JPH1143497A - 新規オリゴ糖誘導体、それを含有するα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法 - Google Patents
新規オリゴ糖誘導体、それを含有するα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法Info
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- JPH1143497A JPH1143497A JP20344497A JP20344497A JPH1143497A JP H1143497 A JPH1143497 A JP H1143497A JP 20344497 A JP20344497 A JP 20344497A JP 20344497 A JP20344497 A JP 20344497A JP H1143497 A JPH1143497 A JP H1143497A
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Abstract
ず、α−アミラーゼとの親和性に優れ、その切断点も特
異的な選択性を持ち、かつ高感度である糖誘導体、また
これを基質として用い、α−アミラーゼ活性を精度よく
測定する試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法の提
供。 【解決手段】 一般式(1) 【化1】 (式中、R1 およびR2 のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、R3 は還元末端
グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能
な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であ
ることを示し、nは0〜7の整数を示す。)で表される
オリゴ糖誘導体、これを基質として用いた、α−アミラ
ーゼ活性を精度よく測定する試薬およびα−アミラーゼ
活性測定方法。
Description
性測定用基質として用いることができる新規なオリゴ糖
およびその糖誘導体、ならびに該オリゴ糖またはその糖
誘導体を含有するα−アミラーゼ活性測定試薬、ならび
に当該試薬を用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関す
る。
るα−アミラーゼ活性を測定することにより、急性や慢
性の膵臓炎症、膵臓癌、耳下腺炎などの各種疾患の診断
が行われており、臨床診断上の重要な指標の一つとなっ
ている。
れているが、近年、構造が決定されており、かつα−ア
ミラーゼの作用状態が明確となっているマルトオリゴ糖
またはマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いる方法が
主流になっている。
リゴ糖誘導体に、追随酵素としてα−グルコシダーゼお
よび/またはβ−グルコシダーゼの存在下に、α−アミ
ラーゼを含有する検体を作用させ、生成するグルコース
またはオリゴ糖誘導体の還元末端から遊離するアグリコ
ンの量を光学的に測定することにより、α−アミラーゼ
活性を測定する方法が汎用されている。
追随酵素は、α−アミラーゼの反応に関係なく僅かでは
あるが基質に作用するため、測定液が不安定でブランク
値が上昇するため調整した測定液の保存が困難であると
いった欠点があった。
またはマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端グルコースを
修飾し、追随酵素の作用を受けないようにした基質を用
いることが試みられている。
0−87297号、同60−237998号、同61−
63299号、同63−301892号、特開平1−1
57996号の各公報などに、非還元末端のグルコース
の4位および/または6位の水酸基を、ハロゲン原子、
アルキル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジリデン
基、エチリデン基、イソプロピリデン基、または3−オ
キソブチリデン基などで置換し、還元末端グルコースに
アグリコンを結合させたマルトオリゴ糖誘導体を基質と
して用いる方法が記載されている。
飾する方法では、その水溶性の問題や、本来澱粉やアミ
ロースなどのグルコース鎖を認識し切断するα−アミラ
ーゼとの親和性が充分でなく、充分な感度が得られない
といった欠点があった。
279596号、同5−208989号、同6−315
399号の各公報などに、非還元末端グルコースの6位
または4位の水酸基に、ガラクトシル基を導入したマル
トオリゴ糖またはその誘導体を基質として用いる方法を
記載している。
導体基質は、理論的には水溶性、ブランク値の上昇とい
った問題を回避してしているものの、実際には製造上分
離困難である、非還元末端が修飾されていない、原料由
来のマルトオリゴ糖誘導体が不純物として若干含まれる
ために、多少ブランク値が上昇するといった問題があ
り、また感度も充分ではなかった。
315399号の各公報などは、追随酵素を必要としな
い2−クロロ−4−ニトロフェニル マルトトリオシド
ラクトピラノシルマルトシド
ルトトリオシドや2−クロロ−4−ニトロフェニル ガ
ラクトピラノシルマルトシドを基質とする方法では、ブ
ランク値上昇の問題は少ないものの、糖鎖が短いためア
ミラーゼとの親和性が充分とはいえず、また感度も充分
でないといった問題があった。
α−アミラーゼ活性測定基質の欠点を解消しようとする
もので、その目的は、水溶性に優れ、追随酵素による影
響を受けず、α−アミラーゼとの親和性に優れ、その切
断点も特異的な選択性を持ち、かつ高感度である糖誘導
体、またこれを基質として用い、α−アミラーゼ活性を
精度よく測定する試薬およびα−アミラーゼ活性測定方
法を提供することにある。
ねた結果、水溶性に優れ、追随酵素により影響を受け
ず、α−アミラーゼとの親和性に優れ、その切断点も特
異的な選択性を持ち、かつ高感度な新規オリゴ糖ならび
にその誘導体を得ることに成功し、さらに、当該オリゴ
糖および/またはその誘導体を含有するα−アミラーゼ
活性測定試薬、およびその測定方法を確立し、本発明を
完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りであ
