JPS59120091A - 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法Info
- Publication number
- JPS59120091A JPS59120091A JP22791282A JP22791282A JPS59120091A JP S59120091 A JPS59120091 A JP S59120091A JP 22791282 A JP22791282 A JP 22791282A JP 22791282 A JP22791282 A JP 22791282A JP S59120091 A JPS59120091 A JP S59120091A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tryptophan
- strain
- producing
- chorismate mutase
- genus bacillus
- Prior art date
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
木Ｊ６明は、発酵法にょるＬ −１−ｕブトファン（以
下、トリプトファン る。
下、トリプトファン る。
Ｋ来１１フｌ−ファンの製造法としては、トリプトファ
ンの前駆物質であるアントラニル酸、インドール或は３
−インドールピルビン酸よりトリプトファンを製造する
方法が知られている。
ンの前駆物質であるアントラニル酸、インドール或は３
−インドールピルビン酸よりトリプトファンを製造する
方法が知られている。
これら前駆物質を使用する方法に勾し、前１駆物質を使
用しないで、糖類等を炭素源とし、バチルス属に属しト
リブトファンアナロクに耐性を有スる変異株を使用して
直接発酵法によりトリゾ）・ファンを生産する方法（特
公昭４８−１．８８２８、特公昭５３−３９５１７ ）
か開発されている。
用しないで、糖類等を炭素源とし、バチルス属に属しト
リブトファンアナロクに耐性を有スる変異株を使用して
直接発酵法によりトリゾ）・ファンを生産する方法（特
公昭４８−１．８８２８、特公昭５３−３９５１７ ）
か開発されている。
そこで、木発明者らはバチルス属の微生物を用いて更に
糖類等の炭素源からトリゾ）ファンを直接発酵法により
安価に製造する方法を開発すべく研究を行った結果、バ
チルス属の上記のようなｌ・リプトファンアナログ耐性
を有するトリプトファン生産菌から誘導したコリスミ酸
ムクーゼの活性の弱化した変異株かりに大量のトリプト
ファンを生産することを見い出した。
糖類等の炭素源からトリゾ）ファンを直接発酵法により
安価に製造する方法を開発すべく研究を行った結果、バ
チルス属の上記のようなｌ・リプトファンアナログ耐性
を有するトリプトファン生産菌から誘導したコリスミ酸
ムクーゼの活性の弱化した変異株かりに大量のトリプト
ファンを生産することを見い出した。
本発明はこの知見に基づいて更に研究の結果完成された
ものである。
ものである。
本発明でいうコリスミ酸ムターゼとは、バチルス属の微
生物においてＬ−チロンンナラびにＬ−フェニルアラニ
ンの生合成に関与する酵素であり、芳香族アミノ酸の生
合成の中間体であるコリスミ酸をプレフェン酸に異性化
せしめる酵素（酵素番号ＥＣ５，４，９９，５）である
。コリスミ酸ムターゼ活性は公知の方法、例えばＲ，Ｇ
、Ｈ，Ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆ、Ｇｉｂｓｏｎ。
生物においてＬ−チロンンナラびにＬ−フェニルアラニ
ンの生合成に関与する酵素であり、芳香族アミノ酸の生
合成の中間体であるコリスミ酸をプレフェン酸に異性化
せしめる酵素（酵素番号ＥＣ５，４，９９，５）である
。コリスミ酸ムターゼ活性は公知の方法、例えばＲ，Ｇ
、Ｈ，Ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆ、Ｇｉｂｓｏｎ。
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ、 １
’００巻、７６ペー７．１９６５年。
’００巻、７６ペー７．１９６５年。
或は１．５ｈｉｉｏ ａｎｄ Ｓ、 Ｓｕｇｉｍｏｔｏ
、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８６巻、１７ペー７、
１９７９年などの文献に記載された方法て測定すること
ができる。
、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８６巻、１７ペー７、
１９７９年などの文献に記載された方法て測定すること
ができる。
本発明ていうトリプトファンアナログとはバチルス属に
属する微生物の生育を阻害し、この生育阻害がＬ−トリ
プトファンの存在によって部分的又は完全に解除される
ような薬剤をいい、例えば５−メチルｉ・リプトファン
等の５．６又は７−低級アルキルトリプトファン、５−
フルオロトリプトファン等の５又は６−バロゲノトリプ
トフアン、トリプトファンハイドロキサメート、又は７
−アザトリプトファン 本発明で使用する変異株は、バチルス属に属し、上記の
トリプトファンアナログに耐性を有しコリスミ酸ムター
ゼの活性が弱化しかつトリプトファン生産能を有する変
異株であり、例えば次のような変異株が代表例として挙
げられる。
