JPH1189572A - アクチン結合蛋白質ｌ−アファディン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カドヘリン性細胞−細胞密着結合に局在する
新規なアクチン結合蛋白質と、この蛋白質を産業上利用
するための遺伝子材料を提供する。 【解決手段】 列番号１のアミノ酸配列または配列番号
１と実質的に同一のアミノ酸配列を有するアクチン結合
蛋白質l-アファディンと、この蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡ配列ならびにこのｃＤＮＡ配列またはその一部配列
がハイブリダイズするゲノムＤＮＡ配列、およびl-アフ
ァディンを特異的に認識する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、新規なアクチン
結合蛋白質l-アファディン(l-Afadin)に関するものであ
る。さらに詳しくは、この発明は、動物の個体形成等に
重要な役割を果たす細胞間密着結合に関与する新規動物
性蛋白質l-アファディンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】動物個体における様々な細胞現象、例え
ば、細胞接着、細胞運動および細胞の形状決定等におい
ては、細胞接着分子、受容体およびチャンネル等の膜貫
通蛋白質によって形成される接着装置が重要な役割を果
たしており、これらの接着装置は、しばしばアクチン性
細胞骨格と結合することが知られている（Biochem. Bio
phys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Bio
l. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1
-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853,1991; S
cience. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol.
4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660,
1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58,1997 ）。従っ
て、アクチン性細胞骨格と細胞質膜とは上記細胞現象に
おいて重要な役割を果たしており、それ故アクチン性細
胞骨格を膜貫通蛋白質に結合させる生体分子の特定に多
大な努力が払われてきた。しかしながら、アクチン性細
胞骨格と細胞質膜との結合に関する分子的基礎について
は、今だ充分に理解されてはいない。

【０００３】このような細胞結合に係わる分子的基礎を
理解するため、これまでに細胞接着部位が最も広範に研
究された（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 198
3; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Mo
til. Cytoskeleton. 20:1-6,1991; Curr. Opin. Cell B
iol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992;
Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opi
n. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sc
i. 22:53-58, 1997 ）。その結果、アクチン線維（Ｆ−
アクチン）に関連する細胞接着部位が２つのタイプ、す
なわち、細胞−細胞接着帯（adherens junctions: Ａ
Ｊ）と、細胞−マトリックスＡＪとに分類されている。
細胞−細胞ＡＪにおいては、その細胞外表面でカドヘリ
ン（cadherin）が互いに相互作用しており、多くの結合
蛋白質が同定されている（Development 102:639-655, 1
988; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Scien
ce 251:1451-1455,1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:83
4-839, 1992; EMBO J. 8:1711-1717, 1989; Cell 65:84
9-857, 1991; Science 251:1451-1455, 1991; Curr. Op
in. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。これらの結合タン
パク質のうち、α−カテニンは、Ｆ−アクチンと直接相
互作用する（Pro.Natl. Acad. Sci. USA. 92:8813-881
7, 1995）と共に、α−アクチニンおよび／またはＺＯ
−１を介してＦ−アクチンに間接的に相互作用している
（J. Cell.Biol. 130:67-77, 1995;J. CellBiol. 138:1
81-192, 1997 ）。また、別のＦ−アクチン結合蛋白質
であるビンキュリン（vinculin）は、細胞−細胞ＡＪに
集中していることが知られているが、細胞−細胞ＡＪに
おけるその相互作用分子は未だ特定されていない（Cell
Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Ce
ll Biol. 4:834-839, 1992）。さらに、細胞外表面にお
いてインテグリン（integrin）がマトリックス蛋白質と
相互作用する細胞−マトリックスＡＪでは、その細胞質
ドメインは、α−アクチニン、ビンキュリン、タリン
（talin ）等のＦ−アクチン結合蛋白質と、直接または
関節的に相互作用している（Ann. Rev. Cell Dev. Bio
l. 11:379-416, 1995）。

【０００４】以上のとおり、多くのＦ−アクチン結合蛋
白質が、アクチン性細胞骨格と細胞質膜のカドヘリンお
よびインテグリンとの結合因子（linker）として作用し
ていると考えられている。一方、アクチン性細胞骨格と
細胞質膜との結合は、神経細胞に特異的な現象（例え
ば、成長円錐の伸長やその後のシナプス結合の形成およ
び維持等）にとっても重要である（Neuron 1:761-772,
1988; Science 242:708-715, 1988; Curr. Opin. Neuro
biol. 4:43-48, 1994; Curr. Opin. Neurobiol. 4:640-
647, 1994; Cell 83:171-176, 1995）。しかしながら、
これらの神経細胞に特異的な現象において、どのような
分子がアクチン性細胞骨格を細胞質膜に結合させている
かは明らかではない。

