JPH1059867A - 血液凝固第ｖｉｉ因子の活性化方法及び該方法に基づく活性化血液凝固第ｖｉｉ因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 陰イオン交換樹脂上での血液凝固第ＶＩＩ因
子の活性化血液凝固第ＶＩＩ因子への活性化方法及び該
活性化方法に基づく活性化血液凝固第ＶＩＩ因子の製造
方法を提供する。 【構成】 血液凝固第ＶＩＩ因子含有溶液を陰イオン交
換樹脂に展開し吸着させ、副産物が産生されないように
血液凝固第ＶＩＩ因子／活性化血液凝固第ＶＩＩ因子混
合溶液として溶出し、その後溶出液中の未活性化血液凝
固第ＶＩＩ因子を液相中で熟成し活性化体とし、所望の
活性化血液凝固第ＶＩＩ因子を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本願発明は、血漿蛋白質の分野に
関する。より詳細には、活性化血液凝固第ＶＩＩ因子
(以下、ＦＶＩＩaと称することがある)の製造方法に関
し、ＦＶＩＩを含有する血漿画分または遺伝子組換え技
術に基づいて作出されたＦＶＩＩ産生細胞培養上清か
ら、陰イオン交換クロマトグラフィーによる処理及びそ
れに連続した液相中での活性化によって、夾雑蛋白質含
量が低減されたＦＶＩＩaを、極めて簡便に生産し得る
ＦＶＩＩaの製造方法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】ＦＶ
ＩＩはビタミンＫ依存性の血液凝固因子であり、外因系
血液凝固の開始因子であることは広く知られている。他
のビタミンＫ依存性凝固因子と同様にＮ末端から３５残
基までのアミノ酸配列に１０個のγカルボキシグルタミ
ン酸(以下、Ｇｌａと称することがある)からなるＧｌａ
領域を有している(Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃ
ｉ.ＵＳＡ,ｖｏｌ.８３,ｐ.２４１２−２４１６,１９８
６)。ＦＶＩＩは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、活性化血
液凝固第Ｘ因子(以下、ＦＸaと称することがある)、活
性化血液凝固第ＩＸ因子(以下、ＦＩＸaと称することが
ある)またはトロンビン(以下、ＦＩＩaと称することが
ある)によって、152Ａｒｇ−153Ｉｌｅが加水分解さ
れ、一個のＳ−Ｓ結合で架橋されたＨ鎖とＬ鎖から構成
される活性型ＦＶＩＩすなわちＦＶＩＩaに変換される
ことが知られている(Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２
５１,ｐ.４７９７−４８０２,１９７６)。また、最近、
Ｓａｕｌｉｕｓ等は生理的なＦＶＩＩ活性化酵素が活性
化血液凝固第Ｘ因子であると報告した(Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ,ｖｏｌ.３５,ｐ.１９０４−１９１０,１９
９６)。

【０００３】血友病Ａ及び血友病Ｂ患者に対する補充療
法として、血液凝固第ＶIII因子(以下、ＦＶIIIと称す
ることがある)及び血液凝固第ＩＸ因子(以下、ＦＩＸと
称することがある)製剤の投与が行なわれている。しか
し、当該治療法に伴いＦＶIII及びＦＩＸに対する中和
抗体(インヒビターと呼ばれることもある)の出現が問題
視されている。このようなインヒビター患者の治療にＦ
ＶＩＩaが有効であることは既に報告されており、現
在、血漿由来ＦＶＩＩa及び遺伝子組換え技術を応用し
た遺伝子組換え型ＦＶＩＩaの開発が進められている(基
礎と臨床,ｖｏｌ.３０,ｐ.３１５−３２５,１９９６;Ｈ
ａｅｍｏｓｔａｓｉｓ,ｖｏｌ.１９,ｐ.３３５−３４
３,１９８９)

