JPH10512750A - 突然変異体ルシフェラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 野生型ルシフェラーゼの２７０位のアミノ酸残基をグルタミン酸以外のアミノ酸に改変することによって、野生型ルシフェラーゼよりもＫ_m値が低いルシフェラーゼ活性を有するタンパク質を提供する。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位のグルタミン酸又はＬｕｃｉｏｌａルシフェラーゼの３５６のグルタミン酸に相当するグルタミン酸を、別のアミノ酸（特にリシン）で置き換えることによって、及び／又は、Ｐｈ ｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ種の２１５位及びＬｕｃ ｉｏｌａ種の２１７位のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸で置き換えることによって、より低いＫ_mを維持しながら野生型ルシフェラーゼよりも高い熱安定性が得られる。このタンパク質をコードし且つ発現させるＤＮＡ、ベクター及び細胞を、本発明のタンパク質を使用して発光検定を行うためのテストキット及び試薬として提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 突然変異体ルシフェラーゼ 本発明は、ルシフェラーゼ活性を有する新規のタンパク質と、このタンパク質 の発現をコードするＤＮＡ及びベクターとに係わる。特に、本発明は、野生型及 び改変野生型の既存の自然及び組換えルシフェラーゼに比較して、より低い基質 ＡＴＰに対するＫ_mを有するルシフェラーゼを提供する。 ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ²⁺及び分子酸素の存在下でルシフェリ ンの酸化を触媒し、その結果として発光を生じさせる。この反応は、約０．８８ の量子収率を有し（ＤｅＬｕｃａ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９７８）とＳｅｌｉｇ ｅｒ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９６０）を参照されたい）、この発光特性は、ＡＴ Ｐレベルを測定する発光測定検定において使用されている。 ルシフェラーゼはホタルの体から直接得ることも、この酵素をコードする組換 えＤＮＡ構築物を含む微生物からの発現によって得ることも可能である。この酵 素を得ることが可能な、又は、この酵素をコードするＤＮＡを得ることが可能な 重要な種は、日本のＧＥＮＪＩ及びＨＥＩＫＥホタルであるＬｕｃｉｏ ｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ とＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ、東ヨーロッパ のホタルであるＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、北アメリカのホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ ）とツチボタル、及び、ヨーロッパのツチボ タルであるＬａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａである。 野生型及び組換え型のルシフェラーゼの熱安定性は、約３０℃を越える温度、 特に３５℃を越える温度に露出される時に極めて迅速にその活性を失うような熱 安定性であり、このために、高い外界温度で使用する場合にはこの酵素の欠損が 生じる。日本ホタルのルシフェラーゼをその２１７位で突然変異させてイソロイ シン残基によってトレオニン残基を置き換えることによって、この酵素を熱安定 化することが可能であり（Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏ（１９９３）Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，ｐ．１３７９５−１３７９９）、そのｐＨ安定性 と比活性も増大される。 同時係属中の特許出願ＧＢ ９４０５７５０．２は、特に、５０℃以上の温度 において比較的熱安定であるルシフェラーゼを提供するために、使用可能なＰｈ ｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ の熱安定性を２１７位における改変によって増大 させるこ とが可能なアミノ酸置換を開示している。 本発明は、ルシフェラーゼ酵素を、比較的低いレベルにおけるアデノシン三リ ン酸の検出に基づく検定で使用するのに適したものにする、ルシフェラーゼ酵素 の特性の強化に係わる。この強化は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフ ェラーゼのミカエリス−メンテン定数（Ｋ_m）が、野生型配列を有する対応する ルシフェラーゼに比較して低減するように、この酵素のアミノ酸配列内の２７０ 位に相当する位置においてアミノ酸を改変することによって実現される。これは 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ 及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓにおけるアミノ酸２７２に相当する。 