【０００５】この点を明らかにするため、この出願の発
明者等は、ラットの脳から幾つかの新規なＦ−アクチン
結合蛋白質を単離し、特に神経細胞に特異的で、シナプ
スに多く存在する蛋白質の構造を解析し、既に特許出願
している（特願平９−９２６１５号）。この先願発明の
蛋白質（以下、発明者等の命名に従って「ニューラビ
ン」（neurabin) と記載する）は、１つのＦ−アクチン
結合ドメインと、１つのＰＤＺドメインを有している。
ＰＤＺドメインは様々な蛋白質に見出されており、その
うちの幾つかは細胞間結合に局在している。例えば、シ
ナプス結合におけるＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０（Neuro
n. 9:929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268:4580-4583,
1993 ）、隔膜結合におけるＤlg（Cell. 66:451-464, 1
991）、密着結合におけるＺＯ−１およびＺＯ−２（J.
Cell Biol. 193:755-766, 1986; Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. 88:3460-3464, 1991; J. Cell Biol. 121:491-
502,1993; J. Cell Biol. 123:1049-1053, 1993; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 90:7834-7838, 1993; J. Cell
Biol. 124:949-961, 1994）等である。また、最近の研
究から、ＰＤＺドメインは標的蛋白質のユニークなＣ−
末端モチーフに結合することが明らかにされたが（Tren
ds Biochem. Sci. 21:455-458, 1996 ）、このモチーフ
は、N-methyl-D-aspartate受容体やＳhaker-type K⁺ チ
ャネル等の多くの膜貫通蛋白質に見出されている（Natu
re 378:85-88, 1995; Science 269:1737-1740, 1995;
J. Neurosci. 16:2157-2163, 1996）。

【０００６】

【発明が解決使用とする課題】以上のとおりの様々な知
見から、この発明者等による先願発明の蛋白質ニューラ
ビンは、シナプスにおけるアクチン性細胞骨格と膜貫通
蛋白質との接着因子として機能しているものと考えられ
る。しかしながら、細胞間接着に関与する分子的基礎の
全容は未だ解明されておらず、そのためには、アクチン
結合蛋白質のさらなる同定が必須である。また、このよ
うな蛋白質は、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズムの
解明につながる可能性もあり、癌腫の悪性度の診断やそ
の治療法、治療薬等の開発への応用も期待される。

【０００７】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、細胞間接着に関与する新規なア
クチン結合蛋白質を、その構造（アミノ酸配列）および
性状を明らかにして提供することを目的としている。ま
た、この発明は、このアクチン結合蛋白質の遺伝子工学
的操作のための材料を提供することも目的としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列を有
するアクチン結合蛋白質l-アファディンを提供する。ま
たこの発明は、配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配
列を有する動物性蛋白質を提供する。

【０００９】さらにこの発明は、配列番号１のアミノ酸
配列または配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡと、このｃＤＮＡまたはその一部配
列がハイブリダイズするゲノムＤＮＡ配列をも提供す
る。さらにまた、この発明は、上記のアクチン結合蛋白
質l-アファディンを免疫原として作成した抗体を提供す
る。

【００１０】

【発明の実施の形態】この発明のアクチン結合蛋白質l-
アファディンは、配列番号１のアミノ酸配列を含む蛋白
質であって、この蛋白質には、配列番号１のアミノ酸配
列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５
アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片
は抗体を作製するための抗原として用いることができ
る。さらに、この発明の蛋白質には、他の任意の蛋白質
（例えば、蛍光蛋白質など）との融合蛋白質も含まれ
る。

【００１１】この発明の蛋白質は、公知の方法によって
ヒトの臓器、細胞株などから単離することができる。ま
た、ペプチドとして使用する場合には、この発明によっ
て提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によって調
製することもできる。あるいはこの発明によって提供さ
れるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術によりイン
ビトロで生産することにより取得することもできる。例
えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場合
には、この発明のｃＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに
組換え、この組換えベクターによる形質転換体細胞（大
腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等）からこの発明の蛋白
質を大量に発現させることができる。具体的には、例え
ば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物
中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結
合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等
を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡを挿入結
合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主
細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養し
てやれば、ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内
で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質と
の融合蛋白質として発現させることもできる。得られた
融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによっ
て、ｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得するこ
ともできる。一方、この発明の蛋白質を動物細胞で分泌
発現させる場合には、ｃＤＮＡ断片を、動物細胞用プロ
モーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等
を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内
に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で発
現させることができる。

【００１２】この発明のゲノムＤＮＡ配列は、上記蛋白
質をコードするヒトおよび他の哺乳動物の遺伝子であっ
て、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列を
プローブとして既存のゲノムライブラリーから単離する
ことができる。この発明のｃＤＮＡは、配列番号１のア
ミノ酸配列からなる蛋白質をコードしているＤＮＡ断片
であって、たとえば、その塩基配列に基づいて合成した
オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞から作
製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことにより、この発明のｃＤＮＡのクローンを容易に得
ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもでき
る。一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認め
られる。従って１または複数個のヌクレオチドの付加、
欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなさ
れているｃＤＮＡもこの発明に含まれるものである。同
様に、これらの変更によって生じる１または複数個のア
ミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による
置換がなされている蛋白質も、配列番号１のアミノ酸配
列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の範疇
に含まれるものである。

【００１３】また、この発明のｃＤＮＡの部分配列は、
10bp以上の連続配列であり、この連続配列からなるＤＮ
Ａ断片（センス鎖およびアンチセンス鎖）もこの発明の
範囲に含まれる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用の
プローブとして用いることができる。さらに、この発明
の抗体は、上記の蛋白質それ自体、またはその部分ペプ
チドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体として得ることができ
る。