る。 1)一般式(1)
β−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、R
3 は還元末端グルコースに結合し、該結合が切断された
とき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位また
はβ配位であることを示し、nは0〜7の整数を示
す。)で表されるオリゴ糖誘導体。 2)一般式(2)
β−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、波
線はα配位またはβ配位であることを示し、nは0〜7
の整数を示す。)で表されるオリゴ糖。 3)一般式(1)で表されるオリゴ糖誘導体を含有して
なる、α−アミラーゼ活性測定試薬。 4)上記3)記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α
−アミラーゼを含有する試料と接触させることにより、
一般式(1)で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミ
ラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質の量を測定
することを特徴とする試料中のα−アミラーゼ活性測定
方法。 5)一般式(3)
β−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、R
4 はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して
還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき
測定可能な物質となる基を示し、pは0〜1の整数を示
す。)で表されるオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を
含有しない、α−アミラーゼ活性測定試薬。 6)上記5)記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α
−アミラーゼを含有する試料と接触させ、一般式(3)
で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応
させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特
徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。 7)一般式(4)
β−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、R
5 はα−アミラーゼもしくは追随酵素によって切断され
うる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合
が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線
はα配位またはβ配位であることを示し、qは1〜7の
整数を示す。)で表されるオリゴ糖誘導体および追随酵
素を含有する、α−アミラーゼ活性測定試薬。 8)上記7)記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α
−アミラーゼを含有する試料と接触させ、一般式(4)
で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応
させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特
徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。
(1)で表される化合物は、ガラクトシル−マルトー
ス、ガラクトシル−マルトトリオース、ガラクトシル−
マルトテトラオース、ガラクトシル−マルトペンタオー
ス、ガラクトシル−マルトヘキサオース、ガラクトシル
−マルトペプタオースなどのオリゴ糖の非還元末端ガラ
クトースの4位または6位の水酸基に修飾基であるガラ
クトピラノシル基がβ配位で結合し、さらに、当該オリ
ゴ糖還元末端グルコースと結合し、該結合が切断された
とき測定可能な物質となる基R3 で示されるアグリコン
を有する。
子に結合した酸素原子と結合している。このグリコシド
結合はα配位もしくはβ配位のいずれでもよい。このグ
リコシド結合は、α−アミラーゼや、グルコアミラー
ゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼなどの追
随酵素によって切断され得る結合であり、該結合が切断
されることによって、R3 は測定可能な物質となり、α
−アミラーゼ活性測定に用いることができる。
っていてもよく、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニ
トロ基を示す。)で表される置換または無置換のフェニ
ル基を示し、例えば、p−ニトロフェニル、o−ニトロ
フェニル、m−ニトロフェニル、2−クロロ−4−ニト
ロフェニル、2−フルオロ−4−ニトロフェニル、2,
4−ジニトロフェニル、2,4−ジクロロフェニル基な
どを挙げることができる。また、4−メチルウンベリフ
ェニルなどの蛍光性基なども挙げられる。
数でもよい。
は、酵素転移反応を利用した方法より得られる。すなわ
ちガラクトシル残基を持つ糖をドナーとし、ガラクトシ
ル−マルトオリゴ糖およびその誘導体をアクセプターと
する糖転移反応をβ−ガラクトシダーゼを用いて行い、
目的とする新規オリゴ糖およびその誘導体を合成するも
のである。
トシル残基を持つ糖とは、例えばラクトース、ラフィノ
ース、メリビオース、スタキオース、ガラクタンなどを
挙げることができる。好ましくは安価で入手の容易なラ
クトースが好適である。
ル−マルトオリゴ糖誘導体としては、一般式(6)
し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を
示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、n
は0〜7の整数を示す。)で表される。一般式(6)で
表される化合物の好ましい例は、例えば、R3 が置換フ
ェニル基である2−クロロ−4−ニトロフェニル基であ
る化合物であり、その具体例としては、2−クロロ−4