【０００４】酵素前駆体であるＦＶＩＩからＦＶＩＩa
への変換に関しては各種の試験が行なわれ、ＦＶＩＩ活
性化酵素であるＦＸa、ＦＩＸa及びＦＩＩaが存在しな
い場合、ＦＶＩＩaの関与によるＦＶＩＩの自己活性化
反応が生じること、即ち次式で示される反応"ＦＶＩＩ
＋ ＦＶＩＩa → ２ＦＶＩＩa"で進行することが明らか
にされている(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,ｖｏｌ.２８,
ｐ.９３３１−９３３６,１９８９)。ところで、ＦＶＩ
Ｉaの調製方法として、陰イオン交換樹脂を使用した活
性化方法がある(Ｒｅｓ.Ｄｉｓｃｌ.,ｖｏｌ.２６９,
ｐ.５６４−５６５,１９８６)。この方法は、反応の詳
細は明らかにされていないが、ＦＶＩＩaを工業規模で
生産するうえで極めて有効な方法である。しかしなが
ら、陰イオン交換樹脂を使用したＦＶＩＩの活性化にお
いて問題となるのは、副産物としてＦＶＩＩのＬ鎖のＮ
末端から３８残基のアミノ酸が欠失したＧｌａ領域欠失
ＦＶＩＩa(以下、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaと称すること
がある)が生成することにある。ＦＶＩＩaの生体内での
活性発現にはリン脂質及び組織因子との結合が必要であ
り、Ｇｌａ領域はそのためには必須である。従って、Ｇ
ｌａ領域の存在しないＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaはリン脂
質及び組織因子との結合が極めて弱く、生物学的活性を
有さずその存在の生理的意義はないものと考えられてい
る(Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２６５,ｐ.１８９０
−１８９４,１９９０；Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ.,ｖｏｌ.６７,ｐ.６７９−６
８５,１９９２)。

【０００５】これまで、陰イオン交換樹脂上での活性化
はゲルにＦＶＩＩを展開した後、完全活性化させ、グラ
ジエント溶出することにより、溶出段階で副産物のＧＤ
-ｌｅｓｓＦＶＩＩaとＦＶＩＩaの等電点の差異を利用
して分離する方法が報告されており、Ｔｈｉｍ等はＭｏ
ｎｏＱを使用した陰イオン交換クロマトグラフィーによ
る活性化反応においては産生されたＧＤ-ｌｅｓｓＦＶ
ＩＩaは分離可能と述べている(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ,ｖｏｌ.２７,ｐ.７７８５−７７９３,１９８８)。し
かしながら、実際上その完全分離は極めて難しく、分離
を厳密に行なえば工程間収率は著しく低減する。さら
に、これまでに陰イオン交換樹脂上でのＧＤ-ｌｅｓｓ
ＦＶＩＩaの産生機構に関する報告はなく、その制御を
陰イオン交換樹脂上で行なうことは極めて困難であっ
た。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本願発明者等は活性化反
応における上記問題点に鑑み、陰イオン交換樹脂上での
活性化反応における副産物であるＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩ
Ｉaの産生を抑制するべく鋭意研究を重ね種々の検討を
行なった結果、本願発明を完成するに至った。本願発明
は、陰イオン交換樹脂上における活性化反応を６０％未
満に抑制し、溶出したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混合溶液を
０.５ｍＭ以上のＣａ²⁺が存在する溶液中での液相中で
熟成させ９５％以上活性化させる方法をその技術の骨子
とする。本願発明を適用すれば、活性化工程におけるＦ
ＶＩＩからＦＶＩＩaの変換において生ずるＧＤ-ｌｅｓ
ｓＦＶＩＩaの産生が抑制され、著しい工程間収率の上
昇が可能となる。

【０００７】以下、本願発明の詳細について説明する。
本願発明で用いられる出発物質は、血漿または血漿を
適当なクロマトグラフィー操作またはコーンのエタノー
ル分離法もしくはその改良法を用いて調製されたＦＶＩ
Ｉ含有溶液または、遺伝子組換え技術に基づいて作出
されたＦＶＩＩ産生形質転換細胞より調製されるＦＶＩ
Ｉ及び／もしくはＦＶＩＩ誘導体含有溶液が対象となる
が、最適な出発原料としては、血漿を陰イオンクロマト
グラフィーで粗精製したＧｌａ領域を有する蛋白溶液
(ＰＰＳＢ画分)を抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固定化
アフィニティーゲルに展開し溶出したほぼＦＶＩＩのみ
を含有する溶液である。ＦＶＩＩの精製は特に免疫吸着
の原理に基づく方法に限定されるものではなく、ＦＶＩ
Ｉを純化可能な方法であればいずれでもよい。