属する微生物の生育を阻害し、この生育阻害がＬ−トリ
プトファンの存在によって部分的又は完全に解除される
ような薬剤をいい、例えば５−メチルｉ・リプトファン
等の５．６又は７−低級アルキルトリプトファン、５−
フルオロトリプトファン等の５又は６−バロゲノトリプ
トフアン、トリプトファンハイドロキサメート、又は７
−アザトリプトファン 本発明で使用する変異株は、バチルス属に属し、上記の
トリプトファンアナログに耐性を有しコリスミ酸ムター
ゼの活性が弱化しかつトリプトファン生産能を有する変
異株であり、例えば次のような変異株が代表例として挙
げられる。
バチルス・ズブチリス ＡＪ１１９８４ ＦＥＲＭ−
Ｐ ６８４５（５−Ｆ−Ｔｒｐｒ，ＣＭＷ） バチルス・ズブチリス ＡＪ１１９８５ ＦＥＲＭ−
Ｐ ６８４６（５−Ｆ−Ｔｒｐｒ，ＣＭＷ） （ 註） ５ Ｆ Ｔｒｐｒ： ５−フルオロト
リプトファン耐性ＣＭｗ コリスミ酸ムターゼ弱
化これら本発明で使用される変異株は、バチルス属のト
リプトファンアナログ耐性のトリプトファン生産菌を親
株とし、これに通常の変異誘導操作、例えば紫外線照射
或はＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮーニトロングアニジ
ノ、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処理した菌液
の中からフリスミ酸ムターゼの活性の低い株を選び出す
ことにより得られる。
Ｐ ６８４５（５−Ｆ−Ｔｒｐｒ，ＣＭＷ） バチルス・ズブチリス ＡＪ１１９８５ ＦＥＲＭ−
Ｐ ６８４６（５−Ｆ−Ｔｒｐｒ，ＣＭＷ） （ 註） ５ Ｆ Ｔｒｐｒ： ５−フルオロト
リプトファン耐性ＣＭｗ コリスミ酸ムターゼ弱
化これら本発明で使用される変異株は、バチルス属のト
リプトファンアナログ耐性のトリプトファン生産菌を親
株とし、これに通常の変異誘導操作、例えば紫外線照射
或はＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮーニトロングアニジ
ノ、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処理した菌液
の中からフリスミ酸ムターゼの活性の低い株を選び出す
ことにより得られる。
コリスミ酸ムターゼ活性の低い変異株の選択方法として
は直接コリスミ酸ムターゼ活性を測定して選ぶ方法をは
じめとして種々の方法を用いることが出来るが、本発明
は変異株の選択方法に何ら限定されることはなく、コリ
スミ酸ムターゼＦ［の弱化株を用いる点に特徴がある。
は直接コリスミ酸ムターゼ活性を測定して選ぶ方法をは
じめとして種々の方法を用いることが出来るが、本発明
は変異株の選択方法に何ら限定されることはなく、コリ
スミ酸ムターゼＦ［の弱化株を用いる点に特徴がある。
上記の親株としては、トリプトファンアナログ耐性の他
にトリプトファン生産に有用な性質を有ｆ ７） ）
！Ｊ −ｉ ｈファン生産菌、例えば、Ｌ−アルギニン
、Ｌ−リンノ、■，−ロインンもしくはＬ−フェニルア
ラニノ要求性のトリプトファンａ４［（特公昭５３−３
９５１７号公報）、更にはトリプトファンアナログ耐性
でかつインドールマイノン耐性のトリプトファン生産菌
（特開昭５６−９２７９６号公報）等も使用できる。
にトリプトファン生産に有用な性質を有ｆ ７） ）
！Ｊ −ｉ ｈファン生産菌、例えば、Ｌ−アルギニン
、Ｌ−リンノ、■，−ロインンもしくはＬ−フェニルア
ラニノ要求性のトリプトファンａ４［（特公昭５３−３
９５１７号公報）、更にはトリプトファンアナログ耐性
でかつインドールマイノン耐性のトリプトファン生産菌
（特開昭５６−９２７９６号公報）等も使用できる。
その他、本発明の変異株はバチルス属の野生株ヲ親株と
し、これからフリスミ酸ムターゼの７Ｅｒ 性の弱化し
た変異株を選択した後、その変異株にトリプトファンア
ナログ耐性を付与することによっても誘導することがて
きる。
し、これからフリスミ酸ムターゼの７Ｅｒ 性の弱化し
た変異株を選択した後、その変異株にトリプトファンア
ナログ耐性を付与することによっても誘導することがて
きる。
本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、そ
の他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養
素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源とし
てはグルコース、ンユークロース、マルトース、澱粉氷
解物、糖蜜等が使用され、その他エタノール、酢酸、ク
エン酸等も単独或は上記能の炭素源と併用して用いられ
る。窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、
尿素、ペプトン等有機或は無機の窒素源が使用される。
の他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養
素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源とし
てはグルコース、ンユークロース、マルトース、澱粉氷
解物、糖蜜等が使用され、その他エタノール、酢酸、ク
エン酸等も単独或は上記能の炭素源と併用して用いられ
る。窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、
