JP2797295B2 - 新規微生物および新規微生物を使用するメナキノン−４の製造法 - Google Patents
新規微生物および新規微生物を使用するメナキノン−４の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規微生物およびこの新規微生物を使用し
たメナキノン−４の製造法に関する。 メナキノン−４は、医薬用のビタミンK2として知られ
ており、血液の凝固を促進する脂溶性のビタミンで抗出
血性作用を有する重要な生理活性物質である。 〔従来の技術，発明が解決しようとする問題点〕 メナキノン−４の製造法としては、合成法および動植
物組織からの抽出法が知られている。しかしながら、前
者は、原料の人手が困難なうえにコスト高であり、一
方、後者は、供給量が限られ、さらに、抽出操作が煩雑
なことも加わってコスト高を免れず、いずれも実用に適
している方法とはいい難い。 これに対して、メナキノン−４を多量に生成，蓄積す
る微生物および／または生成させる条件を見出すことが
できれば、メナキノン−４を大量に生産できるので、非
常に有利である。 本発明は、前記の事情に鑑みてなされたもので、新規
微生物の取得および微生物によるメナキノン−４の効率
のよい生産を目的とするものである。 〔問題を解決するための手段、作用〕 前記の目的を達成すべく、本発明者が鋭意検討を重ね
た結果、メナキノン−４を生産しない菌株を親株として
変異処理を行い、菌体内および／または菌体外にメナキ
ノン−４を生産する菌株を得ることに成功してさきに特
許出願した（特開昭61−216696および特願昭61−4184
0）。その後、このメナキノン−４生産菌株についてさ
らに研究を重ねた結果、フラボバクテリウム属に属しス
ルホナミド耐性を有する新規な変異株を得、この新規変
異株がより優れたメナキノン−４生産能を有することを
見出し、本発明に到達した。 すなわち、本発明は、メナキノン−４生産能を有する
フラボバクテリウム アクアタイルCD−31およびその変
異株であり、この新規微生物を培地に培養し，菌体およ
び培養液中のそれぞれにメナキノン−４を蓄積させ、該
菌体および培養液中のそれぞれから蓄積されたメナキノ
ン−４を採取することを特徴とするメナキノン−４の製
造法である。 本発明の新規微生物は、フラボバクテリウム属に属
し、メナキノン−４生産能を有する微生物に変異処理を
施して、スルホナミド耐性変異株を誘導することによっ
て得ることができる。 変異処理としては、通常の変異処理法、たとえば、紫
外線照射（UV処理）ならびにＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG），エチルメタンサル
ファネート（EMS）および亜硝酸などの化合物をそれぞ
れ使用する化学処理などのそれぞれを施す常法が採用さ
れる。 本発明の新規微生物は、スルファグアニジン（sulfag
uanidine），スルファピリジン（sulfapyridine）また
はスルファチアゾール（sulfathiazole）などのスルホ
ナミドに対して耐性を有する。 この新規微生物の具体例としては、メナキノン−４生
産能を有するフラボバクテリウム アクアタイル（Flav
obacterium aquatile）K3−15（微工研菌寄 第8116
号）から誘導されたフラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）CD−31（微工研菌寄 第9
194号）が挙げられる。 ここで使用されるフラボバクテリウム アクアタイル
K3−15は自然界より分離されたフラボバクテリウム ア
クアタイルNo.238−７（微工研菌寄 第8113号）（この
菌学的性質は、「ビタミン」第58巻,P409〜419,（198
4）に記載されている）を親株として、変異処理を３回
行って得られたものである。 以下に、フラボバクテリウム アクアタイルK3−15を
得る方法を説明する。 すなわち、液体培地中で予め生育増殖させたフラボバ
クテリウム アクアタイルNo.238−７の菌体をNTGを含
むリン酸緩衝液（pH7.0）中に懸濁させ、これを振盪し
て変異処理に付す。この菌体をリン酸緩衝液で洗浄した
後、同様な緩衝液中に懸濁させる。この菌体から、１−
ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む寒天培地を使用し
て、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸耐性株 フラボバ
クテリウム アクアタイルHNA 250−15（微工研菌寄
第8114号）を得た。 さらに、フラボバクテリウム アクアタイルHNA250−
15を液体培地で予め生育増殖させ、リン酸緩衝液（pH7.
