JP3657751B2 - アクチン結合蛋白質ｌ−アファディン - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、新規なアクチン結合蛋白質l-アファディン(l-Afadin)に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、動物の個体形成等に重要な役割を果たす細胞間密着結合に関与する新規動物性蛋白質l-アファディンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物個体における様々な細胞現象、例えば、細胞接着、細胞運動および細胞の形状決定等においては、細胞接着分子、受容体およびチャンネル等の膜貫通蛋白質によって形成される接着装置が重要な役割を果たしており、これらの接着装置は、しばしばアクチン性細胞骨格と結合することが知られている（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58, 1997 ）。従って、アクチン性細胞骨格と細胞質膜とは上記細胞現象において重要な役割を果たしており、それ故アクチン性細胞骨格を膜貫通蛋白質に結合させる生体分子の特定に多大な努力が払われてきた。しかしながら、アクチン性細胞骨格と細胞質膜との結合に関する分子的基礎については、今だ充分に理解されてはいない。
【０００３】
このような細胞結合に係わる分子的基礎を理解するため、これまでに細胞接着部位が最も広範に研究された（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58, 1997 ）。その結果、アクチン線維（Ｆ−アクチン）に関連する細胞接着部位が２つのタイプ、すなわち、細胞−細胞接着帯（adherens junctions: ＡＪ）と、細胞−マトリックスＡＪとに分類されている。細胞−細胞ＡＪにおいては、その細胞外表面でカドヘリン（cadherin）が互いに相互作用しており、多くの結合蛋白質が同定されている（Development 102:639-655, 1988; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Science 251:1451-1455,1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; EMBO J. 8:1711-1717, 1989; Cell 65:849-857, 1991; Science 251:1451-1455, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。これらの結合タンパク質のうち、α−カテニンは、Ｆ−アクチンと直接相互作用する（Pro.Natl. Acad. Sci. USA. 92:8813-8817, 1995）と共に、α−アクチニンおよび／またはＺＯ−１を介してＦ−アクチンに間接的に相互作用している（J. Cell.Biol. 130:67-77, 1995;J. Cell Biol. 138:181-192, 1997 ）。また、別のＦ−アクチン結合蛋白質であるビンキュリン（vinculin）は、細胞−細胞ＡＪに集中していることが知られているが、細胞−細胞ＡＪにおけるその相互作用分子は未だ特定されていない（Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。さらに、細胞外表面においてインテグリン（integrin）がマトリックス蛋白質と相互作用する細胞−マトリックスＡＪでは、その細胞質ドメインは、α−アクチニン、ビンキュリン、タリン（talin ）等のＦ−アクチン結合蛋白質と、直接または関節的に相互作用している（Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11:379-416, 1995）。
【０００４】
以上のとおり、多くのＦ−アクチン結合蛋白質が、アクチン性細胞骨格と細胞質膜のカドヘリンおよびインテグリンとの結合因子（linker）として作用していると考えられている。
一方、アクチン性細胞骨格と細胞質膜との結合は、神経細胞に特異的な現象（例えば、成長円錐の伸長やその後のシナプス結合の形成および維持等）にとっても重要である（Neuron 1:761-772, 1988; Science 242:708-715, 1988; Curr. Opin. Neurobiol. 4:43-48, 1994; Curr. Opin. Neurobiol. 4:640-647, 1994; Cell 83:171-176, 1995）。しかしながら、これらの神経細胞に特異的な現象において、どのような分子がアクチン性細胞骨格を細胞質膜に結合させているかは明らかではない。
【０００５】
この点を明らかにするため、この出願の発明者等は、ラットの脳から幾つかの新規なＦ−アクチン結合蛋白質を単離し、特に神経細胞に特異的で、シナプスに多く存在する蛋白質の構造を解析し、既に特許出願している（特願平９−９２６１５号）。この先願発明の蛋白質（以下、発明者等の命名に従って「ニューラビン」（neurabin) と記載する）は、１つのＦ−アクチン結合ドメインと、１つのＰＤＺドメインを有している。ＰＤＺドメインは様々な蛋白質に見出されており、そのうちの幾つかは細胞間結合に局在している。例えば、シナプス結合におけるＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０（Neuron. 9:929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268:4580-4583, 1993 ）、隔膜結合におけるＤlg（Cell. 66:451-464, 1991）、密着結合におけるＺＯ−１およびＺＯ−２（J. Cell Biol. 193:755-766, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:3460-3464, 1991; J. Cell Biol. 121:491-502, 1993; J. Cell Biol. 123:1049-1053, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:7834-7838, 1993; J. Cell Biol. 124:949-961, 1994）等である。また、最近の研究から、ＰＤＺドメインは標的蛋白質のユニークなＣ−末端モチーフに結合することが明らかにされたが（Trends Biochem. Sci. 21:455-458, 1996 ）、このモチーフは、N-methyl-D-aspartate受容体やＳhaker-type K+ チャネル等の多くの膜貫通蛋白質に見出されている（Nature 378:85-88, 1995; Science 269:1737-1740, 1995; J. Neurosci. 16:2157-2163, 1996）。