−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−α
−マルトシド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトシル−β−マルトシド、2−クロ
ロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシ
ル−α−マルトトリオシド、2−クロロ−4−ニトロフ
ェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−β−マルトト
リオシド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−
β−D−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド、2−
クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラク
トシル−β−マルトテトラオシド、2−クロロ−4−ニ
トロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−α−マ
ルトペンタオシド、2−クロロ−4−ニトロフェニル
4−O−β−D−ガラクトシル−β−マルトペンタオシ
ド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D
−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、2−クロロ
−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシル
−β−マルトヘキサオシド、2−クロロ−4−ニトロフ
ェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−α−マルトヘ
プタオシド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O
−β−D−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシドなど
が挙げられるがこれに限るものではない。
ル−マルトオリゴ糖としては、一般式(7)
ことを示し、nは0〜7の整数を示す。)で表される化
合物が挙げられる。一般式(7)で表される化合物の具
体例としては、ガラクトシル−マルトース、ガラクトシ
ル−マルトトリオース、ガラクトシル−マルトテトラオ
ース、ガラクトシル−マルトペンタオース、ガラクトシ
ル−マルトヘキサオース、ガラクトシル−マルトヘプタ
オースなどが挙げられるがこれに限るものではない。
シダーゼは、いずれの起源のものでもよく、例えばBa
cillus circurans、E.Coli、A
spergillus sp.などの由来のものが挙げ
られる。
親水性有機溶媒との混合溶媒中で行う。混合溶媒中での
反応は、目的とする転移反応の選択性を高めたり、目的
物質の収率を向上させることができるので特に好まし
い。
例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミ
ド、1,3−ジメチル−2−イミダゾリジノン、アセト
ニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、n−プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、メタノール、
エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコー
ルなどが挙げられる。これらの溶媒は、単独または2種
以上を混合してもよい。
割合は、糖及び糖誘導体の種類や使用する酵素の起源や
親水性有機溶媒の種類によっても異なるが、約1〜80
%、好ましくは20〜60%が良い。
とガラクトシル−マルトオリゴ糖及びその誘導体の混合
液は、溶液または懸濁液として用いられ、溶液または懸
濁液の全量に対して、ガラクトシル−マルトオリゴ糖お
よびその誘導体は1〜40%、好ましくは20〜40%
の濃度である。また、ガラクトシル残基を持つ糖の投入
量は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖およびその誘導体
に対して、0.1〜10倍、好ましくは1〜5倍が適当
である。
は1〜40時間程度、反応温度は20〜60℃、pH4
〜8、好ましくは5〜7が適当である。反応終了後、反
応液のpH調整または加熱により反応を停止し、カラム
クロマトグラフィーにより分画精製することなどによ
り、一般式(1)およびこれに包含される一般式
(3)、(4)〔以下、特に言及しない限り、一般式
(1)についての説明は一般式(3)および(4)につ
いての説明をも包含する〕ならびに一般式(2)により
表される新規オリゴ糖およびその誘導体を得ることがで
きる。
されるガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を用いた場
合には、上記の糖転移反応により一般式(1)の化合物
が得られ、アクセプターとして一般式(7)により表さ
れるガラクトシル−マルトオリゴ糖を用いた場合には、
上記の糖転移反応により一般式(2)の化合物が得られ
る。この場合、一般式(2)の化合物を、公知の方法に
よりグルコシド化することにより、一般式(1)の化合
物とすることができる。したがって、一般式(2)の化
合物は、一般式(1)の化合物の原料として用いること
ができる。
好ましい例は、例えば、R3 が置換フェニル基である2
−クロロ−4−ニトロフェニル基である化合物であり、
その具体例としては、2−クロロ−4−ニトロフェニル
4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガ
ラクトシル−α−マルトシド、2−クロロ−4−ニトロ
フェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β
−D−ガラクトシル−β−マルトシド、2−クロロ−4
−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−4
−O−β−D−ガラクトシル−α−マルトトリオシド、
2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガ
ラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシル−β−マル
トトリオシド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクト
シル−α−マルトテトラオシド、2−クロロ−4−ニト
ロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−
β−D−ガラクトシル−β−マルトテトラオシド、2−
クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラク
トシル−4−O−β−D−ガラクトシル−α−マルトペ
ンタオシド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O
−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシ
ル−β−マルトペンタオシド、2−クロロ−4−ニトロ
フェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β
−D−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、2−ク
ロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクト
シル−4−O−β−D−ガラクトシル−β−マルトヘキ
サオシド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−
β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシル
−α−マルトヘプタオシド、2−クロロ−4−ニトロフ
ェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−
D−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシドなどが挙げ
られるが、これに限るものではない。
ロフェニル基である例を挙げたが、2−クロロ−4−ニ
トロフェニル基の代りに、該グリコシド結合が切断され
た時に発色性の物質となる基であればよく、例えば、上
記のp−ニトロフェニル、o−ニトロフェニル、m−ニ
トロフェニル、2−クロロ−4−ニトロフェニル、2−
フルオロ−4−ニトロフェニル、2,4−ジニトロフェ
ニル、2,4−ジクロロフェニル基などであってもよ
い。また、4−メチルウンベリフェニルなどの蛍光性基
などであってもよい。
4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラ
クトシル−α−マルトシド、4−O−β−D−ガラクト
シル−4−O−β−D−ガラクトシル−β−マルトシ
ド、4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−
ガラクトシル−α−マルトトリオシド、4−O−β−D
−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシル−β−
マルトトリオシド、4−O−β−D−ガラクトシル−4
−O−β−D−ガラクトシル−α−マルトテトラオシ
ド、4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−
ガラクトシル−β−マルトテトラオシド、4−O−β−
D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシル−α
−マルトペンタオシド、4−O−β−D−ガラクトシル
−4−O−β−D−ガラクトシル−β−マルトペンタオ
シド、4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D
−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、4−O−β
−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシル−
β−マルトヘキサオシド、4−O−β−D−ガラクトシ
ル−4−O−β−D−ガラクトシル−α−マルトヘプタ
オシド、4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−
D−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシドなどが挙げ
られるが、これに限るものではない。
上記一般式(1)記載のオリゴ糖誘導体を基質として含
有するものである。また、必要に応じて追随酵素とし
て、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、β−グル
コシダーゼ等を適宜に組み合わせて用いることもでき、
これら酵素の起源は特に限定されるものではない。また
必要に応じてアジ化ナトリウム、チオシアン酸カリウ
ム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、酢酸カルシウムなどの添加剤を含有しても良い。追
随酵素を含有する場合、それらの種類、含有量等は使用
する基質の種類、量などに応じて異なるが、一般的には
α−グルコシダーゼであれば0.01〜400U/m
l、好ましくは5〜50U/ml、グルコアミラーゼで
あれば0.01〜400U/ml、好ましくは5〜50
U/ml、β−グルコシダーゼであれば0.1〜100
U/ml、好ましくは2〜20U/ml程度であり、組
み合わせて用いる場合はその組み合わせに応じて適宜増
減する。上記の基質ならびに必要に応じて用いられる追
随酵素、緩衝液および添加剤等の必要量、ならびに反応
に使用する容器等を一緒に梱包してキットとすることも
できる。
本発明化合物を用いる場合、基質濃度は約0.1〜10
mMの範囲とすることが好ましく、反応温度は20〜5
0℃、好ましくは30〜40℃が適当である。至適pH
は5.5〜8であり、各種緩衝剤を用いてpHを維持す
ることが好ましい。
(3)で表される、pが0または1であり、R4 はα−
アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端
グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能