【００１４】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳
細かつ具体的に説明するが、この発明は、以下の例によ
って限定されるものではない。

【００１５】

【実施例】

実施例１：アクチン結合蛋白質l-アファディンの同定と
精製 胎児ラット脳より成長円錐を単離し、¹²⁵Iで標識したＦ
−アクチンによるブロット・オーバーレイ(blot overla
y)法（Cell Motil. Cytoskeleton. 18:164-179, 1991）
を行い、分子量２０５ＫＤａ（ｐ２０５）のバンドを確
認した。競合的結合阻害を試験した結果、この蛋白質は
Ｆ−アクチンに特異的に結合したが、 ¹²⁵ Ｉで標識した
Ｇ−アクチンには結合しないことから、Ｆ−アクチン結
合蛋白質であることが確認された。

【００１６】次に、胎児ラット脳の可溶画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで処理し、分子量約２０５ＫＤａの蛋白質バン
ドを、複数のカラムクロマトグラフィー（Q-Sepharose,
phenyl-5PW, hydroxyapatite, Mono Q ）で精製した。
最終的な Mono Q カラムクロマトグラフィーの結果を図
１に示す。図１（ａ）は２８０ｎｍでの吸光度、（ｂ）
は ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレ
イ、（ｃ）はCoomassie brilliant blueで染色した蛋白
質バンドである。この図１（ｃ）に示したように、精製
蛋白質は、最終的に、約２０５ＫＤａ（ｐ２０５）と約
１９０ＫＤａ（ｐ１９０）が得られた。そこで、これら
２種類の精製蛋白質をポリアクリルアミドゲルから切り
出し、分解酵素 (lysil endopeptidase)によって限定分
解した後、ペプチドマッピングを行い、２つの蛋白質に
共通する５つのペプチドを単離し、それらの部分アミノ
酸配列を決定した。そして、配列データベースによる相
同性検索の結果、５つのペプチドはヒトＡＦ−６蛋白質
と高い相同性を有することが確認された。一方、ｐ２０
５に特異的な２つのペプチドの配列は、既存のデータベ
ースには存在しなかった。これらの結果から、ｐ２０５
およびｐ１９０はヒトＡＦ−６蛋白質に関連するラット
蛋白質であり、ｐ１９０はｐ２０５のスプライシングバ
リアント、相同体または分解産物であることが示唆され
た。また、ｐ２０５は、ＡＪ部位に局在することから、
「a large splicing variant of AF-6protein localize
d at adherens junction：l-afadin」と命名した（以
下、この発明の蛋白質を、l-アファディンまたはｐ２０
５と記載する）。 実施例２：アクチン結合蛋白質l-アファディン遺伝子ク
ローニング 実施例１で得た２０５ＫＤａ蛋白質l-アファディンの部
分アミノ酸配列に基づいて７種類のオリゴヌクレオチド
プローブを作成し、ラットの脳ｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングした。その結果、図２に示したような幾
つかのオーバープクローンが得られた。配列決定の結
果、これらのクローンのうち、クローン２０は、約4.9k
bpからなるコード領域を含んでおり、このコード領域か
ら推定されたアミノ酸配列は、ｐ２０５の全てのペプチ
ドを含んでいた。また、ｐ２０５に特異的な２つのペプ
チドはＣ−端側に位置していた。なお、クローン９４は
ｐ１９０をコードする約4.5kbpからなるコード領域を含
んでいた。ただし、これらのクローン２０および９４は
開始コドンを含んでおらず、その開始コドンはクローン
８４に含まれていた。そこで、ｐ２０５の全長ｃＤＮＡ
をクローン８４および２０から構築し、ｐ１９０の全長
ｃＤＮＡをクローン８４と９４から構築した。

【００１７】また、クローン２０、８４および９４をプ
ローブとしたＦＩＳＨ分析（Cytogenet. Cell Genet. 6
1:282-285, 1992; Electrophoresis. 16:261-272, 199
5）の結果、これらのｃＤＮＡはラット染色体１ｑ１
２．２に位置することも確認された。 実施例３：アクチン結合蛋白質l-アファディンの動物細
胞での発現 実施例２で構築したｐ２０５のｃＤＮＡを発現ベクター
に組み込み、このベクターをＣＯＳ７細胞に導入して、
細胞の発現産物について ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチンを用い
たブロット・オーバーレイ法による分析を行った。得ら
れた組換え蛋白質（myc-l-afadin）は、図３（ａ）に示
したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でネイティブなｐ２０
５と類似の泳動を示し、また ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチンに
対する結合活性を有してもいた。一方、Ｃ−端側の１５
６アミノ酸残基を欠くｐ２０５の変異体は、 ¹²⁵Ｉ標識
Ｆ−アクチンに対する結合活性を示さなかった。これに
対して、ｐ２０５のＣ−端（１９９アミノ酸残基）とＧ
ＴＳ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融
合蛋白質は ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチン結合活性を示した。

【００１８】以上の結果から、ｐ２０５遺伝子は、配列
番号１に記載した1,829 アミノ酸残基からなる蛋白質を
コードしており、その推定分子量は207,667 で、Ｃ−端
１９９アミノ酸残基にＦ−アクチン結合ドメインを有す
ることが明らかになった。また、ｐ１９０遺伝子は、Ｃ
−端約１６０アミノ酸残基を欠失した蛋白質をコード
し、ｐ２０５遺伝子のスプライシングバリアントとであ
ると結論づけられた。

