JPH09191879A

JPH09191879A - 活性型Ｒａｓタンパク質結合性タンパク質ｐ１８０

Info

Publication number: JPH09191879A
Application number: JP7319281A
Authority: JP
Inventors: Kozo Kaibuchi; 淵弘三貝; Akihiko Iwamatsu; 松明彦岩
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1995-11-15
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 1997-07-29

Abstract

(57)【要約】【課題】活性型Ｒａｓタンパク質が関与する腫瘍形成
を抑制するタンパク質の提供。【解決手段】活性型Ｒａｓタンパク質結合能を有する
ＡＦ−６の改変アミノ酸配列またはその等価配列を有す
る、ペプチドまたはタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、活性型Ｒａｓタンパク質結合能を有するＡＦ
−６の改変アミノ酸配列に関する。

【０００２】背景技術生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３
万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク
質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のス
ーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですで
に５０種類以上のメンバーが見い出されている。低分子
量Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性から、Ｒａ
ｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別
することができる。さらに、Ｒｈｏファミリーは、Ｒｈ
ｏタンパク質、Ｒａｃタンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク
質のサブファミリーに大別される。この低分子量Ｇタン
パク質は種々の細胞機能を制御していることが明らかに
なってきており、例えば、Ｒａｓサブファミリーのタン
パク質は細胞の増殖や分化を、Ｒｈｏサブファミリーの
タンパク質は細胞の形態変化、細胞接着、細胞凝集、細
胞運動、細胞***等を制御していると考えられている。

【０００３】Ｒａｓは、発ガンウイルスに誘導される動
物の悪性腫瘍の原因となる遺伝子として最初に同定され
たウイルスのガン遺伝子のひとつである（Barbacid,
M., Annu. Rev. Biophem. 56, 779-827 (1987)、Lowy,
D.R. & Willumsen, B.M., Annu. Rev. Biophem. 62, 85
1-891 (1993)）。このウイルスの発ガン遺伝子に関し
て、これに相当するヒトの遺伝子の解析などが進められ
た結果、正常な細胞の（細胞性の）Ｒａｓ遺伝子群（Ｈ
−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｒ−Ｒａｓ）が変
異すると、インビトロで細胞が形質転換されることが明
かになった。また、ウイルス由来のＲａｓ遺伝子や変異
した細胞性のＲａｓ遺伝子をマウスの生殖細胞に導入す
ることによりトランスジェニック・マウスを作製し、導
入したＲａｓ遺伝子を発現誘導すると、乳腺、顎下腺、
肝臓、肺、脾臓およびＴリンパ細胞に悪性腫瘍が高い効
率で誘導されることが明らかとなった（Adams, J.M. &
Cory,S., Science 254, 1161-1167 (1991) ）。さら
に、変異型または活性型の細胞性Ｒａｓ遺伝子群は広く
２０〜３０％のヒトの各種のガン、特に５０％以上の大
腸ガン、９０％以上の膵臓ガンに認められる（Clark,
G.J. & Der, C.J., Cellular Cancer Markers (eds Gar
rett, C. T. & Sell, S.) 17-52 (Humana Press, Totow
a, New Jersey (1995) 、Bos, J.L. , Cancer Res. 49,
4682-4689 (1989)）。このように変異型Ｒａｓタンパ
ク質はある種のヒトの腫瘍の形成を促すことが知られて
いる。

【０００４】また、低分子量Ｇタンパク質Ｒａｓタンパ
ク質は、シグナル伝達に関与するグアニンヌクレオチド
結合タンパク質であり、チロシンキナーゼ型の受容体、
例えば上皮細胞増殖因子やＳｒｃファミリーのタンパク
質、の下流のシグナル伝達を担い、細胞***反応や細胞
の分化を誘導することが知られている（Satoh, T. eta
l., J. Biol. Chem. 267, 24149-24152 (1992)、McCorm
ick, F., Curr. Opin.Genet. Dev. 4, 71-76 (199
4)）。Ｒａｓタンパク質にはＧＤＰと結合した不活性型
とＧＴＰに結合した活性型があり、後者は標的タンパク
質に物理的に結合する。

【０００５】Ｒａｆキナーゼファミリーのタンパク質、
即ちｃ−Ｒａｆ−１（Blenis, J.,Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 90, 5889-5892 (1993) 、Daum, G. et al., Tr
ends Biochem. Sci. 19, 474-480 (1994)）、Ａ−Ｒａ
ｆ（Vojetk, A.B. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）
およびＢ−Ｒａｆ（Moodie, S.A. et al., Mol. Cell.
Biol. 14, 7153-7162 (1994)、Jaiswal, R.K. et al.,
Mol. Cell. Biol. 14,6944-6953 (1994) 、Catling A.
D.et al., J. Biol. Chem. 269, 30014-30021(1994)、Y
amamori, B. et al., J. Biol. Chem. 270, 11723-1172
6 (1995) ）、はＲａｓタンパク質が直接結合する標的
タンパク質の一つであるということが、多くの研究によ
って明かになった。活性化されたＲａｆタンパク質はＭ
ＡＰキナーゼキナーゼをリン酸化することにより活性化
し、次いで、活性化したＭＡＰキナーゼキナーゼがＭＡ
Ｐキナーゼを活性化し、ある種の遺伝子群、例えば発ガ
ン遺伝子ｖ−ｆｏｓの細胞性遺伝子の産物でもあるｃ−
ｆｏｓ（Cano, E. & Mahadevan, L. C., Trends Bioche
m. Sci. 20, 117-122 (1995)、Marshall, C. J., Cell
80, 179-185 (1995)）、の発現を誘導することが知られ
ている。また、ｃ−Ｒａｆ−１は活性型Ｒａｓタンパク
質と、Ｒａｓタンパク質のエフェクター領域で結合する
ことが知られている（Satoh, T. et al., J. Biol. Che
m. 267, 24149-24152 (1992)、McCormick, F., Curr. O
pin. Genet. Dev. 4, 71-76 (1994)）。

【０００６】一方、ある種のヒト白血病では染色体転座
ｔ（６：１１）の結果、ＡＬＬ−１／ＡＦ−６キメラタ
ンパク質が生じることが知られている（Prasad, R. et
al.,Cancer Res. 53, 5624-5628 (1993) ）。正常なＡ
Ｆ−６遺伝子の塩基配列も明らかになっており、この塩
基配列よりＡＦ−６タンパク質（以下単に「ＡＦ−６」
ということがある）のアミノ酸配列が推定された（前掲
Prasad, R. et al. ）。

【０００７】しかしながらＡＦ−６タンパク質の生物学
的な機能については、本発明者が知る限り報告されてい
ない。また、ＡＦ−６とＲａｓタンパク質との相互の関
係についても同様に、本発明者らが知る限り報告されて
いない。

【０００８】

【発明の概要】今般、本発明者らは、活性型Ｈ−Ｒａｓ
タンパク質と結合する分子量約１８０ｋＤのタンパク質
（以下「ｐ１８０」ということがある）をウシ脳灰白質
から単離し、ｐ１８０がＡＦ−６と同一のタンパク質で
あるとの知見を得た。また、ＡＦ−６の部分アミノ酸配
列がＲａｓタンパク質エフェクター領域に結合し、ｃ−
Ｒａｆ−１と競合するとの知見を得た。本発明はかかる
知見に基づくものである。

【０００９】即ち、本発明は、活性型Ｒａｓタンパク質
結合能を有するＡＦ−６の改変アミノ酸配列またはその
等価配列を有する、ペプチドまたはタンパク質の提供を
その目的とする。

【００１０】また、本発明は、該ペプチドまたはタンパ
ク質をコードする塩基配列、該塩基配列を含んでなるベ
クター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、
該ペプチドまたはタンパク質の製造法、該タンパク質を
含んでなる腫瘍形成または転移抑制剤、該タンパク質を
コードする塩基配列を有するベクターを含んでなる腫瘍
形成または転移抑制用遺伝子治療剤、および活性型Ｒａ
ｓタンパク質とＡＦ−６との結合を阻害する物質のスク
リーニング法の提供をその目的とする。

【００１１】

【発明の具体的説明】活性型Ｒａｓタンパク質結合性タンパク質本発明による活性型Ｒａｓタンパク質結合性タンパク質
は、ＡＦ−６の改変アミノ酸配列またはその等価配列を
有するペプチドまたはタンパク質であって、該改変アミ
ノ酸配列が活性型Ｒａｓタンパク質結合能を有するも
の、をいう。ここで、「改変アミノ酸配列」とは、ＡＦ
−６の全アミノ酸配列においてアミノ酸の付加、挿入、
削除、欠失または置換などにより改変されたアミノ酸配
列をいう。従って、ＡＦ−６の全アミノ酸配列の一部の
配列から構成されるＡＦ−６の部分アミノ酸配列であっ
て、活性型Ｒａｓタンパク質結合能を有するものも改変
アミノ酸配列の一態様である。

【００１２】ＡＦ−６の全アミノ酸配列は、例えば、ヒ
トをその起源とするものは公知であり、その配列は配列
番号１に記載される通りである。ヒトのＡＦ−６の配列
と相同性を有するヒト以外の種（例えば、ウシ、ブタ、
ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ、カエル、ショウジ
ョウバエ、線虫、酵母等）のタンパク質の全アミノ酸配
列も、ここにいうＡＦ−６の全アミノ酸配列に含まれる
ものとする。

【００１３】ＡＦ−６の起源は特に限定されず、ヒトを
含むホ乳類由来のものであっても、それ以外を由来とす
るものであってもよい。

【００１４】本発明によるペプチドまたはタンパク質
は、活性型Ｒａｓタンパク質結合能を有する。ここで、
Ｒａｓタンパク質としては、Ｈ−Ｒａｓタンパク質、Ｋ
−Ｒａｓタンパク質、Ｎ−Ｒａｓタンパク質、Ｒ−Ｒａ
ｓタンパク質、Ｒａｌタンパク質、Ｒａｐ１Ａタンパク
質、Ｒａｐ１Ｂタンパク質、Ｒａｐ２タンパク質、Ｔｃ
２１タンパク質等のＲａｓスーパーファミリーに含まれ
る一群のタンパク質（Ando, S. et al.,実験医学、11,
1973-1980 (1993)）等が挙げられる。

【００１５】本発明において、「活性型Ｒａｓタンパク
質結合能を有するアミノ酸配列」とは、当業者により活
性型Ｒａｓタンパク質との結合が認められたと評価され
るものをいい、例えば、実施例１または３と同様の条件
において実験した場合に、活性型Ｒａｓタンパク質との
結合が認められたと評価されるアミノ酸配列を意味する
ものとする。

【００１６】本発明において「等価配列」とは、アミノ
酸配列においてアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失また
は置換などの改変があっても、改変前の配列と同じ機能
を有することを意味し、例えば、活性型Ｒａｓタンパク
質との結合能を有する改変アミノ酸配列において、アミ
ノ酸の付加、挿入、削除、欠失または置換などの改変が
生じたアミノ酸配列であって、依然として活性型Ｒａｓ
タンパク質との結合能を有するものを意味する。