な物質となる基を示し、具体的には上記R3 で説明した
基と同様の基であるオリゴ糖誘導体を使用することがで
きる。本発明の一般式(3)で表される化合物の好まし
い例は、例えば、R4 が置換フェニル基である2−クロ
ロ−4−ニトロフェニル基である化合物であり、その具
体例としては、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクト
シル−α−マルトシド、2−クロロ−4−ニトロフェニ
ル 4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−
ガラクトシル−α−マルトトリオシドなどが挙げられる
が、これに限るものではない。
式(4)で表される、qが1〜7であり、R5 はα−ア
ミラーゼもしくは追随酵素によって切断されうる結合を
介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断され
たとき測定可能な物質となる基を示し、上記R3 で説明
した基と同様の基のオリゴ糖誘導体を使用することがで
きる。本発明の一般式(4)で表される化合物の好まし
い例は、例えば、R5 が置換フェニル基である2−クロ
ロ−4−ニトロフェニル基である化合物であり、その具
体例としては、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−
O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクト
シル−α−マルトトリオシド、2−クロロ−4−ニトロ
フェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β
−D−ガラクトシル−β−マルトトリオシド、2−クロ
ロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシ
ル−4−O−β−D−ガラクトシル−α−マルトテトラ
オシド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β
−D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシル−
β−マルトテトラオシド、2−クロロ−4−ニトロフェ
ニル 4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D
−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド、2−クロロ
−4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシル
−4−O−β−D−ガラクトシル−β−マルトペンタオ
シド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−
D−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシル−α
−マルトヘキサオシド、2−クロロ−4−ニトロフェニ
ル 4−O−β−D−ガラクトシル−4−O−β−D−
ガラクトシル−β−マルトヘキサオシド、2−クロロ−
4−ニトロフェニル 4−O−β−D−ガラクトシル−
4−O−β−D−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシ
ド、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4−O−β−D
−ガラクトシル−4−O−β−D−ガラクトシル−β−
マルトヘプタオシドなどが挙げられるが、これに限るも
のではない。
明する。本実施例においては、ガラクトシル基を Gal、
グルコシル基を Glu、クロロニトロフェニル基を CNPと
も略記し、各オリゴ糖およびオリゴ糖誘導体の名称の後
に、それらを構成する糖残基や基、ならびにそれらの結
合の様子の概略を示す。 合成例1 ラクトース700mgと、2−クロロ−4−ニトロフェ
ニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−α−マル
トシド(Gal-Glu-Glu-α-CNP)300mgを、50%イ
ソプロパノール/67mMリン酸緩衝液(pH7.0)
混合液5.0mlに溶解し、これにBacillus
circurans由来のβ−ガラクトシダーゼ(大和
化成株式会社製、商品名「β−1,4−ガラクトシダー
ゼ」)を0.4mg添加し、40℃で3時間反応させ
た。反応終了後、90℃で10分間加熱することで反応
を停止し、有機溶媒を留去後、YMC株式会社製ODS
カラム(YMC−PACK(R−355−50))を用
いて精製することにより、目的物32mgを得た。1H
−NMRスペクトル(図1)、13C−NMRスペクトル
(図2)およびFAB−MSスペクトル(図3)による
構造分析により、2−クロロ−4−ニトロフェニル 4
−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O−β−D−
ガラクトピラノシル−α−マルトシド(Gal-Gal-Glu-Gl
u-α-CNP)であることを確認した。
ニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−β−マル
トトリオシド(Gal-Glu-Glu-Glu-β-CNP)300mg
を、50%イソプロパノール/67mMリン酸緩衝液
(pH7.0)混合液5.0mlに溶解し、これにBa
cillus circurans由来のβ−ガラクト
シダーゼ(大和化成株式会社製、商品名「β−1,4−
ガラクトシダーゼ」)を0.4mg添加し、40℃で3
時間反応させた。反応終了後、90℃で10分間加熱す
ることで反応を停止し、有機溶媒を留去後、YMC株式
会社製ODSカラム(YMC−PACK(R−355−
50))を用いて精製することにより目的物33mgを
得た。1H−NMRスペクトル(図4)、13C−NMR
スペクトル(図5)およびFAB−MSスペクトル(図
6)よる構造分析により2−クロロ−4−ニトロフェニ
ル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O−β
−D−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド(Ga
