JPH11228427A - Ｉｌ−４産生抑制剤 - Google Patents
Ｉｌ−４産生抑制剤Info
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- JPH11228427A JPH11228427A JP10052747A JP5274798A JPH11228427A JP H11228427 A JPH11228427 A JP H11228427A JP 10052747 A JP10052747 A JP 10052747A JP 5274798 A JP5274798 A JP 5274798A JP H11228427 A JPH11228427 A JP H11228427A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＩＬ（インターロイキン）−４の産生を抑制
できる薬剤を提供すること。 【解決手段】 クレブシエラ・オキシトカ又はクレブシ
エラ・ニューモニアの莢膜成分またはこれを酸、塩基も
しくは還元剤で処埋することにより得ることのできる成
分を含有することを特徴とする、ＩＬ−４産生抑制剤。
できる薬剤を提供すること。 【解決手段】 クレブシエラ・オキシトカ又はクレブシ
エラ・ニューモニアの莢膜成分またはこれを酸、塩基も
しくは還元剤で処埋することにより得ることのできる成
分を含有することを特徴とする、ＩＬ−４産生抑制剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、クレブシエラ属細
菌特にクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoc
a）及びクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneu
moniae ）の莢膜より得ることのできるＩＬ−４産生抑
制剤に関する。
菌特にクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoc
a）及びクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneu
moniae ）の莢膜より得ることのできるＩＬ−４産生抑
制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＩＬ（インターロイキン）−４は、レク
チン、フォルボールエステルあるいは抗原で刺激された
Ｔリンパ球によって産生される分子量１８，０００〜２
１，０００である糖蛋白質である。ＩＬ−４はＢリンパ
球、Ｔリンパ球及び肥満細胞の分化、増殖等の生体免疫
反応にとって重要な作用を示す。最近、ＩＬ−４がアレ
ルギー反応に関係するＢ細胞でのＩｇＥ産生誘導作用・
肥満細胞の増殖促進作用を示すことが明らかにされ、Ｉ
Ｌ−４産生抑制剤を用いた抗アレルギー剤の開発が期待
されている。
チン、フォルボールエステルあるいは抗原で刺激された
Ｔリンパ球によって産生される分子量１８，０００〜２
１，０００である糖蛋白質である。ＩＬ−４はＢリンパ
球、Ｔリンパ球及び肥満細胞の分化、増殖等の生体免疫
反応にとって重要な作用を示す。最近、ＩＬ−４がアレ
ルギー反応に関係するＢ細胞でのＩｇＥ産生誘導作用・
肥満細胞の増殖促進作用を示すことが明らかにされ、Ｉ
Ｌ−４産生抑制剤を用いた抗アレルギー剤の開発が期待
されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＩＬ
−４産生抑制剤を提供することである。
−４産生抑制剤を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、クレブシエラ
・オキシトカ又はクレブシエラ・ニューモニアの莢膜成
分またはこれを酸、塩基若しくは還元剤で処理すること
により得ることのできる成分、を含有することを特徴と
する、ＩＬ−４産生抑制剤を提供する。
・オキシトカ又はクレブシエラ・ニューモニアの莢膜成
分またはこれを酸、塩基若しくは還元剤で処理すること
により得ることのできる成分、を含有することを特徴と
する、ＩＬ−４産生抑制剤を提供する。
【０００５】ここに、クレブシエラ・オキシトカとして
特に好ましいのは、クレブシエラ・オキシトカＴＮＭ３
株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６６９：通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所）又はその変異株であ