【０００６】
【発明が解決使用とする課題】
以上のとおりの様々な知見から、この発明者等による先願発明の蛋白質ニューラビンは、シナプスにおけるアクチン性細胞骨格と膜貫通蛋白質との接着因子として機能しているものと考えられる。
しかしながら、細胞間接着に関与する分子的基礎の全容は未だ解明されておらず、そのためには、アクチン結合蛋白質のさらなる同定が必須である。また、このような蛋白質は、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズムの解明につながる可能性もあり、癌腫の悪性度の診断やその治療法、治療薬等の開発への応用も期待される。
【０００７】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、細胞間接着に関与する新規なアクチン結合蛋白質を、その構造（アミノ酸配列）および性状を明らかにして提供することを目的としている。
また、この発明は、このアクチン結合蛋白質の遺伝子工学的操作のための材料を提供することも目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列を有するアクチン結合蛋白質l-アファディンを提供する。
またこの発明は、配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する動物性蛋白質を提供する。
【０００９】
さらにこの発明は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、このｃＤＮＡまたはその一部配列がハイブリダイズするゲノムＤＮＡ配列をも提供する。
さらにまた、この発明は、上記のアクチン結合蛋白質l-アファディンを免疫原として作成した抗体を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この発明のアクチン結合蛋白質l-アファディンは、配列番号１のアミノ酸配列を含む蛋白質であって、この蛋白質には、配列番号１のアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。さらに、この発明の蛋白質には、他の任意の蛋白質（例えば、蛍光蛋白質など）との融合蛋白質も含まれる。
【００１１】
この発明の蛋白質は、公知の方法によってヒトの臓器、細胞株などから単離することができる。また、ペプチドとして使用する場合には、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によって調製することもできる。あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術によりインビトロで生産することにより取得することもできる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターによる形質転換体細胞（大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等）からこの発明の蛋白質を大量に発現させることができる。具体的には、例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡを挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。一方、この発明の蛋白質を動物細胞で分泌発現させる場合には、ｃＤＮＡ断片を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で発現させることができる。
【００１２】
この発明のゲノムＤＮＡ配列は、上記蛋白質をコードするヒトおよび他の哺乳動物の遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
この発明のｃＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードしているＤＮＡ断片であって、たとえば、その塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡのクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれるものである。同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の範疇に含まれるものである。
【００１３】
また、この発明のｃＤＮＡの部分配列は、10bp以上の連続配列であり、この連続配列からなるＤＮＡ断片（センス鎖およびアンチセンス鎖）もこの発明の範囲に含まれる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
さらに、この発明の抗体は、上記の蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００１４】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は、以下の例によって限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
実施例１：アクチン結合蛋白質l-アファディンの同定と精製
胎児ラット脳より成長円錐を単離し、125Iで標識したＦ−アクチンによるブロット・オーバーレイ(blot overlay)法（Cell Motil. Cytoskeleton. 18:164-179, 1991）を行い、分子量２０５ＫＤａ（ｐ２０５）のバンドを確認した。競合的結合阻害を試験した結果、この蛋白質はＦ−アクチンに特異的に結合したが、 125 Ｉで標識したＧ−アクチンには結合しないことから、Ｆ−アクチン結合蛋白質であることが確認された。
【００１６】
次に、胎児ラット脳の可溶画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、分子量約２０５ＫＤａの蛋白質バンドを、複数のカラムクロマトグラフィー（Q-Sepharose, phenyl-5PW, hydroxyapatite, Mono Q ）で精製した。最終的な Mono Q カラムクロマトグラフィーの結果を図１に示す。図１（ａ）は２８０ｎｍでの吸光度、（ｂ）は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイ、（ｃ）はCoomassie brilliant blueで染色した蛋白質バンドである。この図１（ｃ）に示したように、精製蛋白質は、最終的に、約２０５ＫＤａ（ｐ２０５）と約１９０ＫＤａ（ｐ１９０）が得られた。そこで、これら２種類の精製蛋白質をポリアクリルアミドゲルから切り出し、分解酵素 (lysil endopeptidase)によって限定分解した後、ペプチドマッピングを行い、２つの蛋白質に共通する５つのペプチドを単離し、それらの部分アミノ酸配列を決定した。そして、配列データベースによる相同性検索の結果、５つのペプチドはヒトＡＦ−６蛋白質と高い相同性を有することが確認された。一方、ｐ２０５に特異的な２つのペプチドの配列は、既存のデータベースには存在しなかった。これらの結果から、ｐ２０５およびｐ１９０はヒトＡＦ−６蛋白質に関連するラット蛋白質であり、ｐ１９０はｐ２０５のスプライシングバリアント、相同体または分解産物であることが示唆された。また、ｐ２０５は、ＡＪ部位に局在することから、「a large splicing variant of AF-6protein localized at adherens junction：l-afadin」と命名した（以下、この発明の蛋白質を、l-アファディンまたはｐ２０５と記載する）。
