方法 (4)アイソデイム活性は分光測光法によって測定する
特許請求の範囲第1項から第3項までのいずれか一つに
記載の定量方法 (5)分光側光法は比色試薬を用いて行う特許請求の範
囲第4項記載の定量方法 (6)比色試薬はチモールフタレイン−リン酸エステル
またはその塩基付加塩である特許請求の範囲第5項記載
の定量方法 (7) 生物学的液体サンプル中の前立腺酸ホスファ
ターゼアイソデイムを定量するための診断試験用キット
システムにおいて、a)本アイソデイムと選択的に免疫
学的に結合できる抗体を含有する第一の容器、b)第一
の容器中に含有される抗体と選択的に免疫学的に結合で
きる第二の抗体をアミロースに結合させて形成させた不
溶化抗体を含有する第二の容器、およびC)本アイソデ
イムの酵素活性を定量できる試薬からなるキットシステ
ム(8) ア(ン結合を介してアミロースに結合させ
九タンパクからなる組成物 (9) タンパクは免疫グロブリンである特許請求の
範囲第8項記載の組成物
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US27622381A | 1981-06-22 | 1981-06-22 | |
US276223 | 1981-06-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS585661A true JPS585661A (ja) | 1983-01-13 |
Family
ID=23055717
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57107519A Pending JPS585661A (ja) | 1981-06-22 | 1982-06-22 | 前立腺酸ホスフアタ−ゼアイソザイムの定量方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0068291B1 (ja) |
JP (1) | JPS585661A (ja) |
AT (1) | ATE16407T1 (ja) |
AU (1) | AU539531B2 (ja) |
CA (1) | CA1185525A (ja) |
DE (1) | DE3267265D1 (ja) |
DK (1) | DK261282A (ja) |
ES (1) | ES8307378A1 (ja) |
FI (1) | FI821821A (ja) |
NO (1) | NO822067L (ja) |
Families Citing this family (3)
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US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
US6942862B2 (en) | 1996-04-01 | 2005-09-13 | University Of Washington | Methods and compositions to generate immunity in humans against self tumor antigens by immunization with homologous foreign proteins |
CN103808712B (zh) * | 2012-11-05 | 2017-12-19 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种用于酸性磷酸酶检测的液体试剂盒和检测方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS54124797A (en) * | 1978-02-27 | 1979-09-27 | Hoffmann La Roche | Method of measuring ldh1 activity of serum |
JPS55107958A (en) * | 1979-02-23 | 1980-08-19 | Corning Glass Works | Method of analyzing creatine kinase isooenzyme |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4048298A (en) * | 1975-02-25 | 1977-09-13 | Rohm And Haas Company | Solid phase double-antibody radioimmunoassay procedure |
DE2952478A1 (de) * | 1979-12-27 | 1981-07-30 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und mittel zur immunologischen bestimmung von enzymen |
-
1982
- 1982-05-17 CA CA000403059A patent/CA1185525A/en not_active Expired
- 1982-05-21 FI FI821821A patent/FI821821A/fi not_active Application Discontinuation
- 1982-06-10 DK DK261282A patent/DK261282A/da not_active Application Discontinuation
- 1982-06-15 AT AT82105246T patent/ATE16407T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-06-15 EP EP82105246A patent/EP0068291B1/de not_active Expired
- 1982-06-15 DE DE8282105246T patent/DE3267265D1/de not_active Expired
- 1982-06-21 AU AU85051/82A patent/AU539531B2/en not_active Ceased
- 1982-06-21 ES ES513286A patent/ES8307378A1/es not_active Expired
- 1982-06-21 NO NO822067A patent/NO822067L/no unknown
- 1982-06-22 JP JP57107519A patent/JPS585661A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS54124797A (en) * | 1978-02-27 | 1979-09-27 | Hoffmann La Roche | Method of measuring ldh1 activity of serum |
JPS55107958A (en) * | 1979-02-23 | 1980-08-19 | Corning Glass Works | Method of analyzing creatine kinase isooenzyme |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA1185525A (en) | 1985-04-16 |
EP0068291A1 (de) | 1983-01-05 |
DK261282A (da) | 1982-12-23 |
DE3267265D1 (en) | 1985-12-12 |
AU8505182A (en) | 1983-01-06 |
NO822067L (no) | 1982-12-23 |
ATE16407T1 (de) | 1985-11-15 |
ES513286A0 (es) | 1983-07-01 |
FI821821A (fi) | 1982-12-23 |
EP0068291B1 (de) | 1985-11-06 |
ES8307378A1 (es) | 1983-07-01 |
AU539531B2 (en) | 1984-10-04 |
FI821821A0 (fi) | 1982-05-21 |
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