これは、Ｌａｍｐｒｉｓ Ｎｏｃｔｉｌｕｃａにおけるアミノ酸２７０にも相当 する。 本発明は、更に、野生型ルシフェラーゼの発光波長とは異なった波長の発光を 伴うＤ−ルシフェリンの酸化を生じさせる能力を特徴とするルシフェラーゼを提 供し、従って、放出光の波長が存在する特定の標識材料に特徴的である結合測定 法において、特異的標識としてこのルシフェラーゼを使用することを可能にし、 又は、このルシフェラーゼをコードするＤＮＡを、遺 伝子操作細胞もしくはこうした細胞から誘導された細胞のリポーターＤＮＡとし て使用することを可能にする。 従って、本発明の第１の側面では、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフ ェラーゼの残基２７０、並びに、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕ ｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ 及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフ ェラーゼの残基２７２に相当するアミノ酸残基がグルタメート以外のアミノ酸で あることを特徴とする、ルシフェラーゼ活性を有し且つＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙ ｒａｌｉｓ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕ ｃｉａｔａ 、又は、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのアミノ酸配列に対し て６０％を越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質が提供される。このタ ンパク質が保存アミノ酸配列Ｆ（１）ＸＥ（２）ＦＬを有することを特徴とする ことが好ましく、前式中で（１）がＤ又はＥであり、（２）がＴ又はＬであり、 Ｘがグルタメート以外のアミノ酸であり、Ｆ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｔの各々が、単一文 字アミノ酸コードによって与えられるような対応するアミノ酸に関連する。 現時点までに確定している好ましいアミノ酸Ｘは、リシン、 その類似体、又は、その修飾物である。他の好ましいアミノ酸は、アルギニン、 グルタミン、及び、アラニンを含む。 本発明の更に好ましい実施様態では、本発明のタンパク質が、更に、疎水性ア ミノ酸、好ましくはイソロイシン、ロイシン、バリン、又は、これらの類似体に 改変された、Ｌｕｃｉｏｌａホタルルシフェラーゼのアミノ酸２１７又はＰｈｏ ｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ ルシフェラーゼのアミノ酸２１５に相当する位置の アミノ酸を有し、及び／又は、グルタミン酸以外のアミノ酸、特に、リシン、ア ルギニン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、又は、これらの類似体もしく は修飾物に改変された、Ｌｕｃｉｏｌａ ホタルルシフェラーゼのアミノ酸３５ ６又はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸３５４に相 当する位置のアミノ酸を有する。 本発明の第２の側面では、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが提供され 、第３の側面では、本発明のタンパク質を発現させることが可能であるような形 でｌｕｃ遺伝子（ルシフェラーゼをコードする遺伝子）を含むベクター（特に、 プラスミド）が提供される。こうした形は、微生物宿主細胞の中に取り込まれる 時にそのタンパク質が（場合によっては、適切な誘導 物質の添加によって）必要に応じて容易に発現させられることが可能であるよう に本発明のタンパク質の発現を制御することが可能なＤＮＡを上記ベクターが含 むような形である。 Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ に関するｌｕｃ遺伝子が公知であり、標準的な分子生物学的方法で単離可能であ る。これは、更に、Ｌａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａに関しても同様であ る。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのｌｕｃ遺伝子は、Ｐｒｏｍｅｇａから プラスミドｐＧＥＭ−ｌｕｃとして市販入手可能である。従って、本発明のＤＮ Ａの生産のための開始材料を得るための慣用方法と起源は、（ｉ）自然発生ホタ ルゲノムＤＮＡの使用、及び、例えばＰＣＲを使用することによるこのＤＮＡか らのｌｕｃ遺伝子の増幅、（ｉｉ）ｐＧＥＭプラスミド、並びに、（ｉｉｉ）Ｋ ａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏのｐＧＬｆ３７プラスミドである。ルシフェラ ーゼ活性、即ち、発光を伴ってルシフェリンを酸化する活性を有するタンパク質 をコードする更に別の遺伝子も、ＤＮＡを得るための、及び、最終的には遺伝子 発現によって本発明のタンパク質 を得るための開始材料の適切な起源であろう。 