JPS59120094A - 発酵法によるｌ−プロリンの製法 - Google Patents
発酵法によるｌ−プロリンの製法Info
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- JPS59120094A JPS59120094A JP22853282A JP22853282A JPS59120094A JP S59120094 A JPS59120094 A JP S59120094A JP 22853282 A JP22853282 A JP 22853282A JP 22853282 A JP22853282 A JP 22853282A JP S59120094 A JPS59120094 A JP S59120094A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はコリネバクテリウム属に属し、ヒボキサンチン
および、イノシトールの少なくとも一種を生育に必要と
するし一プロリン生産性の微生物を培養する発酵法によ
るし一プロリンの製造法に関する。
および、イノシトールの少なくとも一種を生育に必要と
するし一プロリン生産性の微生物を培養する発酵法によ
るし一プロリンの製造法に関する。
Ｌ−プロリンは医薬・食品・飼料添加物等として有用な
アミノ酸である。
アミノ酸である。
従来発酵法によるし一プロリンの製造法として。
コリネバクテリウム属の微生物がＬ−プロリンを生成す
ることは公知である。
ることは公知である。
また２種々の要求性あるいは抵抗性を付与した変異株に
よる方法も知られている。
よる方法も知られている。
好収率の生産菌については常に開発が望まれており、こ
の目的のために変異株について検討の結果コリネバクテ
リウム属細菌にヒボキサンチンおよびイノシトールの少
なくとも１種に対する要求性を付与することにより、プ
ロリン生産能が向上することを見出し２本発明を完成す
るに至った。
の目的のために変異株について検討の結果コリネバクテ
リウム属細菌にヒボキサンチンおよびイノシトールの少
なくとも１種に対する要求性を付与することにより、プ
ロリン生産能が向上することを見出し２本発明を完成す
るに至った。
公に本発明の詳細な説明する。
すなわち３本発明によれば、コリネバクテリウム属に属
し、ヒボキサンチンおよびイノシトールの少なくとも１
種を生育に要求し、かつＬ−プロリン生産能を有する微
生物を炭素源、窒素源およびその他の栄養物質を含有す
る培地に培養し、生成したし一プロリンを採取すること
によりＬ−プロリンを製造することができる。
し、ヒボキサンチンおよびイノシトールの少なくとも１
種を生育に要求し、かつＬ−プロリン生産能を有する微
生物を炭素源、窒素源およびその他の栄養物質を含有す
る培地に培養し、生成したし一プロリンを採取すること
によりＬ−プロリンを製造することができる。
本発明で用いられる微生物としては、コリネバクテリウ
ム属に属し５ ヒボキサンチンおよびイノシトールの少
なくとも１種を生育に必要とする菌株より選ばれるＬ−
プロリン生産能を有する菌株が挙げられるが、更に他の
栄養要求性、またはサルファ剤、プロリンアナログ等の
薬剤耐性等を併せ有する菌株も使用できる。本発明に用
いる菌株は上記のごとき性質の他に、他のし一プロリン
生産に寄与するいかなる性質を備えていてもさしつかえ
ない。
ム属に属し５ ヒボキサンチンおよびイノシトールの少
なくとも１種を生育に必要とする菌株より選ばれるＬ−
プロリン生産能を有する菌株が挙げられるが、更に他の
栄養要求性、またはサルファ剤、プロリンアナログ等の
薬剤耐性等を併せ有する菌株も使用できる。本発明に用
いる菌株は上記のごとき性質の他に、他のし一プロリン
生産に寄与するいかなる性質を備えていてもさしつかえ
ない。
上記要求性変異株を得るための変異誘導法は紫外線照射
、Ｘ線照射あるいは薬剤処理（例えばニトロソグアニジ
ン、エチルメタンスルフォネート等）により行う他に自
然変異によっても該変異株は得られる。
、Ｘ線照射あるいは薬剤処理（例えばニトロソグアニジ
ン、エチルメタンスルフォネート等）により行う他に自
然変異によっても該変異株は得られる。
本発明の実施例で用いる菌株の変異操作をざらに詳細に
述べる。親株をブイヨン培地で一夜振盪培養後簗菌し、
トリス・マレート緩衝液（硫安１ｇ／ｊ！、ＭｇＳＯ４
Ｈ７Ｈ２００−１ｇ／（１゜ＣａＣ７！２・２Ｈ２０５
ｍｇ／（１，Ｆｅ ＳＯ４・７Ｈ２００，２５ｗ／ｊ！