0）中に懸濁させ、UV処理を行った。ウスニン酸を含む
寒天培地を使用して、ウスニン酸耐性株USN−２（微工
研菌寄 第8115号）を得た。 さらにフラボバクテリウム アクアタイルUSN−２を
液体培地で生育増殖させ、リン酸緩衝液（pH7.0）中に
懸濁させ、UV処理を行った。メナジオンを含む寒天培地
を使用して、メナジオン耐性株K3−15（微工研菌寄 第
8116号）を得た。 このようにして得られたフラボバクテリウム アクア
タイルK3−15からフラボバクテリウム アクアタイルCD
−31が得られる。 このフラボバクテリウム アクアタイルCD−31の菌学
的性質は、メナキノン−４生産性およびスルホナミド耐
性を有する点で大きく異なる他はフラボバウテリウム
アクアタイルNo.238−７と実質的に異なる処はない。 このフラボバクテリウム アクアタイルCD−31は、生
成したメナキノン−４を菌体内に蓄積するとともに菌体
外へ排出する。 なお、この菌株の培養に際して、培地または、培養液
に、界面活性剤を添加することにより、メナキノン−４
の菌体外への排出量を増加させることができる。界面活
性剤としては、非イオン界面活性剤が好ましい。この界
面活性剤の代表例としては（商品名として表示する）、
ユニオン（高級アルコール）、エマルゲン（ポリオキシ
エチレンオレイルエーテル）、ブラウノン（ノニルフェ
ニル，ヒマシ油）、レオドール（ポリオキシエチレン
ソルビタン，テトラオレイン酸ポリオキシエチレレ
ン）、リカノン（ポリオキシエチレン オレイルエーテ
ル）、シルバン（ソルビタン モノパルミテート）、ア
ミゼット（ヤシ脂肪酸 モノエタノールアミド）および
ニューコール（特殊ノニオン）などがある。これらの界
面活性剤は、培地または培養液に添加されるが、培地ま
たは培養初期の培養液に添加することが好ましい。 培地または培養液の界面活性剤の濃度は0.01wt/v％
（以下％と記す）乃至生育抑制濃度の範囲内であればよ
く、使用する菌株、培養液の菌体濃度および界面活性剤
の種類などにより適宜選択されるが、通常は、0.01〜１
％程度、好ましくは0.01〜0.3％程度とされる。 この微生物を培養するにあたって用いられる栄養培地
は、炭素源、窒素源および無機塩などを含有する通常の
微生物培養用の培地が用いられる。 この炭素源としては、これらの微生物が資化しうるも
のであればよく、グルコース，フラクトース，シェクロ
ース，マルトース，廃糖蜜、でんぷん、でんぷん加水分
解物などの炭水化物、グリセロール、ソルビトールなど
の糖アルコール、アスパラギン酸，グルタミン酸，リジ
ン，アラニン，グリシン，プロリン，メチオニンなどの
アミノ酸、乳酸，ピルビン酸，酢酸，リンゴ酸，コハク
酸，フマール酸，クエン酸，プロピオン酸，脂肪酸など
の有機酸類，エタノール，プロパノール，ブタノールな
どのアルコール類を単独または組み合わせて使用するこ
とができる。これらのうちグリセロールが特に好まし
い。 窒素源としては、硫酸アンモニウム，尿素，硝酸アン
モニウム，リン酸アンモニウム，ペプトン，肉エキスな
どが用いられる。これらのうちポリペプトンが特に好ま
しい。 無機塩としては、リン酸塩，マグネシウム塩，鉄塩，
その他必要に応じて微量金属塩が用いられ、さらに、ア
ミノ酸，核酸，ビタミン，酵母エキス，麦芽エキスなど
の生育促進物質も使用される。一般に、K2HPO4,NAClお
よび酵母エキスをそれぞれ添加した場合には、メナキノ
ン−４の生成量は増大される。また、使用する菌株が栄
養要求性を示す場合には、その要求性物質を培地に添加
する。 さらに、これらの微生物の培養用いられる前記の培地
に、イソペンテニルアルコール，ジメチルアリルアルコ
ール，ゲラニオール，ファルネソールなどのアルコール
類およびシキミ酸,D−サクシニル安息香酸,L−チロシ
ン，パラヒドロキシフェニルピルビン酸，セダーウッド
オイル，α−ピネン，ジフェニルアミンなどを添加する
ことにより、これらを添加しない場合に比してメナキノ
ン−４の生産量が増大する傾向にある。 本発明で使用される微生物の培養は、pH5〜8.5、培養
温度20〜40℃で１〜10日間好気的に振盪培養または通気
培養することによって行われる。 メナキノン−４は菌体内に蓄積され、さらに、菌体外
に排出されるので、培養液を延伸分離または濾過して培
養上澄液と菌体とを分離した後、菌体および／または培
養上澄液から抽出、単離される。 菌体からメナキノン−４を単離するには、常法による
ことができる。すなわち、たとえば、生菌体または乾燥
菌体をアセトン中に懸濁し、60℃で２時間抽出する。こ
の抽出物を濃縮後、エーテルで抽出し、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーを行い、メナキノン−４画分を分
取し、これを濃縮してメナキノン−４が得られる。 培養上澄液中からメナキノン−４を単離するには、常
法によることができる。すなわち、たとえば、培養上澄
液をそのまま、あるいは、濃縮した後、たとえば、ヘキ