【００１９】コンピュータによるホモロジー検索の結
果、ｐ１９０のアミノ酸配列は、ヒトＡＦ−６蛋白質の
全配列と９０％一致した。ただし、ヒトＡＦ−６蛋白質
もｐ１９０も、ｐ２０５のＣ−端領域を欠失していた。
また、ｐ２０５のＣ−端（Ｆ−アクチン結合ドメイン）
は、他の如何なるＦ−アクチン結合蛋白質との有意な相
同性を示さなかった。従って、ｐ１９０がラットにおけ
るヒトＡＦ−６の類似体であるのに対し、ｐ２０５は新
規なＦ−アクチン結合蛋白質であることが確認された。
なお、図３（ｂ）に示したように、ｐ２０５およびｐ１
９０は、いずれもＰＤＺを有していた。 実施例４：抗l-アファディン抗体の作成 公知の方法に従い、配列番号１の1814−1829番目までの
アミノ酸配列からなる合成ペプチドを免疫原として、l-
アファディンを特異的に認識するウサギ・ポリクローナ
ル抗体を作成した。また、配列番号１の 557−592 番目
までのアミノ酸配列からなる合成ペプチドを免疫原とし
て、l-アファディンおよびS-アファディンを認識するウ
サギ・ポリクローナル抗体を作成した。 実施例５：l-アファディンの発現組織の確認 l-アファディンｃＤＮＡに特異的な配列をプローブとし
て用いたノーザンブロット分析の結果、図４（ａ）に示
したとおり、l-アファディンは検査したラット組織（心
臓、脳、脾臓、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣）の全
てで発現していた。

【００２０】また、実施例４で作成した抗l-アファディ
ン抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果からも、
図４（ｂ１）に示したように、l-アファディンはラット
の全ての組織で発現することが確認された。しかしなが
ら、図４（ｂ２）に示したように、l-アファディンとS-
アファディンの両方を認識する抗体を使用したウエスタ
ンブロットの結果からは、これらの臓器のうち、S-アフ
ァディンは脳のみに発現していることが確認された。

【００２１】以上の結果から、この発明のl-アファディ
ンは全ての組織で発現するのに対し、s-アファディンは
脳のみに発現していることが確認された。 実施例６：l-アファディンの生化学的特性 実施例１で得た２０５ＫＤａ蛋白質（l-アファディン）
のアクチン結合様式をブロット・オーバーレイ法を用い
て検討した結果、l-アファディンとアクチンとの結合は
ミオシンＳ１によって特異的に阻害されたが（図５
ａ）、この阻害はＭｇＡＴＰの添加によって消失した。
ミオシンＳ１はＦ−アクチンの側面に結合することが確
認されている蛋白質であり（Science 261:58-65, 1993;
Nature 364:171-174, 1993 ）、ＭｇＡＴＰはアクチン
−ミオシン複合体を分離することが知られているため
（Biochemistry 14:2207-2214, 1975 ）、l-アファディ
ンはＦ−アクチンの側面に結合することが確認された。

【００２２】次に、falling ball法（Methods Enzymol.
85:211-233, 1982; J. Biol. Chem. 271:31775-31778,
1996 ）を用いて、l-アファディンによるＦ−アクチン
の粘度変化を調べた結果、図５（ｂ）に示したように、
l-アファディンはＦ−アクチンの粘度を用量依存的に増
加させ、粘度は最大約３倍にまで増加した。さらに、ス
トイキオメトリー（stoichiometry ）を計算した結果
（図５ｃ）、アクチン約５００分子に対してHis6−l-ア
ファディン−Ｃ１分子の割合で結合すると計算され、そ
のＫｄ値は１０^-7オーダーと計算された。

【００２３】また、アクチンに対するl-アファディン効
果をpyrene−アクチンを用いて検討したところ、l-アフ
ァディンはアクチンの核形成促進作用を示さないことも
判明した。 実施例７：l-アファディンの局在位置の確認 抗l-アファディン抗体を用い、様々なマウスまたはラッ
ト組織の凍結切片を免疫蛍光顕微鏡で検査してl-アファ
ディンの局在位置を確認した。

【００２４】肝臓では、l-アファディンは毛細胆管に沿
った帯状結合複合体領域（belt-like junctional compl
ex region ）に局在していた（図６ａ）。小腸では、抗
Ｅ−カドヘリン−モノクローナル抗体を併用して調べた
ところ、l-アファディンは腸吸収上皮の結合複合領域に
Ｅ−カドヘリンと共に検出されたが、Ｅ−カドヘリンに
比べ同部位により濃縮されていた（図６ｂ１−３、ｃ１
−３）。心臓については、抗ビンキュリン−モノクロー
ナル抗体を併用して調べた。ビンキュリンは、細胞−細
胞ＡＪだけでなく、細胞−マトリックスＡＪに対するマ
ーカーとして知られている（Cell 18:193-205, 1979; B
iochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983 ）。その結
果、l-アファディンは、心臓の境界膜にビンキュリンと
共に検出された（図６ｄ１−３）。ただし、ビンキュリ
ンは心筋細胞の外側縁に沿っても検出されたが、l-アフ
ァディンはこの領域には検出されなかった。また、Ｅ−
カドヘリンを発現する培養ＥＬ細胞（Nature 329:341-3
43, 1987）を、抗ＺＯ−１抗体を併用して調べたとこ
ろ、l-アファディンの局在はＺＯ−１の局在と類似して
いた（図７ａ，ｂ）。ＺＯ−１は、線維芽細胞における
カドヘリン性細胞−細胞ＡＪに存在することが知られて
いるので（J. Cell Biol. 115:1149-1462, 1991; J. Ce
ll Biol. 121:491-502, 1993）、l-アファディンもま
た、このカドヘリン性細胞−細胞ＡＪに局在することが
示唆された。