を含ムｐＨ６，００，０５Ｍトリス・アレイン酸緩衝液
）で洗浄した後、ニトロソグアニジン１■／ｍ＋を溶か
した同経ｉｈ液に懸濁し、３０分間３０ ’ｃで静置後
直ちに同緩衝液で２度洗浄し３次いで？゛イヨン培地そ
の４１！！濁液を植菌し、６０分間３０ ’ｃで振盪培
養を行い、培養後の液を１０４倍に稀釈してペプトン１
０ｇ／ｄｉ、ｉゲ素ｘ＊ス０．５ ｇ／ｌＵ、 肉ｘ
−＋ス０．５ ｇ／４１゜ＮａＣ（ｌ ０．２５ｇ／
ｄｉ、寒天２．５ｇ／ｄｌからなる栄養培地（ｐＨ７，
２）に塗布し、３０’１４’２日間インキユヘートする
。生育したコロニーを常法により釣菌し、 グルコ−
ｘｌ、Ｏｇ／ａ、ＮＨ４ＮＯ３０，１ｇ／ｄＪ、ＮＨ４
Ｃ６０，５ｇ／ｄ１．’ＫＯＨＯ，Ｉ ｇ／ｄｉ：
ＫＨ２ＰＯａ ０．３４ ｇ／ａ、 Ｎａ ２ＳＯａ
０．２ｇ／み、ＭｇＳＯ４・ ７ Ｈ２００，０
２ｇ／ｄｌ、 ビオチン５０γ／Ｉ２．ビタミン８．
５ｍｇ／β、ニコチン酸１２５ｍｇ／β、パントテン
酸カルシウム１２．５ｍ１ｒ／β１ トレースエレメン
ト（（ＮＨ４）２ Ｍｏ ７０２ｎ ・４ Ｈ２０９，
２５＋ｎｇ。
述べる。親株をブイヨン培地で一夜振盪培養後簗菌し、
トリス・マレート緩衝液（硫安１ｇ／ｊ！、ＭｇＳＯ４
Ｈ７Ｈ２００−１ｇ／（１゜ＣａＣ７！２・２Ｈ２０５
ｍｇ／（１，Ｆｅ ＳＯ４・７Ｈ２００，２５ｗ／ｊ！
を含ムｐＨ６，００，０５Ｍトリス・アレイン酸緩衝液
）で洗浄した後、ニトロソグアニジン１■／ｍ＋を溶か
した同経ｉｈ液に懸濁し、３０分間３０ ’ｃで静置後
直ちに同緩衝液で２度洗浄し３次いで？゛イヨン培地そ
の４１！！濁液を植菌し、６０分間３０ ’ｃで振盪培
養を行い、培養後の液を１０４倍に稀釈してペプトン１
０ｇ／ｄｉ、ｉゲ素ｘ＊ス０．５ ｇ／ｌＵ、 肉ｘ
−＋ス０．５ ｇ／４１゜ＮａＣ（ｌ ０．２５ｇ／
ｄｉ、寒天２．５ｇ／ｄｌからなる栄養培地（ｐＨ７，
２）に塗布し、３０’１４’２日間インキユヘートする
。生育したコロニーを常法により釣菌し、 グルコ−
ｘｌ、Ｏｇ／ａ、ＮＨ４ＮＯ３０，１ｇ／ｄＪ、ＮＨ４
Ｃ６０，５ｇ／ｄ１．’ＫＯＨＯ，Ｉ ｇ／ｄｉ：
ＫＨ２ＰＯａ ０．３４ ｇ／ａ、 Ｎａ ２ＳＯａ
０．２ｇ／み、ＭｇＳＯ４・ ７ Ｈ２００，０
２ｇ／ｄｌ、 ビオチン５０γ／Ｉ２．ビタミン８．
５ｍｇ／β、ニコチン酸１２５ｍｇ／β、パントテン
酸カルシウム１２．５ｍ１ｒ／β１ トレースエレメン
ト（（ＮＨ４）２ Ｍｏ ７０２ｎ ・４ Ｈ２０９，
２５＋ｎｇ。
ＦｅＣ（２３・６Ｈ２０２４２，５ｍ１ｒ、Ｚｎ５Ｏａ
・７Ｈ２０２２ｍｇ、ＣｕＣβ２・２Ｈ２０６７，５１
１１ｇ、Ｍｎ３Ｏ４１７，５ｍｇを蒸留水に溶かして５
００ｍ１としたもの）１＋ｎｌ／ｆｆ、寒天２．５ｇ／
ａの組成を有する最少培地（ｐｌ＋ ７．２） 、最少
培地にヒボキサンチン５０■／βを添加した培地、最少
培地にイノシトール５■／βを添加した培地および最少
培地にヒボキサンチン５０■／βとイノシトール５■／
１を添加した培地の４種類の培地に塗布し。
・７Ｈ２０２２ｍｇ、ＣｕＣβ２・２Ｈ２０６７，５１
１１ｇ、Ｍｎ３Ｏ４１７，５ｍｇを蒸留水に溶かして５
００ｍ１としたもの）１＋ｎｌ／ｆｆ、寒天２．５ｇ／
ａの組成を有する最少培地（ｐｌ＋ ７．２） 、最少
培地にヒボキサンチン５０■／βを添加した培地、最少
培地にイノシトール５■／βを添加した培地および最少
培地にヒボキサンチン５０■／βとイノシトール５■／
１を添加した培地の４種類の培地に塗布し。
３０°Ｃでインキュベートする。最少培地には生育モす
、他の３種類のいずれかに生育するコロニーの中からＬ
−プロリン生産性の優れた菌株を得る。
、他の３種類のいずれかに生育するコロニーの中からＬ
−プロリン生産性の優れた菌株を得る。
かくして得られるヒボキサンチンもしくはイノシトール
要求性でかつＬ−プロリン生産能を有する菌株としては
、コリネバクテリウム・アセトアジドフィルム ＡＴＣ
Ｃ−１３８７０から変異誘導されたＨ −２６１５（ヒ
ボキサンチン要求性株）（微工研菌寄第 ６８３６ 号
） 、 Ｈ−２６１７（イノシトール要求性株）（微工
研菌寄第 ６８３７ 号）が例示される。これら例示の
菌株の栄養要求性の程度についての実験結果を第１表に
示す。
要求性でかつＬ−プロリン生産能を有する菌株としては
、コリネバクテリウム・アセトアジドフィルム ＡＴＣ
Ｃ−１３８７０から変異誘導されたＨ −２６１５（ヒ
ボキサンチン要求性株）（微工研菌寄第 ６８３６ 号