る。またクレブシエラ・ニューモニアとして特に好まし
いのは、クレブシエラ・ニューモニアＫ１９株（Michel
Beurret et al., "Structual investigation of the c
apsular polysaccharide from Klebsiella K19 by chem
ical and N.M.R. analyses", Carbohydrate Research,
157:13-25(1986).）又はその変異株である。これらの変
異株は、クレブシエラ・オキシトカＴＮＭ３株又はクレ
ブシエラ・ニューモニアＫ１９株を、紫外線、Ｘ線など
の放射線に暴露し、または、エチルメタンスルホン酸
（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（ＭＮＮＧ）等の化学的突然変異誘発物質の
ような公知の突然変異誘発手段と接触させることにより
発生させることができる。これらの細菌の莢膜成分、ま
たはこれを酸、塩基若しくは還元剤で処理することによ
り得ることのできる成分のＩＬ−４産生抑制作用の有無
及び強弱は、後述の方法により容易に測定することがで
きる。
特に好ましいのは、クレブシエラ・オキシトカＴＮＭ３
株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６６９：通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所）又はその変異株であ
る。またクレブシエラ・ニューモニアとして特に好まし
いのは、クレブシエラ・ニューモニアＫ１９株（Michel
Beurret et al., "Structual investigation of the c
apsular polysaccharide from Klebsiella K19 by chem
ical and N.M.R. analyses", Carbohydrate Research,
157:13-25(1986).）又はその変異株である。これらの変
異株は、クレブシエラ・オキシトカＴＮＭ３株又はクレ
ブシエラ・ニューモニアＫ１９株を、紫外線、Ｘ線など
の放射線に暴露し、または、エチルメタンスルホン酸
（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（ＭＮＮＧ）等の化学的突然変異誘発物質の
ような公知の突然変異誘発手段と接触させることにより
発生させることができる。これらの細菌の莢膜成分、ま
たはこれを酸、塩基若しくは還元剤で処理することによ
り得ることのできる成分のＩＬ−４産生抑制作用の有無
及び強弱は、後述の方法により容易に測定することがで
きる。
【０００６】クレブシエラ・オキシトカＴＮＭ３株及び
クレブシエラ・ニューモニアＫ１９株は、いずれも以下
の結合様式からなる各多糖を構成糖として、以下のモル
比で構成される多糖類を莢膜成分として有する。すなわ
ち： である。〔但し上記式中、Ｒｈａはラムノース残基、Ｇ
ｌｃはグルコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇ
ｌｃＵＡはグルクロン酸残基を表し、小括弧に隣接する
数字は各残基におけるグリコシド結合の位置を表す。〕
クレブシエラ・ニューモニアＫ１９株は、いずれも以下
の結合様式からなる各多糖を構成糖として、以下のモル
比で構成される多糖類を莢膜成分として有する。すなわ
ち： である。〔但し上記式中、Ｒｈａはラムノース残基、Ｇ
ｌｃはグルコース残基、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇ
ｌｃＵＡはグルクロン酸残基を表し、小括弧に隣接する
数字は各残基におけるグリコシド結合の位置を表す。〕
【０００７】本発明は、クレブシエラ・オキシトカ又は
クレブシエラ・ニューモニアの莢膜多糖類、またはこれ
を酸、塩基若しくは還元剤で処理することにより得るこ
とのできるフラグメント、を含有することを特徴とする
ＩＬ−４産生抑制剤をも提供する。該莢膜多糖類は、例
えば湿熱滅菌処理または超音波処理などによって莢膜を
菌体から遊離させ、菌体を例えば遠心により除去した培
養上清を限外濾過（例えばミリポア社製限外濾過膜：分
画分子量１，０００）して高分子量側に残存する成分と
して得ることができる。また、莢膜成分のフラグメント
化による生成物は、莢膜成分の酸、塩基または還元剤に
よる処理によって行うことができる。また、還元剤によ
る処理は、培地に例えば硫酸鉄及びＥＤＴＡを加えるこ
とにより、培養しつつ行うこともできる。これらの細菌