尿素、ペプトン等有機或は無機の窒素源が使用される。
有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、
核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ
酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育に
アミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合
には要求される栄養素を補添することが必要である。無
機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルノウム
塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ
酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育に
アミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合
には要求される栄養素を補添することが必要である。無
機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルノウム
塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は通常の培養条件下で行えばよく、ｐＨを５ないし
９、温度を２０ないし４０℃に制御しつつ１〜４日間振
盪培養又は通気攪拌培養することにより培養液中に著量
のトリプトファンが蓄積される。培養中にｐＨが下がる
場合には、炭素カルンウムを別殺菌して加えるか又はア
ンモニア水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。
９、温度を２０ないし４０℃に制御しつつ１〜４日間振
盪培養又は通気攪拌培養することにより培養液中に著量
のトリプトファンが蓄積される。培養中にｐＨが下がる
場合には、炭素カルンウムを別殺菌して加えるか又はア
ンモニア水、アンモニアガス等のアルカリで中和する。
又、有機酸を炭素源とする場合はｐＨの」二昇を鉱酸又
は有機酸で中和する。
は有機酸で中和する。
培養液からトリプトファンを採取する方法は、公知のト
リプトファン回収方法に従って行えばよく、培養液から
菌体を除去した後濃縮晶析する方法或はイオン交換クロ
マトグラフィー等によって採取される。
リプトファン回収方法に従って行えばよく、培養液から
菌体を除去した後濃縮晶析する方法或はイオン交換クロ
マトグラフィー等によって採取される。
以下、実施例にて説明する。
実施例１
第１表に示す組成の培地を５００１１ｅ容振とうフラス
コに５０ｍｅ宛分注し、】１０℃て１０分間加熱殺菌し
て培地を調製した。
コに５０ｍｅ宛分注し、】１０℃て１０分間加熱殺菌し
て培地を調製した。
第１表 菌体培養培地の組成（ｐＨ７，０）成
分 濃 度グルフース
５ｏｙ／を塩化アンモニウム ｌ Ｑ
／／Ｋ Ｈ４Ｆ Ｏ，ｌ ／／ Ｋ ＣＩ
’ｌ ／／ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０１０ｍ
９／ｌ ＦｅＳＯ４＊ ７Ｈ２０１０／／ カザミノ酸 ４ ２／１Ｍ ｇ Ｓ
Ｏ４・７Ｈ２００，４／／ＣａＣＯ３４０／／ 本培地に第２表に示した菌株を接種し、３０℃で２４〜
４８時間振とう培養を行い、”′培養液の２６倍稀釈液
の５７０ ｎｍの吸光度が０３〜０．４になった時点で
培養を停止した。遠心分離によって菌体を集め、５ｍＭ
のジチオスレイトールを含む５０ ｍ Ｍリン酸カリバ
ッファー（ｐ Ｈ７，０）で２回洗浄後、同バッファー
１０ｍ（！に懸濁し、細胞を超音波破砕した後、１５，
０００回転、２０分間遠心分離して得られた上澄を粗酵
素液として用いた。
分 濃 度グルフース
５ｏｙ／を塩化アンモニウム ｌ Ｑ
／／Ｋ Ｈ４Ｆ Ｏ，ｌ ／／ Ｋ ＣＩ
’ｌ ／／ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０１０ｍ
９／ｌ ＦｅＳＯ４＊ ７Ｈ２０１０／／ カザミノ酸 ４ ２／１Ｍ ｇ Ｓ
Ｏ４・７Ｈ２００，４／／ＣａＣＯ３４０／／ 本培地に第２表に示した菌株を接種し、３０℃で２４〜
４８時間振とう培養を行い、”′培養液の２６倍稀釈液
の５７０ ｎｍの吸光度が０３〜０．４になった時点で
培養を停止した。遠心分離によって菌体を集め、５ｍＭ
のジチオスレイトールを含む５０ ｍ Ｍリン酸カリバ
ッファー（ｐ Ｈ７，０）で２回洗浄後、同バッファー
１０ｍ（！に懸濁し、細胞を超音波破砕した後、１５，
０００回転、２０分間遠心分離して得られた上澄を粗酵
素液として用いた。
フリスミ酸ムターゼの活性は１．５ｈｉｉｏ、 Ｓ、
Ｓｕｇｉｍｏｔｏ。
Ｓｕｇｉｍｏｔｏ。
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８６巻１１７ペーン、］９
７９年に記載の方法で測定した。反応液は０．４ｍｅ中
に５０ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐ、Ｈ７，０）
、２．５ｍＭコリスミ酸及び粗酵素液を含み、反応を３
０℃で２０分間行った後、０．４ｍｅの１Ｎ塩酸を添加
して停止した。