【０００８】前記ＦＶＩＩ画分を、陰イオン交換樹脂ク
ロマトグラフィーに供する。陰イオン交換樹脂は陰イオ
ン交換樹脂であれば特に限定されるものではないが、好
適にはＤＥＡＥセファロースファーストフロウ(ファル
マシア社)及びＱセファロースファーストフロウ(ファル
マシア社)等が使用され、ＦＶＩＩ画分を樹脂と接触さ
せる。この工程では種々の条件を採用することができ、
上記リガンドとの接触はバッチ法または連続カラム法で
実施することができるが、最適な態様としては、前記の
陰イオン交換樹脂をクロマトグラフィーのカラムに充填
し、試料を通液後、吸着した所望のＦＶＩＩを溶出させ
る。陰イオン交換樹脂からの溶出は０.５ｍＭ以上のＣ
ａ²⁺を含む緩衝液を用いて段階的溶出法(ステップワイ
ズ溶出法)により、溶出液中のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混合
溶液のＦＶＩＩaへの活性化率が６０％以下になるよう
に溶出する。溶出液中の活性化率を制御するためには、
陰イオン交換樹脂へのＦＶＩＩ展開量と樹脂内での滞留
時間を調整すればよい。すなわち、樹脂へのＦＶＩＩ展
開量及び樹脂内での滞留時間の増加は活性化率を増大さ
せ、樹脂へのＦＶＩＩ展開量及び樹脂内での滞留時間の
減少は活性化率を低下せしめる。

【０００９】溶出後の熟成時間は、溶出時のＦＶＩＩ
／ＦＶＩＩaの混合比率、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩaの蛋白
濃度によって決定される。溶出液中の蛋白濃度は陰イオ
ン交換樹脂へのＦＶＩＩ展開量及びカラムサイズが決定
されれば一定になる。好適には１.０〜３.０ｍｇ／ｍｌ
が望ましく、そのように陰イオン交換樹脂への展開量及
びカラムサイズを決定する。また、溶出時の活性化率は
陰イオン交換樹脂へのＦＶＩＩ展開量が決定されれば、
上述のごとく樹脂内での滞留時間を制御すればよい。ま
た、熟成開始時のＣａ²⁺濃度は０.５ｍＭ以上が要求さ
れ、それ以下の濃度ではＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生
が顕著になり、適正ではない。好適には１.０〜１０ｍ
Ｍの濃度範囲が使用される。熟成の終了は、ＦＶＩＩ／
ＦＶＩＩaの混合溶液のＦＶＩＩaの活性化率が９５％を
越えた時点で、希釈操作によって蛋白濃度を減じ活性化
反応速度を遅延させるか、またはｐＨを低下させ酵素反
応を一時停止せしめることによって行なう。得られたＦ
ＶＩＩa溶液は透析操作によって所望の製薬学的調合剤
に処方すればよい。

【００１０】静脈内投与のための調合剤に対しては、組
成物を、通常、生理学的に適合し得る物質例えば塩化ナ
トリウム、グリシン等を含み且つ生理学的条件に適合し
得る緩衝されたｐＨを有する水溶液中に溶解する。ま
た、長期安定性の確保の観点から、最終的剤型として凍
結乾燥製剤の形態を採ることも考慮され得る。なお、静
脈内に投与される組成物のガイドラインは政府の規則、
例えば「生物学的製剤基準」によって確立されている。
以下に、実施例を挙げて本願発明を具体的に説明する
が、本願発明は何等これらに限定されるものではない。

【００１１】

【実施例】実施例の記述に先立ち、本願発明において使
用されたＦＶＩＩ活性及びＦＶＩＩa含量の測定方法に
ついて概説する。 １) ＦＶＩＩの生物学的活性 ＦＶＩＩは血液凝固の開始因子である組織因子と結合し
血液凝固を開始する。ＦＶＩＩの定量方法は、検体をＦ
ＶＩＩ欠乏血漿に添加後、一定時間インキュベーション
した後、組織因子、リン脂質及びＣａ²⁺を含有したＰＴ
試薬を添加しその凝固時間から算出する。 ２) ＦＶＩＩa含量の測定 ＦＶＩＩa含量の測定にはＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用す
る。ＦＶＩＩ(分子量５０ｋｄａ)は活性化すると１個の
Ｓ−Ｓ結合で結合した２本鎖に分かれる。Ｈ鎖は分子量
３０ｋｄａ、Ｌ鎖は分子量２０ｋｄａ。還元系のＳＤＳ
−ＰＡＧＥでは未活性体は分子量５０ｋｄａの位置に、
Ｈ鎖は３０ｋｄａ、Ｌ鎖は２０ｋｄａの位置に確認され
る。検出されるバンドをデンシトメーターで読み取り、
分子量５０ｋｄａのバンドを未活性化ＦＶＩＩ含量％、
Ｈ鎖とＬ鎖の含量の和をＦＶＩＩa含量％とした。活性
化率はＦＶＩＩa含量をＦＶＩＩ含量とＦＶＩＩa含量の
和で除した値を百分率(％)で表した。

