JPH1143497A

JPH1143497A - 新規オリゴ糖誘導体、それを含有するα−アミラーゼ活性測定試薬および測定方法

Info

Publication number: JPH1143497A
Application number: JP20344497A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Suga; 守須賀
Original assignee: YOSHITOMI FINE CHEM KK; Toyobo Co Ltd
Current assignee: YOSHITOMI FINE CHEM KK; Toyobo Co Ltd
Priority date: 1997-07-29
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 1999-02-16
Anticipated expiration: 2017-07-29
Also published as: JP4171088B2

Abstract

(57)【要約】【課題】水溶性に優れ、追随酵素による影響を受け
ず、α−アミラーゼとの親和性に優れ、その切断点も特
異的な選択性を持ち、かつ高感度である糖誘導体、また
これを基質として用い、α−アミラーゼ活性を精度よく
測定する試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法の提
供。【解決手段】一般式（１）【化１】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ³は還元末端
グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能
な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であ
ることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表される
オリゴ糖誘導体、これを基質として用いた、α−アミラ
ーゼ活性を精度よく測定する試薬およびα−アミラーゼ
活性測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、α−アミラーゼ活
性測定用基質として用いることができる新規なオリゴ糖
およびその糖誘導体、ならびに該オリゴ糖またはその糖
誘導体を含有するα−アミラーゼ活性測定試薬、ならび
に当該試薬を用いたα−アミラーゼ活性測定方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来より膵液や尿などの体液に含有され
るα−アミラーゼ活性を測定することにより、急性や慢
性の膵臓炎症、膵臓癌、耳下腺炎などの各種疾患の診断
が行われており、臨床診断上の重要な指標の一つとなっ
ている。

【０００３】α−アミラーゼ活性測定の方法は各種知ら
れているが、近年、構造が決定されており、かつα−ア
ミラーゼの作用状態が明確となっているマルトオリゴ糖
またはマルトオリゴ糖誘導体を基質として用いる方法が
主流になっている。

【０００４】すなわち、マルトオリゴ糖またはマルトオ
リゴ糖誘導体に、追随酵素としてα−グルコシダーゼお
よび／またはβ−グルコシダーゼの存在下に、α−アミ
ラーゼを含有する検体を作用させ、生成するグルコース
またはオリゴ糖誘導体の還元末端から遊離するアグリコ
ンの量を光学的に測定することにより、α−アミラーゼ
活性を測定する方法が汎用されている。

【０００５】しかしながら、α−グルコシダーゼなどの
追随酵素は、α−アミラーゼの反応に関係なく僅かでは
あるが基質に作用するため、測定液が不安定でブランク
値が上昇するため調整した測定液の保存が困難であると
いった欠点があった。

【０００６】この欠点を解決するため、マルトオリゴ糖
またはマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端グルコースを
修飾し、追随酵素の作用を受けないようにした基質を用
いることが試みられている。

【０００７】例えば、特開昭６０−５４３９５号、同６
０−８７２９７号、同６０−２３７９９８号、同６１−
６３２９９号、同６３−３０１８９２号、特開平１−１
５７９９６号の各公報などに、非還元末端のグルコース
の４位および／または６位の水酸基を、ハロゲン原子、
アルキル基、フェニル基、ピリジル基、ベンジリデン
基、エチリデン基、イソプロピリデン基、または３−オ
キソブチリデン基などで置換し、還元末端グルコースに
アグリコンを結合させたマルトオリゴ糖誘導体を基質と
して用いる方法が記載されている。

【０００８】しかし、これらの非還元末端を非糖質で修
飾する方法では、その水溶性の問題や、本来澱粉やアミ
ロースなどのグルコース鎖を認識し切断するα−アミラ
ーゼとの親和性が充分でなく、充分な感度が得られない
といった欠点があった。

【０００９】一方、特開平３−２６４５９６号、同４−
２７９５９６号、同５−２０８９８９号、同６−３１５
３９９号の各公報などに、非還元末端グルコースの６位
または４位の水酸基に、ガラクトシル基を導入したマル
トオリゴ糖またはその誘導体を基質として用いる方法を
記載している。

【００１０】これらのガラクトシル−マルトオリゴ糖誘
導体基質は、理論的には水溶性、ブランク値の上昇とい
った問題を回避してしているものの、実際には製造上分
離困難である、非還元末端が修飾されていない、原料由
来のマルトオリゴ糖誘導体が不純物として若干含まれる
ために、多少ブランク値が上昇するといった問題があ
り、また感度も充分ではなかった。