本発明のＤＮＡを生産するための野生型又は他のｌｕｃ遺伝子ＤＮＡの操作に 使用するのに適したベクターは、天然グルタメートを別のアミノ酸に改変する際 に本発明のＤＮＡがその中に含まれることが可能なあらゆるベクターである。例 えばヒドロキシルアミンのような物質を使用して化学的に誘導する突然変異誘発 の場合には、こうしたベクターはあまり重要ではなく、突然変異誘発処理の前と 後に遺伝子の容易な操作を可能にする数多くの適切なベクターを、当業者は見い 出すだろう。そのｌｕｃ遺伝子をグルタメートにおいて特異的に突然変異させる ことが好ましい場合も考えられ、従って、この場合には、部位特異的な突然変異 誘発操作が必要とされるだろう。こうした操作をベクター内において極めて容易 に行うことが可能であり、こうした操作は当業者にとって公知だろう。 野生型及び公知タイプのｌｕｃ遺伝子と本発明のｌｕｃ遺伝子とを発現させる ための適切なベクターは、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能）、及び、ｐＴ７−７を含む。ｐＫＫ２２ ３−３とｐＤＲ５４０は、イソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ） の存在によって発現が誘導されることを可能にする、ラクトースリプレッサーの 制御下にあるｔａｃプロモーターを有する。ｐＴ７−７は、Ｔ７−ＲＮＡポリメ ラーゼプロモーターによる制御を可能にし、従って、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞内での非常に高レベルの遺伝子発現のための基礎を与え る。こうしたベクターの中で、ｌｕｃ遺伝子を挿入する場合に最も高レベルの発 現を示すことが確認されているベクターは、ｐＴ７−７ベクターである。 ｐＫＫ２２３−３及びｐＤＲ５４０の中に挿入されたｌｕｃ遺伝子からのルシ フェラーゼの発現が、野生型Ｎ末端配列ルシフェラーゼの発現を生じさせると同 時に、ｐＴ７−７の中に挿入されたｌｕｃ遺伝子からの発現が、別のＮ末端アミ ノ酸Ａ−Ｒ−Ｉ−Ｑを有する融合タンパク質の合成をもたらす。ｌｕｃ遺伝子を 含む個々のベクター（構築物ｐＰＷ２０４、ｐＰＷ１１６、及び、ｐＰＷ３０４ と呼ぶ）内のｌｕｃ遺伝子のリボソーム結合部位と出発コドンを、実施例の表１ に示す。後述するｐＷ６０１ａは、ユニークＸｈｏ Ｉ部位ｐＰＷ１１６を除去 することによって得られる。 本発明の第３の側面は、本発明のタンパク質を発現させるこ とが可能な細胞、この細胞を用いるこうしたタンパク質を生産するための方法及 び本発明のタンパク質を含むテストキット及び試薬を提供する。当業者には公知 であるように、そのルシフェラーゼが本発明のタンパク質であることを特徴とす るルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を使用してＡＴＰを測定する検定方法も提 供される。本発明のルシフェラーゼ調製物は、対応する野生型及び組換えルシフ ェラーゼに比較してＫ_mが低く、更に、好ましい二重改変及び三重改変ルシフェ ラーゼ（即ち、２１５、２７０もしくは３５４位において改変されたＰｈｏｔｉ ｎｕｓ 、２１７、２７２もしくは３５６位において改変されたＬｕｃｉｏｌａ、 又は、２１５、２７０もしくは３５４位で改変されたＬ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ） は、３０℃から７０℃までにおいて、特に３７℃から６０℃までにおいて、とり わけ４０℃から５０℃までにおいて、比較的高い熱安定性特性を有する。従って 、本発明は、本発明人等による他の同時期の研究と以前の研究との熱安定性強化 策が使用されることを妨げないものとして、確立されている。 その細胞のＤＮＡ中のＤＮＡ配列、又は、細胞中に含まれるプラスミドのよう なベクター中のＤＮＡ配列を使用して異種タ ンパク質を発現させることが可能な細胞を、本発明のタンパク質を発現させるた めに使用することが可能である。こうした細胞の中で典型的な細胞は、Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 細胞のような酵母細胞と、Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 細胞のような細菌細胞であると考えられるが、当業者 は、タンパク質発現の目的に適した他の数多くの宿主生物を見い出すことだろう 。 本発明のタンパク質を、自然ルシフェラーゼ及び公知の組換えルシフェラーゼ に類似した構造のタンパク質として発現させることが可能であり、又は、他のア ミノ酸、ペプチド、タンパク質、もしくは、他の化学種（例えば、上記のＡ−Ｒ −Ｉ−Ｏ配列）を有するこうしたタンパク質の融合体又は複合体として発現させ ることが可能である。 宿主の中には特定のコドン優先性を有するものがあり、例えば、細菌が酵母と は異なったコドンを使用する場合があり、従って、こうした宿主におけるより有 利な発現を生じさせる所与のアミノ酸に関与する縮重コドンを与えるために、そ の宿主に取り込まれたＤＮＡを有利に改変することが可能であることが当業者に 理解されるだろう。当然のことながら、こうした縮重 コドンは本発明のＤＮＡの範囲内に含まれる。 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、適した宿主の１つであり、誘導性ｌａ ｃＵＶ５プロモーターの制御下でその染色体の中に安定的に統合されたＴ７ Ｒ ＮＡポリメラーゼを有し、従って、ｐＴ７−７誘導構築物に対して適合性がある 。 