【００１２】実施例１ 新鮮凍結血漿１００リットルを冷融解し沈澱画分を遠心分離
した上清を、陰イオン交換体(ＤＥＡＥ−セファデック
ス Ａ−５０:ファルマシア社)カラムに通液し、２０ｍ
Ｍクエン酸／０.１ＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ７.０)にて充
分に洗浄し、２０ｍＭクエン酸／０.５ＭＮａＣｌ緩衝
液(ｐＨ７.０)にてＧｌａドメインを有するＰＰＳＢ画
分を溶出した。溶出液１０リットルを５０ｍＭＴｒｉｓ／１
５０ｍＭＮａＣｌ／５.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐＨ８.
０)で予め平衡化した抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固
定化アフィニティーゲルに展開し、５０ｍＭＴｒｉｓ／
２.５ＭＮａＣｌ／５.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐＨ８.
０)で洗浄後、５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／
５.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐＨ８.０)でさらに洗浄
し、５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭＥ
ＤＴＡ緩衝液(ｐＨ７.４)で溶出してＦＶＩＩ画分を得
た。該ＦＶＩＩ画分を予め５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭ
ＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０)で充填されているウイルス
除去膜(ベンベルグマイクロポーラスメンブレン、旭化
成)に展開し濾液を得た。得られた濾液のＦＶＩＩ純度
は８５％であった。

【００１３】上記０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液５０
ｍｌを、予め５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝
液(ｐＨ８.０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０
ｃｍのＤＥＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファ
ルマシア社)カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、
さらに同線速下、上記緩衝液で所定の各種カラム容量洗
浄し、吸着したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩaを失活させるため
に５０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ３.５)で溶出した。溶出し
たＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を
行ない、表１の結果を得た。本結果は洗浄カラム容量が
７０カラム容量を越えるとＦＶＩＩaの活性化率が６６.
４％を越え、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が始まるこ
とを示している。

【００１４】

【表１】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００１５】実施例２ 実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製
した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液５０ｍｌを、予め
５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＤＥ
ＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)
カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速
下、上記緩衝液で１０倍カラム容量洗浄し、５０ｍＭＴ
ｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／２.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液
(ｐＨ８.０)を用い各種線速で溶出した。溶出したＦＶ
ＩＩ／ＦＶＩＩa画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行な
い、表２の結果を得た。本結果は溶出線速が１００ｃｍ
／ｈｒを下回るとＦＶＩＩaの活性化率が６２.８％を越
え、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が始まることを示し
ている。

【００１６】

【表２】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００１７】実施例３ 実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製
した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液７０ｍｌを、予め
５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ３.３ｃｍのＤＥ
ＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)
カラムに線速２００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速
下、上記緩衝液で１０カラム容量洗浄後、５０ｍＭＴｒ
ｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／１.７５ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液
(ｐＨ８.０)を用い線速１５０ｃｍ／ｈｒで溶出した。
溶出した濃度２.０ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混
合溶液をさらに液相中で１０時間熟成させた。カラム溶
出直後(熟成前)及び熟成後の成績を表３に示す。結果
は、実施例１、２とは陰イオン交換樹脂への展開量及び
カラムサイズの異なる条件においても、溶出後の活性化
率が６０％以下ではＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaが産生され
ず、且つ熟成後もその産生が極めて抑制されていること
を示している。

【００１８】

【表３】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００１９】実施例４ 実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製
された０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液３５ｍｌを予め
１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
５)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＱ−
セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラム
に線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上
記緩衝液で各種カラム容量洗浄後、吸着したＦＶＩＩa
を失活させるために５０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ３.５)で
溶出した。溶出したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa画分のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ解析を行ない、表４の結果を得た。本結果は
洗浄カラム容量が４０カラム容量を越えるとＦＶＩＩa
の活性化率が６１.３％を越え、ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩ
aの産生が始まることを示している。

【００２０】

【表４】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００２１】実施例５ 実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製
した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液３５ｍｌを、予め
１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
５)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＱ−
セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラム
に線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上
記緩衝液で１０倍カラム容量洗浄し、１０ｍＭＴｒｉｓ
／１００ｍＭＮａＣｌ／４.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐ
Ｈ８.５)を用い各種線速で溶出した。溶出したＦＶＩＩ
／ＦＶＩＩa画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ない、表
５の結果を得た。本結果は溶出線速が１０８ｃｍ／ｈｒ
以下になるとＦＶＩＩaの活性化率が６２.７％を越え、
ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生が始まることを示してい
る。