【００２５】さらに、l-アファディンの正確な局在を調
べるために、小腸の凍結切片を抗Ｚｏ−１モノクローナ
ル抗体と抗l-アファディン抗体で共染色し、また肝臓の
毛細胆管を抗デスモプラキン（desmoplakin ）モノクロ
ーナル抗体と抗l-アファディン抗体で共染色した。ＺＯ
−１は密着結合に対するマーカーとして知られており
（J. Cell Biol. 103:755-766, 1986; J. Cell Biol. 1
21:491-502, 1993）、デスモプラキンはデスモソームの
マーカーとして知られている（J. Cell Biol. 63:515-5
23, 1974; Eur. J. Cell Biol. 32:117-130, 1983; J.
Mol. Biol. 163:647-671, 1983; EMBO J. 6:885-889, 1
987 ）。その結果、小腸の吸収上皮では、l-アファディ
ンはＺＯ−１より僅かに基底側に存在していた（図８ａ
１−３）。また、胆管では、l-アファディンの局在とデ
スモプラキンの局在は一致していなかった（図８ｂ１−
３）。

【００２６】これらの結果から、l-アファディンは、密
着結合やデスモソームよりもむしろ、細胞−細胞ＡＪに
局在していることが示された。そしてさらに、免疫電子
顕微鏡によりl-アファディンは、小腸の吸収上皮細胞の
細胞−細胞ＡＪに局在することが観察された（図９ａ、
ｂ）。以上により、この発明のl-アファディンは、アク
チン性細胞骨格と細胞−細胞ＡＪとを連結する新規なタ
ンパク質であることが確認された。

【００２７】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、カドヘリン性細胞−細胞密着結合に局在する新
規なアクチン結合蛋白質l-アファディンと、このl-アフ
ァディンを産業上利用するための遺伝子材料が提供され
る。

【００２８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1829 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：ラット 組織：胎児脳 配列