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ菌株は、ＢＬ２１と同様に、ｌｏｎプロテアーゼとｏｍｐＴ 外膜プロテアーゼとに欠けている。こうした欠乏は、Ｅ．ｃｏｌｉ中における外 来タンパク質の発現と蓄積の安定化を促進することが可能である。上記の３つの 発現構築物の各々を含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の粗抽出物の検定は 、最高レベルのルシフェラーゼ発現が、構築物ｐＰＷ３０４を含む細胞から得ら れることを示した（表２を参照されたい）。下記の実施例で使用するＥ．ｃｏｌ ｉ ＪＭ１０９細胞のような他の適切な細胞系統を、当業者は容易に見い出すだ ろう。 以下では、下記の非限定的な実施例、図面、表及び配列表を参照しながら、本 発明のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター及び細胞を単なる例示の形で説明する。本 発明のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター及び細胞を考慮することによって、当業者 は、これら のいずれかを組み込んだ更に別のタンパク質、タンパク質複合体、ＤＮＡ、ベク ター及び細胞、並びに、検定及びテストキットを容易に見い出すだろう。図面 図１は、下記実施例で説明する通りのｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＫＫ２２ ３−３から誘導されるプラスミドｐＰＷ２０４の制限地図を示す。 図２は、下記実施例で説明する通りのｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＤＲ５４ ０から誘導されるプラスミドｐＰＷ１１６の制限地図を示す。 図３は、下記実施例で説明する通りのｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＴ７−７ から誘導されるプラスミドｐＰＷ３０４の制限地図を示す。 図４は、ｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位が除去されたｐＧＥＭ−ｌｕｃからのＢ ａｍＨ１／Ｓｓｔ１フラグメントとから誘導された、プラスミドｐＰＷ６０１ａ の制限地図を示す。 図５は、下記実施例で説明する通りに所与の温度に１６分間インキュベートし た、組換え野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、本発明のＫ_m 改変ルシフェラーゼ、同 時係属中のＧＢ ９４０５７５０．２に開示されている熱安定性３５４リシン突 然変異体、及び、本発明のＫ_m／３５４リシン二重突然変異体の熱不活性化のグ ラフを示す。 図６は、Ｔａｂｏｒ後のｐＴ７−７の制限地図を示す。配列表 本明細書の末尾に示した配列表は、次のようなＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示 す。 配列番号：１は、８１１から８１３までのＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ 野生型コドンが突然変異している本発明のルシフェラーゼをコードするＤＮＡの ＤＮＡ配列を示す。リシンに関しては８１１の塩基だけがＡに突然変異している 。この配列は、１０６３から１０６５までの、熱安定性をもたらすための位置も 示す。 配列番号：２は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型アミノ酸２７０グ ルタメートがグルタメート以外の残基Ｘａａに改変されている、本発明のタンパ ク質のアミノ酸配列を示す。 配列番号：３は、２７０位においてグルタメートの代わりにリシンを与えるた めの、ｐＰＷ６０１ａのＳＤＭ突然変異に使用するオリゴヌクレオチドの配列を 示す。 配列番号：４は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型アミノ酸２７０グ ルタメートがリシンに改変され且つアミノ酸３５４がリシンに改変されている、 本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。 配列番号：５は、３５４位においてグルタメートの代わりにリシンを与えるた めのｐＰＷ６０１ａのＳＤＭ突然変異に使用するオリゴヌクレオチドの配列を示 す。実施例 実施例１： 本発明のＤＮＡを含むプラスミドの生産 プラスミドｐＫＫ２２３−３とプラスミドｐＤＲ５４０をＢｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した。ｐＤＲ５４０は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ ｉｏｔｅｃｈ，Ｓｔ Ａｌｂａｎｓ，ＵＫからも入手可能である。ファージミド ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊ ｏｌｌａ，ＵＳＡから入手した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ）を、ｐＴ７ −７誘導プラスミドからのルシフェラーゼの発現のために使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ 菌株ＪＭ１０９（４）をクローニング実験の全てにおいてｐＤＲ５４０誘導プラ スミドからのルシフェラーゼの発現のために使用した。 