【００１７】本発明によるペプチドまたはタンパク質の
具体例としては、配列番号１に記載されるアミノ酸配列
の３６〜８４８番の配列からなるもの、および３６〜２
０６番の配列からなるもの、並びに活性型Ｒｈｏタンパ
ク質結合能を有するこれらの部分配列からなるもの、が
挙げられる。

【００１８】本発明によるペプチドまたはタンパク質
は、活性型Ｒａｓタンパク質結合能を有するＡＦ−６の
改変アミノ酸配列を含んでなるものである。また、活性
型Ｒａｓタンパク質はヒトの腫瘍の形成、転移等に密接
にかかわっている（前掲 Clark, G. J. & Der, C. J.、
Bos, J. L.）。従って、本発明によるペプチドまたはタ
ンパク質は、腫瘍の形成および転移を解明する上で有用
である。

【００１９】活性型Ｒａｓ結合性タンパク質をコードす
る塩基配列本発明によれば、活性型Ｒａｓタンパク質に結合するタ
ンパク質をコードする塩基配列が提供される。この塩基
配列の典型的配列は、配列番号１に記載されるＤＮＡ配
列の一部または全部を有するものである。更に、前記し
たように本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列
の等価配列をも包含するものである。従って、本発明に
よる塩基配列には、更にこの等価配列をコードする塩基
配列も包含される。なお、本明細書において塩基配列と
は、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味する
ものとする。

【００２０】前記改変アミノ酸配列が与えられれば、そ
れをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号１に
記載されるアミノ酸配列およびその等価配列をコードす
る種々の塩基配列を選択することができる。従って、本
発明によるペプチドまたはタンパク質をコードする塩基
配列とは、配列番号１に記載される一部または全部のＤ
ＮＡ配列に加え、同一のアミノ酸をコードする配列であ
って縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配
列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ
配列も含まれる。

【００２１】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであ
ってもよい。ＤＮＡの典型的な取得方法としては、染色
体ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子
工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸
配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを
用いてスクリーニングを行う方法、等が挙げられる。

【００２２】本発明による塩基配列としては、配列番号
１に記載されるＤＮＡ配列の１０６〜６１８番の配列ま
たは１０６〜２５４４番の配列からなる配列が挙げられ
る。

【００２３】ベクターおよび形質転換された宿主細胞本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主
細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタン
パク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供さ
れる。更に、本発明によれば、このベクターによって形
質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクタ
ー系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。融合タン
パク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパ
ク質）、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ｍｙｃ、Ｆａｓ等を用
いたものが挙げられる。

【００２４】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発
現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイ
ウイルスベクター、ＨＩＶベクター）、リポソームベク
ター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等が
挙げられる。

【００２５】本発明によるベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望のアミノ酸配列を発現させるため
には、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を
制御する配列や微生物または動物培養細胞等を選択する
ための遺伝子マーカー等を含んでいてもよい。また、こ
のベクターは、本発明による塩基配列を反復した形（タ
ンデム）で含んでいてもよい。これらは常法に従いベク
ターに存在させてよく、このベクターによる微生物また
は動物培養細胞等の形質転換の方法も、この分野で慣用
されているものを用いることができる。

【００２６】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。

【００２７】また、宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、
リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍
細胞等）が挙げられる。

【００２８】上記形質転換された宿主細胞を適当な培地
で培養し、その培養物から上記した本発明による改変ア
ミノ酸配列またはその等価配列を有するペプチドまたは
タンパク質を得ることができる。従って、本発明の別の
態様によれば、本発明による改変アミノ酸配列またはそ
の等価配列を有するペプチドまたはタンパク質の製造法
が提供される。形質転換された宿主細胞の培養およびそ
の条件は、使用する細胞についてのそれと本質的に同様
であってよい。また、培養液からの本発明による改変ア
ミノ酸配列等の回収、精製も常法に従って行うことがで
きる。

【００２９】活性型Ｒａｓタンパク質結合性タンパク質
の用途ＡＦ−６および本発明によるペプチドまたはタンパク質
は、活性型Ｒａｓタンパク質を中和することにより、活
性型Ｒａｓタンパク質からＲａｆタンパク質等へのシグ
ナル伝達を遮断することができると考えられる。また、
Ｒａｓタンパク質がＲａｆタンパク質や、ｃ−ｆｏｓタ
ンパク質等を経由して腫瘍の形成、転移に密接にかかわ
っていることが確認されている（前掲Blenis, J., Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA 90, 5889-5892 (1993) 、Dau
m, G. et al., Trends Biochem. Sci. 19, 474-480 (19
94)、（Vojtek, A.B. et al., Cell 74, 205-214 (199
3)、Moodie, S.A. et al., Mol. Cell. Biol. 14, 7153
-7162 (1994)、Jaiswal, R.K. et al., Mol. Cell. Bio
l. 14, 6944-6953 (1994) 、Catling A.D.et al., J.Bi
ol. Chem. 269, 30014-30021 (1994)、Yamamori, B. et
al., J. Biol. Chem. 270, 11723-11726 (1995) 、Can
o, E. & Mahadevan, L. C., Trends Biochem.Sci. 20,
117-122 (1995)、Marshall, C. J., Cell 80, 179-185
(1995)、Satoh, T. et al., J. Biol. Chem. 267, 2414
9-24152 (1992)、McCormick, F., Curr. Opin. Genet.
Dev. 4, 71-76 (1994)）。更に、後記実施例に記載され
るように、本発明によるペプチドまたはタンパク質はＲ
ａｆタンパク質と競合し、また、本発明によるペプチド
またはタンパク質をＲａｓ遺伝子を発現している細胞内
で発現させると、ｃ−ｆｏｓ遺伝子の転写活性が抑制さ
れる。従って、ＡＦ−６または活性型Ｒａｓタンパク質
結合能を有するＡＦ−６の改変アミノ酸配列もしくはそ
の等価配列を投与することによって、あるいはこれらを
ヒトを含む生体内で発現させることによって、活性型Ｒ
ａｓタンパク質がこれに結合し、その結果として活性型
Ｒａｓタンパク質からＲａｆタンパク質へのシグナル伝
達が遮断され、Ｒａｓタンパク質が関与する腫瘍の形成
および転移を抑制できると考えられる。

【００３０】従って、本発明のもう一つの態様として、
ＡＦ−６または本発明によるペプチドもしくはタンパク
質を含んでなる、腫瘍形成または転移の抑制剤（以下
「腫瘍形成等抑制剤」という）が提供される。

【００３１】ここで、腫瘍形成および転移としては、Ｒ
ａｓが関与する腫瘍の形成（すなわち、Ｒａｓタンパク
質を経由するシグナルの伝達による腫瘍の形成）、Ｒａ
ｆが関与する腫瘍の形成、他の低分子量Ｇタンパク質
（例えば、Ｒａｌタンパク質、Ｒａｐタンパク質等）が
関与する腫瘍の形成、Ｒａｓタンパク質の活性化タンパ
ク質（例えば、ＳｏＳ等）が関与する腫瘍の形成、受容
体型チロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧ
Ｆ受容体等）が関与する腫瘍の形成等が挙げられる。

【００３２】本発明による腫瘍形成等抑制剤は、また、
経口または非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投
与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）、好ましくは
経口投与することができ、薬剤として経口または非経口
投与に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動物
に使用される。

【００３３】腫瘍形成等抑制剤は、例えばその用途に応
じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒
剤、トローチ錠などの経口剤、静注および筋注などの注
射剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいず
れかの製剤形態に調製することができる。これらの各種
製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、
湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝
剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化
剤、安定化剤などを用いて常法により製造することがで
きる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば
乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネ
シウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレン
グリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノ
ール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウ
ム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが挙げられ
る。

【００３４】薬剤中における本発明のペプチドまたはタ
ンパク質の含有量はその剤形に応じて異なるが、通常全
組成物中約０．１〜約５０重量％、好ましくは約１〜約
２０重量％濃度である。

【００３５】腫瘍形成および転移の治療のための投与量
は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度などを考慮し
て適宜決定されるが、通常成人１日当り約０．１〜約５
００ｍｇ、好ましくは約０．５〜約５０ｍｇ程度とする
のがよく、これを１日１回または数回に分けて投与する
ことができる。

【００３６】本発明の更にもう一つの態様として、ＡＦ
−６または本発明によるペプチドもしくはタンパク質を
コードする塩基配列を含んでなる、腫瘍形成または転移
抑制用遺伝子治療剤が提供される。この遺伝子治療剤
は、ＡＦ−６または本発明によるペプチドもしくはタン
パク質をコードする塩基配列を有する前記ベクターを用
いて標的細胞を形質転換し、腫瘍の形成または転移を抑
制する様な態様で用いることができる。

【００３７】形質転換される細胞としては、ガン患者体
内のガン細胞、例えば、骨髄性白血病細胞、リンパ性白
血病細胞、肺ガン細胞、大腸ガン細胞、胃ガン細胞、膵
臓ガン細胞、乳ガン細胞、腎ガン細胞、頭頸部ガン細
胞、肝臓ガン細胞、皮膚ガン細胞、脳腫瘍細胞等が挙げ
られる。

【００３８】前記の本発明によるタンパク質等をコード
する塩基配列を有するベクターをヒトを含む生体内のガ
ン細胞に適当な方法によって導入することによって、悪
性腫瘍等について遺伝子治療を行うことができる。遺伝
子治療用のベクターについては、高久史磨監修の実験医
学（増刊号）第１２巻、第１５号「遺伝子治療の最前
線」（１９９４年）を参照することができる。

【００３９】スクリーニング法本発明によれば、（１）スクリーニングの対象となる物
質を、活性型Ｒａｓタンパク質およびＡＦ−６または本
発明によるペプチドもしくはタンパク質を含むスクリー
ニング系に存在させ、そして（２）活性型Ｒａｓタンパ
ク質と、ＡＦ−６または本発明によるペプチドもしくは
タンパク質との結合の阻害の程度を測定することを含ん
でなる、活性型Ｒａｓタンパク質とＡＦ−６との結合を
阻害する物質のスクリーニング法が提供される。

【００４０】ここで、「結合の阻害の程度を測定する」
方法としては、例えば、無細胞系での組換え型ＡＦ−６
とＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｓタンパク質との結合をグ
ルタチオンセファロースビーズを用いて測定する方法、
オーバーレイ・アッセイを用いて測定する方法（Mance
r, E. et al, 、J. Biol. Chem. 267, 16025-16028 (19
92)）、酵母ツー・ハイブリッド・システム（two hybri
d system ）を用いて測定する方法（Vojetk et al.,Cel
l 74,205-214(1993) ）等が挙げられ、例えば、実施例
３の（２）に記載される方法に準じて結合の阻害の程度
を測定することができる。

【００４１】スクリーニング系は細胞系または無細胞系
のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、Ｃ
ＯＳ細胞、酵母細胞、線維芽細胞（３Ｙｌ細胞、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞、Ｒａｔｌ細胞、ＤＴ細胞、Ｂａｌｂ３Ｔ３
細胞等）、血液系細胞（Ｂａ／Ｆ３細胞等）等が挙げら
れる。