の内、本発明においてとりわけ好ましいのは、クレブシ
エラ・オキシトカＴＮＭ３株細菌である。
クレブシエラ・ニューモニアの莢膜多糖類、またはこれ
を酸、塩基若しくは還元剤で処理することにより得るこ
とのできるフラグメント、を含有することを特徴とする
ＩＬ−４産生抑制剤をも提供する。該莢膜多糖類は、例
えば湿熱滅菌処理または超音波処理などによって莢膜を
菌体から遊離させ、菌体を例えば遠心により除去した培
養上清を限外濾過（例えばミリポア社製限外濾過膜：分
画分子量１，０００）して高分子量側に残存する成分と
して得ることができる。また、莢膜成分のフラグメント
化による生成物は、莢膜成分の酸、塩基または還元剤に
よる処理によって行うことができる。また、還元剤によ
る処理は、培地に例えば硫酸鉄及びＥＤＴＡを加えるこ
とにより、培養しつつ行うこともできる。これらの細菌
の内、本発明においてとりわけ好ましいのは、クレブシ
エラ・オキシトカＴＮＭ３株細菌である。
【０００８】本発明の莢膜成分を得るためのクレブシエ
ラ属細菌の培養は、一般的に次の方法に準じて行うこと
ができる。すなわち、培養の為の培地としては、クレブ
シエラ属細菌が生育でき、かつ、目的とする莢膜成分を
産生するのに必要な炭素源及び窒素源、無機塩類、並び
に微量栄養素を含有する培地であればよく、それ以外に
は特に限定されない。炭素源としては、例えばグルコー
ス、ラクトース、マルトース、キシロース、マンニトー
ル、サッカロース、ラムノース、アラビノース、トレハ
ロース、ラフィノース等が使用できる。窒素源として
は、例えば硝酸塩、アンモニウム塩、尿素等の合成化合
物、ポリペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキ
ス、肉エキス、脱脂大豆抽出物、ペプチド、アミノ酸等
の天然有機物が使用できる。無機塩類としては、例えば
リン酸塩、カリウム塩、硫酸塩、マグネシウム塩等が使
用できる。微量栄養素としては、例えば酵母エキス、各
種ビタミン類等が使用できる。培地には、更に必要に応
じ、カルシウム塩、マンガン塩などを添加しても良い。
ラ属細菌の培養は、一般的に次の方法に準じて行うこと
ができる。すなわち、培養の為の培地としては、クレブ
シエラ属細菌が生育でき、かつ、目的とする莢膜成分を
産生するのに必要な炭素源及び窒素源、無機塩類、並び
に微量栄養素を含有する培地であればよく、それ以外に
は特に限定されない。炭素源としては、例えばグルコー
ス、ラクトース、マルトース、キシロース、マンニトー
ル、サッカロース、ラムノース、アラビノース、トレハ
ロース、ラフィノース等が使用できる。窒素源として
は、例えば硝酸塩、アンモニウム塩、尿素等の合成化合
物、ポリペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキ
ス、肉エキス、脱脂大豆抽出物、ペプチド、アミノ酸等
の天然有機物が使用できる。無機塩類としては、例えば
リン酸塩、カリウム塩、硫酸塩、マグネシウム塩等が使
用できる。微量栄養素としては、例えば酵母エキス、各
種ビタミン類等が使用できる。培地には、更に必要に応
じ、カルシウム塩、マンガン塩などを添加しても良い。
【０００９】使用する培地は、固形培地でも液体培地で
も良い。液体培地を使用する場合には、静置培養でも良
いが、目的とする莢膜成分を高収率で得るためには、振
とう培養または通気攪拌培養の方がより好ましい。培養
時の培地ｐＨは、当該微生物の生育に適しかつ目的とす
る莢膜成分の産生を妨げないｐＨである限り、特に限定
されないが、通常適切なｐＨは４〜８である。培養温度
については、特に制限されないが、通常２０〜３５℃が
好ましい。培養時間は、目的とする莢膜成分の産生が最
大となるように適宜設定されるが、通常好ましいのは１
〜７日間である。
も良い。液体培地を使用する場合には、静置培養でも良
いが、目的とする莢膜成分を高収率で得るためには、振
とう培養または通気攪拌培養の方がより好ましい。培養
時の培地ｐＨは、当該微生物の生育に適しかつ目的とす
る莢膜成分の産生を妨げないｐＨである限り、特に限定
されないが、通常適切なｐＨは４〜８である。培養温度
については、特に制限されないが、通常２０〜３５℃が
好ましい。培養時間は、目的とする莢膜成分の産生が最
大となるように適宜設定されるが、通常好ましいのは１
〜７日間である。
【００１０】上記培養によって得られる培養物は、滅菌
後、精製せずにそのままＩＬ−４産生抑制剤として使用
することができる。しかしながら、菌体を除去し更には
目的とする莢膜成分を精製して使用するのが一層好まし
い。菌体の除去は、例えば湿熱滅菌により莢膜を菌体か