サン，ベンゼン，およびエチルエーテルなどの水に不溶
な有機溶媒を加え、有機溶媒層へナメキソン−４を転溶
させ、メナキノン−４抽出物を濃縮後、エーテルに溶解
し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、メナ
キノン−４画分を分取し、これを濃縮してメナキノン−
４が得られる。 メナキノン−４の同定は、高速液体クロマトグラフィ
ー，薄層クロマトグラフィー、UVスペクトル,IRスペク
トル，マススペクトルなどによって行った。また、メナ
キノン−４の定量法としては高速液体クロマトグラフィ
ーを使用した。 〔実施例〕 以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明す
る。 実施例１ （Ａ）フラボバクテリウム アクアタイルCD−31の取得 ペプトン−グリセロール液体培地（M31培地）（グリ
セロール15g,酵母エキス1g,KH2PO4 3g,NaCl 2g,MgSO4・
7H2O 0.2gおよび純水1000ml,pH7.0）で30℃ 24時間生
育させたフラボバクテリウム アクアタイルK3−15をNT
G 100μg/mlを含む0.Mリン酸緩衝液（pH7.0）中に108個
/mlとなるように懸濁し、30℃30分間振盪した。その
後、遠心分離で集菌した菌体を0.1Mリン酸緩衝液で洗浄
し同様王な緩衝液中に106個／となるように懸濁した。
スルファグアニジン3.5g/mlを含むペプトン−グリセロ
ール寒天培地（前記ペプトン−グリセロール液体培地に
寒天20g/を添加したもの）上に前記の懸濁液0.1mlを
塗布し、出現したコロニーをスルファグアニジン耐性株
として採取した。これらの耐性株の中からメナキノン−
４を多量生産するフラボバクテリウム アクアタイルCD
−31（微工研菌寄 第9194号）を得た。 （Ｂ）メナキノン−４の製造 グリセロール60g/，ポリペプトン23g/，酵母エキ
ス3g/,K2HPO4 7g/,NaCl 5g/,MgSO・7H2O 0.8g/
を含む接地100mlを１容三角フラスコに入れ、120℃で
20分間加熱殺菌を行った。 前記と同様な培地を用いて30℃で１日間前培養（試験
管培養）して得られたフラボバクテリウム アクアタイ
ルCD−31の培養液を、培地に対して１容量％接種し、培
養温度30℃で回転振盪培養を行った。培養開始８日目に
培養を終了した。培養液のpHは、4.95であり、610nmの
吸光度（0.D610nm）は、15.0であった。 培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメ
ナキノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に、
46mg/および菌体中には培養液１あたり63mg/のメ
ナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産性
は、109mg/であった。 実施例２ 本培養の培地中に、セダーウッドオイルを0.2％加え
た以外は、実施例１と同様にして培養した。 培養開始８日目に培養を終了した。培養液のpHは4.85
であり、610nmの吸光度（0.D610nm）は、17.5であっ
た。 培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメ
ナキノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に43
mg/，および菌体中には培養液１あたり89mg/のメ
ナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産性
は、132mg/であった。 実施例３ 本培養の培地中に、リカノンを0.1％加えた以外は、
実施例１と同様にして培養した。 培養開始８日目に培養を終了した。培養液のpHは6.7
であり、610nmの吸光度（0.D610nm）は、7.8であった。 培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメ
ナキノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に94
mg/，および菌体中には培養液１あたり45mg/のメ
ナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産性
は、139mg/であった。 実施例４ 本培養の培地中に、セダーウッドオイルおよびリカノ
ンをそれぞれ0.2％および0.1％加えた以外は、実施例１
と同様にして培養した。 培養開始８日目に培養を終了した。培養液のpHは6.4
であり、610nmの吸光度（0.D610nm）は、9.6であった。 培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメ
ナキノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に13
2mg/，および菌体中には培養液１あたり71mg/の
メナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産性
は、203mg/であった。 〔発明の効果〕 本発明の新規微生物は、メナキノン−４の生産性が高
く、この新規微生物を使用する本発明のメナキノン−４
の製造法によってメナキノン−４を容易にしかも効率良
く製造することができる。
たメナキノン−４の製造法に関する。 メナキノン−４は、医薬用のビタミンK2として知られ
ており、血液の凝固を促進する脂溶性のビタミンで抗出
血性作用を有する重要な生理活性物質である。 〔従来の技術，発明が解決しようとする問題点〕 メナキノン−４の製造法としては、合成法および動植
物組織からの抽出法が知られている。しかしながら、前
者は、原料の人手が困難なうえにコスト高であり、一
方、後者は、供給量が限られ、さらに、抽出操作が煩雑
なことも加わってコスト高を免れず、いずれも実用に適
している方法とはいい難い。 これに対して、メナキノン−４を多量に生成，蓄積す
る微生物および／または生成させる条件を見出すことが
できれば、メナキノン−４を大量に生産できるので、非
常に有利である。 本発明は、前記の事情に鑑みてなされたもので、新規
微生物の取得および微生物によるメナキノン−４の効率
のよい生産を目的とするものである。 〔問題を解決するための手段、作用〕 前記の目的を達成すべく、本発明者が鋭意検討を重ね
た結果、メナキノン−４を生産しない菌株を親株として
変異処理を行い、菌体内および／または菌体外にメナキ
ノン−４を生産する菌株を得ることに成功してさきに特
許出願した（特開昭61−216696および特願昭61−4184
0）。その後、このメナキノン−４生産菌株についてさ
らに研究を重ねた結果、フラボバクテリウム属に属しス
ルホナミド耐性を有する新規な変異株を得、この新規変
異株がより優れたメナキノン−４生産能を有することを
見出し、本発明に到達した。 すなわち、本発明は、メナキノン−４生産能を有する
フラボバクテリウム アクアタイルCD−31およびその変
異株であり、この新規微生物を培地に培養し，菌体およ
び培養液中のそれぞれにメナキノン−４を蓄積させ、該
菌体および培養液中のそれぞれから蓄積されたメナキノ
ン−４を採取することを特徴とするメナキノン−４の製
造法である。 本発明の新規微生物は、フラボバクテリウム属に属
し、メナキノン−４生産能を有する微生物に変異処理を
施して、スルホナミド耐性変異株を誘導することによっ
て得ることができる。 変異処理としては、通常の変異処理法、たとえば、紫
外線照射（UV処理）ならびにＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG），エチルメタンサル
ファネート（EMS）および亜硝酸などの化合物をそれぞ
れ使用する化学処理などのそれぞれを施す常法が採用さ
れる。 本発明の新規微生物は、スルファグアニジン（sulfag
uanidine），スルファピリジン（sulfapyridine）また
はスルファチアゾール（sulfathiazole）などのスルホ
ナミドに対して耐性を有する。 この新規微生物の具体例としては、メナキノン−４生
産能を有するフラボバクテリウム アクアタイル（Flav
obacterium aquatile）K3−15（微工研菌寄 第8116
号）から誘導されたフラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）CD−31（微工研菌寄 第9
194号）が挙げられる。 ここで使用されるフラボバクテリウム アクアタイル
K3−15は自然界より分離されたフラボバクテリウム ア
クアタイルNo.238−７（微工研菌寄 第8113号）（この
菌学的性質は、「ビタミン」第58巻,P409〜419,（198
4）に記載されている）を親株として、変異処理を３回
行って得られたものである。 以下に、フラボバクテリウム アクアタイルK3−15を
得る方法を説明する。 すなわち、液体培地中で予め生育増殖させたフラボバ
クテリウム アクアタイルNo.238−７の菌体をNTGを含
むリン酸緩衝液（pH7.0）中に懸濁させ、これを振盪し
て変異処理に付す。この菌体をリン酸緩衝液で洗浄した
後、同様な緩衝液中に懸濁させる。この菌体から、１−
ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む寒天培地を使用し
て、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸耐性株 フラボバ
クテリウム アクアタイルHNA 250−15（微工研菌寄
第8114号）を得た。 さらに、フラボバクテリウム アクアタイルHNA250−
15を液体培地で予め生育増殖させ、リン酸緩衝液（pH7.