実施例２：アクチン結合蛋白質l-アファディン遺伝子クローニング
実施例１で得た２０５ＫＤａ蛋白質l-アファディンの部分アミノ酸配列に基づいて７種類のオリゴヌクレオチドプローブを作成し、ラットの脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、図２に示したような幾つかのオーバープクローンが得られた。配列決定の結果、これらのクローンのうち、クローン２０は、約4.9kbpからなるコード領域を含んでおり、このコード領域から推定されたアミノ酸配列は、ｐ２０５の全てのペプチドを含んでいた。また、ｐ２０５に特異的な２つのペプチドはＣ−端側に位置していた。なお、クローン９４はｐ１９０をコードする約4.5kbpからなるコード領域を含んでいた。ただし、これらのクローン２０および９４は開始コドンを含んでおらず、その開始コドンはクローン８４に含まれていた。そこで、ｐ２０５の全長ｃＤＮＡをクローン８４および２０から構築し、ｐ１９０の全長ｃＤＮＡをクローン８４と９４から構築した。
【００１７】
また、クローン２０、８４および９４をプローブとしたＦＩＳＨ分析（Cytogenet. Cell Genet. 61:282-285, 1992; Electrophoresis. 16:261-272, 1995）の結果、これらのｃＤＮＡはラット染色体１ｑ１２．２に位置することも確認された。
実施例３：アクチン結合蛋白質l-アファディンの動物細胞での発現
実施例２で構築したｐ２０５のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、このベクターをＣＯＳ７細胞に導入して、細胞の発現産物について 125Ｉ標識Ｆ−アクチンを用いたブロット・オーバーレイ法による分析を行った。得られた組換え蛋白質（myc-l-afadin）は、図３（ａ）に示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でネイティブなｐ２０５と類似の泳動を示し、また 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有してもいた。一方、Ｃ−端側の１５６アミノ酸残基を欠くｐ２０５の変異体は、 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を示さなかった。これに対して、ｐ２０５のＣ−端（１９９アミノ酸残基）とＧＴＳ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合蛋白質は 125Ｉ標識Ｆ−アクチン結合活性を示した。
【００１８】
以上の結果から、ｐ２０５遺伝子は、配列番号１に記載した1,829 アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、その推定分子量は207,667 で、Ｃ−端１９９アミノ酸残基にＦ−アクチン結合ドメインを有することが明らかになった。また、ｐ１９０遺伝子は、Ｃ−端約１６０アミノ酸残基を欠失した蛋白質をコードし、ｐ２０５遺伝子のスプライシングバリアントとであると結論づけられた。
【００１９】
コンピュータによるホモロジー検索の結果、ｐ１９０のアミノ酸配列は、ヒトＡＦ−６蛋白質の全配列と９０％一致した。ただし、ヒトＡＦ−６蛋白質もｐ１９０も、ｐ２０５のＣ−端領域を欠失していた。また、ｐ２０５のＣ−端（Ｆ−アクチン結合ドメイン）は、他の如何なるＦ−アクチン結合蛋白質との有意な相同性を示さなかった。従って、ｐ１９０がラットにおけるヒトＡＦ−６の類似体であるのに対し、ｐ２０５は新規なＦ−アクチン結合蛋白質であることが確認された。なお、図３（ｂ）に示したように、ｐ２０５およびｐ１９０は、いずれもＰＤＺを有していた。
実施例４：抗l-アファディン抗体の作成
公知の方法に従い、配列番号１の1814−1829番目までのアミノ酸配列からなる合成ペプチドを免疫原として、l-アファディンを特異的に認識するウサギ・ポリクローナル抗体を作成した。また、配列番号１の 557−592 番目までのアミノ酸配列からなる合成ペプチドを免疫原として、l-アファディンおよびS-アファディンを認識するウサギ・ポリクローナル抗体を作成した。
実施例５：l-アファディンの発現組織の確認
l-アファディンｃＤＮＡに特異的な配列をプローブとして用いたノーザンブロット分析の結果、図４（ａ）に示したとおり、l-アファディンは検査したラット組織（心臓、脳、脾臓、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣）の全てで発現していた。
【００２０】
また、実施例４で作成した抗l-アファディン抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果からも、図４（ｂ１）に示したように、l-アファディンはラットの全ての組織で発現することが確認された。
しかしながら、図４（ｂ２）に示したように、l-アファディンとS-アファディンの両方を認識する抗体を使用したウエスタンブロットの結果からは、これらの臓器のうち、S-アファディンは脳のみに発現していることが確認された。
【００２１】
以上の結果から、この発明のl-アファディンは全ての組織で発現するのに対し、s-アファディンは脳のみに発現していることが確認された。
実施例６：l-アファディンの生化学的特性
実施例１で得た２０５ＫＤａ蛋白質（l-アファディン）のアクチン結合様式をブロット・オーバーレイ法を用いて検討した結果、l-アファディンとアクチンとの結合はミオシンＳ１によって特異的に阻害されたが（図５ａ）、この阻害はＭｇＡＴＰの添加によって消失した。ミオシンＳ１はＦ−アクチンの側面に結合することが確認されている蛋白質であり（Science 261:58-65, 1993; Nature 364:171-174, 1993 ）、ＭｇＡＴＰはアクチン−ミオシン複合体を分離することが知られているため（Biochemistry 14:2207-2214, 1975 ）、l-アファディンはＦ−アクチンの側面に結合することが確認された。