ら遊離させた後、遠心分離や濾過を用いて常法に従って
行うことができる。また、菌体除去後の培養液に、メタ
ノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等の
水混和性有機溶媒を加えて沈殿を生じさせ、次いで該沈
殿物を水に溶解させた後、水に対して透析を行い、その
後、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、減圧
乾燥、凍結乾燥などの方法により透析内液を乾燥させる
等の精製処理を行ってもよい。精製処理の為には、これ
らの方法の他、限外濾過（例えばミリポア社製の分画分
子量１，０００のものを濃縮に使用できる。）を行い、
得られる濃縮液を乾燥工程に付す方法や、更に、必要に
応じ、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーなどの各
種のカラムクロマトグラフィー、第４級アンモニウム塩
による沈殿または塩析、有機溶媒による沈殿等が用いら
れる。
後、精製せずにそのままＩＬ−４産生抑制剤として使用
することができる。しかしながら、菌体を除去し更には
目的とする莢膜成分を精製して使用するのが一層好まし
い。菌体の除去は、例えば湿熱滅菌により莢膜を菌体か
ら遊離させた後、遠心分離や濾過を用いて常法に従って
行うことができる。また、菌体除去後の培養液に、メタ
ノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等の
水混和性有機溶媒を加えて沈殿を生じさせ、次いで該沈
殿物を水に溶解させた後、水に対して透析を行い、その
後、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、減圧
乾燥、凍結乾燥などの方法により透析内液を乾燥させる
等の精製処理を行ってもよい。精製処理の為には、これ
らの方法の他、限外濾過（例えばミリポア社製の分画分
子量１，０００のものを濃縮に使用できる。）を行い、
得られる濃縮液を乾燥工程に付す方法や、更に、必要に
応じ、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーなどの各
種のカラムクロマトグラフィー、第４級アンモニウム塩
による沈殿または塩析、有機溶媒による沈殿等が用いら
れる。
【００１１】また、培養物自体または上記で精製した莢
膜成分に対し、所望により還元剤の添加や酸・塩基加水
分解、加圧下での加温や超音波処理など各種の処理を施
しても良い。酸・塩基加水分解については、培養操作完
了後の培養物にまたは上記で精製した莢膜成分に、硫
酸、塩酸等の酸や水酸化ナトリウム水溶液、アンモニア
水などのアルカリを添加しかつ条件を調節するのが好ま
しい。また、培養に際し、培養物中の莢膜成分産生量が
減少しない程度に、培地に還元剤を添加しても良い。こ
の場合に使用する還元剤としては、例えば硫酸第一鉄及
び／または塩化第一鉄と、エチレンジアミン四酢酸との
組み合わせが好ましい。
膜成分に対し、所望により還元剤の添加や酸・塩基加水
分解、加圧下での加温や超音波処理など各種の処理を施
しても良い。酸・塩基加水分解については、培養操作完
了後の培養物にまたは上記で精製した莢膜成分に、硫
酸、塩酸等の酸や水酸化ナトリウム水溶液、アンモニア
水などのアルカリを添加しかつ条件を調節するのが好ま
しい。また、培養に際し、培養物中の莢膜成分産生量が
減少しない程度に、培地に還元剤を添加しても良い。こ
の場合に使用する還元剤としては、例えば硫酸第一鉄及
び／または塩化第一鉄と、エチレンジアミン四酢酸との
組み合わせが好ましい。
【００１２】このようにして得られるクレブシエラ属細
菌の莢膜成分である多糖類、あるいはこれらを酸、塩基
若しくは還元剤で処理することにより得られるフラグメ
ントは、ＩＬ−４産生抑制作用を有している。このこと
は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球及び肥満細胞の分化、増殖
などの生体免疫反応にとって重要な作用を示し、また、
アレルギー反応に関係するＢ細胞でのＩｇＥ産生誘導作
用・肥満細胞の増殖促進作用をも示すＩＬ−４産生を抑
制するために使用でき、ＩＬ−４産生抑制型の抗アレル
ギー剤開発への利用が期待できる。また、ラット経口で
の急性毒性試験により、５ｇ／ｋｇの投与によっても死
亡例がなく、体重増加も対照群と同等であり、しかも、
外観や剖検上も全く異常は認められないことが明らかに
された。従ってこれらの成分の経口投与における安全性
は高いと考えられる。