0）中に懸濁させ、UV処理を行った。ウスニン酸を含む
寒天培地を使用して、ウスニン酸耐性株USN−２（微工
研菌寄 第8115号）を得た。 さらにフラボバクテリウム アクアタイルUSN−２を
液体培地で生育増殖させ、リン酸緩衝液（pH7.0）中に
懸濁させ、UV処理を行った。メナジオンを含む寒天培地
を使用して、メナジオン耐性株K3−15（微工研菌寄 第
8116号）を得た。 このようにして得られたフラボバクテリウム アクア
タイルK3−15からフラボバクテリウム アクアタイルCD
−31が得られる。 このフラボバクテリウム アクアタイルCD−31の菌学
的性質は、メナキノン−４生産性およびスルホナミド耐
性を有する点で大きく異なる他はフラボバウテリウム
アクアタイルNo.238−７と実質的に異なる処はない。 このフラボバクテリウム アクアタイルCD−31は、生
成したメナキノン−４を菌体内に蓄積するとともに菌体
外へ排出する。 なお、この菌株の培養に際して、培地または、培養液
に、界面活性剤を添加することにより、メナキノン−４
の菌体外への排出量を増加させることができる。界面活
性剤としては、非イオン界面活性剤が好ましい。この界
面活性剤の代表例としては（商品名として表示する）、
ユニオン（高級アルコール）、エマルゲン（ポリオキシ
エチレンオレイルエーテル）、ブラウノン（ノニルフェ
ニル，ヒマシ油）、レオドール（ポリオキシエチレン
ソルビタン，テトラオレイン酸ポリオキシエチレレ
ン）、リカノン（ポリオキシエチレン オレイルエーテ
ル）、シルバン（ソルビタン モノパルミテート）、ア
ミゼット（ヤシ脂肪酸 モノエタノールアミド）および
ニューコール（特殊ノニオン）などがある。これらの界
面活性剤は、培地または培養液に添加されるが、培地ま
たは培養初期の培養液に添加することが好ましい。 培地または培養液の界面活性剤の濃度は0.01wt/v％
（以下％と記す）乃至生育抑制濃度の範囲内であればよ
く、使用する菌株、培養液の菌体濃度および界面活性剤
の種類などにより適宜選択されるが、通常は、0.01〜１
％程度、好ましくは0.01〜0.3％程度とされる。 この微生物を培養するにあたって用いられる栄養培地
は、炭素源、窒素源および無機塩などを含有する通常の
微生物培養用の培地が用いられる。 この炭素源としては、これらの微生物が資化しうるも
のであればよく、グルコース，フラクトース，シェクロ
ース，マルトース，廃糖蜜、でんぷん、でんぷん加水分
解物などの炭水化物、グリセロール、ソルビトールなど
の糖アルコール、アスパラギン酸，グルタミン酸，リジ
ン，アラニン，グリシン，プロリン，メチオニンなどの
アミノ酸、乳酸，ピルビン酸，酢酸，リンゴ酸，コハク
酸，フマール酸，クエン酸，プロピオン酸，脂肪酸など
の有機酸類，エタノール，プロパノール，ブタノールな
どのアルコール類を単独または組み合わせて使用するこ
とができる。これらのうちグリセロールが特に好まし
い。 窒素源としては、硫酸アンモニウム，尿素，硝酸アン
モニウム，リン酸アンモニウム，ペプトン，肉エキスな
どが用いられる。これらのうちポリペプトンが特に好ま
しい。 無機塩としては、リン酸塩，マグネシウム塩，鉄塩，
その他必要に応じて微量金属塩が用いられ、さらに、ア
ミノ酸，核酸，ビタミン，酵母エキス，麦芽エキスなど
の生育促進物質も使用される。一般に、K2HPO4,NAClお
よび酵母エキスをそれぞれ添加した場合には、メナキノ
ン−４の生成量は増大される。また、使用する菌株が栄
養要求性を示す場合には、その要求性物質を培地に添加
する。 さらに、これらの微生物の培養用いられる前記の培地
に、イソペンテニルアルコール，ジメチルアリルアルコ
ール，ゲラニオール，ファルネソールなどのアルコール
類およびシキミ酸,D−サクシニル安息香酸,L−チロシ
ン，パラヒドロキシフェニルピルビン酸，セダーウッド
オイル，α−ピネン，ジフェニルアミンなどを添加する
ことにより、これらを添加しない場合に比してメナキノ
ン−４の生産量が増大する傾向にある。 本発明で使用される微生物の培養は、pH5〜8.5、培養
温度20〜40℃で１〜10日間好気的に振盪培養または通気
培養することによって行われる。 メナキノン−４は菌体内に蓄積され、さらに、菌体外
に排出されるので、培養液を延伸分離または濾過して培
養上澄液と菌体とを分離した後、菌体および／または培
養上澄液から抽出、単離される。 菌体からメナキノン−４を単離するには、常法による
ことができる。すなわち、たとえば、生菌体または乾燥
菌体をアセトン中に懸濁し、60℃で２時間抽出する。こ
の抽出物を濃縮後、エーテルで抽出し、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーを行い、メナキノン−４画分を分