プラスミドｐＴ７−７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ＩＩ ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １６．２．１のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照 されたい）を、Ｓｔａｎ Ｔａｂｏｒ，Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ ０ ２１１５から入手し、このプラスミドは（図６に示すように）、Ｔ７ ＲＮＡポ リメラーゼプロモーターφ１０と、ｐＴ７−５のＰｖｕＩＩ部位とＣｌａＩ部位 との間に挿入されたＴ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７ ｂｐ２２８５７からｂｐ ２２９７２まで）のための翻訳開始部位とを含む。（５′末端の充填後の）融合 タンパク質の作成のためのユニーク制限部位は、Ｆｒａｍｅ ０：ＥｃｏＲ１、 Ｆｒａｍｅ １：ＮｄｃＩ，ＳｍａＩ、ＣａｌＩ、Ｆｒａｍｅ ２： ＢａｍＨ Ｉ，ＳａｌＩ，ＨｉｎｄＩＩＩである。その当初のポリリンカーのＳａｃＩ部位 を欠失によって除去し、追加のＸｂａＩ部位を出発コドンの上流に与える。 図面の説明に述べているように、各々に、標準的な制限エンドヌクレアーゼと ライゲーション法とを使用してＰｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−ｌｕｃから誘導したｌｕｃ 遺伝子を挿入するこ とによって、ｐＰＷ２０４をｐＫＫ２２３−３から誘導し、ｐＰＷ１１６をｐＤ Ｒ５４０から誘導し、ｐＰＷ３０４をｐＴ７−７から誘導し、一方、ｐＤＲ５４ ０と、このプラスミドのポリリンカー内のユニークＸｈｏ Ｉ部位を除去するこ とによって誘導されるようなｐＰＷ６０１ａとの中に、ｐＧＥＭ−ｌｕｃから誘 導したｌｕｃ遺伝子と、ＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１フラグメントとをクローニングす ることによって、ｐＰＷ６０１を生産した。ｐＰＷ６０１ａは、ルシフェラーゼ アミノ酸３５４改変のためのＳＤＭ手順を単純化する、Ａｖａ Ｉに関するユニ ーク認識部位を含む。 ｐＰＷ３０４の生産のために、ｐＴ７−７をＥｃｏＲＩで消化し、末端をクレ ノウフラグメントを使用して充填し、その産物をＳａｌＩで消化し、そのＤＮＡ をゲル精製する。ｐＧＥＭ−ｌｕｃをＢａｍ ＨＩで消化し、生産されたオーバ ーハングをＭＢＮで消化し、その産物をＳａｌＩで消化し、生産された１Ｋｂフ ラグメントを精製し、ライゲーションして精製ｐＴ７−７ ＤＮＡを得る。 ＢＭＨ ７１−１８ ｍｕｔ Ｓ細胞へのプラスミドの形質転換を、Ｂｉｏ− Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ｖｅｒｓ ｉｏｎ ２−８９を使用して行った。ｐＰＷ６０１クローンの生産のために、収 集した細胞と、突然変異プラスミドと親プラスミドを含む精製混合プラスミドプ ールとを与え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞内への形質転換の前にＡｖａ Ｉ による二次制限消化を行った。これらの細胞を選択培地（ＬＢ寒天＋５０μｇ／ ｍＬアンピシリン）上で平板培養し、クローンを、そのプラスミドＤＮＡを精製 して所期の改変に関して分析することによってスクリーニングした。プラスミド ＤＮＡを、アルカリ溶解を使用して精製した（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ （１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７，ｐ１５１３ ）。 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた場合に、構築物ｐＰＷ ２０４、ｐＰＷ１１６、及び、ｐＰＷ３０４の各々から得られるルシフェラーゼ の相対的発現レベルは、０．１：０．５：１．０である。細胞を３７℃のＬＢ中 で０．３のＯＤ ６００に増殖させ、その後で、ＩＰＴＧで誘導し、増殖を４時 間続けさせた後で粗抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。 初期定常期に収集した後で、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ジチオトレイト ール及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）（緩衝液 Ａ）中に再懸濁させたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞上で、ルシフェラーゼの部 分精製を行った。ＭＳＥ ｓｏｎｉｐｒｅｐ（増幅１４μ）内での破壊によって 細胞を破壊し、そのライゼートを３００００ｘｇで１時間遠心した。その後で、 硫酸アンモニウムを使用して粗抽出物の上清液を分画し、３５％飽和から５５％ 飽和の間で沈殿した画分がルシフェラーゼ活性を含み、この画分を緩衝液Ａ中に 溶解し、０．４ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（ 緩衝液Ｂ）５００ｍＬに対して一晩透析した。 沈殿させ透析したその酵素をＭｏｎｏ Ｑ（ＨＲ１０／１０）陰イオン交換カ ラムにかけ、緩衝液Ｂ中の０−２００ｍＭＮａＣｌ直線勾配（流量４ｍＬ／分、 画分２ｍＬ）で酵素を溶 離させることによって、ルシフェラーゼの完全精製を行った。ルシフェラーゼ活 性を含むピーク画分を５０％グリセロール（ｖ／ｖ）にし、−２０℃で保存した 。 ホタルルシフェラーゼ（結晶性懸濁液から調製、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ９００９） 、コエンザイムＡ、及び、ＡＴＰを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．か ら入手した。甲虫ルシフェリンカリウム塩をＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手した。細胞抽出 物をＰｒｏｍｅｇａ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１０１に 記載の通りに調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養のアリコートを、細胞培養溶解試薬（ ２５ｍＭトリス−リン酸塩、ｐＨ７．８、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、 １０％グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍｇ／ｍＬ Ｂ ＳＡ、１．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム）中で室温で１０分間溶解し、２分間１６ ０００ｇで遠心し、その後で、検定で使用するまで氷上に保存した。 コロニーをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移 し、そのフィルターを室温の１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中 の０．５ｍＭ ルシフェリ ンで浸漬し（Ｗｏｏｄ及びＤｅＬｕｃａ，（１９８７）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅ ｍ １６１，ｐ５０１−５０７）、コロニーが放出するバイオルミネセンスの測 定によって細胞系のルシフェラーゼ活性を検定した。検定緩衝液（１ｍＭ Ｍｇ ＳＯ₄、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、０．２７ｍＭ コエン ザイムＡ、０．４７ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、０．５３ｍＭ ＡＴＰ、及び、試 料１μＬから５μＬを含む２０ｍＭ トリシン（ｐＨ７．８））１００μＬを使 用して、２１℃でインビトロでルシフェラーゼ検定を行った。検定用反応混液の 最終ｐＨは７．８であり、光測定をＢｉｏＯｒｂｉｔ １２５０ ｌｕｍｉｎｏ ｍｅｔｅｒを使用して、又は、ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ ＲＳ ｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用してマイクロタイタープレー ト内で行った。 Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，ｐ２４８− ２５４の方法によって、ＢＳＡを標準として使用してタンパク質を決定した。Ｄ ＮＡの非特異的化学突然変異を生じさせるために、Ｋｉｒｏｎｄｅ他（１９８９ ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９，ｐ４２１−４２６の方法によって、 ０．１ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中の０．８Ｍヒドロキシルアミン、 １ｍＭ ＥＤＴＡを使用して、６５℃で２時間、ｌｕｃ遺伝子を含むプラスミド を処理した。 最初に、ｐＷ３０４内でのｌｕｃ遺伝子のヒドロキシルアミン誘導突然変異誘 発を生じさせ、２７０位におけるアミノ酸グルタメートのリシンへの改変を生じ させる配列番号：１の８１１におけるＤＮＡ配列の単一塩基改変を有するプラス ミド３０４ Ｇ１を得ることによって、Ｋ_m突然変異体を産生した。１．１ｋｂ ＤＮＡフラグメント（ＢｓｔＥ ＩＩ／Ｓｔｕ Ｉ）をｐＰＷ３０４からクロ ーニングし、ｐＰ６０１ａ内の対応するフラグメントを置き換えてｐＰＷ６０１ Ｇ１を形成するために使用し、こうして、ｐＰＷ３０４によってコードされる、 ４つの別のアミノ酸（Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｉ−ＱからのＭは含まれない）を含まないル シフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子を得た。 この突然変異誘発プラスミドをＧ６０ ＤＮＡグレードＮｉｃｋカラム（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）上で脱塩した後に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の中に 形質転換した。