菌の莢膜成分である多糖類、あるいはこれらを酸、塩基
若しくは還元剤で処理することにより得られるフラグメ
ントは、ＩＬ−４産生抑制作用を有している。このこと
は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球及び肥満細胞の分化、増殖
などの生体免疫反応にとって重要な作用を示し、また、
アレルギー反応に関係するＢ細胞でのＩｇＥ産生誘導作
用・肥満細胞の増殖促進作用をも示すＩＬ−４産生を抑
制するために使用でき、ＩＬ−４産生抑制型の抗アレル
ギー剤開発への利用が期待できる。また、ラット経口で
の急性毒性試験により、５ｇ／ｋｇの投与によっても死
亡例がなく、体重増加も対照群と同等であり、しかも、
外観や剖検上も全く異常は認められないことが明らかに
された。従ってこれらの成分の経口投与における安全性
は高いと考えられる。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を典型的な実施例に
より更に詳細に説明するが、後述する実施例により本発
明が限定されることを意図するものではない。
より更に詳細に説明するが、後述する実施例により本発
明が限定されることを意図するものではない。
【００１４】製造例：クレブシエラ属細菌の培養及び莢
膜成分の回収 ５００ｍＬ容の坂口フラスコに、表１に示す組成の培地
１００ｍＬを入れ、１２１℃で２０分間湿熱滅菌後、ク
レブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘ
ｙｔｏｃａ）ＴＮＭ３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６６９）
を試験管より１白金耳分植菌し、振とう数毎分１１０ス
トロークで２８℃にて３日間レシプロ振とうで前々培養
を行った。５００ｍＬ容の坂口フラスコに、表２に示す
組成の培地１００ｍＬを上記と同様の滅菌処理後、上記
の前々培養物１ｍＬを植菌し、振とう数毎分１１０スト
ロークで２８℃にて１日間レシプロ振とうで前培養を行
った。表３に示した組成の培地８Ｌを入れ１２１℃で２
０分間湿熱滅菌処理を行った１５Ｌ容ジャーファーメン
ターに、上記で得られた前培養物３００ｍＬを接種し、
２８℃の条件下で９６時間本培養を行った。なお、本培
養時の回転数は培養３６時間目までは２００ｒｐｍ、そ
れ以降９６時間目まで４００ｒｐｍとした。また、通気
量は４８時間までは１．５Ｌ／分、それ以降９６時間目
まで４Ｌ／分とした。
膜成分の回収 ５００ｍＬ容の坂口フラスコに、表１に示す組成の培地
１００ｍＬを入れ、１２１℃で２０分間湿熱滅菌後、ク
レブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘ
ｙｔｏｃａ）ＴＮＭ３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６６９）
を試験管より１白金耳分植菌し、振とう数毎分１１０ス
トロークで２８℃にて３日間レシプロ振とうで前々培養
を行った。５００ｍＬ容の坂口フラスコに、表２に示す
組成の培地１００ｍＬを上記と同様の滅菌処理後、上記
の前々培養物１ｍＬを植菌し、振とう数毎分１１０スト
ロークで２８℃にて１日間レシプロ振とうで前培養を行
った。表３に示した組成の培地８Ｌを入れ１２１℃で２
０分間湿熱滅菌処理を行った１５Ｌ容ジャーファーメン
ターに、上記で得られた前培養物３００ｍＬを接種し、
２８℃の条件下で９６時間本培養を行った。なお、本培
養時の回転数は培養３６時間目までは２００ｒｐｍ、そ
れ以降９６時間目まで４００ｒｐｍとした。また、通気
量は４８時間までは１．５Ｌ／分、それ以降９６時間目
まで４Ｌ／分とした。
【００１５】
【表１】 前々培養時の培地組成（重量％） グルコース ２％ ポリペプトン ０．１％ リン酸一水素カリウム ０．１％ 硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％ ビタミンＢ１ ０．０００５％ ビオチン ０．０００００６％ パントテン酸カルシウム ０．００１％ ニコチンアミド ０．０００５％ 炭酸カルシウム １％ ｐＨ ７
【００１６】
【表２】 前培養時の培地組成（重量％） グルコース ２％ ポリペプトン ０．１５％ リン酸一水素カリウム ０．１５％ 硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％ ビタミンＢ１ ０．０００５％ ビオチン ０．０００００６％ パントテン酸カルシウム ０．００１％ ニコチンアミド ０．０００５％ ｐＨ ７