取し、これを濃縮してメナキノン−４が得られる。 培養上澄液中からメナキノン−４を単離するには、常
法によることができる。すなわち、たとえば、培養上澄
液をそのまま、あるいは、濃縮した後、たとえば、ヘキ
サン，ベンゼン，およびエチルエーテルなどの水に不溶
な有機溶媒を加え、有機溶媒層へナメキソン−４を転溶
させ、メナキノン−４抽出物を濃縮後、エーテルに溶解
し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、メナ
キノン−４画分を分取し、これを濃縮してメナキノン−
４が得られる。 メナキノン−４の同定は、高速液体クロマトグラフィ
ー，薄層クロマトグラフィー、UVスペクトル,IRスペク
トル，マススペクトルなどによって行った。また、メナ
キノン−４の定量法としては高速液体クロマトグラフィ
ーを使用した。 〔実施例〕 以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明す
る。 実施例１ （Ａ）フラボバクテリウム アクアタイルCD−31の取得 ペプトン−グリセロール液体培地（M31培地）（グリ
セロール15g,酵母エキス1g,KH2PO4 3g,NaCl 2g,MgSO4・
7H2O 0.2gおよび純水1000ml,pH7.0）で30℃ 24時間生
育させたフラボバクテリウム アクアタイルK3−15をNT
G 100μg/mlを含む0.Mリン酸緩衝液（pH7.0）中に108個
/mlとなるように懸濁し、30℃30分間振盪した。その
後、遠心分離で集菌した菌体を0.1Mリン酸緩衝液で洗浄
し同様王な緩衝液中に106個／となるように懸濁した。
スルファグアニジン3.5g/mlを含むペプトン−グリセロ
ール寒天培地（前記ペプトン−グリセロール液体培地に
寒天20g/を添加したもの）上に前記の懸濁液0.1mlを
塗布し、出現したコロニーをスルファグアニジン耐性株
として採取した。これらの耐性株の中からメナキノン−
４を多量生産するフラボバクテリウム アクアタイルCD
−31（微工研菌寄 第9194号）を得た。 （Ｂ）メナキノン−４の製造 グリセロール60g/，ポリペプトン23g/，酵母エキ
ス3g/,K2HPO4 7g/,NaCl 5g/,MgSO・7H2O 0.8g/
を含む接地100mlを１容三角フラスコに入れ、120℃で
20分間加熱殺菌を行った。 前記と同様な培地を用いて30℃で１日間前培養（試験
管培養）して得られたフラボバクテリウム アクアタイ
ルCD−31の培養液を、培地に対して１容量％接種し、培
養温度30℃で回転振盪培養を行った。培養開始８日目に
培養を終了した。培養液のpHは、4.95であり、610nmの
吸光度（0.D610nm）は、15.0であった。 培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメ
ナキノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に、
46mg/および菌体中には培養液１あたり63mg/のメ
ナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産性
は、109mg/であった。 実施例２ 本培養の培地中に、セダーウッドオイルを0.2％加え
た以外は、実施例１と同様にして培養した。 培養開始８日目に培養を終了した。培養液のpHは4.85
であり、610nmの吸光度（0.D610nm）は、17.5であっ
た。 培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメ
ナキノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に43
mg/，および菌体中には培養液１あたり89mg/のメ
ナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産性
は、132mg/であった。 実施例３ 本培養の培地中に、リカノンを0.1％加えた以外は、
実施例１と同様にして培養した。 培養開始８日目に培養を終了した。培養液のpHは6.7
であり、610nmの吸光度（0.D610nm）は、7.8であった。 培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメ
ナキノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に94
mg/，および菌体中には培養液１あたり45mg/のメ
ナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産性