【００２２】

【表５】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００２３】実施例６ 実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製
した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液３５ｍｌを、予め
１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
５)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＱ−
セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラム
に線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上
記緩衝液で１０カラム容量洗浄後、１０ｍＭＴｒｉｓ／
１００ｍＭＮａＣｌ／４.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐＨ
８.５)で線速１８０ｃｍ／ｈｒで溶出した。溶出した濃
度１.０ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混合溶液を液
相中で２５時間熟成させた。カラム溶出直後(熟成前)及
び熟成後の成績を表６に示す。結果は、実施例３と同様
に陰イオン交換樹脂としてＱ−セファロースファースト
フロウ(ファルマシア社)を使用しても、溶出後の活性化
率が６０％以下ではＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaが産生され
ず、且つ溶出液熟成後もその産生が極めて抑制されてい
ることを示している。

【００２４】

【表６】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００２５】実施例７ 実施例３と同様な操作で、ＤＥＡＥ−セファロースファ
ーストフロウ(ファルマシア社)を使用し部分活性化後、
液相で熟成し完全活性化させたＣａ²⁺濃度２.０ｍＭを
含む５.０ｍｇ／ｍｌ濃度のＦＶＩＩa混合溶液を、Ｃａ
²⁺濃度が０.１７ｍＭ、０.５０ｍＭ、０.７５ｍＭ、１.
０ｍＭ、２.０ｍＭ、蛋白質濃度が０.４ｍｇ／ｍｌにな
るように５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液
(ｐＨ８.１)で希釈し、９℃で８８時間インキュベート
した。インキュベート後の成績を表７に記載する。表７
の成績はＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩa産生の至適Ｃａ²⁺濃度
が０.５ｍＭ未満であることを示すと共に、ＦＶＩＩaの
ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaへの分解反応が０.７５ｍＭ以
上のＣａ²⁺濃度下で抑制されることをも示している。こ
の結果は液相におけるＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩa産生反応
のＣａ²⁺濃度の閾値を示すと共に、陰イオン交換樹脂か
らの溶出をＣａ²⁺を含む緩衝液で行なう場合、溶出時の
ＧＤ-ｌｅｓｓＦＶＩＩaの産生を抑制するためには溶出
緩衝液のＣａ²⁺濃度は０.５ｍＭ以上必要であることを
示している。

【００２６】

【表７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 丸野 真一 熊本県菊池郡西合志町須屋1733−31 (72)発明者 緒方 洋一 熊本県熊本市帯山７丁目９−142 (72)発明者 寺野 剛 熊本県菊池郡西合志町須屋1548−２

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の工程を経てなる血液凝固第ＶＩ
   Ｉ因子(以下、ＦＶＩＩと称することがある)の活性化血
   液凝固第ＶＩＩ因子(以下、ＦＶＩＩaと称することがあ
   る)への活性化方法。ＦＶＩＩを含有する溶液を陰イ
   オン交換樹脂に接触させ展開し、ＦＶＩＩを部分的に
   活性化し溶出して、該溶出液を溶液状態で静置し未活
   性体分子を完全に活性化させる。
2. 【請求項２】 上記部分的活性化後の溶出液の活性化
   率が６０％未満である請求項１記載のＦＶＩＩの活性化
   方法。
3. 【請求項３】 上記陰イオン交換樹脂からの溶出時の
   溶出緩衝液はＣａ^{2 +}を含有し該Ｃａ²⁺濃度が０.５ｍＭ
   以上である請求項１または請求項２記載のＦＶＩＩの活
   性化方法。
4. 【請求項４】 上記陰イオン交換樹脂からの溶出時の
   溶出方法が段階的溶出法(ステップワイズ溶出法)である
   請求項１から請求項３のいずれかに記載のＦＶＩＩの活
   性化方法。
5. 【請求項５】 上記溶液状態での静置(熟成)における
   溶液中にＣａ²⁺を含有し該Ｃａ²⁺濃度が０.５ｍＭ以上
   である請求項１に記載のＦＶＩＩの活性化方法。
6. 【請求項６】 請求項１から請求項５のいずれかに記
   載のＦＶＩＩの活性化方法に基づく工程を含むことを特
   徴とする活性化血液凝固第ＶＩＩ因子の製造方法。