【００４２】スクリーニングの対象となるものは、特に
限定されないが、例えばペプチド、ペプチドのアナロ
グ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられる。

【００４３】本発明によれば、また、（１）ＡＦ−６の
改変アミノ酸配列またはその等価配列を有するペプチド
またはタンパク質を、活性型Ｒａｓタンパク質と活性型
Ｒａｆタンパク質とを含むスクリーニング系に存在さ
せ、そして（２）活性型Ｒａｓタンパク質と活性型Ｒａ
ｆタンパク質との結合の程度を測定することを含んでな
る、活性型Ｒａｓタンパク質と活性型Ｒａｆタンパク質
との結合を阻害するＡＦ−６の改変アミノ酸配列または
その等価配列を有するペプチドまたはタンパク質のスク
リーニング法が提供される。

【００４４】ここで、「活性型Ｒａｓタンパク質と活性
型Ｒａｆタンパク質との結合の程度を測定する」方法と
しては、無細胞系でグルタチオンセファロースビーズを
用いて測定する方法や、オーバーレイアッセイを用いて
測定する方法（前掲 Mancer,E. et. al. ）、酵母ツー
・ハイブリッド・システムを用いて測定する方法（前掲
Vojetk et al.）等が挙げられ、例えば、実施例３の
（２）に記載される方法に準じて結合の阻害の程度を測
定することができる。スクリーニング系は、前記スクリ
ーニング系において記載したものに準ずることができ
る。

【００４５】本発明によるスクリーニング法は、ＡＦ−
６の改変アミノ酸配列またはその等価配列を有するペプ
チドまたはタンパク質をスクリーニングの対象とするも
のである。ＡＦ−６の改変アミノ酸配列またはその等価
配列を有するペプチドまたはタンパク質は、本発明によ
るペプチドまたはタンパク質であってもよく、具体的に
は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３６〜２０６番
の配列の部分配列またはその等価配列であってもよい。
本発明によるスクリーニング法において用いることがで
きるＲａｆタンパク質としては、ｃ−Ｒａｆ−１タンパ
ク質、Ａ−Ｒａｆタンパク質、およびＢ−Ｒａｆタンパ
ク質等が挙げられる。

【００４６】本発明によれば、更に、（１）ＡＦ−６の
改変アミノ酸配列またはその等価配列を有するペプチド
またはタンパク質を、Ｒａｓ遺伝子を発現している細胞
を含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）該細
胞中のガン関連遺伝子転写プロモーターの活性化の程度
を測定することを含んでなる、ガン関連遺伝子転写プロ
モーターの活性化を阻害するＡＦ−６の改変アミノ酸配
列またはその等価配列を有するペプチドまたはタンパク
質のスクリーニング法が提供される。

【００４７】ここで、「ガン関連遺伝子転写プロモータ
ーの活性化の程度を測定する」方法としては、ガン関連
遺伝子転写プロモーターの下流に適当な遺伝子（例え
ば、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラク
トシダーゼ遺伝子）を連結し、該遺伝子の発現の程度を
測定する方法が挙げられ、例えば、実施例４に記載され
る方法に準じて活性化の程度を測定することができる。
「ガン関連遺伝子」としては、ｃ−ｆｏｓ−１、ｃ−ｊ
ｕｎ等が挙げられる。

【００４８】本発明によるスクリーニング法におけるス
クリーニング系は、Ｒａｓ遺伝子を発現している細胞を
含むもの、である。「Ｒａｓ遺伝子が発現している細
胞」としては、変異型または野生型Ｒａｓ遺伝子を導入
した細胞、変異型または野生型のチロシンキナーゼ型の
受容体の遺伝子を導入した細胞、変異型または野生型の
Ｓｒｃ等のセリン／スレオニン・キナーゼ遺伝子を導入
した細胞、細胞増殖因子やサイトカインで刺激した細
胞、常法に従って変異型または野生型のＲａｓ遺伝子の
発現が確認される腫瘍細胞等の細胞（前記背景技術参
照）等が挙げられる。「Ｒａｓ遺伝子」としては、野生
型Ｒａｓ遺伝子および変異型Ｒａｓ遺伝子等が挙げられ
る。また、Ｒａｓ遺伝子の導入は、遺伝子工学の分野で
慣用されている方法を用いることができる。

【００４９】本発明によるスクリーニング法は、ＡＦ−
６の改変アミノ酸配列またはその等価配列を有するペプ
チドまたはタンパク質をスクリーニングの対象とするも
のである。ＡＦ−６の改変アミノ酸配列またはその等価
配列を有するペプチドまたはタンパク質は、本発明によ
るペプチドまたはタンパク質であってもよく、具体的に
は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３６〜２０６番
の配列の部分配列またはその等価配列であってもよい。

【００５０】変異型Ｒａｓタンパク質（例えばＨ−Ｒａ
ｓ^{Ｖａｌ１２}）による細胞の形質転換においては、変異
型Ｒａｓタンパク質がＲａｆキナーゼファミリーのタン
パク質（ｃ−Ｒａｆ−ｌ、Ａ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａ
ｆ）に結合することが必要である。しかしながら、Ｒａ
ｆタンパク質に結合できるにもかかわらず、細胞の形質
転換を起こすことができない点突然変異型Ｈ−Ｒａｓ
（Ｈ−Ｒａｓ^{Ｖａｌ１２、} ^{Ｓｅｒ３５}）が存在すること
が知られている（White, M. A. et al., Cell 80,533-5
41 ）。このことより、Ｒａｆタンパク質以外の他の活
性型Ｒａｓタンパク質結合タンパク質も、変異型Ｒａｓ
タンパク質による細胞の形質転換に必要であることが示
唆された。ＡＦ−６タンパク質はこの様なＲａｓタンパ
ク質結合タンパク質の候補のひとつであるという可能性
がある。従って、上記２つのスクリーニング法は、腫瘍
形成または転移抑制物質のスクリーニング法としても用
いることができる。

【００５１】

【実施例】本発明を以下の実施例によって説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１活性型Ｈ−Ｒａｓタンパク質と結合するタン
パク質の検出と同定（１）ウシ脳膜画分抽出液の調製ウシ脳灰白質の（１９０ｇ）を鋏で切って小片にし、５
７０ｍｌのホモジェナイズ用バッファー（２５ｍＭＴ
ｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭＥＧＴＡ，１
ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ_２，１０μＭ（ρ−アミジノフェニル）−メタンス
ルホニルフルオライド，１μｇ／ｍｌロイペプチン，
１０％スクロース）に懸濁した。懸濁液をＰｏｔｔｅ
ｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍテフロン・グラス・ホモジェナ
イザーでホモジェナイズし、４層のガーゼで瀘過した。
ホモジェネートを２０，０００×ｇで３０分、４℃で遠
心分離した。沈殿物を３６０ｍｌのホモジェナイズ用バ
ッファー中に懸濁し粗膜画分とした。粗膜画分のタンパ
ク質を、等量の４ＭＮａＣｌを含むホモジェナイズ用
バッファーを添加することにより抽出した。４℃で１時
間震盪した後、膜画分を２０，０００×ｇで１時間、４
℃で遠心分離した。上澄画分をバッファーＡ（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴ
Ａ，１ｍＭＤＴＴ，５ｍＭＭｇＣｌ_２）に対して３
回透析した。その後、固形硫安を、最終濃度が４０％飽
和濃度となるように添加した。０−４０％硫安で沈殿し
た沈殿物を１６ｍｌのバッファーＡに溶解し、再びバッ
ファーＡに対して３回透析した後、ウシ脳膜抽出液とし
て使用した。

【００５２】（２）ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓタンパク質アフ
ィニティーカラムクロマトグラフィーグアニンヌクレオチド結合型のＧＳＴ−低分子量Ｇタン
パク質（Ｈ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ^{Ａｌａ３８}、Ｒ−Ｒａ
ｓ、ＲａｌＡ、またはＲｈｏＡタンパク質）は、低分子
量Ｇタンパク質（１．５ｎｍｏｌ）を、３０℃で１時
間、１５μＭＧＤＰまたはＧＴＰγＳとともに、１ｍ
ｌ中の反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），１０ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴＴ，５ｍＭ
ＭｇＣｌ_２，１ｍＭＬ−α−ジミリストイルホスファ
チジルコリン，０．３％３−［（３−コールアミドプ
ロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネ
ート）中でインキュベートすることにより調製した（Sh
imizu, K. et al., J. Biol.Chem. 269, 22917-22920
(1994)）。

【００５３】ウシ脳膜抽出液（１６ｍｌ）を２．５ｍｌ
のグルタチオンーセファロース４Ｂカラム（ファルマシ
ア・バイオテック社製）より溶出し、内因性のＧＳＴを
除去した。素通り画分の１０分の１量を、グアニンヌク
レオチドをロードしたＧＳＴー低分子量Ｇタンパク質を
含む０．２５ｍｌのグルタチオンーセファロース４Ｂカ
ラムにかけた。カラムを０．８２５ｍｌのバッファーＡ
で３回洗浄した後、１０ｍＭグルタチオンと０．２Ｍ
ＮａＣｌを含む０．８２５ｍｌのバッファーＡで３回処
理することにより、カラムに結合したタンパク質をそれ
ぞれの低分子量Ｇタンパク質とともに溶出した。溶出画
分の各４０μｌを、ＳＤＳーポリアクリルアミド（ＰＡ
ＧＥ）電気泳動（Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685
(1970)）にかけ、ゲルを銀染色することにより解析し
た（図１）。

【００５４】その結果、１８０ｋＤａ（ｐ１８０）およ
び１９５ｋＤａ（ｐ１９５）の分子量を有するタンパク
質が、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓアフィニティー
カラムからのグルタチオン溶出画分に検出されたが、Ｇ
ＳＴアフィニティーカラムまたはＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−
Ｒａｓアフィニティーカラムからの溶出画分には検出さ
れなかった（図１）。また、ｐ１８０およびｐ１９５は
いずれもＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^{Ａｌａ３８}ア
フィニティーカラムからの溶出画分には検出されなかっ
た。Ｈ−Ｒａｓ^{Ａｌａ３８}は、エフェクター結合領域中
に点突然変異（３８番目のアミノ酸がアラニンに置換）
を有する突然変異タンパク質である（Satoh, T. et a
l., J. Biol. Chem. 267, 24149-24152 (1992)、McCorm
ick, F., Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 71-76 (199
4)）。

【００５５】さらに、他の低分子量Ｇタンパク質のＧＳ
Ｔ融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｒ−Ｒａｓ、ＧＳＴ−Ｒａ
ｌＡ、およびＧＳＴ−ＲｈｏＡ）を用いたアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーによって、Ｈ−Ｒａｓへの
結合の特異性が確認された。即ち、ｐ１８０およびｐ１
９５はいずれも、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒ−Ｒａｓアフ
ィニティーカラムからはより少量しか溶出されず、ＧＤ
Ｐ・ＧＳＴ−Ｒ−Ｒａｓアフィニティーカラムからは全
く溶出されなかった（データ省略）。また、ｐ１８０お
よびｐ１９５はいずれも、ＧＳＴ−ＲａｌＡアフィニテ
ィーカラムからもＧＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティーカラ
ムからも全く溶出されなかった（データ省略）。