【００１１】特開昭６３−１８３５９５号、特開平６−
３１５３９９号の各公報などは、追随酵素を必要としな
い２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシド

【００１２】

【化５】

【００１３】や、２−クロロ−４−ニトロフェニルガ
ラクトピラノシルマルトシド

【００１４】

【化６】

【００１５】を基質とする方法を記載している。

【００１６】この２−クロロ−４−ニトロフェニルマ
ルトトリオシドや２−クロロ−４−ニトロフェニルガ
ラクトピラノシルマルトシドを基質とする方法では、ブ
ランク値上昇の問題は少ないものの、糖鎖が短いためア
ミラーゼとの親和性が充分とはいえず、また感度も充分
でないといった問題があった。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
α−アミラーゼ活性測定基質の欠点を解消しようとする
もので、その目的は、水溶性に優れ、追随酵素による影
響を受けず、α−アミラーゼとの親和性に優れ、その切
断点も特異的な選択性を持ち、かつ高感度である糖誘導
体、またこれを基質として用い、α−アミラーゼ活性を
精度よく測定する試薬およびα−アミラーゼ活性測定方
法を提供することにある。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究を重
ねた結果、水溶性に優れ、追随酵素により影響を受け
ず、α−アミラーゼとの親和性に優れ、その切断点も特
異的な選択性を持ち、かつ高感度な新規オリゴ糖ならび
にその誘導体を得ることに成功し、さらに、当該オリゴ
糖および／またはその誘導体を含有するα−アミラーゼ
活性測定試薬、およびその測定方法を確立し、本発明を
完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りであ
る。１）一般式（１）

【００１９】

【化７】

【００２０】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方は
β−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ
³は還元末端グルコースに結合し、該結合が切断された
とき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位また
はβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示
す。）で表されるオリゴ糖誘導体。２）一般式（２）

【００２１】

【化８】

【００２２】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方は
β−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、波
線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎは０〜７
の整数を示す。）で表されるオリゴ糖。３）一般式（１）で表されるオリゴ糖誘導体を含有して
なる、α−アミラーゼ活性測定試薬。４）上記３）記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α
−アミラーゼを含有する試料と接触させることにより、
一般式（１）で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミ
ラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質の量を測定
することを特徴とする試料中のα−アミラーゼ活性測定
方法。５）一般式（３）

【００２３】

【化９】

【００２４】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方は
β−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ
⁴はα−アミラーゼによって切断されうる結合を介して
還元末端グルコースに結合し、該結合が切断されたとき
測定可能な物質となる基を示し、ｐは０〜１の整数を示
す。）で表されるオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を
含有しない、α−アミラーゼ活性測定試薬。６）上記５）記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α
−アミラーゼを含有する試料と接触させ、一般式（３）
で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応
させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特
徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。７）一般式（４）

【００２５】

【化１０】

【００２６】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方は
β−ガラクトシル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ
⁵はα−アミラーゼもしくは追随酵素によって切断され
うる結合を介して還元末端グルコースに結合し、該結合
が切断されたとき測定可能な物質となる基を示し、波線
はα配位またはβ配位であることを示し、ｑは１〜７の
整数を示す。）で表されるオリゴ糖誘導体および追随酵
素を含有する、α−アミラーゼ活性測定試薬。８）上記７）記載のα−アミラーゼ活性測定試薬を、α
−アミラーゼを含有する試料と接触させ、一般式（４）
で表される前記オリゴ糖誘導体をα−アミラーゼと反応
させ、遊離した測定可能な物質の量を測定することを特
徴とする、試料中のα−アミラーゼ活性測定方法。

【００２７】本発明のオリゴ糖誘導体である一般式
（１）で表される化合物は、ガラクトシル−マルトー
ス、ガラクトシル−マルトトリオース、ガラクトシル−
マルトテトラオース、ガラクトシル−マルトペンタオー
ス、ガラクトシル−マルトヘキサオース、ガラクトシル
−マルトペプタオースなどのオリゴ糖の非還元末端ガラ
クトースの４位または６位の水酸基に修飾基であるガラ
クトピラノシル基がβ配位で結合し、さらに、当該オリ
ゴ糖還元末端グルコースと結合し、該結合が切断された
とき測定可能な物質となる基Ｒ³で示されるアグリコン
を有する。