【００２９】

【配列表】 Met Ser Ala Gly Gly Arg Asp Glu Glu Arg Arg Lys Leu Ala Asp Ile 1 5 10 15 Ile His His Trp Asn Ala Asn Arg Leu Asp Leu Phe Glu Ile Ser Gln 20 25 30 Pro Thr Glu Asp Leu Glu Phe His Gly Val Met Arg Phe Tyr Phe Gln 35 40 45 Asp Lys Ala Ala Gly Asn Phe Ala Thr Lys Cys Ile Arg Val Ser Ser 50 55 60 Thr Ala Thr Thr Gln Asp Val Ile Glu Thr Leu Ala Glu Lys Phe Arg 65 70 75 80 Pro Asp Met Arg Met Leu Ser Ser Pro Lys Tyr Ser Leu Tyr Glu Val 85 90 95 His Val Ser Gly Glu Arg Arg Leu Asp Ile Asp Glu Lys Pro Leu Val 100 105 110 Val Gln Leu Asn Trp Asn Lys Asp Asp Arg Glu Gly Arg Phe Val Leu 115 120 125 Lys Asn Glu Asn Asp Ala Ile Pro Ala Lys Lys Ala Gln Ser Asn Gly 130 135 140 Pro Glu Lys Gln Glu Lys Glu Gly Val Ile Gln Asn Phe Lys Arg Thr 145 150 155 160 Leu Ser Lys Lys Glu Lys Lys Glu Lys Lys Lys Arg Glu Lys Glu Ala 165 170 175 Leu Arg Gln Ala Ser Asp Lys Glu Glu Arg Pro Ser Gln Gly Asp Asp 180 185 190 Ser Glu Asn Ser Arg Leu Ala Ala Glu Val Tyr Lys Asp Met Pro Glu 195 200 205 Thr Ser Phe Thr Arg Thr Ile Ser Asn Pro Glu Val Val Met Lys Arg 210 215 220 Arg Arg Gln Gln Lys Leu Glu Lys Arg Met Gln Glu Phe Arg Ser Ser 225 230 235 240 Asp Gly Arg Pro Asp Ser Gly Gly Thr Leu Arg Ile Tyr Ala Asp Ser 245 250 255 Leu Lys Pro Asn Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Leu Leu Ser Thr Thr Asp 260 265 270 Pro Ala Asp Phe Ala Val Ala Glu Ser Leu Glu Lys Tyr Gly Leu Glu 275 280 285 Lys Glu Asn Pro Lys Asp Tyr Cys Ile Ala Arg Val Met Leu Pro Pro 290 295 300 Gly Ala Gln His Ser Asp Glu Arg Gly Ala Lys Glu Ile Ile Leu Asp 305 310 315 320 Asp Asp Glu Cys Pro Leu Gln Ile Phe Arg Glu Trp Pro Ser Asp Lys 325 330 335 Gly Ile Leu Val Phe Gln Leu Lys Arg Arg Pro Pro Asp Tyr Ile Pro 340 345 350 Lys Lys Met Lys Lys His Val Glu Gly Lys Pro Leu Lys Gly Lys Asp 355 360 365 Arg Ala Asp Gly Ser Gly Tyr Gly Ser Ala Leu Pro Pro Glu Lys Leu 370 375 380 Pro Tyr Leu Val Glu Leu Ser Pro Gly Arg Arg Asn His Phe Ala Tyr 385 390 395 400 Tyr Ser Tyr His Thr Tyr Glu Asp Gly Ser Asp Ser Arg Asp Lys Pro 405 410 415 Lys Leu Tyr Arg Leu Gln Leu Ser Val Thr Glu Val Gly Thr Glu Lys 420 425 430 Phe Asp Asp Asn Ser Ile Gln Leu Phe Gly Pro Gly Ile Gln Pro His 435 440 445 His Cys Asp Leu Thr Asn Met Asp Gly Val Val Thr Val Thr Pro Arg 450 455 460 Ser Met Asp Ala Glu Thr Tyr Val Asp Gly Gln Arg Ile Ser Glu Thr 465 470 475 480 Thr Met Leu Gln Ser Gly Met Arg Leu Gln Phe Gly Thr Ser His Val 485 490 495 Phe Lys Phe Val Asp Pro Ile Gln Asp His Val Leu Ser Lys Arg Ser 500 505 510 Val Asp Gly Gly Leu Met Val Lys Gly Pro Arg His Lys Pro Gly Ala 515 520 525 Val Gln Glu Thr Thr Phe Glu Leu Gly Gly Asp Ile His Ser Gly Thr 530 535 540 Ala Leu Pro Ala Ser Arg Ser Thr Thr Arg Leu Asp Ser Asp Arg Val 545 550 555 560 Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ala Glu Arg Gly Met Val Lys Pro Met Ile 565 570 575 Arg Leu Asp Gln Glu Gln Asp Tyr Arg Arg Arg Glu Ser Arg Thr Gln 580 585 590 Asp Ala Ala Gly Pro Glu Leu Met Leu Pro Ala Ser Ile Glu Phe Arg 595 600 605 Glu Ser Ser Glu Asp Ser Phe Leu Ser Ala Ile Ile Asn Tyr Thr Asn 610 615 620 Ser Ser Thr Val His Phe Lys Leu Ser Pro Thr Tyr Val Leu Tyr Met 625 630 635 640 Ala Cys Arg Tyr Val Leu Ser Ser Gln His Arg Pro Asp Ile Ser Pro 645 650 655 Thr Glu Arg Thr His Lys Ala Ile Ala Val Val Asn Lys Met Val Ser 660 665 670 Met Met Glu Gly Val Ile Gln Glu Val Asp Gln Val Asp Gln Lys Gln 675 680 685 Lys Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ala Phe Trp Met Ala Asn Ala Ser Glu 690 695 700 Leu Leu Asn Phe Ile Lys Gln Asp Arg Asp Leu Ser Arg Ile Thr Leu 705 710 715 720 Asp Ala Gln Asp Val Leu Ala His Leu Val Gln Met Ala Phe Lys Tyr 725 730 735 Leu Val His Cys Leu Gln Ser Glu Leu Asn Asn Tyr Met Pro Ala Phe 740 745 750 Leu Asp Asp Pro Glu Glu Asn Ser Leu Gln Arg Pro Lys Ile Asp Asp 755 760 765 Val Leu His Thr Leu Thr Gly Ala Met Ser Leu Leu Arg Arg Cys Arg 770 775 780 Val Asn Ala Ala Leu Thr Ile Gln Leu Phe Ser Gln Leu Phe His Phe 785 790 795 800 Ile Asn Met Trp Leu Phe Asn Arg Leu Val Thr Asp Pro Asp Ser Gly 805 810 815 Leu Cys Ser His Tyr Trp Gly Ala Ile Ile Arg Gln Gln Leu Gly His 820 825 830 Ile Glu Ala Trp Ala Glu Lys Gln Gly Leu Glu Leu Ala Ala Asp Cys 835 840 845 His Leu Ser Arg Ile Val Gln Ala Thr Thr Leu Leu Thr Met Asp Lys 850 855 860 Tyr Val Pro Asp Asp Ile Pro Asn Ile Asn Ser Thr Cys Phe Lys Leu 865 870 875 880 Asn Ser Leu Gln Leu Gln Ala Leu Leu Gln Asn Tyr His Cys Ala Pro 885 890 895 Asp Glu Pro Phe Ile Pro Thr Asp Leu Ile Glu Asn Val Val Ala Val 900 905 910 Ala Glu Asn Thr Ala Asp Glu Leu Ala Arg Ser Asp Gly Arg Asp Val 915 920 925 Gln Leu Glu Glu Asp Pro Asp Leu Gln Leu Pro Phe