【００２２】
次に、falling ball法（Methods Enzymol. 85:211-233, 1982; J. Biol. Chem. 271:31775-31778, 1996 ）を用いて、l-アファディンによるＦ−アクチンの粘度変化を調べた結果、図５（ｂ）に示したように、l-アファディンはＦ−アクチンの粘度を用量依存的に増加させ、粘度は最大約３倍にまで増加した。
さらに、ストイキオメトリー（stoichiometry ）を計算した結果（図５ｃ）、アクチン約５００分子に対してHis6−l-アファディン−Ｃ１分子の割合で結合すると計算され、そのＫｄ値は１０-7オーダーと計算された。
【００２３】
また、アクチンに対するl-アファディン効果をpyrene−アクチンを用いて検討したところ、l-アファディンはアクチンの核形成促進作用を示さないことも判明した。
実施例７：l-アファディンの局在位置の確認
抗l-アファディン抗体を用い、様々なマウスまたはラット組織の凍結切片を免疫蛍光顕微鏡で検査してl-アファディンの局在位置を確認した。
【００２４】
肝臓では、l-アファディンは毛細胆管に沿った帯状結合複合体領域（belt-like junctional complex region ）に局在していた（図６ａ）。小腸では、抗Ｅ−カドヘリン−モノクローナル抗体を併用して調べたところ、l-アファディンは腸吸収上皮の結合複合領域にＥ−カドヘリンと共に検出されたが、Ｅ−カドヘリンに比べ同部位により濃縮されていた（図６ｂ１−３、ｃ１−３）。心臓については、抗ビンキュリン−モノクローナル抗体を併用して調べた。ビンキュリンは、細胞−細胞ＡＪだけでなく、細胞−マトリックスＡＪに対するマーカーとして知られている（Cell 18:193-205, 1979; Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983 ）。その結果、l-アファディンは、心臓の境界膜にビンキュリンと共に検出された（図６ｄ１−３）。ただし、ビンキュリンは心筋細胞の外側縁に沿っても検出されたが、l-アファディンはこの領域には検出されなかった。また、Ｅ−カドヘリンを発現する培養ＥＬ細胞（Nature 329:341-343, 1987）を、抗ＺＯ−１抗体を併用して調べたところ、l-アファディンの局在はＺＯ−１の局在と類似していた（図７ａ，ｂ）。ＺＯ−１は、線維芽細胞におけるカドヘリン性細胞−細胞ＡＪに存在することが知られているので（J. Cell Biol. 115:1149-1462, 1991; J. Cell Biol. 121:491-502, 1993）、l-アファディンもまた、このカドヘリン性細胞−細胞ＡＪに局在することが示唆された。
【００２５】
さらに、l-アファディンの正確な局在を調べるために、小腸の凍結切片を抗Ｚｏ−１モノクローナル抗体と抗l-アファディン抗体で共染色し、また肝臓の毛細胆管を抗デスモプラキン（desmoplakin ）モノクローナル抗体と抗l-アファディン抗体で共染色した。ＺＯ−１は密着結合に対するマーカーとして知られており（J. Cell Biol. 103:755-766, 1986; J. Cell Biol. 121:491-502, 1993）、デスモプラキンはデスモソームのマーカーとして知られている（J. Cell Biol. 63:515-523, 1974; Eur. J. Cell Biol. 32:117-130, 1983; J. Mol. Biol. 163:647-671, 1983; EMBO J. 6:885-889, 1987 ）。その結果、小腸の吸収上皮では、l-アファディンはＺＯ−１より僅かに基底側に存在していた（図８ａ１−３）。また、胆管では、l-アファディンの局在とデスモプラキンの局在は一致していなかった（図８ｂ１−３）。
【００２６】
これらの結果から、l-アファディンは、密着結合やデスモソームよりもむしろ、細胞−細胞ＡＪに局在していることが示された。そしてさらに、免疫電子顕微鏡によりl-アファディンは、小腸の吸収上皮細胞の細胞−細胞ＡＪに局在することが観察された（図９ａ、ｂ）。
以上により、この発明のl-アファディンは、アクチン性細胞骨格と細胞−細胞ＡＪとを連結する新規なタンパク質であることが確認された。
【００２７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、カドヘリン性細胞−細胞密着結合に局在する新規なアクチン結合蛋白質l-アファディンと、このl-アファディンを産業上利用するための遺伝子材料が提供される。
【００２８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：1829
配列の型：アミノ酸
配列の種類：蛋白質
起源
生物名：ラット
組織：胎児脳
配列
【００２９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】モノＱカラムクロマトグラフィーの吸光度（ａ）、 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイの結果（ｂ）およびＳＤＳ電気泳動の染色結果（ｃ）である。
【図２】 l-アファディン（ｐ２０５）およびS-アファディン（ｐ１９０）のｃＤＮＡの模式図である。
【図３】（ａ）は、様々な組換えl-アファディン断片のＦ−アクチン結合活性を示す。左は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイ、右はウエスタンブロットの結果である。（ｂ）は、l-アファディンおよびS-アファディンの構造を示した模式図である。
【図４】 l-アファディンの臓器分布を調べた結果であり、（ａ）はノーザンブロット、（ｂ）は抗l-アファディン抗体（ｂ１）および抗l-アファディン／S-アファディン抗体（ｂ２）を用いたウエスタンブロットの結果である。
【図５】 l-アファディンの生化学特性であり、（ａ）はl-アファディンのＦアクチン結合活性のミオシンＳ１による阻害、（ｂ）はl-アファディンによるＦ−アクチン粘度の増加、（ｃ）はHis6−l-アファディン−ＣのＦ−アクチンへの結合を示す。
【図６】ラットまたはマウスの様々な組織におけるl-アファディン、Ｅ−カドヘリンおよびビンキュリンの局在を示す写真図である。
【図７】ＥＬ細胞におけるl-アファディンおよびＺＯ−１の局在を示す写真図である。
【図８】 l-アファディン、ＺＯ−１およびデスモプラキンの異なる局在を示す写真図である。
【図９】ラット小腸におけるl-アファディンの局在を示す写真図である。
【発明の属する技術分野】