【００２８】Ｒ³は還元末端グルコースの１位の炭素原
子に結合した酸素原子と結合している。このグリコシド
結合はα配位もしくはβ配位のいずれでもよい。このグ
リコシド結合は、α−アミラーゼや、グルコアミラー
ゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼなどの追
随酵素によって切断され得る結合であり、該結合が切断
されることによって、Ｒ³は測定可能な物質となり、α
−アミラーゼ活性測定に用いることができる。

【００２９】Ｒ³で表される基としては、一般式（５）

【００３０】

【化１１】

【００３１】（式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は、同一または異
っていてもよく、それぞれ水素原子、ハロゲン原子、ニ
トロ基を示す。）で表される置換または無置換のフェニ
ル基を示し、例えば、ｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロ
フェニル、ｍ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル、２−フルオロ−４−ニトロフェニル、２，
４−ジニトロフェニル、２，４−ジクロロフェニル基な
どを挙げることができる。また、４−メチルウンベリフ
ェニルなどの蛍光性基なども挙げられる。

【００３２】一般式（１）中のｎは０〜７のいずれの整
数でもよい。

【００３３】本発明の新規オリゴ糖およびその誘導体
は、酵素転移反応を利用した方法より得られる。すなわ
ちガラクトシル残基を持つ糖をドナーとし、ガラクトシ
ル−マルトオリゴ糖およびその誘導体をアクセプターと
する糖転移反応をβ−ガラクトシダーゼを用いて行い、
目的とする新規オリゴ糖およびその誘導体を合成するも
のである。

【００３４】以下にこの方法について説明する。ガラク
トシル残基を持つ糖とは、例えばラクトース、ラフィノ
ース、メリビオース、スタキオース、ガラクタンなどを
挙げることができる。好ましくは安価で入手の容易なラ
クトースが好適である。

【００３５】アクセプターとして用いられるガラクトシ
ル−マルトオリゴ糖誘導体としては、一般式（６）

【００３６】

【化１２】

【００３７】（式中、Ｒ³は還元末端グルコースに結合
し、該結合が切断されたとき測定可能な物質となる基を
示し、波線はα配位またはβ配位であることを示し、ｎ
は０〜７の整数を示す。）で表される。一般式（６）で
表される化合物の好ましい例は、例えば、Ｒ³が置換フ
ェニル基である２−クロロ−４−ニトロフェニル基であ
る化合物であり、その具体例としては、２−クロロ−４
−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α
−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトシド、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシ
ル−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトト
リオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド、２−
クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トシル−β−マルトテトラオシド、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マ
ルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトペンタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、２−クロロ
−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル
−β−マルトヘキサオシド、２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘ
プタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシドなど
が挙げられるがこれに限るものではない。

【００３８】アクセプターとして用いられるガラクトシ
ル−マルトオリゴ糖としては、一般式（７）

【００３９】

【化１３】

【００４０】（式中、波線はα配位またはβ配位である
ことを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表される化
合物が挙げられる。一般式（７）で表される化合物の具
体例としては、ガラクトシル−マルトース、ガラクトシ
ル−マルトトリオース、ガラクトシル−マルトテトラオ
ース、ガラクトシル−マルトペンタオース、ガラクトシ
ル−マルトヘキサオース、ガラクトシル−マルトヘプタ
オースなどが挙げられるがこれに限るものではない。

【００４１】本発明において、用いられるβ−ガラクト
シダーゼは、いずれの起源のものでもよく、例えばＢａ
ｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｒａｎｓ、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．などの由来のものが挙げ
られる。

【００４２】本発明の酵素を用いた転移反応は水および
親水性有機溶媒との混合溶媒中で行う。混合溶媒中での
反応は、目的とする転移反応の選択性を高めたり、目的
物質の収率を向上させることができるので特に好まし
い。

【００４３】親水性有機溶媒としては特に限定はなく、
例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミ
ド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、アセト
ニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、ｎ−プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、メタノール、
エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコー
ルなどが挙げられる。これらの溶媒は、単独または２種
以上を混合してもよい。

【００４４】水との混合溶媒における親水性有機溶媒の
割合は、糖及び糖誘導体の種類や使用する酵素の起源や
親水性有機溶媒の種類によっても異なるが、約１〜８０
％、好ましくは２０〜６０％が良い。