は、139mg/であった。 実施例４ 本培養の培地中に、セダーウッドオイルおよびリカノ
ンをそれぞれ0.2％および0.1％加えた以外は、実施例１
と同様にして培養した。 培養開始８日目に培養を終了した。培養液のpHは6.4
であり、610nmの吸光度（0.D610nm）は、9.6であった。 培養液を遠心分離し、培養上澄液中および菌体中のメ
ナキノン−４含量を測定したところ、培養上澄液中に13
2mg/，および菌体中には培養液１あたり71mg/の
メナキノン−４を含んでおり、メナキノン−４の生産性
は、203mg/であった。 〔発明の効果〕 本発明の新規微生物は、メナキノン−４の生産性が高
く、この新規微生物を使用する本発明のメナキノン−４
の製造法によってメナキノン−４を容易にしかも効率良
く製造することができる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:20）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．メナキノン−４生産能を有するフラボバクテリウム
アクアタイルCD−31およびその変異株。 ２．メナキノン−４生産能を有するフラボバクテリウム
アクアタイルCD−31および／またはその変異株を培地
に培養し、菌体および培養液中のそれぞれにメナキノン
−４を蓄積させ、該菌体および培養液中のそれぞれから
蓄積されたメナキノン−４を採取することを特徴とする
メナキノン−４の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62029722A JP2797295B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | 新規微生物および新規微生物を使用するメナキノン−４の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62029722A JP2797295B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | 新規微生物および新規微生物を使用するメナキノン−４の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63198993A JPS63198993A (ja) | 1988-08-17 |
| JP2797295B2 true JP2797295B2 (ja) | 1998-09-17 |
Family
ID=12284003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62029722A Expired - Lifetime JP2797295B2 (ja) | 1987-02-13 | 1987-02-13 | 新規微生物および新規微生物を使用するメナキノン−４の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2797295B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2906816B1 (fr) * | 2006-10-04 | 2012-04-06 | Gervais Danone Sa | Variants de bacteries lactiques utiles pour produire la vitamine k2 et leurs applications a la preparation de produits alimentaires |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61216696A (ja) * | 1985-03-19 | 1986-09-26 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | メナキノン−４の製造法 |
-
1987
- 1987-02-13 JP JP62029722A patent/JP2797295B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61216696A (ja) * | 1985-03-19 | 1986-09-26 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | メナキノン−４の製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63198993A (ja) | 1988-08-17 |
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