【００５６】実施例２ｐ１８０の同定（１）アミノ酸配列分析による同定アミノ配列分析用の精製ｐ１８０画分の調製するため
に、グルタチオン−セファロース４Ｂカラムからの素通
り画分（１６ｍｌ）を、２ｎｍｏｌのＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−Ｈ−Ｒａｓを含む１ｍｌのグルタチオン・セファロ
ース４Ｂカラムにロードした。カラムに結合したタンパ
ク質は、１０ｍＭグルタチオンと０．２ＭＮａＣｌを含
むバッファーＡで溶出し、溶出画分を１ｍｌづつ回収し
た。ｐ１８０タンパク質は画分２−１０に含まれてい
た。全量１９２ｍｌの脳膜抽出液を用いて、この作業を
１２回繰り返した。ＧＴＰγＳ・Ｈ−Ｒａｓに結合する
タンパク質（ｐ１８０）を同定するため、下記の方法に
よって、精製したｐ１８０をアミノ酸配列分析にかけ
た。具体的には、アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーで精製したｐ１８０を、蒸留水に対して３回透析
し、フリーズドライング法により濃縮した。濃縮した試
料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）（Laemmli, U. K., Nature 227, 680-685 (1970)）
によって分離し、ポリビニリデン・ジフルオロライド膜
にトランスファーした（Iwamatsu, A., Electrophoresi
s 13, 142-147 (1992)）。固定したｐ１８０をタンパク
質分解酵素で消化し、分画し、アミノ酸配列分析にかけ
た（Iwamatsu, A., Electrophoresis13, 142-147 (199
2)）。

【００５７】その結果、ｐ１８０由来の６種のペプチド
配列が決定された。これらはそれぞれ、１）ＳＴＡＴ
ＴＱＤＶＬＥ、２）ＤＭＰＥＴＳＦＴＲ、３）ＬＰ
ＹＬＶＥＬＳＰＤＧ、４）ＰＧＩＶＱＥＴＴＦＤＬ
Ｇ、５）ＹＡＰＤＤＩＰＮＩＮＳ、６）ＬＬＬＥＷ
ＱＦＱＫであった。６種のペプチド配列は全て、ＡＬＬ
−１タンパク質の融合パートナーであるヒトＡＦ−６の
推定アミノ酸配列（Prasad, R. et al., Cancer Res. 5
3, 5624-5628 (1993) ）とほぼ同一であった。ヒトＡＦ
−６の推定アミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ
配列は配列番号１に示される通りである。

【００５８】（２）抗ヒトＡＦ−６抗体による同定アミノ酸配列分析の結果を確認するために、常法に従
い、ウサギ抗ヒトＡＦ−６抗体を作製し、これを用いて
ｐ１８０の同定を試みた。まず、ヒトＡＦ−６の部分ア
ミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列の５６１−５７
６番）に相当する１６−ｍｅｒのペプチド（ＲＶＥＱＱ
ＰＤＹＲＲＱＥＳＲＴＱ）に対するウサギのポリクロー
ナル抗体を作製した。このウサギ抗ヒトＡＦ−６抗体を
用いて、イムノブロット分析（Harlow, E. & Lame, D.,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ）を試みた。
その結果、ｐ１８０は抗ヒトＡＦ−６抗体によって認識
されることがわかった（図２）。ヒトＡＦ−６の計算上
の分子量は１８１，７７７Ｄａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって測定されたｐ１８０の実際の分子量と近かっ
た。以上の結果より、ｐ１８０はヒトＡＦ−６に相当す
るウシのカウンターパートであると結論された。

【００５９】また、抗ヒトＡＦ−６抗体はｐ１９５に弱
く交差反応を示した（データ省略）。ｐ１９５はＡＦ−
６のアイソフォームであるか、あるいはＡＦ−６のオル
タナティブ・スプライスド・フォーム（alternative sp
liced form）であると推測された。

【００６０】実施例３組換えｐ１８０とＧＴＰγＳ−
ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓとの特異的な結合の測定（１）プラスミドの作製インビトロ・トランスレーションにより、ヒトＡＦ−６
のＮ末端領域を含むタンパク質を作製する目的で、ヒト
ＡＦ−６のＮ末端領域（配列番号１のアミノ酸配列の３
６−８４８番）をコードする２．４キロベースのｃＤＮ
Ａ断片を、ヒト脳クイッククローンｃＤＮＡ（クロンテ
ック・ラボラトリーズ・インク社製）よりＰＣＲ法によ
って増幅した。より短いヒトＡＦ−６のＮ末端領域を得
るために、ヒトＡＦ−６のＮ末端領域（配列番号１のア
ミノ酸配列の３６−２０６番）をコードする０．５１キ
ロベースのｃＤＮＡ断片をヒトＡＦ−６ｃＤＮＡクロー
ンＫ１２（Prasad, R. et al., Cancer Res. 53, 5624-
5628 (1993) ）よりＰＣＲ法によって増幅した。これら
のｃＤＮＡ断片はＣ末端に人工的な終止コドンが、両末
端に人工的なＫｐｎＩ制限酵素認識部位が存在している
ので、これらをｐＲＳＥＴプラスミド（ファルマシア・
バイオテック社製）のＫｐｎＩ制限酵素認識部位中にク
ローニングした。

【００６１】短い方のＡＦ−６のＮ末端領域およびｃ−
Ｒａｆ−１のＮ末端領域をマルトース結合タンパク質
（ＭＢＰ）との融合タンパク質として作製するために、
ＡＦ−６のＮ末端領域（配列番号１のアミノ酸配列の３
６−２０６番）をコードするｃＤＮＡ断片およびｃ−Ｒ
ａｆ−１（アミノ酸番１−１４９）をコードするｃＤＮ
Ａ断片をプラスミドｐＭａｌ−ｃ２−ＫｐｎＩ（ファル
マシア・バイオテック社製）のＫｐｎ−１制限酵素認識
部位中にサブクローニングした。プラスミドｐＭａｌ−
ｃ２−ＫｐｎＩには、ＢａｍＨ１部位の近傍にアディシ
ョナルなＫｐｎ−１部位が導入されている。

【００６２】（２）ヒトＡＦ−６ｃＤＮＡのインビトロ
・トランスレーションによって調製したＡＦ−６Ｎ末端
領域とＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質との結合ｐＲＳＥＴ−ＡＦ−６（配列番号１のアミノ酸配列の３
６−８４８番）およびｐＲＳＥＴ−ＡＦ−６（配列番号
１のアミノ酸配列の３６−２０６番）のインビトロ・ト
ランスレーションは、ＴＮＴＴ７にカップルしたレテ
ィキュロサイト・ライゼート・システム（プロメガ社
製）を用いて、インストラクション・マニュアルに記載
されている条件によって実施した。

【００６３】組換えＡＦ−６Ｎ末端領域がＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓと結合するか否かを調べるために、
ビーズに固定化したＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質をイ
ンビトロ・トランスレーションによって調製した組換え
ＡＦ−６Ｎ末端領域（配列番号１のアミノ酸配列の３６
−８４８番）またはＮ末端領域（配列番号１のアミノ酸
配列の３６−２０６番）と混合し、結合したタンパク質
をＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質とともに、グルタチオ
ンの添加により溶出した。

【００６４】より具体的には、ＧＳＴ−低分子量Ｇタン
パク質（各０．７５ｎｍｏｌ）を３１μｌのグルタチオ
ン・セファロース４Ｂビーズに固定化し、３１０μｌ
（１０倍量）のバッファーＡで洗浄した。固定化したビ
ーズに、４０μｌのインビトロ・トランスレーション混
合液（［^３５Ｓ］メチオニンで標識されたＡＦ−６を含
む）を加え、４℃で１時間緩やかに混合した。ビーズを
１０２μｌ（３．３倍量）のバッファーＡで３回洗浄し
た後、ビーズに結合したタンパク質をＧＳＴ−低分子量
Ｇタンパク質とともに、１０ｍＭグルタチオンを含むバ
ッファーＡを添加することにより溶出した。その後、各
４０μｌの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離
し、ゲルを真空乾燥後オートラジオグラフィーによって
解析した。

【００６５】その結果、インビトロ・トランスレーショ
ンによって調製したＡＦ−６Ｎ末端領域（配列番号１の
アミノ酸配列の３６−８４８番）は、ＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−Ｈ−Ｒａｓとともに溶出されたが、ＧＳＴ、ＧＤＰ
・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａ
ｓ^{Ａｌａ３８}、ＧＳＴ−Ｒ−Ｒａｓ、ＧＳＴ−Ｒａｌ
Ａ、ＧＳＴ−ＲｈｏＡではごく少量しか溶出されなかっ
た（図３）。

【００６６】次に、ヒトＡＦ−６のＲａｓ結合領域を決
定するために、同様の実験をヒトＡＦ−６のＮ末端領域
（配列番号１のアミノ酸配列の３６−２０６番）を用い
て実施した。ＡＦ−６のＮ末端領域（配列番号１のアミ
ノ酸配列の３６−２０６番）をＭＢＰとの融合タンパク
質（ＭＢＰ−ＡＦ−６）として発現させ、アミロース樹
脂（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いて
精製した。得られたＭＢＰ−ＡＦ−６（０．１５ｎｍｏ
ｌ）を、ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質カラム・アフィ
ニティー・クロマトグラフィーにかけた。

【００６７】その結果、より短いＮ末端領域（配列番号
１のアミノ酸配列の３６−２０６番）を用いた場合で
も、前述と同様の結果が得られた。即ち、ＭＢＰ−ＡＦ
−６はＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓとともに溶出さ
れたが、ＧＳＴ、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^{Ａｌａ３８}では溶出されなか
った。わずかに早く泳動されるバンドは、ＭＢＰ−ＡＦ
−６の分解産物であると推定された（図４）。

【００６８】同様に、ｃ−Ｒａｆ−１のＮ末端領域（ア
ミノ酸番号１−１４９番）をＭＢＰとの融合タンパク質
（ＭＢＰ−ｃ−Ｒａｆ−１）として発現させ、アミロー
ス樹脂（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用
いて精製し、これを用いてＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓとの結合を測定した。その結果、ＭＢＰ−ｃ−Ｒａ
ｆ−１もＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓに結合した。
ＭＢＰ−ＡＦ−６およびＭＢＰ−ｃ−Ｒａｆ−１のＫｄ
の実測値はそれぞれ、２５０ｎＭおよび２００ｎＭであ
った（データ省略）。

【００６９】次に、ｃ−Ｒａｆ−１がＡＦ−６と競合
し、活性型Ｒａｓタンパク質と結合するかどうかを調べ
た。ｃ−Ｒａｆ−１を用いた競合アッセイでは、１．５
ｎｍｏｌ（ＭＢＰ−ＡＦ−６の１０倍量）のＭＢＰ−ｃ
−Ｒａｆ−１をインキュベーション混合液に同時に加え
た。その結果、過剰量（１０倍量）のＭＢＰ−ｃ−Ｒａ
ｆ−１が、ＭＢＰ−ＡＦ−６とＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ
−Ｒａｓとの結合を抑制することがわかった（図５）。