） 、 Ｈ−２６１７（イノシトール要求性株）（微工
研菌寄第 ６８３７ 号）が例示される。これら例示の
菌株の栄養要求性の程度についての実験結果を第１表に
示す。
第１表
本発明で用いられる培地としては炭素源、窒素源、無機
物、その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程良く
含有するものであれは合成培地および天然培地のいずれ
も使用可能である。炭素源。
物、その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程良く
含有するものであれは合成培地および天然培地のいずれ
も使用可能である。炭素源。
窒素源は使用菌株の利用可能なものならはいずれの４１
１１ｆｌを用いることかできる。炭素源としては。
１１ｆｌを用いることかできる。炭素源としては。
クルコース、フラクトース、ンユクロース、マルト−ス
、マンノース、ソルビトール等の炭水化物。
、マンノース、ソルビトール等の炭水化物。
糖アルコール、グリセロール、殿粉、殿粉加水分解物、
糖蜜などが使用でき、また酢酸、ピルビン酸、乳酸、フ
マール酸、グルコン酸などの有機酸。
糖蜜などが使用でき、また酢酸、ピルビン酸、乳酸、フ
マール酸、グルコン酸などの有機酸。
およびグルタミン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸類
、あるいはエタノールなどの低級アルコールも使用可能
である。
、あるいはエタノールなどの低級アルコールも使用可能
である。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
、酢酸アンモニウムなどの各種無−ｔ７３１および有機
アンモニウム塩類、あるいはグルコミン酸、アスパラギ
ン酸などのアミノ酸類、尿素および他の窒素含有物質例
えはペプトン、肉エキス５ コーン・スヂーブ・リカー
、カゼイン加水分解物、大豆粕の加水分解物などの窒素
含有有機物等が使用可能である。
アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
、酢酸アンモニウムなどの各種無−ｔ７３１および有機
アンモニウム塩類、あるいはグルコミン酸、アスパラギ
ン酸などのアミノ酸類、尿素および他の窒素含有物質例
えはペプトン、肉エキス５ コーン・スヂーブ・リカー
、カゼイン加水分解物、大豆粕の加水分解物などの窒素
含有有機物等が使用可能である。
Ｌ−グルタミン酸塩およびＤ−、Ｌ−オよびＤＬ−ピロ
リドンカルボン酸の添加はし一プロリンの収率向上に特
に効果的である。
リドンカルボン酸の添加はし一プロリンの収率向上に特
に効果的である。
無機物としてはリン酸−カリウム、リン酸二カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸
マンガンおよび炭酸カルシウム等を利用する。
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸
マンガンおよび炭酸カルシウム等を利用する。
さらに、ビオチン、ニコチンアミド、パントテン酸、サ
イアミン等の微生物の生育に必要なビタミン類も使用す
るが、前記のような他の培地組成に伴って培地に供され
れば特に加えなくともよい。
イアミン等の微生物の生育に必要なビタミン類も使用す
るが、前記のような他の培地組成に伴って培地に供され
れば特に加えなくともよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は一般に２０〜４０°Ｃが好適であ
る。培地中のｐＨは中性付近（ｐＨ５〜９）に維持する
ことが高収率を上げるためには望ましいが、これらの温
度、ｐＨ条件は本発明の実施に必須の条件ではない。培
養期間は通常１〜５日間で培地中に著量のＬ−プロリン
が蓄積する。
下で行う。培養温度は一般に２０〜４０°Ｃが好適であ
る。培地中のｐＨは中性付近（ｐＨ５〜９）に維持する
ことが高収率を上げるためには望ましいが、これらの温
度、ｐＨ条件は本発明の実施に必須の条件ではない。培
養期間は通常１〜５日間で培地中に著量のＬ−プロリン
が蓄積する。
培養終了後、菌対を除去して実施例に示した如くイオン
交換樹脂および活性炭処理等の公知の方法で培養液から
し一プロリンが回収される。
交換樹脂および活性炭処理等の公知の方法で培養液から
し一プロリンが回収される。
次に実施例を示ず。
実施例１゜