【００４５】糖供与体であるガラクトシル残基を持つ糖
とガラクトシル−マルトオリゴ糖及びその誘導体の混合
液は、溶液または懸濁液として用いられ、溶液または懸
濁液の全量に対して、ガラクトシル−マルトオリゴ糖お
よびその誘導体は１〜４０％、好ましくは２０〜４０％
の濃度である。また、ガラクトシル残基を持つ糖の投入
量は、ガラクトシル−マルトオリゴ糖およびその誘導体
に対して、０．１〜１０倍、好ましくは１〜５倍が適当
である。

【００４６】反応時間は１０分〜１２０時間、好ましく
は１〜４０時間程度、反応温度は２０〜６０℃、ｐＨ４
〜８、好ましくは５〜７が適当である。反応終了後、反
応液のｐＨ調整または加熱により反応を停止し、カラム
クロマトグラフィーにより分画精製することなどによ
り、一般式（１）およびこれに包含される一般式
（３）、（４）〔以下、特に言及しない限り、一般式
（１）についての説明は一般式（３）および（４）につ
いての説明をも包含する〕ならびに一般式（２）により
表される新規オリゴ糖およびその誘導体を得ることがで
きる。

【００４７】アクセプターとして一般式（６）により表
されるガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を用いた場
合には、上記の糖転移反応により一般式（１）の化合物
が得られ、アクセプターとして一般式（７）により表さ
れるガラクトシル−マルトオリゴ糖を用いた場合には、
上記の糖転移反応により一般式（２）の化合物が得られ
る。この場合、一般式（２）の化合物を、公知の方法に
よりグルコシド化することにより、一般式（１）の化合
物とすることができる。したがって、一般式（２）の化
合物は、一般式（１）の化合物の原料として用いること
ができる。

【００４８】本発明の一般式（１）で表される化合物の
好ましい例は、例えば、Ｒ³が置換フェニル基である２
−クロロ−４−ニトロフェニル基である化合物であり、
その具体例としては、２−クロロ−４−ニトロフェニル
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトシル−α−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトシド、２−クロロ−４
−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４
−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトトリオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マル
トトリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
シル−α−マルトテトラオシド、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトテトラオシド、２−
クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトペ
ンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシ
ル−β−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
シル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘキ
サオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−
β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル
−α−マルトヘプタオシド、２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシドなどが挙げ
られるが、これに限るものではない。

【００４９】上記には、Ｒ³が、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル基である例を挙げたが、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル基の代りに、該グリコシド結合が切断され
た時に発色性の物質となる基であればよく、例えば、上
記のｐ−ニトロフェニル、ｏ−ニトロフェニル、ｍ−ニ
トロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニル、２−
フルオロ−４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェ
ニル、２，４−ジクロロフェニル基などであってもよ
い。また、４−メチルウンベリフェニルなどの蛍光性基
などであってもよい。

【００５０】本発明の一般式（２）の化合物としては、
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラ
クトシル−α−マルトシド、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
シル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトシ
ド、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトシル−α−マルトトリオシド、４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−
マルトトリオシド、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４
−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラオシ
ド、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトシル−β−マルトテトラオシド、４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α
−マルトペンタオシド、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル
−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトペンタオ
シド、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトシル−α−マルトヘキサオシド、４−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−
β−マルトヘキサオシド、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシ
ル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタ
オシド、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトシル−β−マルトヘプタオシドなどが挙げ
られるが、これに限るものではない。

【００５１】本発明のα−アミラーゼ活性測定試薬は、
上記一般式（１）記載のオリゴ糖誘導体を基質として含
有するものである。また、必要に応じて追随酵素とし
て、α−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、β−グル
コシダーゼ等を適宜に組み合わせて用いることもでき、
これら酵素の起源は特に限定されるものではない。また
必要に応じてアジ化ナトリウム、チオシアン酸カリウ
ム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、酢酸カルシウムなどの添加剤を含有しても良い。追
随酵素を含有する場合、それらの種類、含有量等は使用
する基質の種類、量などに応じて異なるが、一般的には
α−グルコシダーゼであれば０．０１〜４００Ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌ、グルコアミラーゼで
あれば０．０１〜４００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜５０
Ｕ／ｍｌ、β−グルコシダーゼであれば０．１〜１００
Ｕ／ｍｌ、好ましくは２〜２０Ｕ／ｍｌ程度であり、組
み合わせて用いる場合はその組み合わせに応じて適宜増
減する。上記の基質ならびに必要に応じて用いられる追
随酵素、緩衝液および添加剤等の必要量、ならびに反応
に使用する容器等を一緒に梱包してキットとすることも
できる。