【００７０】実施例４ＡＦ−６のＲａｓ結合領域によ
るＲａｓによって促進されるｃ−ｆｏｓ活性化の抑制Ｈ−Ｒａｓ^{Ｖａｌ１２}、ｃ−Ｒａｆ−１ dominant neg
ative mutantまたはＡＦ−６（配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列の３６〜２０６番の配列）をコードするｃＤＮ
Ａを含むプラスミドをＮＩＨ／３Ｔ３マウス線維芽細胞
にコトランスフェクションし、Ｈ−Ｒａｓ^{Ｖａｌ１２}に
よるｃ−ｆｏｓ遺伝子の転写活性化へのｃ−Ｒａｆ−１
dominant negative mutantまたはＡＦ−６（３６〜２
０６番のアミノ酸配列）の影響を下記の方法に従い検討
した。結果は、図７に示す通りであった。（１）プラスミドの構築発現用プラスミドｐＣＥＶ４−Ｈ−Ｒａｓ^{Ｖａｌ１２}、
ｃ−Ｒａｆ−１ dominant negative mutantをコードす
るｐＭＮＣ３０１−１は、Fujioka,H.et al.,J.Biol.Ch
em.267,926-930(1992)およびKolch,W.et al.,Nature 34
9,426-428(1991) に記載の方法に従って構築した。ｐＳ
Ｒαｎｅｏ−ＨＡ−ＡＦ−６（３６〜２０６番のアミノ
酸配列）は、以下の方法によって構築した。まず、ＨＡ
−エピトープを３回直列に配置したｃＤＮＡ断片をｐＳ
Ｒαｎｅｏベクター（Fujioka,H.et al.,J.Biol.Chem.2
67,926-930(1992)）のＢａｍＨＩ部位に導入した。結果
として得られたベクターをｐＳＲαｎｅｏ−ＨＡと呼
ぶ。ＢａｍＨＩリンカーを連結したＡＦ−６（３６〜２
０６番のアミノ酸配列）（実施例３の（１））をコード
するｃＤＮＡを、ｐＳＲαｎｅｏ−ＨＡ−ｔａｇの下流
のＢａｍＨＩ部位のライゲートした。また、ｃ−ｆｏｓ
５′−フランキング配列下流に配置されたルシフェラー
ゼｃＤＮＡを含むプラスミド（ｃ−ｆｏｓ−ルシフェラ
ーゼ）を、Fukumoto,Y.et al.,J.Biol.Chem.265,714-78
0(1990) に記載の方法に従って構築した。常法に従っ
て、ｌａｃＺ遺伝子をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαを
持つプラスミドのＳＲα下流に導入し、ｐＳＲα−ｌａ
ｃＺとして用いた。プラスミド・マップは図６に示され
る通りである。

【００７１】（２）発現用プラスミドの細胞へのトラン
スフェクションＮＩＨ／３Ｔ３を６ウエル・ディッシュ（３５ｍｍφ）
に細胞濃度が６×１０⁴となるように蒔き、１０％ウシ
血清（ＣＳ）を含むＤＭＥＭ中に３７℃で、５％ＣＯ₂
存在下で１６時間培養した。培地を１０％ＣＳおよび１
０ｍＭＨｅｐｅｓを含むＤＭＥＭに置換した後、細胞
を４時間培養した。過去の記載（Current Protocols in
Molecular Biology,Current Protocols社）に従って、
リン酸カルシウム／ＤＮＡカクテルを２×ＢＥＳ−緩衝
生理食塩水を用いて調製し、緩やかにディッシュを振盪
しながら、ＤＮＡを下記の濃度で、図７に示される組み
合わせでウエルに加えた。

【００７２】ベクター濃度ｐＣＥＶ４−Ｈ−Ｒａｓ^{Ｖａｌ１２} ０．０５μｇ／ウエルｐＭＮＣ３０１−１（ｃ−Ｒａｆ−１^{Ｔｒｐ３７５}）１．９５μｇ／ウエルｐＳＲａｎｅｏ−ＡＦ−６（３６−２０６ａａ）１．９５μｇ／ウエルｃ−ｆｏｓ−ルシフェラーゼ１．０ μｇ／ウエルｐＳＲα−ｌａｃＺ２．３３μｇ／ウエル１６時間インキュベーションした後、細胞をカルシウム
−フリーのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５〜１０
分間２回に分けて洗浄し、０．５％ＣＳを含むＤＭＥＭ
で４０時間増殖させた後、ルシフェラーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼ・アッセイにかけた。

【００７３】（３）ルシフェラーゼおよびβ−ガラクト
シダーゼ・アッセイ培養細胞をカルシウム−フリーのＰＢＳで３回洗浄した
後、１００μｌのリシス用バッファー（２５ｍＭＴｒ
ｉｓ／ＰＯ₄（ｐＨ７．８），２ｍＭＤＴＴ，１０％グ
リセロール，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を用いて１
５分間室温でリシスした。細胞ライゼートを１．５ｍｌ
チューブに移し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離
した。上清を酵素アッセイに用いた。ルシフェラーゼ・
アッセイのために、細胞ライゼートを０．４ｍｌの反応
溶液（２０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．
８），１．０７ｍＭ（ＭｇＣＯ₃）₄Ｍｇ（ＯＨ）₂・
５Ｈ₂Ｏ，２．６７ｍＭＭｇＳＯ₄，０．１ｍＭＥ
ＤＴＡ，３３．３ｍＭＤＴＴ，２７０μＭ補酵素
Ａ，５３０μＭ５′−ＡＴＰ・２Ｎａ，４７７μＭ
Ｄ−ルシフェリンカリウム塩）中で室温でインキュベー
トした。ルシフェラーゼ活性はルミフォトメーター（La
bo Science社，Model ＴＤ−4000）によって測定し、β
−ガラクトシダーゼ活性により標準化した。β−ガラク
トシダーゼ・アッセイのために、細胞ライゼートを０．
１ｍｌの反応溶液（６０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ
₂Ｏ，４０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ，１０ｍＭ
ＫＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ₂，４８ｍＭ２−メルカ
プトエタノール，３３０μｇ／ｍｌｏ−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）中で３７℃でインキ
ュベートした。反応を５０μｌの１ＭＮａ₂ＣＯ₃の
添加により停止し、４２０ｎｍでの吸光度を測定した。
その結果、ＡＦ−６のＲａｓ結合領域（３６〜２０６番
のアミノ酸配列）により、Ｈ−Ｒａｓ^{Ｖａｌ１２}による
ｃ−ｆｏｓ転写活性化が完全に抑制されることがわかっ
た。ｉｎｖｉｔｒｏ結合実験系で、Ｈ−Ｒａｓとの結
合に関して、ＡＦ−６のＲａｓ結合領域（３６−２０６
アミノ酸）はｃ−Ｒａｆ−ｌと競合する（実施例３）こ
とがわかっている。従って、ＡＦ−６のＲａｓ結合領域
（３６〜２０６番のアミノ酸配列）によるｃ−ｆｏｓ転
写プロモーター（ｃ−ｆｏｓ５′フランキング配列中に
存在する）の活性化の抑制は、ＡＦ−６のＲａｓ結合領
域（３６〜２０６番のアミノ酸配列）によりＨ−Ｒａｓ
^{Ｖａｌ１２}と内在性のｃ−Ｒａｆ−ｌとの結合が抑制さ
れることを介すると推定される。