l-Gal-Glu-Glu-Glu-β-CNP)であることを確認した。
ニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−β−マル
トテトラオシド(Gal-Glu-Glu-Glu-Glu-β-CNP)300
mgを、50%イソプロパノール/67mMリン酸緩衝
液(pH7.0)混合液5.0mlに溶解し、これにB
acillus circurans由来のβ−ガラク
トシダーゼ(大和化成株式会社製、商品名「β−1,4
−ガラクトシダーゼ」)を0.4mg添加し、40℃で
3時間反応させた。反応終了後、90℃で10分間加熱
することで反応を停止し、有機溶媒を留去後、YMC株
式会社製ODSカラム(YMC−PACK(R−355
−50))を用いて精製することにより目的物36mg
を得た。1H−NMRスペクトル(図7)、13C−NM
Rスペクトル(図8)およびFAB−MSスペクトル
(図9)よる構造分析により2−クロロ−4−ニトロフ
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシ
ド(Gal-Gal-Glu-Glu-Glu-Glu-β-CNP)であることを確
認した。
ラノシル−マルトシド(Gal-Glu-Glu 〜OH)300mg
を67mMリン酸緩衝液(pH7.0)5.0mlに懸
濁し、これにBacillus circurans由
来のβ−ガラクトシダーゼ(大和化成株式会社製、商品
名「β−1,4−ガラクトシダーゼ」)を0.4mg添
加し、40℃で5時間反応させた。反応終了後、100
℃で10分間加熱することで反応を停止し、昭光通商株
式会社製Asahipak NH2P−90 2Fカラ
ムを用いて精製することにより目的物28mgを得た。
13C−NMRスペクトル(図10)およびFAB−MS
スペクトル(図11)で以下のピークを検出することに
より、構造解析することで4−O−β−D−ガラクトピ
ラノシル−4−O−β−D−ガラクトピラノシル−マル
トシド(Gal-Gal-Glu-Glu〜OH)であることを確認し
た。 FAB−MSスペクトル (C24H42O21=666) 667[M+H]+ 689[M+Na]+
い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定用試薬を
それぞれ調整した。 50mMグッドバッファー(pH6.0) 酢酸カルシウム 5mM 塩化ナトリウム 50mM アジ化ナトリウム 150mM 基質 2mM 表1に記載した基質を各々用い上記条件で調整した各試
薬3mlに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清(第一
化学薬品株式会社製、商品名「ファデバスヒューミラー
ゼコントロール」)をそれぞれ0.020ml添加し、
37℃で10分間経時的に405nmの吸光度を測定し
た。本測定における1分間当たりの吸光度変化を算出し
結果を表2に示した。なお各試薬ブランクの1分間当た
りの吸光度変化も併せて表2に記載した。
い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定用試薬を
それぞれ調整した。 試薬組成A 50mMグッドバッファー(pH7.0) β−グルコシダーゼ 5U/ml 酢酸カルシウム 1mM 塩化ナトリウム 20mM 基質 2mM 表3に記載した基質を用い上記条件で調整した各試薬3
mlに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清(商品名;
ファデバスヒューミラーゼコントロール,第一化学薬品
株式会社製)をそれぞれ0.020ml添加し、37℃
で10分間経時的に405nmの吸光度を測定した。本
測定における1分間当たりの吸光度変化を算出し結果を
表4に示した。なお各試薬ブランクの1分間当たりの吸
光度変化も併せて表4に記載した。
を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活
性測定用試薬をそれぞれ調整した。 試薬組成A 50mMグッドバッファー(pH7.0) α−グルコシダーゼ 10U/ml β−グルコシダーゼ 5U/ml 酢酸カルシウム 1mM 塩化ナトリウム 20mM 基質 2mM 表5に記載した基質を用い上記条件で調整した各試薬3
mlに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清(第一化学
薬品株式会社製、商品名「ファデバスヒューミラーゼコ
ントロール」)をそれぞれ0.020ml添加し、37
℃で10分間経時的に405nmの吸光度を測定した。
本測定における1分間当たりの吸光度変化を算出し結果
を表6に示した。なお各試薬ブランクの1分間当たりの
吸光度変化も併せて表6に記載した。
と、ブランク値の上昇を抑え、溶解性に優れ、より高感
度なα−アミラーゼ活性測定試薬を提供することがで
き、ヒト体液などのα−アミラーゼ活性の測定に大変有
用である。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの 1H
−NMRスペクトル図を示す。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの13C
−NMRスペクトル図を示す。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−α−マルトシドのFA
B−MSスペクトル図を示す。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド
の 1H−NMRスペクトル図を示す。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド
の13C−NMRスペクトル図を示す。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド
のFAB−MSスペクトル図を示す。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシ
ドの 1H−NMRスペクトル図を示す。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシ
ドの13C−NMRスペクトル図を示す。
ェニル 4−O−β−D−ガラクトピラノシル−4−O