Leu Leu Pro Glu 930 935 940 Asp Gly Tyr Ser Cys Asp Val Val Arg Asn Ile Pro Asn Gly Leu Gln 945 950 955 960 Glu Phe Leu Asp Pro Leu Cys Gln Arg Gly Phe Cys Arg Leu Val Pro 965 970 975 His Thr Arg Ser Pro Gly Thr Trp Thr Ile Tyr Phe Glu Gly Ala Asp 980 985 990 Tyr Glu Ser His Leu Met Arg Glu Asn Thr Glu Leu Thr Gln Pro Leu 995 1000 1005 Arg Lys Glu Pro Glu Val Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Gln Asn Gly 1010 1015 1020 Met Gly Leu Ser Ile Val Ala Ala Lys Gly Ala Gly Gln Asp Lys Leu 1025 1030 1035 1040 Gly Ile Tyr Val Lys Ser Val Val Lys Gly Gly Ala Ala Asp Val Asp 1045 1050 1055 Gly Arg Leu Ala Ala Gly Asp Gln Leu Leu Ser Val Asp Gly Arg Ser 1060 1065 1070 Leu Val Gly Leu Ser Gln Glu Arg Ala Ala Glu Leu Met Thr Arg Thr 1075 1080 1085 Ser Ser Val Val Thr Leu Glu Val Ala Lys Gln Gly Ala Ile Tyr His 1090 1095 1100 Gly Leu Ala Thr Leu Leu Asn Gln Pro Ser Pro Met Met Gln Arg Ile 1105 1110 1115 1120 Ser Asp Arg Arg Gly Ser Gly Lys Pro Arg Pro Lys Ser Glu Gly Phe 1125 1130 1135 Glu Leu Tyr Asn Asn Ser Ala Gln Asn Gly Ser Pro Glu Ser Pro Gln 1140 1145 1150 Met Pro Trp Thr Glu Tyr Ser Glu Pro Lys Lys Leu Pro Gly Asp Asp 1155 1160 1165 Arg Leu Met Lys Asn Arg Ala Asp His Arg Ser Ser Pro Asn Val Ala 1170 1175 1180 Asn Gln Pro Pro Ser Pro Gly Gly Lys Ser Pro Tyr Thr Ser Gly Thr 1185 1190 1195 1200 Ala Ala Lys Ile Thr Ser Val Ser Thr Gly Asn Leu Cys Thr Glu Glu 1205 1210 1215 Gln Thr Pro Pro Pro Arg Pro Glu Ala Tyr Pro Ile Pro Thr Gln Thr 1220 1225 1230 Tyr Thr Arg Glu Tyr Phe Thr Phe Pro Ala Ser Lys Ser Gln Asp Arg 1235 1240 1245 Met Ala Pro Val Gln Asn Gln Trp Pro Asn Tyr Glu Glu Lys Pro His 1250 1255 1260 Met His Thr Glu Ser Asp His Ala Ser Ile Ala Ile Gln Arg Val Thr 1265 1270 1275 1280 Arg Ser Gln Glu Glu Leu Arg Glu Glu Lys Val Tyr Gln Leu Glu Arg 1285 1290 1295 His Arg Val Glu Ser Gly Met Asp Arg Lys Cys Asp Ser Asp Met Trp 1300 1305 1310 Ile Asn Gln Ser Ser Ser Val Glu Ser Ser Thr Ser Ser Gln Glu His 1315 1320 1325 Leu Asn His Ser Ser Lys Ser Val Thr Pro Ala Ser Thr Leu Thr Lys 1330 1335 1340 Ser Gly Pro Gly Arg Trp Lys Thr Pro Ala Ala Val Leu Pro Thr Pro 1345 1350 1355 1360 Val Ala Val Ser Gln Pro Ile Arg Thr Asp Leu Pro Pro Pro Pro Pro 1365 1370 1375 Pro Pro Pro Ala His Tyr Thr Ser Asp Phe Asp Gly Ile Ser Met Asp 1380 1385 1390 Leu Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala Asn Gln Ala Ala Pro Gln Ser Ala 1395 1400 1405 Gln Val Ala Ala Ala Glu Arg Lys Lys Arg Glu Glu His Gln Arg Trp 1410 1415 1420 Tyr Glu Lys Glu Lys Ala Arg Leu Glu Glu Glu Arg Glu Arg Lys Arg 1425 1430 1435 1440 Arg Glu Gln Glu Arg Lys Leu Gly Gln Met Arg Thr Gln Ser Leu Asn 1445 1450 1455 Pro Ala Ser Phe Ser Pro Leu Ala Thr Gln Ala Lys Pro Glu Lys Pro 1460 1465 1470 Ser Thr Leu Gln Arg Pro Gln Glu Thr Val Ile Arg Glu Leu Gln Pro 1475 1480 1485 Gln Gln Gln Pro Arg Thr Ile Glu Arg Arg Asp Leu Gln Tyr Ile Thr 1490 1495 1500 Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ser Ser Gly Asp Ser Leu Ser Pro Asp Pro 1505 1510 1515 1520 Trp Lys Arg Asp Ala Arg Glu Lys Leu Glu Lys Gln Gln Gln Met His 1525 1530 1535 Ile Val Asp Met Leu Ser Lys Glu Ile His Glu Leu Gln Asn Lys Gly 1540 1545 1550 Asp Arg Thr Ala Glu Glu Ser Asp Arg Leu Arg Lys Leu Met Leu Glu 1555 1560 1565 Trp Gln Phe Gln Lys Arg Leu Gln Glu Ser Lys Gln Lys Asp Glu Asp 1570 1575 1580 Asp Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Val Asp Thr Met Leu Ile Met Gln 1585 1590 1595 1600 Arg Leu Glu Ala Glu Arg Arg Ala Arg Leu Gln Asp Glu Glu Arg Arg 1605 1610 1615 Arg Gln Gln Gln Leu Glu Glu Met Arg Lys Arg Glu Val Glu Asp Arg 1620 1625 1630 Val Arg Gln Glu Glu Asp Gly Arg His Gln Glu Glu Glu Arg Val Lys 1635 1640 1645 Arg Asp Ala Glu Glu Lys Arg Arg Gln Glu Glu Gly Tyr Tyr Ser Arg 1650 1655 1660 Leu Glu Ala Glu Arg Arg Arg Gln His Glu Glu Ala Ala Arg Arg Leu 1665 1670 1675 1680 Leu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Leu Ser Arg Pro Pro Leu Pro Gln Asp 1685 1690 1695 Tyr Glu Pro Pro Ser Gln Ser Ser Ala Pro Ser Ala Pro Pro Pro Pro 1700 1705 1710 Pro Gln Arg Asn Ala Ser Tyr Leu Lys Thr Gln Val Leu Ser Pro Asp 1715 1720 1725 Ser Leu Phe Thr Ala Lys Phe Val Ala Tyr Asp Asp Asp Asp Glu Glu 1730 1735 1740 Glu Asn Tyr Val Pro Ala Gly Pro Asn Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Thr Thr Ala Gly Thr Tyr Asp Ala Pro Arg Asp Thr Arg Glu Lys Leu 1765 1770 1775 Ser Arg Ser Gln Asp Ala Asp Leu Pro Gly Ser Ser Gly Ala Pro Glu 1780 1785 1790 Asn Leu Thr Phe Arg Glu Arg Gln Arg Leu Phe Ser Gln Gly Gln Asp 1795 1800 1805 Val Ser Asp Lys Val Lys Ala Ser Arg Lys Leu Thr Glu Leu Glu Asn 1810 1815 1820 Glu Leu Asn Thr Lys 1825