【００７４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１６１２および４８３９配列の型：アミノ酸および核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドおよびｃＤＮＡ起源：生物名：ヒト配列 ATG TCG GCG GGC GGC CGT GAC GAG GAG CGG CGG AAG CTG GCC GAC ATC 48 Met Ser Ala Gly Gly Arg Asp Glu Glu Arg Arg Lys Leu Ala Asp Ile 1 5 10 15 ATC CAC CAC TGG AAC GCC AAC CGG CTG GAC CTG TTC GAG ATC AGC CAG 96 Ile His His Trp Asn Ala Asn Arg Leu Asp Leu Phe Glu Ile Ser Gln 20 25 30 CCG ACC GAG GAT TTG GAG TTC CAT GGA GTG ATG AGA TTT TAT TTT CAA 144 Pro Thr Glu Asp Leu Glu Phe His Gly Val Met Arg Phe Tyr Phe Gln 35 40 45 GAT AAA GCT GCT GGA AAC TTT GCA ACA AAA TGT ATT CGG GTC TCT AGT 192 Asp Lys Ala Ala Gly Asn Phe Ala Thr Lys Cys Ile Arg Val Ser Ser 50 55 60 ACT GCC ACC ACT CAA GAT GTA ATC GAA ACG CTC GCG GAG AAA TTT CGA 240 Thr Ala Thr Thr Gln Asp Val Ile Glu Thr Leu Ala Glu Lys Phe Arg 65 70 75 80 CCT GAT ATG CGA ATG CTG TCC TCT CCC AAG TAT TCA CTC TAT GAA GTG 288 Pro Asp Met Arg Met Leu Ser Ser Pro Lys Tyr Ser Leu Tyr Glu Val 85 90 95 CAT GTC AGC GGA GAA AGA AGA TTG GAT ATA GAT GAG AAA CCT CTA GTT 336 His Val Ser Gly Glu Arg Arg Leu Asp Ile Asp Glu Lys Pro Leu Val 100 105 110 GTA CAA CTG AAT TGG AAC AAA GAT GAT CGG GAA GGC AGA TTT GTT CTT 384 Val Gln Leu Asn Trp Asn Lys Asp Asp Arg Glu Gly Arg Phe Val Leu 115 120 125 AAG AAT GAG AAT GAC GCC ATT CCT CCT AAG GCT CAA AGT AAT GGA CCT 432 Lys Asn Glu Asn Asp Ala Ile Pro Pro Lys Ala Gln Ser Asn Gly Pro 130 135 140 GAA AAG CAG GAA AAA GAA GGG GTT ATC CAG AAC TTC AAG AGA ACT CTC 480 Glu Lys Gln Glu Lys Glu Gly Val Ile Gln Asn Phe Lys Arg Thr Leu 145 150 155 160 TCA AAG AAA GAA AAG AAG GAA AAA AAG AAG AGA GAA AAA GAG GCA TTG 528 Ser Lys Lys Glu Lys Lys Glu Lys Lys Lys Arg Glu Lys Glu Ala Leu 165 170 175 CGA CAG GCA TCT GAT AAA GAT GAT AGA CCT TTC CAA GGG GAG GAT GTT 576 Arg Gln Ala Ser Asp Lys Asp Asp Arg Pro Phe Gln Gly Glu Asp Val 180 185 190 GAA AAT TCT CGA CTG GCT GCT GAG GTT TAC AAA GAC ATG CCG GAA ACC 624 Glu Asn Ser Arg Leu Ala Ala Glu Val Tyr Lys Asp Met Pro Glu Thr 195 200 205 AGC TTT ACT CGA ACC ATT TCT AAT CCT GAG GTG GTT ATG AAA CGA CGG 672 Ser Phe Thr Arg Thr Ile Ser Asn Pro Glu Val Val Met Lys Arg Arg 210 215 220 AGG CAG CAA AAA TTG GAA AAG AGA ATG CAG GAA TTT CGG AGC TCA GAT 720 Arg Gln Gln Lys Leu Glu Lys Arg Met Gln Glu Phe Arg Ser Ser Asp 225 230 235 240 GGG CGG CCT GAT TCA GGT GGA ACA TTG AGA ATT TAT GCA GAT AGT TTA 768 Gly Arg Pro Asp Ser Gly Gly Thr Leu Arg Ile Tyr Ala Asp Ser Leu 245 250 255 AAA CCA AAT ATT CCC TAC AAG ACA ATC CTG CTG TCT ACT ACA GAT CCT 816 Lys Pro Asn Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Leu Leu Ser Thr Thr Asp Pro 260 265 270 GCA GAC TTT GCT GTG GCT GAA GCT TTA GAG AAG TAT GGT CTG GAA AAA 864 Ala Asp Phe Ala Val Ala Glu Ala Leu Glu Lys Tyr Gly Leu Glu Lys 275 280 285 GAA AAC CCT AAG GAT TAC TGC ATC GCC CGG GTT ATG CTT CCT CCT GGA 912 Glu Asn Pro Lys Asp Tyr Cys Ile Ala Arg Val Met Leu Pro Pro Gly 290 295 300 GCC CAG CAT TCT GAT GAA AAG GGT GCT AAA GAA ATT ATT CTT GAT GAT 960 Ala Gln His Ser Asp Glu Lys Gly Ala Lys Glu Ile Ile Leu Asp Asp 305 310 315 320 GAT GAG TGT CCT TTA CAA ATC TTC AGG GAA TGG CCA AGT GAC AAA GGG 1008 Asp Glu Cys Pro Leu Gln Ile Phe Arg Glu Trp Pro Ser Asp Lys Gly 325 330 335 ATT TTA GTC TTT CAG TTG AAG AGG AGG CCA CCA GAC CAC ATC CCA AAG 1056 Ile Leu Val Phe Gln Leu Lys Arg Arg Pro Pro Asp His Ile Pro Lys 340 345 350 AAA ACC AAG AAA CAC TTG GAA GGC AAG ACA CCC AAG GGA AAG GAG AGA 1104 Lys Thr Lys Lys His Leu Glu Gly Lys Thr Pro Lys Gly Lys Glu Arg 355 360 365 GCT GAC GGG TCT GTC TAT GGC TCC ACC CTT CCT CCG GAG AAG CTG CCC 1152 Ala Asp Gly Ser Val Tyr Gly Ser Thr Leu Pro Pro Glu Lys Leu Pro 370 375 380 TAT TTA GTA GAG TTA AGC CCA GAT GGT TCT GAC TCT AGA GAT AAG CCA 1200 Tyr Leu Val Glu Leu Ser Pro Asp Gly Ser Asp Ser Arg Asp Lys Pro 385 390 395 400 AAG CTT TAC CGC CTT CAG TTA AGT GTT ACT GAA GTT GGG ACA GAA AAG 1248 Lys Leu Tyr Arg Leu Gln Leu Ser Val Thr Glu Val Gly Thr Glu Lys 405 410 415 TTG GAT GAC AAC TCT ATC CAG TTG TTT GGC CCA GGA ATT CAG CCC CAT 1296 Leu Asp Asp Asn Ser Ile Gln Leu Phe Gly Pro Gly Ile Gln Pro His 420 425 430 CAC TGT GAC CTT ACC AAC ATG GAT GGA GTG GTC ACT GTG ACG CCC AGA 1344 His Cys Asp Leu Thr Asn Met Asp Gly Val Val Thr Val Thr Pro Arg 435 440 445 AGT ATG GAC GCA GAA ACC TAC GTG GAA GGC CAG CGC ATC TCA GAA ACC 1392 Ser Met Asp Ala Glu Thr Tyr Val Glu Gly Gln Arg Ile Ser Glu Thr 450 455 460 ACC ATG CTG CAG AGT GGC ATG AAA GTG CAG TTT GGG GCG TCC CAT GTA 1440 Thr Met Leu Gln Ser Gly Met Lys Val Gln Phe Gly Ala Ser His Val 465 470 475 480 TTT AAG TTT GTG GAC CCC AGT CAG GAT CAT GCT CTT GCA AAA AGA TCT 1488 Phe Lys Phe Val Asp Pro Ser Gln Asp His Ala Leu Ala Lys Arg Ser 485 490 495 GTG GAT GGA GGC CTG ATG GTT AAG GGC CCA AGA CAT AAA CCT GGA ATT 1536 Val Asp Gly Gly Leu Met Val Lys Gly Pro Arg His Lys Pro Gly Ile 500 505 510 GTT CAG GAG ACA ACT TTT GAT TTG GGA GGA GAT ATT CAT AGT GGG ACA 1584 Val Gln Glu Thr Thr Phe Asp Leu Gly Gly Asp Ile His Ser Gly Thr 515 520 525 GCA TTA CCG ACA AGC AAG AGC ACC ACT AGG CTG GAC AGC GAC AGA GTG 1632 Ala Leu Pro Thr Ser Lys Ser Thr Thr Arg Leu Asp Ser Asp Arg Val 530 535 540 TCG TCT GCC TCT AGC ACA GCC GAG CGG GGA ATG GTG AAG CCG ATG ATC 1680 Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ala Glu Arg Gly Met Val Lys Pro Met Ile 545 550 555 560 AGA GTA GAA CAG CAG CCA GAT TAT CGC AGG CAA GAA AGC AGA ACA CAG 1728 Arg Val Glu Gln Gln Pro Asp Tyr Arg Arg Gln Glu Ser Arg Thr Gln 565 570 575 GAT GCT TCT GGG CCT GAG CTG ATA CTA CCT GCA AGC ATT GAA TTC AGG 1776 Asp Ala Ser Gly Pro Glu Leu Ile Leu Pro Ala Ser Ile Glu Phe Arg 580 585 590 GAA AGT TCT GAA GAT TCA TTT TTG TCT GCC ATT ATA AAT TAT ACT AAT 1824 Glu Ser Ser Glu Asp Ser Phe Leu Ser Ala Ile Ile Asn Tyr Thr Asn 595 600 605 AGC TCT ACA GTC CAC TTT AAG TTG TCC CCT ACA TAT GTA TTA TAT ATG 1872 Ser Ser Thr Val His Phe Lys Leu Ser Pro Thr Tyr Val Leu Tyr Met 610 615 620 GCA TGC CGG TAT GTA TTG TCC AAC CAG TAC AGA CCT GAC ATC AGC CCT 1920 Ala Cys Arg Tyr Val Leu Ser Asn Gln Tyr Arg Pro Asp Ile Ser Pro 625 630 635 640 ACA GAG CGC ACA CAT AAA GTC ATT GCA GTC GTC AAC AAG ATG GTG AGC 1968 Thr Glu Arg Thr His Lys Val Ile Ala Val Val Asn Lys Met Val Ser 645 650 655 ATG ATG GAG GGT GTC ATC CAG AAA CAG AAG AAT ATT GCA GGG GCA CTT 2016 Met Met Glu Gly Val Ile Gln Lys Gln Lys Asn Ile Ala Gly Ala Leu 660 665 670 GCC TTC TGG ATG GCA AAT GCA TCT GAA CTT CTC AAC TTC ATT AAG CAA 2064 Ala Phe Trp Met Ala Asn Ala Ser Glu Leu Leu Asn Phe Ile Lys Gln 675 680 685 GAC CGA GAC CTT AGT CGG ATC ACA CTG GAT GCT CAA GAT GTT TTA GCA 2112 Asp Arg Asp Leu Ser Arg Ile Thr Leu Asp Ala Gln Asp Val Leu Ala 690 695 700 CAT TTG GTT CAA ATG GCA TTT AAA TAC TTG GTT CAC TGT CTT CAA TCA 2160 His Leu Val Gln Met Ala Phe Lys Tyr Leu Val His Cys Leu Gln Ser 705 710 715 720 GAA CTT AAT AAT TAC ATG CCA GCC TTT CTA GAT GAC CCT GAA GAG AAC 2208 Glu Leu Asn Asn Tyr Met Pro Ala Phe Leu Asp Asp Pro Glu Glu Asn 725 730 735 AGT CTG CAA CGA CCA AAA ATA GAT GAT GTG CTG CAC ACG CTC ACA GGA 2256 Ser Leu Gln Arg Pro Lys Ile Asp Asp Val Leu His Thr Leu Thr Gly 740 745 750 GCC ATG TCC TTG CTA CGA CGC TGC AGA GTC AAT GCC GCC CTG ACC ATC 2304 Ala Met Ser Leu Leu Arg Arg Cys Arg Val Asn Ala Ala Leu Thr Ile 755 760 765 CAG CTC TTC TCT CAG CTC TTC CAC TTC ATC AAT ATG TGG CTG TTC AAT 2352 Gln Leu Phe Ser Gln Leu Phe His Phe Ile Asn Met Trp Leu Phe Asn 770 775 780 AGA TTG GTG ACC GAC CCA GAT TCG GGG CTG TGC TCC CAT TAC TGG GGT 2400 Arg Leu Val Thr Asp Pro Asp Ser Gly Leu Cys Ser His Tyr Trp Gly 785 790 795 800 GCG ATT ATC CGT CAG CAG TTG GGC CAT ATT GAA GCC TGG GCT GAG AAG 2448 Ala Ile Ile Arg Gln Gln