−β−D−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシ
ドのFAB−MSスペクトル図を示す。
トピラノシル−4−O−β−D−ガラクトピラノシル−
マルトシドの13C−NMRスペクトル図を示す。
トピラノシル−4−O−β−D−ガラクトピラノシル−
マルトシドのFAB−MSスペクトル図を示す。
Claims (8)
- 【請求項1】 一般式(1) 【化1】 (式中、R1 およびR2 のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、R3 は還元末端
グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能
な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であ
ることを示し、nは0〜7の整数を示す。)で表される
オリゴ糖誘導体。 - 【請求項2】 一般式(2) 【化2】 (式中、R1 およびR2 のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、波線はα配位ま
たはβ配位であることを示し、nは0〜7の整数を示
す。)で表されるオリゴ糖。 - 【請求項3】 一般式(1)で表されるオリゴ糖誘導体
を含有してなる、α−アミラーゼ活性測定試薬。 - 【請求項4】 請求項3記載のα−アミラーゼ活性測定
試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させるこ
とにより、一般式(1)で表される前記オリゴ糖誘導体
をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質
の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラー
ゼ活性測定方法。 - 【請求項5】 一般式(3) 【化3】 (式中、R1 およびR2 のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、R4 はα−アミ
ラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グル
コースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物
質となる基を示し、pは0〜1の整数を示す。)で表さ
れるオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含有しない、
α−アミラーゼ活性測定試薬。 - 【請求項6】 請求項5記載のα−アミラーゼ活性測定
試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させるこ
とにより、一般式(3)で表される前記オリゴ糖誘導体
をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質
の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラー
ゼ活性測定方法。 - 【請求項7】 一般式(4) 【化4】 (式中、R1 およびR2 のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、R5 はα−アミ
ラーゼもしくは追随酵素によって切断されうる結合を介
して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断された
とき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位また
はβ配位であることを示し、qは1〜7の整数を示
す。)で表されるオリゴ糖誘導体および追随酵素を含有
する、α−アミラーゼ活性測定試薬。 - 【請求項8】 請求項7記載のα−アミラーゼ活性測定
試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させるこ
とにより、一般式(4)で表される前記オリゴ糖誘導体
をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質
の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラー
ゼ活性測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20344497A JP4171088B2 (ja) | 1997-07-29 | 1997-07-29 | 新規オリゴ糖誘導体、それを含有するα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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---|---|---|---|
JP20344497A JP4171088B2 (ja) | 1997-07-29 | 1997-07-29 | 新規オリゴ糖誘導体、それを含有するα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1143497A true JPH1143497A (ja) | 1999-02-16 |
JP4171088B2 JP4171088B2 (ja) | 2008-10-22 |
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JP20344497A Expired - Fee Related JP4171088B2 (ja) | 1997-07-29 | 1997-07-29 | 新規オリゴ糖誘導体、それを含有するα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法 |
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JP (1) | JP4171088B2 (ja) |
-
1997
- 1997-07-29 JP JP20344497A patent/JP4171088B2/ja not_active Expired - Fee Related
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