【図面の簡単な説明】

【図１】モノＱカラムクロマトグラフィーの吸光度
（ａ）、 ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オー
バーレイの結果（ｂ）およびＳＤＳ電気泳動の染色結果
（ｃ）である。

【図２】l-アファディン（ｐ２０５）およびS-アファデ
ィン（ｐ１９０）のｃＤＮＡの模式図である。

【図３】（ａ）は、様々な組換えl-アファディン断片の
Ｆ−アクチン結合活性を示す。左は ¹²⁵Ｉ標識Ｆ−アク
チンによるブロット・オーバーレイ、右はウエスタンブ
ロットの結果である。（ｂ）は、l-アファディンおよび
S-アファディンの構造を示した模式図である。

【図４】l-アファディンの臓器分布を調べた結果であ
り、（ａ）はノーザンブロット、（ｂ）は抗l-アファデ
ィン抗体（ｂ１）および抗l-アファディン／S-アファデ
ィン抗体（ｂ２）を用いたウエスタンブロットの結果で
ある。

【図５】l-アファディンの生化学特性であり、（ａ）は
l-アファディンのＦアクチン結合活性のミオシンＳ１に
よる阻害、（ｂ）はl-アファディンによるＦ−アクチン
粘度の増加、（ｃ）はHis6−l-アファディン−ＣのＦ−
アクチンへの結合を示す。

【図６】ラットまたはマウスの様々な組織におけるl-ア
ファディン、Ｅ−カドヘリンおよびビンキュリンの局在
を示す写真図である。

【図７】ＥＬ細胞におけるl-アファディンおよびＺＯ−
１の局在を示す写真図である。

【図８】l-アファディン、ＺＯ−１およびデスモプラキ
ンの異なる局在を示す写真図である。

【図９】ラット小腸におけるl-アファディンの局在を示
す写真図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 高井 義美 兵庫県神戸市西区学園東町二丁目５番地の 73 (72)発明者 中西 宏之 兵庫県神戸市西区学園西町二丁目５番地の 110 (72)発明者 萬代 研二 大阪府箕面市小野原東四丁目３番７−203 号 (72)発明者 和田 学 兵庫県神戸市垂水区桃山台一丁目16番地 (72)発明者 尾葉石 浩 兵庫県神戸市須磨区白川台七丁目２番地の ７ シェスタ白川台407号

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列を有するアク
   チン結合蛋白質l-アファディン。
2. 【請求項２】 配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配
   列を有する動物性蛋白質。
3. 【請求項３】 配列番号１のアミノ酸配列または配列番
   号１と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするｃＤＮ
   Ａ。
4. 【請求項４】 請求項３のｃＤＮＡまたはその一部配列
   がハイブリダイズするゲノムＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 請求項１のアクチン結合蛋白質l-アファ
   ディンを免疫原として作成された抗体。