【００５２】α−アミラーゼ活性測定試薬の基質として
本発明化合物を用いる場合、基質濃度は約０．１〜１０
ｍＭの範囲とすることが好ましく、反応温度は２０〜５
０℃、好ましくは３０〜４０℃が適当である。至適ｐＨ
は５．５〜８であり、各種緩衝剤を用いてｐＨを維持す
ることが好ましい。

【００５３】追随酵素を含有しない場合には、一般式
（３）で表される、ｐが０または１であり、Ｒ⁴はα−
アミラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端
グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能
な物質となる基を示し、具体的には上記Ｒ³で説明した
基と同様の基であるオリゴ糖誘導体を使用することがで
きる。本発明の一般式（３）で表される化合物の好まし
い例は、例えば、Ｒ⁴が置換フェニル基である２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル基である化合物であり、その具
体例としては、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
シル−α−マルトシド、２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトシル−α−マルトトリオシドなどが挙げられる
が、これに限るものではない。

【００５４】また、追随酵素を含有する場合には、一般
式（４）で表される、ｑが１〜７であり、Ｒ⁵はα−ア
ミラーゼもしくは追随酵素によって切断されうる結合を
介して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断され
たとき測定可能な物質となる基を示し、上記Ｒ³で説明
した基と同様の基のオリゴ糖誘導体を使用することがで
きる。本発明の一般式（４）で表される化合物の好まし
い例は、例えば、Ｒ⁵が置換フェニル基である２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル基である化合物であり、その具
体例としては、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクト
シル−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−ニトロ
フェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトトリオシド、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシ
ル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトテトラ
オシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−
β−マルトテトラオシド、２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド、２−クロロ
−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル
−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−マルトペンタオ
シド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α
−マルトヘキサオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトシル−β−マルトヘキサオシド、２−クロロ−
４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−
４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−マルトヘプタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ
−ガラクトシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシル−β−
マルトヘプタオシドなどが挙げられるが、これに限るも
のではない。

【００５５】

【実施例】以下に、実施例を示し本発明をより詳細に説
明する。本実施例においては、ガラクトシル基を Gal、
グルコシル基を Glu、クロロニトロフェニル基を CNPと
も略記し、各オリゴ糖およびオリゴ糖誘導体の名称の後
に、それらを構成する糖残基や基、ならびにそれらの結
合の様子の概略を示す。合成例１ラクトース７００ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マル
トシド（Gal-Glu-Glu-α-CNP）３００ｍｇを、５０％イ
ソプロパノール／６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
混合液５．０ｍｌに溶解し、これにＢａｃｉｌｌｕｓ
ｃｉｒｃｕｒａｎｓ由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和
化成株式会社製、商品名「β−１，４−ガラクトシダー
ゼ」）を０．４ｍｇ添加し、４０℃で３時間反応させ
た。反応終了後、９０℃で１０分間加熱することで反応
を停止し、有機溶媒を留去後、ＹＭＣ株式会社製ＯＤＳ
カラム（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ（Ｒ−３５５−５０））を用
いて精製することにより、目的物３２ｍｇを得た。¹Ｈ
−ＮＭＲスペクトル（図１）、¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル
（図２）およびＦＡＢ−ＭＳスペクトル（図３）による
構造分析により、２−クロロ−４−ニトロフェニル４
−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−α−マルトシド（Gal-Gal-Glu-Gl
u-α-CNP）であることを確認した。

【００５６】合成例２ラクトース５００ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マル
トトリオシド（Gal-Glu-Glu-Glu-β-CNP）３００ｍｇ
を、５０％イソプロパノール／６７ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）混合液５．０ｍｌに溶解し、これにＢａ
ｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｒａｎｓ由来のβ−ガラクト
シダーゼ（大和化成株式会社製、商品名「β−１，４−
ガラクトシダーゼ」）を０．４ｍｇ添加し、４０℃で３
時間反応させた。反応終了後、９０℃で１０分間加熱す
ることで反応を停止し、有機溶媒を留去後、ＹＭＣ株式
会社製ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ（Ｒ−３５５−
５０））を用いて精製することにより目的物３３ｍｇを
得た。¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図４）、¹³Ｃ−ＮＭＲ
スペクトル（図５）およびＦＡＢ−ＭＳスペクトル（図
６）よる構造分析により２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド（Ga
l-Gal-Glu-Glu-Glu-β-CNP）であることを確認した。