肉エキス５ｇ／β、ペプトン１０ｇ／β、酵母エキス３
ｇ／ｌ、食塩３ｇ／Ｉｌ （ｐＨ７，２）からなる組
成の種培養培地３０ｍ１を２５０ｍ１容三角フラスコに
入れ殺菌後、第２表に示す菌株を接種して３０℃、２２
０ｒｐｍで２４時間振とう培養する。
ｇ／ｌ、食塩３ｇ／Ｉｌ （ｐＨ７，２）からなる組
成の種培養培地３０ｍ１を２５０ｍ１容三角フラスコに
入れ殺菌後、第２表に示す菌株を接種して３０℃、２２
０ｒｐｍで２４時間振とう培養する。
下記の培地組成を有する本発酵培地３’ ＯＯｍｌずつ
を２４容バツフル付三角フラスコに分注し、殺菌後、前
記種培養液３０ｍ１を植菌し３２°ｃ、２２Ｏｒｐｍで
４日間培養する。発酵液中に蓄積したし−プロリンの蓄
積量は第２表に示される。
を２４容バツフル付三角フラスコに分注し、殺菌後、前
記種培養液３０ｍ１を植菌し３２°ｃ、２２Ｏｒｐｍで
４日間培養する。発酵液中に蓄積したし−プロリンの蓄
積量は第２表に示される。
本発酵培地
グルコース１００ｇ／ｆｆ、ＫＨ２Ｐ○４ ３ｇ／ ｊ
２ 、 Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７Ｉ］２００．５ｇ／β、
硫安１０ｇ／ｐ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０■／Ｉ２．
ニコチン酸１０■／β、チアミン塩酸塩１００μｇ ／
７！、ビオチン１００μｇ ／ ７！、コーン・スチ
ープ・リカー２０ビ／β、Ｌ−グルタミン酸ソーダ２０
ｇ／ＣおよびＣａＣＯ３３０ｇ／β（ｐＨ７，４） 第 ２ 表 Ｌ−プロリン 実施例２゜ 下記のごとき組成を有する種培養培地２００ｍ１を２β
容バツフル付三角フラスコに入れ殺菌後Ｈ−２６１５ま
たはＨ−２６１７を接種し、３０’Ｃ２２Ｏｒｐｍで２
４時間振盪培養する。
２ 、 Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７Ｉ］２００．５ｇ／β、
硫安１０ｇ／ｐ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０■／Ｉ２．
ニコチン酸１０■／β、チアミン塩酸塩１００μｇ ／
７！、ビオチン１００μｇ ／ ７！、コーン・スチ
ープ・リカー２０ビ／β、Ｌ−グルタミン酸ソーダ２０
ｇ／ＣおよびＣａＣＯ３３０ｇ／β（ｐＨ７，４） 第 ２ 表 Ｌ−プロリン 実施例２゜ 下記のごとき組成を有する種培養培地２００ｍ１を２β
容バツフル付三角フラスコに入れ殺菌後Ｈ−２６１５ま
たはＨ−２６１７を接種し、３０’Ｃ２２Ｏｒｐｍで２
４時間振盪培養する。
種培養培地
シュクロース６０ｇ／β、ＫＨ２Ｐ○ａ ２ｇ／β、
ＭｇＳ○４・７Ｈ２００，５ｇ／β。
ＭｇＳ○４・７Ｈ２００，５ｇ／β。
Ｆｅ３Ｏ３・７Ｈ２０１０ｍｇ／ｊ！、ＭｎＳ○４・４
Ｈ２０１０■／β、コーンスチープ・リカー１０ｇ／／
２．チアミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ビオチン１００μ
ｇ／ｊｌ！、尿素３ｇ／β（ｐＨ７，４） 下記の組成の本発酵培地を２１１容ジヤー・ファーメン
タ−に７００：ｎｌずつ分注し、殺菌後前述の種培養液
を１００ｍ１植菌し、３２℃にて通気攪拌培養する。培
養中のｐＨコントロー１１番よ西Ｖ酸溶液を自動的に添
加してｐ Ｈ７，０？こ維（寺する。
Ｈ２０１０■／β、コーンスチープ・リカー１０ｇ／／
２．チアミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ビオチン１００μ
ｇ／ｊｌ！、尿素３ｇ／β（ｐＨ７，４） 下記の組成の本発酵培地を２１１容ジヤー・ファーメン
タ−に７００：ｎｌずつ分注し、殺菌後前述の種培養液
を１００ｍ１植菌し、３２℃にて通気攪拌培養する。培
養中のｐＨコントロー１１番よ西Ｖ酸溶液を自動的に添
加してｐ Ｈ７，０？こ維（寺する。
本発酵培地
シュクロース２０ ｇ／Ｌ 酢酸アンモニウム７ｇ／β
、Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２００，６ｇ／β。
、Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２００，６ｇ／β。
ＫＨ２ＰＯ’４ ４ ｇ／ ７！、硫安５ｇ／ｊ２．Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２０’ １０ｒｒｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４