この発明は、新規なアクチン結合蛋白質l-アファディン(l-Afadin)に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、動物の個体形成等に重要な役割を果たす細胞間密着結合に関与する新規動物性蛋白質l-アファディンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物個体における様々な細胞現象、例えば、細胞接着、細胞運動および細胞の形状決定等においては、細胞接着分子、受容体およびチャンネル等の膜貫通蛋白質によって形成される接着装置が重要な役割を果たしており、これらの接着装置は、しばしばアクチン性細胞骨格と結合することが知られている（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58, 1997 ）。従って、アクチン性細胞骨格と細胞質膜とは上記細胞現象において重要な役割を果たしており、それ故アクチン性細胞骨格を膜貫通蛋白質に結合させる生体分子の特定に多大な努力が払われてきた。しかしながら、アクチン性細胞骨格と細胞質膜との結合に関する分子的基礎については、今だ充分に理解されてはいない。
【０００３】
このような細胞結合に係わる分子的基礎を理解するため、これまでに細胞接着部位が最も広範に研究された（Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1:103-109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3:849-853, 1991; Science. 258:955-964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5:653-660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22:53-58, 1997 ）。その結果、アクチン線維（Ｆ−アクチン）に関連する細胞接着部位が２つのタイプ、すなわち、細胞−細胞接着帯（adherens junctions: ＡＪ）と、細胞−マトリックスＡＪとに分類されている。細胞−細胞ＡＪにおいては、その細胞外表面でカドヘリン（cadherin）が互いに相互作用しており、多くの結合蛋白質が同定されている（Development 102:639-655, 1988; Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Science 251:1451-1455,1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992; EMBO J. 8:1711-1717, 1989; Cell 65:849-857, 1991; Science 251:1451-1455, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。これらの結合タンパク質のうち、α−カテニンは、Ｆ−アクチンと直接相互作用する（Pro.Natl. Acad. Sci. USA. 92:8813-8817, 1995）と共に、α−アクチニンおよび／またはＺＯ−１を介してＦ−アクチンに間接的に相互作用している（J. Cell.Biol. 130:67-77, 1995;J. Cell Biol. 138:181-192, 1997 ）。また、別のＦ−アクチン結合蛋白質であるビンキュリン（vinculin）は、細胞−細胞ＡＪに集中していることが知られているが、細胞−細胞ＡＪにおけるその相互作用分子は未だ特定されていない（Cell Motil. Cytoskeleton. 20:1-6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4:834-839, 1992）。さらに、細胞外表面においてインテグリン（integrin）がマトリックス蛋白質と相互作用する細胞−マトリックスＡＪでは、その細胞質ドメインは、α−アクチニン、ビンキュリン、タリン（talin ）等のＦ−アクチン結合蛋白質と、直接または関節的に相互作用している（Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11:379-416, 1995）。
【０００４】
以上のとおり、多くのＦ−アクチン結合蛋白質が、アクチン性細胞骨格と細胞質膜のカドヘリンおよびインテグリンとの結合因子（linker）として作用していると考えられている。
一方、アクチン性細胞骨格と細胞質膜との結合は、神経細胞に特異的な現象（例えば、成長円錐の伸長やその後のシナプス結合の形成および維持等）にとっても重要である（Neuron 1:761-772, 1988; Science 242:708-715, 1988; Curr. Opin. Neurobiol. 4:43-48, 1994; Curr. Opin. Neurobiol. 4:640-647, 1994; Cell 83:171-176, 1995）。しかしながら、これらの神経細胞に特異的な現象において、どのような分子がアクチン性細胞骨格を細胞質膜に結合させているかは明らかではない。
【０００５】
この点を明らかにするため、この出願の発明者等は、ラットの脳から幾つかの新規なＦ−アクチン結合蛋白質を単離し、特に神経細胞に特異的で、シナプスに多く存在する蛋白質の構造を解析し、既に特許出願している（特願平９−９２６１５号）。この先願発明の蛋白質（以下、発明者等の命名に従って「ニューラビン」（neurabin) と記載する）は、１つのＦ−アクチン結合ドメインと、１つのＰＤＺドメインを有している。ＰＤＺドメインは様々な蛋白質に見出されており、そのうちの幾つかは細胞間結合に局在している。例えば、シナプス結合におけるＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０（Neuron. 9:929-942, 1992; J. Biol. Chem. 268:4580-4583, 1993 ）、隔膜結合におけるＤlg（Cell. 66:451-464, 1991）、密着結合におけるＺＯ−１およびＺＯ−２（J. Cell Biol. 193:755-766, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:3460-3464, 1991; J. Cell Biol. 121:491-502, 1993; J. Cell Biol. 123:1049-1053, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:7834-7838, 1993; J. Cell Biol. 124:949-961, 1994）等である。また、最近の研究から、ＰＤＺドメインは標的蛋白質のユニークなＣ−末端モチーフに結合することが明らかにされたが（Trends Biochem. Sci. 21:455-458, 1996 ）、このモチーフは、N-methyl-D-aspartate受容体やＳhaker-type K+ チャネル等の多くの膜貫通蛋白質に見出されている（Nature 378:85-88, 1995; Science 269:1737-1740, 1995; J. Neurosci. 16:2157-2163, 1996）。