Leu Gly His Ile Glu Ala Trp Ala Glu Lys 805 810 815 CAG GGG CTG GAA CTG GCT GCG GAC TGT CAT CTG AGC AGG ATC GTG CAG 2496 Gln Gly Leu Glu Leu Ala Ala Asp Cys His Leu Ser Arg Ile Val Gln 820 825 830 GCA ACG ACT TTG CTT ACC ATG GAT AAG TAT GCA CCT GAT GAC ATT CCA 2544 Ala Thr Thr Leu Leu Thr Met Asp Lys Tyr Ala Pro Asp Asp Ile Pro 835 840 845 AAT ATA AAC AGC ACC TGC TTT AAG TTA AAT TCA TTA CAA CTT CAA GCC 2592 Asn Ile Asn Ser Thr Cys Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Leu Gln Ala 850 855 860 TTA TTA CAG AAC TAT CAC TGT GCA CCT GAT GAG CCT TTT ATC CCA ACG 2640 Leu Leu Gln Asn Tyr His Cys Ala Pro Asp Glu Pro Phe Ile Pro Thr 865 870 875 880 GAT CTT ATA GAA AAT GTA GTG ACT GTG GCT GAA AAC ACT GCC GAT GAG 2688 Asp Leu Ile Glu Asn Val Val Thr Val Ala Glu Asn Thr Ala Asp Glu 885 890 895 CTG GCC CGC AGT GAT GGA AGG GAA GTG CAG TTG GAG GAG GAT CCT GAT 2736 Leu Ala Arg Ser Asp Gly Arg Glu Val Gln Leu Glu Glu Asp Pro Asp 900 905 910 CTG CAG CTG CCG TTT CTT TTG CCA GAA GAT GGT TAT TCT TGT GAT GTT 2784 Leu Gln Leu Pro Phe Leu Leu Pro Glu Asp Gly Tyr Ser Cys Asp Val 915 920 925 GTC AGA AAC ATT CCA AAT GGT TTA CAA GAA TTT TTA GAC CCT CTG TGC 2832 Val Arg Asn Ile Pro Asn Gly Leu Gln Glu Phe Leu Asp Pro Leu Cys 930 935 940 CAG AGA GGA TTT TGC AGG TTA ATT CCT CAC ACA CGT TCA CCA GGT ACT 2880 Gln Arg Gly Phe Cys Arg Leu Ile Pro His Thr Arg Ser Pro Gly Thr 945 950 955 960 TGG ACA ATA TAT TTT GAA GGT GCA GAT TAT GAA AGT CAC CTT CTG CGT 2928 Trp Thr Ile Tyr Phe Glu Gly Ala Asp Tyr Glu Ser His Leu Leu Arg 965 970 975 GAG AAC ACA GAG CTG GCT CAG CCT CTG AGG AAA GAA CCT GAA ATA ATC 2976 Glu Asn Thr Glu Leu Ala Gln Pro Leu Arg Lys Glu Pro Glu Ile Ile 980 985 990 ACT GTG ACC CTA AAA AAG CAG AAT GGA ATG GGC CTT AGC ATT GTT GCA 3024 Thr Val Thr Leu Lys Lys Gln Asn Gly Met Gly Leu Ser Ile Val Ala 995 1000 1005 GCA AAG GGT GCT GGT CAA GAT AAA CTA GGA ATC TAC GTG AAG TCG GTT 3072 Ala Lys Gly Ala Gly Gln Asp Lys Leu Gly Ile Tyr Val Lys Ser Val 1010 1015 1020 GTG AAA GGA GGT GCT GCA GAT GTG GAT GGA CGT CTA GCT GCA GGT GAT 3120 Val Lys Gly Gly Ala Ala Asp Val Asp Gly Arg Leu Ala Ala Gly Asp 1025 1030 1035 1040 CAG CTC CTC AGT GTG GAT GGA CGA AGT CTG GTT GGA CTC TCT CAG GAA 3168 Gln Leu Leu Ser Val Asp Gly Arg Ser Leu Val Gly Leu Ser Gln Glu 1045 1050 1055 AGG GCG GCA GAA CTC ATG ACA AGA ACA AGC TCT GTG GTG ACA CTG GAA 3216 Arg Ala Ala Glu Leu Met Thr Arg Thr Ser Ser Val Val Thr Leu Glu 1060 1065 1070 GTA GCA AAG CAG GGT GCC ATC TAC CAC GGT CTG GCC ACC CTT CTC AAT 3264 Val Ala Lys Gln Gly Ala Ile Tyr His Gly Leu Ala Thr Leu Leu Asn 1075 1080 1085 CAG CCA TCC CCC ATG ATG CAG AGA ATT TCA GAT CGT CGT GGC TCA GGT 3312 Gln Pro Ser Pro Met Met Gln Arg Ile Ser Asp Arg Arg Gly Ser Gly 1090 1095 1100 AAA CCC CGA CCA AAG AGT GAA GGC TTT GAG CTC TAT AAT AAT TCA ACT 3360 Lys Pro Arg Pro Lys Ser Glu Gly Phe Glu Leu Tyr Asn Asn Ser Thr 1105 1110 1115 1120 CAA AAT GGG TCT CCT GAG AGT CCT CAG CTG CCT TGG GCA GAA TAT AGT 3408 Gln Asn Gly Ser Pro Glu Ser Pro Gln Leu Pro Trp Ala Glu Tyr Ser 1125 1130 1135 GAA CCA AAG AAA TTG CCT GGT GAT GAC AGA CTG ATG AAA AAT AGA GCT 3456 Glu Pro Lys Lys Leu Pro Gly Asp Asp Arg Leu Met Lys Asn Arg Ala 1140 1145 1150 GAT CAC CGT TCC AGC CCC AAC GTA GCA AAT CAG CCT CCT AGT CCT GGA 3504 Asp His Arg Ser Ser Pro Asn Val Ala Asn Gln Pro Pro Ser Pro Gly 1155 1160 1165 GGG AAA AGT GCA TAT GCC TCT GGA ACA ACA GCG AAG ATA ACA TCT GTC 3552 Gly Lys Ser Ala Tyr Ala Ser Gly Thr Thr Ala Lys Ile Thr Ser Val 1170 1175 1180 TCT ACT GGA AAC CTC TGC ACT GAG GAG CAG ACG CCT CCG CCT AGA CCT 3600 Ser Thr Gly Asn Leu Cys Thr Glu Glu Gln Thr Pro Pro Pro Arg Pro 1185 1190 1195 1200 GAA GCC TAC CCC ATT CCC ACT CAG ACG TAC ACC AGA GAG TAT TTT ACC 3648 Glu Ala Tyr Pro Ile Pro Thr Gln Thr Tyr Thr Arg Glu Tyr Phe Thr 1205 1210 1215 TTC CCA GCT TCC AAA TCC CAG GAT CGG ATG GCT CCT CCT CAG AAC CAG 3696 Phe Pro Ala Ser Lys Ser Gln Asp Arg Met Ala Pro Pro Gln Asn Gln 1220 1225 1230 TGG CCA AAT TAT GAG GAA AAG CCA CAT ATG CAC ACA GAT AGT AAT CAT 3744 Trp Pro Asn Tyr Glu Glu Lys Pro His Met His Thr Asp Ser Asn His 1235 1240 1245 TCC AGT ATT GCA ATT CAG CGT GTT ACA CGT TCC CAA GAA GAA CTT CGA 3792 Ser Ser Ile Ala Ile Gln Arg Val Thr Arg Ser Gln Glu Glu Leu Arg 1250 1255 1260 GAA GAT AAA GCT TAC CAA CTT GAG CGG CAT CGA ATA GAG GCA GCT ATG 3840 Glu Asp Lys Ala Tyr Gln Leu Glu Arg His Arg Ile Glu Ala Ala Met 1265 1270 1275 1280 GAC CGA AAG TCT GAT AGT GAT ATG TGG ATA AAT CAG AGC TCC TCA CTG 3888 Asp Arg Lys Ser Asp Ser Asp Met Trp Ile Asn Gln Ser Ser Ser Leu 1285 1290 1295 GAC TCC AGT ACC TCT AGC CAG GAG CAT CTG AAC CAT TCC TCT AAG TCG 3936 Asp Ser Ser Thr Ser Ser Gln Glu His Leu Asn His Ser Ser Lys Ser 1300 1305 1310 GTC ACC CCT GCT TCC ACA CTG ACC AAA AGT GGC CCT GGC CGT TGG AAA 3984 Val Thr Pro Ala Ser Thr Leu Thr Lys Ser Gly Pro Gly Arg Trp Lys 1315 1320 1325 ACA CCA GCA GCC ATA CCG GCC ACC CCT GTG GCC GTC TCC CAG CCA ATC 4032 Thr Pro Ala Ala Ile Pro Ala Thr Pro Val Ala Val Ser Gln Pro Ile 1330 1335 1340 CGA ACA GAC CTG CCT CCG CCA CCC CCG CCA CCT CCA GTC CAC TAT GCC 4080 Arg Thr Asp Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val His Tyr Ala 1345 1350 1355 1360 GGT GAT TTC GAT GGA ATG TCC ATG GAT TTG CCT CTC CCA CCA CCC CCT 4128 Gly Asp Phe Asp Gly Met Ser Met Asp Leu Pro Leu Pro Pro Pro Pro 1365 1370 1375 TCC GCC AAC CAG ATA GGG CTG CCG TCT GCG CAG GTG GCT GCT GCT GAA 4176 Ser Ala Asn Gln Ile Gly Leu Pro Ser Ala Gln Val Ala Ala Ala Glu 1380 1385 1390 CGG AGA AAG AGA GAA GAA CAT CAG CGT TGG TAT GAG AAG GAG AAG GCC 4224 Arg Arg Lys Arg Glu Glu His Gln Arg Trp Tyr Glu Lys Glu Lys Ala 1395 1400 1405 CCC CTG GAG GAG GAG CGG GAG AGG AAG CGG AGA GAG CAG GAG AGG AAG 4272 Pro Leu Glu Glu Glu Arg Glu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Glu Arg Lys 1410 1415 1420 TTG GGC CAG ATG CGC ACT CAG TCC TTA AAC CCT GCT CCG TTT TCT CCC 4320 Leu Gly Gln Met Arg Thr Gln Ser Leu Asn Pro Ala Pro Phe Ser Pro 1425 1430 1435 1440 CTG ACT GCA CAG CAG ATG AAG CCC GAA AAG CCT TCC ACA CTC CAG CGG 4368 Leu Thr Ala Gln Gln Met Lys Pro Glu Lys Pro Ser Thr Leu Gln Arg 1445 1450 1455 CCA CAG GAA ACA GTC ATT CGG GAG CTG CAG CCT CAG CAG CAG CCC CGC 4416 Pro Gln Glu Thr Val Ile Arg Glu Leu Gln Pro Gln Gln Gln Pro Arg 1460 1465 1470 ACG ATC GAG CGC AGA GAC TTG CAG TAC ATT ACA GTC AGC AAA GAG GAG 4464 Thr Ile Glu Arg Arg Asp Leu Gln Tyr Ile Thr Val Ser Lys Glu Glu 1475 1480 1485 CTT TCC TCG GGG GAC AGT CTG TCC CCC GAC CCG TGG AAG CGG GAC GCC 4512 Leu Ser Ser Gly Asp Ser Leu Ser Pro Asp Pro Trp Lys Arg Asp Ala 1490 1495 1500 AAG GAG AAG CTG GAG AAG CAG CAG CAG ATG CAC ATC GTG GAC ATG CTG 4560 Lys Glu Lys Leu Glu Lys Gln Gln Gln Met His Ile Val Asp Met Leu 1505 1510 1515 1520 AGC AAG GAG ATC CAG GAG CTC CAG AGC AAA CCG GAC CGC AGC GCC GAG 4608 Ser Lys Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ser Lys Pro Asp Arg Ser Ala Glu 1525 1530 1535 GAG AGC GAC CGG CTG CGC AAG CTC ATG CTG GAG TGG CAG TTC CAG AAG 4656 Glu Ser Asp Arg Leu Arg Lys Leu Met Leu Glu Trp Gln Phe Gln Lys 1540 1545 1550 AGA CTC CAG GAG TCG AAG CAG AAG GAC GAA GAT GAC GAG GAG GAG GAG 4704 Arg Leu Gln Glu Ser Lys Gln Lys Asp Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu 1555 1560 1565 GAC GAT GAT GTG GAC ACC ATG CTG ATC ATG CAG CGC CTG GAG GCT GAA 4752 Asp Asp Asp Val Asp Thr Met Leu Ile Met Gln Arg Leu Glu Ala Glu 1570 1575 1580 CGA AGA GCG AGG GTA AAG GGG GGA GTG CTT TGG CTG TGC CCA TCT GTG 4800 Arg Arg Ala Arg Val Lys Gly Gly Val Leu Trp Leu Cys Pro Ser Val 1585 1590 1595 1600 GTC CCT ATT TTA GCT TCT GCG TGT TTC CCA TGG GGA TAG 4839 Val Pro Ile Leu Ala Ser Ala Cys Phe Pro Trp Gly 1605 1610