【００１７】
【表３】 本培養時の培地組成（重量％） グルコース ４％ ポリペプトン ０．２％ リン酸一水素カリウム ０．１５％ 硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０５％ 硫酸第一鉄・７水和物 ０．００３％ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・２水和物 ０．１％ ビタミンＢ１ ０．０００５％ ビオチン ０．０００００６％ パントテン酸カルシウム ０．００１％ ニコチンアミド ０．０００５％ 炭酸カルシウム １．５％ ｐＨ ７
【００１８】本培養により得られた培養物を、１２１℃
で２０分間湿熱滅菌後、遠心分離により菌体を除去し、
アセトン沈殿を行った。７０％アセトン水溶液により沈
殿物を洗浄後、温風乾燥することにより、培地１Ｌ当り
莢膜多糖類からのフラグメントを主体とする成分１９ｇ
を得た。精製の為、得られた莢膜多糖類からのフラグメ
ントを主体とする成分２０ｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４．５）５００ｍＬに溶解し、１２１℃で１０分
間湿熱処理後、遠心分離により不溶成分を除去し、０．
４５μｍのメンブランフィルターを通過させた溶液につ
いて低分子成分などが除去されるまで、クロスフロー方
式の限外濾過を繰返した。限外濾過には、ミリポア社製
限外濾過膜（分画分子量：１０，０００）を用いた。限
外濾過膜を透過しなかった濃縮液に、ｐＨが１３になる
ように水酸化ナトリウムを添加し、室温で６時間攪拌し
た。そして、遠心分離により不溶成分を除去した上清に
ついて低分子成分等が除去されるまで、クロスフロー方
式の限外濾過を繰返した。先程と同じく、限外濾過に
は、ミリポア社製限外濾過膜（分画分子量：１０，００
０）を用いた。限外濾過膜を透過しなかった濃縮液を陽
イオン交換樹脂に通した後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶
液で中和し、０．２μｍのメンブランフィルターを通過
した溶液を凍結乾燥することにより、莢膜多糖類からの
フラグメントを主体とする成分の精製物８ｇを得た。
で２０分間湿熱滅菌後、遠心分離により菌体を除去し、
アセトン沈殿を行った。７０％アセトン水溶液により沈
殿物を洗浄後、温風乾燥することにより、培地１Ｌ当り
莢膜多糖類からのフラグメントを主体とする成分１９ｇ
を得た。精製の為、得られた莢膜多糖類からのフラグメ
ントを主体とする成分２０ｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４．５）５００ｍＬに溶解し、１２１℃で１０分
間湿熱処理後、遠心分離により不溶成分を除去し、０．
４５μｍのメンブランフィルターを通過させた溶液につ
いて低分子成分などが除去されるまで、クロスフロー方
式の限外濾過を繰返した。限外濾過には、ミリポア社製
限外濾過膜（分画分子量：１０，０００）を用いた。限
外濾過膜を透過しなかった濃縮液に、ｐＨが１３になる
ように水酸化ナトリウムを添加し、室温で６時間攪拌し
た。そして、遠心分離により不溶成分を除去した上清に
ついて低分子成分等が除去されるまで、クロスフロー方
式の限外濾過を繰返した。先程と同じく、限外濾過に
は、ミリポア社製限外濾過膜（分画分子量：１０，００
０）を用いた。限外濾過膜を透過しなかった濃縮液を陽
イオン交換樹脂に通した後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶
液で中和し、０．２μｍのメンブランフィルターを通過
した溶液を凍結乾燥することにより、莢膜多糖類からの
フラグメントを主体とする成分の精製物８ｇを得た。
【００１９】実施例：ＩＬ−４産生抑制作用評価 ８週齢の雄性マウス（ＢＤＦ１、３匹／群）を用い、抗
原としてキーホルリンペットヘモシアニンをトリニトロ
ベンゼンスルホン酸と反応させて調製したＴＮＰ−ＫＬ
Ｈ１０μｇと、アジュバントとしての水酸化アルミニウ
ム１ｍｇとの混合物を含有する生理食塩水０．２ｍＬ
を、腹腔内に注射し感作した。製造例で得た莢膜多糖類
からのフラグメントを主体とする成分の精製物を生理食
塩水に溶解させ、上記ＢＤＦ１マウスに対し投与量が１
００ｍｇ／ｋｇになるように調整した溶液１５０μＬ
を、感作前日から感作２日後までの計４回背部皮下に投
与した。対照群には生理食塩水のみを投与した。６日後
に脾臓細胞を取り出し、２４穴プレートの各ウエルに
６，０００，０００個／ｍＬになるよう調整した脾臓細
胞液４００μＬを分注し、各々のウエルに濃度が５０μ