【０００６】
【発明が解決使用とする課題】
以上のとおりの様々な知見から、この発明者等による先願発明の蛋白質ニューラビンは、シナプスにおけるアクチン性細胞骨格と膜貫通蛋白質との接着因子として機能しているものと考えられる。
しかしながら、細胞間接着に関与する分子的基礎の全容は未だ解明されておらず、そのためには、アクチン結合蛋白質のさらなる同定が必須である。また、このような蛋白質は、例えば癌腫の浸潤、転移のメカニズムの解明につながる可能性もあり、癌腫の悪性度の診断やその治療法、治療薬等の開発への応用も期待される。
【０００７】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、細胞間接着に関与する新規なアクチン結合蛋白質を、その構造（アミノ酸配列）および性状を明らかにして提供することを目的としている。
また、この発明は、このアクチン結合蛋白質の遺伝子工学的操作のための材料を提供することも目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列を有するアクチン結合蛋白質l-アファディンを提供する。
またこの発明は、配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する動物性蛋白質を提供する。
【０００９】
さらにこの発明は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、このｃＤＮＡまたはその一部配列がハイブリダイズするゲノムＤＮＡ配列をも提供する。
さらにまた、この発明は、上記のアクチン結合蛋白質l-アファディンを免疫原として作成した抗体を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この発明のアクチン結合蛋白質l-アファディンは、配列番号１のアミノ酸配列を含む蛋白質であって、この蛋白質には、配列番号１のアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。さらに、この発明の蛋白質には、他の任意の蛋白質（例えば、蛍光蛋白質など）との融合蛋白質も含まれる。
【００１１】
この発明の蛋白質は、公知の方法によってヒトの臓器、細胞株などから単離することができる。また、ペプチドとして使用する場合には、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によって調製することもできる。あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術によりインビトロで生産することにより取得することもできる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターによる形質転換体細胞（大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等）からこの発明の蛋白質を大量に発現させることができる。具体的には、例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡを挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。一方、この発明の蛋白質を動物細胞で分泌発現させる場合には、ｃＤＮＡ断片を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で発現させることができる。
【００１２】
この発明のゲノムＤＮＡ配列は、上記蛋白質をコードするヒトおよび他の哺乳動物の遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
この発明のｃＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードしているＤＮＡ断片であって、たとえば、その塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡのクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれるものである。同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の範疇に含まれるものである。
【００１３】
また、この発明のｃＤＮＡの部分配列は、10bp以上の連続配列であり、この連続配列からなるＤＮＡ断片（センス鎖およびアンチセンス鎖）もこの発明の範囲に含まれる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
さらに、この発明の抗体は、上記の蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００１４】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は、以下の例によって限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
実施例１：アクチン結合蛋白質l-アファディンの同定と精製
胎児ラット脳より成長円錐を単離し、125Iで標識したＦ−アクチンによるブロット・オーバーレイ(blot overlay)法（Cell Motil. Cytoskeleton. 18:164-179, 1991）を行い、分子量２０５ＫＤａ（ｐ２０５）のバンドを確認した。競合的結合阻害を試験した結果、この蛋白質はＦ−アクチンに特異的に結合したが、 125 Ｉで標識したＧ−アクチンには結合しないことから、Ｆ−アクチン結合蛋白質であることが確認された。
【００１６】
次に、胎児ラット脳の可溶画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、分子量約２０５ＫＤａの蛋白質バンドを、複数のカラムクロマトグラフィー（Q-Sepharose, phenyl-5PW, hydroxyapatite, Mono Q ）で精製した。最終的な Mono Q カラムクロマトグラフィーの結果を図１に示す。図１（ａ）は２８０ｎｍでの吸光度、（ｂ）は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイ、（ｃ）はCoomassie brilliant blueで染色した蛋白質バンドである。この図１（ｃ）に示したように、精製蛋白質は、最終的に、約２０５ＫＤａ（ｐ２０５）と約１９０ＫＤａ（ｐ１９０）が得られた。そこで、これら２種類の精製蛋白質をポリアクリルアミドゲルから切り出し、分解酵素 (lysil endopeptidase)によって限定分解した後、ペプチドマッピングを行い、２つの蛋白質に共通する５つのペプチドを単離し、それらの部分アミノ酸配列を決定した。そして、配列データベースによる相同性検索の結果、５つのペプチドはヒトＡＦ−６蛋白質と高い相同性を有することが確認された。一方、ｐ２０５に特異的な２つのペプチドの配列は、既存のデータベースには存在しなかった。これらの結果から、ｐ２０５およびｐ１９０はヒトＡＦ−６蛋白質に関連するラット蛋白質であり、ｐ１９０はｐ２０５のスプライシングバリアント、相同体または分解産物であることが示唆された。また、ｐ２０５は、ＡＪ部位に局在することから、「a large splicing variant of AF-6protein localized at adherens junction：l-afadin」と命名した（以下、この発明の蛋白質を、l-アファディンまたはｐ２０５と記載する）。