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｈ−Ｒａｓタンパク質結合タンパク質の精製の
結果を示した図である。結果は、３回の独立した実験の
代表例である。レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・
ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
Ｈ−Ｒａｓ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａ
ｓ^Ａ３ ^８。

【図２】ｐ１８０についてのイムノブロット分析の結果
を示した図である。結果は、３回の独立した実験の代表
例である。レーン１：免疫前血清、レーン２：抗ヒトＡＦ−６抗
体。

【図３】ＡＦ−６と活性化Ｈ−Ｒａｓタンパク質との結
合を示した図である。レーン１：インビトロ・トランスレーションＡＦ−６、
レーン２：ＧＳＴ、レーン３：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レ
ーン５：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^Ａ３８、レー
ン６：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒ−Ｒａｓ、レーン７：ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−Ｒ−Ｒａｓ、レーン８：ＧＤＰ・ＧＳＴ
−ＲａｌＡ、レーン９：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｌ
Ａ、レーン１０：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン１
１：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ。

【図４】インビトロ・トランスレーションされたＡＦ−
６のＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓタンパク質との結合を示した図
である。結果は、３回の独立した実験の代表例である。レーン１：インビトロ・トランスレーションＡＦ−６、
レーン２：ＧＳＴ、レーン３：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レ
ーン５：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^Ａ３８。

【図５】ＡＦ−６およびｃ−Ｒａｆ−１の活性型Ｈ−Ｒ
ａｓタンパク質との結合を示した図である。結果は、３
回の独立した実験の代表例である。レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レ
ーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^Ａ３ ^８、レー
ン５：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−ＲａｓおよびＭＢＰ−
ｃ−Ｒａｆ−１。

【図６】実施例４において用いたプラスミドベクターを
示した図である。

【図７】Ｒａｓによって誘導されるｃ−ｆｏｓ転写プロ
モーターの転写活性の抑制を示した図である。ＮＩＨ／
３Ｔ３細胞にｃ−ｆｏｓ−ルシフェラーゼベクターおよ
びｐＳＲα−ｌａｃＺベクターを導入し、更に図に示し
た組み合わせベクターを導入した。図は、検出されたル
シフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性との相対
値で表した。

【手続補正書】

【提出日】平成８年４月１８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｈ−Ｒａｓタンパク質結合タンパク質の精製の
結果を示した電気泳動写真である。結果は、３回の独立
した実験の代表例である。レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レ
ーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^Ａ３８。

【図２】ｐ１８０についてのイムノブロット分析の結果
を示した電気泳動写真である。結果は、３回の独立した
実験の代表例である。レーン１：免疫前血清、レーン２：抗ヒトＡＦ−６抗
体。

【図３】ＡＦ−６と活性化Ｈ−Ｒａｓタンパク質との結
合を示した電気泳動写真である。レーン１：インビトロ・トランスレーションＡＦ−６、
レーン２：ＧＳＴ、レーン３：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レ
ーン５：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^Ａ３８、レー
ン６：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒ−Ｒａｓ、レーン７：ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−Ｒ−Ｒａｓ、レーン８：ＧＤＰ・ＧＳＴ
−ＲａｌＡ、レーン９：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｌ
Ａ、レーン１０：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン１
１：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ。

【図４】インビトロ・トランスレーションされたＡＦ−
６のＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓタンパク質との結合を示した電
気泳動写真である。結果は、３回の独立した実験の代表
例である。レーン１：インビトロ・トランスレーションＡＦ−６、
レーン２：ＧＳＴ、レーン３：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レ
ーン５：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^Ａ３８。

【図５】ＡＦ−６およびｃ−Ｒａｆ−１の活性型Ｈ−Ｒ
ａｓタンパク質との結合を示した電気泳動写真である。
結果は、３回の独立した実験の代表例である。レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒ
ａｓ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レ
ーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ^Ａ３８、レー
ン５：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−ＲａｓおよびＭＢＰ−
ｃ−Ｒａｆ−１。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】活性型Ｒａｓタンパク質結合能を有するＡ
Ｆ−６の改変アミノ酸配列またはその等価配列を有す
る、ペプチドまたはタンパク質。
【請求項２】Ｒａｓタンパク質が、Ｈ−Ｒａｓタンパク
質、Ｋ−Ｒａｓタンパク質、Ｎ−Ｒａｓタンパク質、Ｒ
−Ｒａｓタンパク質、Ｒａｌタンパク質、Ｒａｐ１Ａタ
ンパク質、Ｒａｐ１Ｂタンパク質、Ｒａｐ２タンパク
質、およびＴｃ２１タンパク質からなる群から選択され
るものである、請求項１に記載のペプチドまたはタンパ
ク質。
【請求項３】ＡＦ−６がホ乳類由来のものである、請求
項１または２に記載のペプチドまたはタンパク質。
【請求項４】ＡＦ−６がヒト由来のものである、請求項
３に記載のペプチドまたはタンパク質。
【請求項５】配列番号１に記載されるアミノ酸配列の３
６〜８４８番の配列または活性型Ｒａｓタンパク質結合
能を有するその部分配列からなるものである、請求項１
〜４いずれか一項に記載のペプチドまたはタンパク質。
【請求項６】配列番号１に記載されるアミノ酸配列の３
６〜２０６番の配列または活性型Ｒａｓタンパク質結合
能を有するその部分配列からなるものである、請求項１
〜４いずれか一項に記載のペプチドまたはタンパク質。
【請求項７】請求項１〜６いずれか一項に記載のペプチ
ドまたはタンパク質をコードする、塩基配列。
【請求項８】配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の少な
くとも１０６〜６１８番の配列を含んでなる、請求項７
に記載の塩基配列。
【請求項９】請求項７または８に記載の塩基配列を含ん
でなる、ベクター。
【請求項１０】プラスミドベクター、ウイルスベクタ
ー、およびリポソームベクターからなる群から選択され
るものである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】請求項９または１０に記載のベクターに
よって形質転換された、宿主細胞（ただし、ヒト細胞に
あってはヒトから単離された細胞に限る）。
【請求項１２】大腸菌、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、
リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫
瘍細胞からなる群から選択されるものである、請求項１
１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】請求項１１または１２に記載の宿主細胞
を培養し、そして培養物から請求項１〜６いずれか一項
に記載のペプチドまたはタンパク質を採取することを含
んでなる、請求項１〜６いずれか一項に記載のペプチド
またはタンパク質の製造法。
【請求項１４】ＡＦ−６または請求項１〜６いずれか一
項に記載のペプチドもしくはタンパク質を含んでなる、
腫瘍形成または転移抑制剤。
【請求項１５】活性型Ｒａｓタンパク質が関与する腫瘍
形成または転移を抑制する、請求項１４に記載の腫瘍形
成または転移抑制剤。
【請求項１６】ＡＦ−６または請求項１〜６いずれか一
項に記載のペプチドもしくはタンパク質をコードする塩
基配列を含んでなる、腫瘍形成または転移抑制用遺伝子
治療剤。
【請求項１７】活性型Ｒａｓタンパク質が関与する腫瘍
形成または転移を抑制する、請求項１６に記載の腫瘍形
成または転移抑制用遺伝子治療剤。
【請求項１８】（１）スクリーニングの対象となる物質
を、活性型Ｒａｓタンパク質およびＡＦ−６または請求
項１〜６いずれか一項に記載のペプチドもしくはタンパ
ク質を含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）
活性型Ｒａｓタンパク質と、ＡＦ−６または請求項１〜
６いずれか一項に記載のペプチドもしくはタンパク質と
の結合の阻害の程度を測定することを含んでなる、活性
型Ｒａｓタンパク質とＡＦ−６との結合を阻害する物質
のスクリーニング法。
【請求項１９】スクリーニング系が細胞系または無細胞
系である、請求項１８に記載のスクリーニング法。
【請求項２０】（１）ＡＦ−６の改変アミノ酸配列また
はその等価配列を有するペプチドまたはタンパク質を、
活性型Ｒａｓタンパク質と活性型Ｒａｆタンパク質とを
含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）活性型
Ｒａｓタンパク質と活性型Ｒａｆタンパク質との結合の
程度を測定することを含んでなる、活性型Ｒａｓタンパ
ク質と活性型Ｒａｆタンパク質との結合を阻害するＡＦ
−６の改変アミノ酸配列またはその等価配列を有するペ
プチドまたはタンパク質のスクリーニング法。
【請求項２１】ＡＦ−６の改変アミノ酸配列またはその
等価配列を有するペプチドまたはタンパク質が請求項１
〜６いずれか一項に記載のペプチドまたはタンパク質で
ある、請求項２０に記載のスクリーニング法。
【請求項２２】Ｒａｆタンパク質が、ｃ−Ｒａｆ−１タ
ンパク質、Ａ−Ｒａｆタンパク質、またはＢ−Ｒａｆタ
ンパク質である、請求項２０または２１に記載のスクリ
ーニング法。
【請求項２３】スクリーニング系が細胞系または無細胞
系である、請求項２０〜２２いずれか一項に記載のスク
リーニング法。
【請求項２４】（１）ＡＦ−６の改変アミノ酸配列また
はその等価配列を有するペプチドまたはタンパク質を、
Ｒａｓ遺伝子が発現している細胞を含むスクリーニング
系に存在させ、そして（２）該細胞中のガン関連遺伝子
転写プロモーターの活性化の程度を測定することを含ん
でなる、ガン関連遺伝子転写プロモーターの活性化を阻
害するＡＦ−６の改変アミノ酸配列またはその等価配列
を有するペプチドまたはタンパク質のスクリーニング
法。
【請求項２５】ＡＦ−６の改変アミノ酸配列またはその
等価配列を有するペプチドまたはタンパク質が請求項１
〜６いずれか一項に記載のペプチドまたはタンパク質で
ある、請求項２４に記載のスクリーニング法。
【請求項２６】ガン関連遺伝子がｃ−ｆｏｓ−１であ
る、請求項２４または２５に記載のスクリーニング法。
【請求項２７】Ｒａｓ遺伝子が、野生型または変異型Ｒ
ａｓ遺伝子である、請求項２４〜２６いずれか一項に記
載のスクリーニング法。
【請求項２８】腫瘍形成または転移抑制物質のスクリー
ニング法である、請求項１８〜２７に記載のスクリーニ
ング法。