ｇ／ｍＬになるようにＴＮＰ−ＫＬＨを添加した後、３
７℃，５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの条件下で培養した。
培養２４時間目に培養上清を回収し、ＩＬ−４アッセイ
キット（アマシャム社製）を用いて、ＩＬ−４産生量を
測定した。結果を表４に示す。
原としてキーホルリンペットヘモシアニンをトリニトロ
ベンゼンスルホン酸と反応させて調製したＴＮＰ−ＫＬ
Ｈ１０μｇと、アジュバントとしての水酸化アルミニウ
ム１ｍｇとの混合物を含有する生理食塩水０．２ｍＬ
を、腹腔内に注射し感作した。製造例で得た莢膜多糖類
からのフラグメントを主体とする成分の精製物を生理食
塩水に溶解させ、上記ＢＤＦ１マウスに対し投与量が１
００ｍｇ／ｋｇになるように調整した溶液１５０μＬ
を、感作前日から感作２日後までの計４回背部皮下に投
与した。対照群には生理食塩水のみを投与した。６日後
に脾臓細胞を取り出し、２４穴プレートの各ウエルに
６，０００，０００個／ｍＬになるよう調整した脾臓細
胞液４００μＬを分注し、各々のウエルに濃度が５０μ
ｇ／ｍＬになるようにＴＮＰ−ＫＬＨを添加した後、３
７℃，５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの条件下で培養した。
培養２４時間目に培養上清を回収し、ＩＬ−４アッセイ
キット（アマシャム社製）を用いて、ＩＬ−４産生量を
測定した。結果を表４に示す。
【００２０】
【表４】 ───────────────────────────────── ＩＬ−４産生量（ｐｇ／ｍＬ） ───────────────────────────────── 被検試料 対照 抑制率（％） ３９ １１２ ６５ ───────────────────────────────── 表４から明らかなように、莢膜多糖類からのフラグメン
トを主体とする成分は、ＩＬ−４産生抑制作用を有す
る。
トを主体とする成分は、ＩＬ−４産生抑制作用を有す
る。
Claims (3)
- 【請求項１】 クレブシエラ・オキシトカ又はクレブシ
エラ・ニューモニアの莢膜成分またはこれを酸、塩基若
しくは還元剤で処理することにより得ることのできる成
分を含有することを特徴とする、ＩＬ−４産生抑制剤。 - 【請求項２】 クレブシエラ・オキシトカ又はクレブシ
エラ・ニューモニアの莢膜多糖類またはこれを酸、塩基
若しくは還元剤で処理することにより得ることのできる
フラグメントを含有することを特徴とする、ＩＬ−４産
生抑制剤。 - 【請求項３】 請求項２記載の多糖類の構成糖およびそ
のモル比が、 であることを特徴とするＩＬ−４産生抑制剤。〔但し上
記式中、Ｒｈａはラムノース残基、Ｇｌｃはグルコース
残基、Ｇａｌはガラクトース残基、ＧｌｃＵＡはグルク
ロン酸残基を表し、小括弧に隣接する数字は各残基にお
けるグリコシド結合の位置を表す。〕
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10052747A JPH11228427A (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | Ｉｌ−４産生抑制剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10052747A JPH11228427A (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | Ｉｌ−４産生抑制剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11228427A true JPH11228427A (ja) | 1999-08-24 |
Family
ID=12923517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10052747A Pending JPH11228427A (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | Ｉｌ−４産生抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11228427A (ja) |
-
1998
- 1998-02-17 JP JP10052747A patent/JPH11228427A/ja active Pending
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