実施例２：アクチン結合蛋白質l-アファディン遺伝子クローニング
実施例１で得た２０５ＫＤａ蛋白質l-アファディンの部分アミノ酸配列に基づいて７種類のオリゴヌクレオチドプローブを作成し、ラットの脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、図２に示したような幾つかのオーバープクローンが得られた。配列決定の結果、これらのクローンのうち、クローン２０は、約4.9kbpからなるコード領域を含んでおり、このコード領域から推定されたアミノ酸配列は、ｐ２０５の全てのペプチドを含んでいた。また、ｐ２０５に特異的な２つのペプチドはＣ−端側に位置していた。なお、クローン９４はｐ１９０をコードする約4.5kbpからなるコード領域を含んでいた。ただし、これらのクローン２０および９４は開始コドンを含んでおらず、その開始コドンはクローン８４に含まれていた。そこで、ｐ２０５の全長ｃＤＮＡをクローン８４および２０から構築し、ｐ１９０の全長ｃＤＮＡをクローン８４と９４から構築した。
【００１７】
また、クローン２０、８４および９４をプローブとしたＦＩＳＨ分析（Cytogenet. Cell Genet. 61:282-285, 1992; Electrophoresis. 16:261-272, 1995）の結果、これらのｃＤＮＡはラット染色体１ｑ１２．２に位置することも確認された。
実施例３：アクチン結合蛋白質l-アファディンの動物細胞での発現
実施例２で構築したｐ２０５のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、このベクターをＣＯＳ７細胞に導入して、細胞の発現産物について 125Ｉ標識Ｆ−アクチンを用いたブロット・オーバーレイ法による分析を行った。得られた組換え蛋白質（myc-l-afadin）は、図３（ａ）に示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でネイティブなｐ２０５と類似の泳動を示し、また 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を有してもいた。一方、Ｃ−端側の１５６アミノ酸残基を欠くｐ２０５の変異体は、 125Ｉ標識Ｆ−アクチンに対する結合活性を示さなかった。これに対して、ｐ２０５のＣ−端（１９９アミノ酸残基）とＧＴＳ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合蛋白質は 125Ｉ標識Ｆ−アクチン結合活性を示した。
【００１８】
以上の結果から、ｐ２０５遺伝子は、配列番号１に記載した1,829 アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、その推定分子量は207,667 で、Ｃ−端１９９アミノ酸残基にＦ−アクチン結合ドメインを有することが明らかになった。また、ｐ１９０遺伝子は、Ｃ−端約１６０アミノ酸残基を欠失した蛋白質をコードし、ｐ２０５遺伝子のスプライシングバリアントとであると結論づけられた。
【００１９】
コンピュータによるホモロジー検索の結果、ｐ１９０のアミノ酸配列は、ヒトＡＦ−６蛋白質の全配列と９０％一致した。ただし、ヒトＡＦ−６蛋白質もｐ１９０も、ｐ２０５のＣ−端領域を欠失していた。また、ｐ２０５のＣ−端（Ｆ−アクチン結合ドメイン）は、他の如何なるＦ−アクチン結合蛋白質との有意な相同性を示さなかった。従って、ｐ１９０がラットにおけるヒトＡＦ−６の類似体であるのに対し、ｐ２０５は新規なＦ−アクチン結合蛋白質であることが確認された。なお、図３（ｂ）に示したように、ｐ２０５およびｐ１９０は、いずれもＰＤＺを有していた。
実施例４：抗l-アファディン抗体の作成
公知の方法に従い、配列番号１の1814−1829番目までのアミノ酸配列からなる合成ペプチドを免疫原として、l-アファディンを特異的に認識するウサギ・ポリクローナル抗体を作成した。また、配列番号１の 557−592 番目までのアミノ酸配列からなる合成ペプチドを免疫原として、l-アファディンおよびS-アファディンを認識するウサギ・ポリクローナル抗体を作成した。
実施例５：l-アファディンの発現組織の確認
l-アファディンｃＤＮＡに特異的な配列をプローブとして用いたノーザンブロット分析の結果、図４（ａ）に示したとおり、l-アファディンは検査したラット組織（心臓、脳、脾臓、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣）の全てで発現していた。
【００２０】
また、実施例４で作成した抗l-アファディン抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果からも、図４（ｂ１）に示したように、l-アファディンはラットの全ての組織で発現することが確認された。
しかしながら、図４（ｂ２）に示したように、l-アファディンとS-アファディンの両方を認識する抗体を使用したウエスタンブロットの結果からは、これらの臓器のうち、S-アファディンは脳のみに発現していることが確認された。
【００２１】
以上の結果から、この発明のl-アファディンは全ての組織で発現するのに対し、s-アファディンは脳のみに発現していることが確認された。
実施例６：l-アファディンの生化学的特性
実施例１で得た２０５ＫＤａ蛋白質（l-アファディン）のアクチン結合様式をブロット・オーバーレイ法を用いて検討した結果、l-アファディンとアクチンとの結合はミオシンＳ１によって特異的に阻害されたが（図５ａ）、この阻害はＭｇＡＴＰの添加によって消失した。ミオシンＳ１はＦ−アクチンの側面に結合することが確認されている蛋白質であり（Science 261:58-65, 1993; Nature 364:171-174, 1993 ）、ＭｇＡＴＰはアクチン−ミオシン複合体を分離することが知られているため（Biochemistry 14:2207-2214, 1975 ）、l-アファディンはＦ−アクチンの側面に結合することが確認された。
【００２２】