７９年に記載の方法で測定した。反応液は０．４ｍｅ中
に５０ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐ、Ｈ７，０）
、２．５ｍＭコリスミ酸及び粗酵素液を含み、反応を３
０℃で２０分間行った後、０．４ｍｅの１Ｎ塩酸を添加
して停止した。
次いでそのまま３７℃で１０分間更に加温して生成した
プリフェン酸を定量的にフェニルピルビン酸に変換した
後、３．２ｍｌ！の１Ｎ苛性ソータを加え、フェニルピ
ルビン酸を３２０ｎｍにおける吸光度で測定した。また
粗酵素液中の蛋白量は兇法により０、 Ｈ，Ｌｏｗｒｙ
ら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 １９３巻、２
６５ページ、 ］］９５１に記載の方法で定量した。
プリフェン酸を定量的にフェニルピルビン酸に変換した
後、３．２ｍｌ！の１Ｎ苛性ソータを加え、フェニルピ
ルビン酸を３２０ｎｍにおける吸光度で測定した。また
粗酵素液中の蛋白量は兇法により０、 Ｈ，Ｌｏｗｒｙ
ら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 １９３巻、２
６５ページ、 ］］９５１に記載の方法で定量した。
一方、同菌株を上記培地を用いて３０℃にて９６時間振
盪培養し培養液中に生成したトリプトファンを常法に従
い定量した。第２表に本発明の変異株ノフリスミ酸ムタ
ーゼ活性とトリプトファンの蓄積量を示す。第２表に示
す結果はコリスミ酸ムターゼ活性の弱化によりトリプト
ファンの生産性が増大することを示している。
盪培養し培養液中に生成したトリプトファンを常法に従
い定量した。第２表に本発明の変異株ノフリスミ酸ムタ
ーゼ活性とトリプトファンの蓄積量を示す。第２表に示
す結果はコリスミ酸ムターゼ活性の弱化によりトリプト
ファンの生産性が増大することを示している。
第２表 コリスミ酸ムクーゼ活性ト
Ｌ −）リプトファ／蓄積量
ＦＴ−１４５（ＦＥＲＭ−Ｐ１７８３） ３４６
１．９（５−ＦＴｒ） ＡＪ １１９８４ １０５ ４．
３（５−ＦＴｒ、 ＣＭｗ） ＡＪ １１９８５ ２８ ５．
９（５−ＦＴｒ、 ＣＭＷ） 特許出願人 味の素株式会社
１．９（５−ＦＴｒ） ＡＪ １１９８４ １０５ ４．
３（５−ＦＴｒ、 ＣＭｗ） ＡＪ １１９８５ ２８ ５．
９（５−ＦＴｒ、 ＣＭＷ） 特許出願人 味の素株式会社
Claims (1)
- バチルス属に属しトリプトファンアナログ耐性を有しか
つコリスミ酸ムターゼ活性の弱化したし一トリブトファ
／生産性変異株を好気的に培養して培養液中にＬ −１
−リプトファノを生成、蓄ｆＪ’ｉ セしめ、８亥Ｌ
−１−リブトファ／を採Ｍ又することを牙寺徴とする発
酵法によるＬ −トリプトファンのＮａ法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22791282A JPS59120091A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22791282A JPS59120091A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59120091A true JPS59120091A (ja) | 1984-07-11 |
| JPH0456597B2 JPH0456597B2 (ja) | 1992-09-08 |
Family
ID=16868242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22791282A Granted JPS59120091A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59120091A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS561916A (en) * | 1979-06-20 | 1981-01-10 | Hideo Seo | Spectacles for preventing decrease in sight or recovering sight |
| JPS5634279A (en) * | 1979-08-28 | 1981-04-06 | Sharp Corp | Image pickup device |
-
1982
- 1982-12-27 JP JP22791282A patent/JPS59120091A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS561916A (en) * | 1979-06-20 | 1981-01-10 | Hideo Seo | Spectacles for preventing decrease in sight or recovering sight |
| JPS5634279A (en) * | 1979-08-28 | 1981-04-06 | Sharp Corp | Image pickup device |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0456597B2 (ja) | 1992-09-08 |
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