【００５７】合成例３ラクトース５００ｍｇと、２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マル
トテトラオシド（Gal-Glu-Glu-Glu-Glu-β-CNP）３００
ｍｇを、５０％イソプロパノール／６７ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）混合液５．０ｍｌに溶解し、これにＢ
ａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｒａｎｓ由来のβ−ガラク
トシダーゼ（大和化成株式会社製、商品名「β−１，４
−ガラクトシダーゼ」）を０．４ｍｇ添加し、４０℃で
３時間反応させた。反応終了後、９０℃で１０分間加熱
することで反応を停止し、有機溶媒を留去後、ＹＭＣ株
式会社製ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−ＰＡＣＫ（Ｒ−３５５
−５０））を用いて精製することにより目的物３６ｍｇ
を得た。¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図７）、¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトル（図８）およびＦＡＢ−ＭＳスペクトル
（図９）よる構造分析により２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシ
ド（Gal-Gal-Glu-Glu-Glu-Glu-β-CNP）であることを確
認した。

【００５８】合成例４ラクトース７００ｍｇと、４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−マルトシド（Gal-Glu-Glu 〜OH）３００ｍｇ
を６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５．０ｍｌに懸
濁し、これにＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｒａｎｓ由
来のβ−ガラクトシダーゼ（大和化成株式会社製、商品
名「β−１，４−ガラクトシダーゼ」）を０．４ｍｇ添
加し、４０℃で５時間反応させた。反応終了後、１００
℃で１０分間加熱することで反応を停止し、昭光通商株
式会社製ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ−９０２Ｆカラ
ムを用いて精製することにより目的物２８ｍｇを得た。
¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図１０）およびＦＡＢ−ＭＳ
スペクトル（図１１）で以下のピークを検出することに
より、構造解析することで４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−マル
トシド（Gal-Gal-Glu-Glu〜OH）であることを確認し
た。ＦＡＢ−ＭＳスペクトル（Ｃ₂₄Ｈ₄₂Ｏ₂₁＝６６６）６６７［Ｍ＋Ｈ］⁺ ６８９［Ｍ＋Ｎａ］⁺

【００５９】試験例１前記合成例１で得られたオリゴ糖誘導体を基質として用
い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定用試薬を
それぞれ調整した。５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ６．０）酢酸カルシウム５ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭアジ化ナトリウム１５０ｍＭ基質２ｍＭ表１に記載した基質を各々用い上記条件で調整した各試
薬３ｍｌに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清（第一
化学薬品株式会社製、商品名「ファデバスヒューミラー
ゼコントロール」）をそれぞれ０．０２０ｍｌ添加し、
３７℃で１０分間経時的に４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。本測定における１分間当たりの吸光度変化を算出し
結果を表２に示した。なお各試薬ブランクの１分間当た
りの吸光度変化も併せて表２に記載した。

【００６０】

【表１】

【００６１】

【表２】

【００６２】試験例２前記合成例２で得られたオリゴ糖誘導体を基質として用
い、下記組成からなるα−アミラーゼ活性測定用試薬を
それぞれ調整した。試薬組成Ａ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） β−グルコシダーゼ５Ｕ／ｍｌ酢酸カルシウム１ｍＭ塩化ナトリウム２０ｍＭ基質２ｍＭ表３に記載した基質を用い上記条件で調整した各試薬３
ｍｌに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清（商品名；
ファデバスヒューミラーゼコントロール，第一化学薬品
株式会社製）をそれぞれ０．０２０ｍｌ添加し、３７℃
で１０分間経時的に４０５ｎｍの吸光度を測定した。本
測定における１分間当たりの吸光度変化を算出し結果を
表４に示した。なお各試薬ブランクの１分間当たりの吸
光度変化も併せて表４に記載した。