ＨｊＨ２０１０ｍｇ／ｌ−、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０１■
／β、チアミン塩酸塩１００μｇ ／ ＩＩ 、 ビオ
チン１００μｇ ／ Ｉｔ （ｐ Ｈ７，４）７２時間
培養によって初発液量番こ対し１５％の酢酸を消費し、
Ｈ−２６１５，、Ｈ−２６１７のし−プロリン蓄積量は
それぞれ４１ｇ／β、３９ｇ／ｐである。同様に培養し
た親キ朱ＡＴＣＣ−１３８７０は０．８ｇ／βである。
ｅＳＯ４・７Ｈ２０’ １０ｒｒｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４
ＨｊＨ２０１０ｍｇ／ｌ−、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０１■
／β、チアミン塩酸塩１００μｇ ／ ＩＩ 、 ビオ
チン１００μｇ ／ Ｉｔ （ｐ Ｈ７，４）７２時間
培養によって初発液量番こ対し１５％の酢酸を消費し、
Ｈ−２６１５，、Ｈ−２６１７のし−プロリン蓄積量は
それぞれ４１ｇ／β、３９ｇ／ｐである。同様に培養し
た親キ朱ＡＴＣＣ−１３８７０は０．８ｇ／βである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 コリネバクテリウム属に属し、ヒボキサンチンおよびイ
ノシトールの少なくとも一種を生育に要求するし一プロ
リン生産能を有する微生物を培養し、培養液中にＬ−プ
ロリンを生成Ｅ積せしめ。 これを採取することを特徴とするし一プロリンの製造法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22853282A JPS59120094A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−プロリンの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22853282A JPS59120094A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−プロリンの製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59120094A true JPS59120094A (ja) | 1984-07-11 |
Family
ID=16877878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22853282A Pending JPS59120094A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−プロリンの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59120094A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017071890A1 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-04 | Nestec S.A. | Natural flavor base and process for its preparation |
-
1982
- 1982-12-27 JP JP22853282A patent/JPS59120094A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017071890A1 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-04 | Nestec S.A. | Natural flavor base and process for its preparation |
| US10980248B2 (en) | 2015-10-27 | 2021-04-20 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Natural flavor base and process for its preparation |
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