次に、falling ball法（Methods Enzymol. 85:211-233, 1982; J. Biol. Chem. 271:31775-31778, 1996 ）を用いて、l-アファディンによるＦ−アクチンの粘度変化を調べた結果、図５（ｂ）に示したように、l-アファディンはＦ−アクチンの粘度を用量依存的に増加させ、粘度は最大約３倍にまで増加した。
さらに、ストイキオメトリー（stoichiometry ）を計算した結果（図５ｃ）、アクチン約５００分子に対してHis6−l-アファディン−Ｃ１分子の割合で結合すると計算され、そのＫｄ値は１０-7オーダーと計算された。
【００２３】
また、アクチンに対するl-アファディン効果をpyrene−アクチンを用いて検討したところ、l-アファディンはアクチンの核形成促進作用を示さないことも判明した。
実施例７：l-アファディンの局在位置の確認
抗l-アファディン抗体を用い、様々なマウスまたはラット組織の凍結切片を免疫蛍光顕微鏡で検査してl-アファディンの局在位置を確認した。
【００２４】
肝臓では、l-アファディンは毛細胆管に沿った帯状結合複合体領域（belt-like junctional complex region ）に局在していた（図６ａ）。小腸では、抗Ｅ−カドヘリン−モノクローナル抗体を併用して調べたところ、l-アファディンは腸吸収上皮の結合複合領域にＥ−カドヘリンと共に検出されたが、Ｅ−カドヘリンに比べ同部位により濃縮されていた（図６ｂ１−３、ｃ１−３）。心臓については、抗ビンキュリン−モノクローナル抗体を併用して調べた。ビンキュリンは、細胞−細胞ＡＪだけでなく、細胞−マトリックスＡＪに対するマーカーとして知られている（Cell 18:193-205, 1979; Biochem. Biophys. Acta 737:305-341, 1983 ）。その結果、l-アファディンは、心臓の境界膜にビンキュリンと共に検出された（図６ｄ１−３）。ただし、ビンキュリンは心筋細胞の外側縁に沿っても検出されたが、l-アファディンはこの領域には検出されなかった。また、Ｅ−カドヘリンを発現する培養ＥＬ細胞（Nature 329:341-343, 1987）を、抗ＺＯ−１抗体を併用して調べたところ、l-アファディンの局在はＺＯ−１の局在と類似していた（図７ａ，ｂ）。ＺＯ−１は、線維芽細胞におけるカドヘリン性細胞−細胞ＡＪに存在することが知られているので（J. Cell Biol. 115:1149-1462, 1991; J. Cell Biol. 121:491-502, 1993）、l-アファディンもまた、このカドヘリン性細胞−細胞ＡＪに局在することが示唆された。
【００２５】
さらに、l-アファディンの正確な局在を調べるために、小腸の凍結切片を抗Ｚｏ−１モノクローナル抗体と抗l-アファディン抗体で共染色し、また肝臓の毛細胆管を抗デスモプラキン（desmoplakin ）モノクローナル抗体と抗l-アファディン抗体で共染色した。ＺＯ−１は密着結合に対するマーカーとして知られており（J. Cell Biol. 103:755-766, 1986; J. Cell Biol. 121:491-502, 1993）、デスモプラキンはデスモソームのマーカーとして知られている（J. Cell Biol. 63:515-523, 1974; Eur. J. Cell Biol. 32:117-130, 1983; J. Mol. Biol. 163:647-671, 1983; EMBO J. 6:885-889, 1987 ）。その結果、小腸の吸収上皮では、l-アファディンはＺＯ−１より僅かに基底側に存在していた（図８ａ１−３）。また、胆管では、l-アファディンの局在とデスモプラキンの局在は一致していなかった（図８ｂ１−３）。
【００２６】
これらの結果から、l-アファディンは、密着結合やデスモソームよりもむしろ、細胞−細胞ＡＪに局在していることが示された。そしてさらに、免疫電子顕微鏡によりl-アファディンは、小腸の吸収上皮細胞の細胞−細胞ＡＪに局在することが観察された（図９ａ、ｂ）。
以上により、この発明のl-アファディンは、アクチン性細胞骨格と細胞−細胞ＡＪとを連結する新規なタンパク質であることが確認された。
【００２７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、カドヘリン性細胞−細胞密着結合に局在する新規なアクチン結合蛋白質l-アファディンと、このl-アファディンを産業上利用するための遺伝子材料が提供される。
【００２８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：1829
配列の型：アミノ酸
配列の種類：蛋白質
起源
生物名：ラット
組織：胎児脳
配列
【００２９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】モノＱカラムクロマトグラフィーの吸光度（ａ）、 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイの結果（ｂ）およびＳＤＳ電気泳動の染色結果（ｃ）である。
【図２】 l-アファディン（ｐ２０５）およびS-アファディン（ｐ１９０）のｃＤＮＡの模式図である。
【図３】（ａ）は、様々な組換えl-アファディン断片のＦ−アクチン結合活性を示す。左は 125Ｉ標識Ｆ−アクチンによるブロット・オーバーレイ、右はウエスタンブロットの結果である。（ｂ）は、l-アファディンおよびS-アファディンの構造を示した模式図である。
【図４】 l-アファディンの臓器分布を調べた結果であり、（ａ）はノーザンブロット、（ｂ）は抗l-アファディン抗体（ｂ１）および抗l-アファディン／S-アファディン抗体（ｂ２）を用いたウエスタンブロットの結果である。
【図５】 l-アファディンの生化学特性であり、（ａ）はl-アファディンのＦアクチン結合活性のミオシンＳ１による阻害、（ｂ）はl-アファディンによるＦ−アクチン粘度の増加、（ｃ）はHis6−l-アファディン−ＣのＦ−アクチンへの結合を示す。
【図６】ラットまたはマウスの様々な組織におけるl-アファディン、Ｅ−カドヘリンおよびビンキュリンの局在を示す写真図である。
【図７】ＥＬ細胞におけるl-アファディンおよびＺＯ−１の局在を示す写真図である。
【図８】 l-アファディン、ＺＯ−１およびデスモプラキンの異なる局在を示す写真図である。
【図９】ラット小腸におけるl-アファディンの局在を示す写真図である。
Claims (3)
- 配列番号１のアミノ酸配列からなるアクチン結合蛋白質l-アファディン。
- 配列番号１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
- 請求項１のアクチン結合蛋白質 l- アファディンの部分ペプチドを抗原として作成された抗体であって、請求項１のアクチン結合蛋白質 l- アファディンを特異的に認識する抗体。
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