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】

【００６５】試験例３前記合成例２および合成例３で得られたオリゴ糖誘導体
を基質として用い、下記組成からなるα−アミラーゼ活
性測定用試薬をそれぞれ調整した。試薬組成Ａ５０ｍＭグッドバッファー（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ１０Ｕ／ｍｌ β−グルコシダーゼ５Ｕ／ｍｌ酢酸カルシウム１ｍＭ塩化ナトリウム２０ｍＭ基質２ｍＭ表５に記載した基質を用い上記条件で調整した各試薬３
ｍｌに、α−アミラーゼ活性測定用管理血清（第一化学
薬品株式会社製、商品名「ファデバスヒューミラーゼコ
ントロール」）をそれぞれ０．０２０ｍｌ添加し、３７
℃で１０分間経時的に４０５ｎｍの吸光度を測定した。
本測定における１分間当たりの吸光度変化を算出し結果
を表６に示した。なお各試薬ブランクの１分間当たりの
吸光度変化も併せて表６に記載した。

【００６６】

【表５】

【００６７】

【表６】

【００６８】

【発明の効果】本発明の新規オリゴ糖誘導体を用いる
と、ブランク値の上昇を抑え、溶解性に優れ、より高感
度なα−アミラーゼ活性測定試薬を提供することがで
き、ヒト体液などのα−アミラーゼ活性の測定に大変有
用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】合成例１で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの¹Ｈ
−ＮＭＲスペクトル図を示す。

【図２】合成例１で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの¹³Ｃ
−ＮＭＲスペクトル図を示す。

【図３】合成例１で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドのＦＡ
Ｂ−ＭＳスペクトル図を示す。

【図４】合成例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド
の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。

【図５】合成例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド
の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル図を示す。

【図６】合成例２で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトトリオシド
のＦＡＢ−ＭＳスペクトル図を示す。

【図７】合成例３で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシ
ドの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル図を示す。

【図８】合成例３で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシ
ドの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル図を示す。

【図９】合成例３で得られた２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−マルトテトラオシ
ドのＦＡＢ−ＭＳスペクトル図を示す。

【図１０】合成例４で得られた４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
マルトシドの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル図を示す。

【図１１】合成例４で得られた４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
マルトシドのＦＡＢ−ＭＳスペクトル図を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（１）【化１】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ³は還元末端
グルコースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能
な物質となる基を示し、波線はα配位またはβ配位であ
ることを示し、ｎは０〜７の整数を示す。）で表される
オリゴ糖誘導体。
【請求項２】一般式（２）【化２】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、波線はα配位ま
たはβ配位であることを示し、ｎは０〜７の整数を示
す。）で表されるオリゴ糖。
【請求項３】一般式（１）で表されるオリゴ糖誘導体
を含有してなる、α−アミラーゼ活性測定試薬。
【請求項４】請求項３記載のα−アミラーゼ活性測定
試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させるこ
とにより、一般式（１）で表される前記オリゴ糖誘導体
をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質
の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラー
ゼ活性測定方法。
【請求項５】一般式（３）【化３】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ⁴はα−アミ
ラーゼによって切断されうる結合を介して還元末端グル
コースに結合し、該結合が切断されたとき測定可能な物
質となる基を示し、ｐは０〜１の整数を示す。）で表さ
れるオリゴ糖誘導体を含有し、追随酵素を含有しない、
α−アミラーゼ活性測定試薬。
【請求項６】請求項５記載のα−アミラーゼ活性測定
試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させるこ
とにより、一般式（３）で表される前記オリゴ糖誘導体
をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質
の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラー
ゼ活性測定方法。
【請求項７】一般式（４）【化４】（式中、Ｒ¹およびＲ²のいずれか一方はβ−ガラクト
シル基を示し、他方は水素原子を示し、Ｒ⁵はα−アミ
ラーゼもしくは追随酵素によって切断されうる結合を介
して還元末端グルコースに結合し、該結合が切断された
とき測定可能な物質となる基を示し、波線はα配位また
はβ配位であることを示し、ｑは１〜７の整数を示
す。）で表されるオリゴ糖誘導体および追随酵素を含有
する、α−アミラーゼ活性測定試薬。
【請求項８】請求項７記載のα−アミラーゼ活性測定
試薬を、α−アミラーゼを含有する試料と接触させるこ
とにより、一般式（４）で表される前記オリゴ糖誘導体
をα−アミラーゼと反応させ、遊離した測定可能な物質
の量を測定することを特徴とする試料中のα−アミラー
ゼ活性測定方法。