これから発現させたルシフェラーゼは、当初の突然変異体の低Ｋ_m 表現 型と同じ低Ｋ_m表現型を示した。 ［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰと８Ｍ尿素（６％ｗｔ／ｖｏｌ）ポリアクリルアミドゲ ル中での電気泳動を使用するＳａｎｇｅｒ他（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７４，５４６３−５４６７のジデオキシ鎖成長終結 法によって、二本鎖ＤＮＡの配列決定を行った。更に、自動配列決定を、ＤＮＡ ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ）を使用して行った。 ＡＴＰに関するこのルシフェラーゼのＫ_m値を定量するための検定を、ｃｐｍ を測定するためにルミノメーターを使用し、検定緩衝液（１．０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３ｍＭジチオトレイトール、２７０μＭコエンザ イムＡ、４７０μＭ Ｄ−ルシフェリン、及び、６．２５μＭから４００μＭま でのＡＴＰを含む２０ｍＭ トリシン ｐＨ７．８）１００μＬを用いて２１℃ で行った。 ６０１ａ組換え野生型に関するＫ_m値を６６．１μＭ（標準誤差４．１）と測 定し、６０１ａＫ（熱安定性突然変異体３５４リシン）に関しては６１．３（標 準誤差４．７）と測定し、６０１ａＧ１（２７０リシンＫ_m改変）に関しては ２８．７（標準誤差０．９）と測定し、このことは、２７０改変が、その酵素が 最適化されるＡＴＰ濃度を半分以上にすることを示している。 ルシフェラーゼの熱安定性に対する２７０改変の影響はネガティブであり、３ ７℃において、野生型ではｔ_1/2活性に達するのに７分を要するのとは対照的に 、僅か２分後にｔ_1/2活性に達するが、３０℃では、２７０の比活性は野生型よ り高い。実施例２： 「二重突然変異体」２７０Ｋ：３５４Ｋ Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙ ｒａｌｉｓルシフェラーゼの調製 ２７０改変ルシフェラーゼの熱安定性の低下を補うために、部位特異的突然変 異誘発を使用して、実施例１で説明した２７０リシンルシフェラーゼをコードす るＤＮＡとプラスミドとの中に３５４におけるリシン改変を組み込むことによっ て、二重改変ルシフェラーゼを調製した。これは、ｐＰＷ６０１ａＧ１をｐＰＷ ６０１ａに変換し更にＧ１Ｋに変換するために特別に設計されたオリゴヌクレオ チドを使用する突然変異を含んでいた。 ＳＤＭによって３５４リシン改変を生じさせるために使用したオリゴヌクレオ チドは、下線付きのＴがミスマッチであるＣ ＡＴＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＧＴＡＡＴＣＡＧ（配列番号：５）であった。 ｐＰＷ６０１ａＥ２７０Ｋのグルタメート３５４を所期のアミノ酸に変換する ために（及び、ｐＰＷ６０１ａからの２７０突然変異体の直接合成が必要である 場合に）必要とされる部位特異的突然変異誘発を、必要に応じて設計したオリゴ ヌクレオチドを使用して、次のプロトコルによって行う。部位特異的突然変異誘発プロトコル 選択されたプラスミドを、選択と、所期の改変のための突然変異原性オリゴヌ クレオチドとによって、変性させ、アニーリングする。突然変異体ＤＮＡ鎖を合 成してライゲーションし、一次制限全体を制限エンドヌクレアーゼで消化する。 配列決定とＳＤＭのためのオリゴヌクレオチドプライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザーを使用し て合成した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを、ｌｕｃ遺伝子内のユニー クＡｖａ Ｉ部位、又は、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子のユニークＳｃ ａＩ部位を破壊するように設計した。これらの部位の存在を、突然変異誘発を受 けなかったプラスミドを選択するために使用し た。詳細なプロトコルは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎ ｃ（ＵＳ）ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｋ１６００−１によって販売されるＴｒａｎ ｓｆｏｒｍｅｒ^RTMＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋ ｉｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に記載されている通りだった。 ｐＤＲ５４０から誘導したｐＰＷ６０１とクローニングしたｌｕｃ遺伝子との 制限地図を図４に示す。挿入された野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｌｕｃ遺伝子を、 改変されたアミノ酸配列のタンパク質を発現する、配列番号：１で示される配列 に配列番号：２でＸａａとして示されている２７０位においてリシンに変換する ように、部位特異的突然変異誘発を上記の通りに且つＣｌｏｎｔｅｃｈの指示に 従って行った。 Ｋ_mの測定を実施例１で説明した通りに行い、一方、熱不活性化の研究を溶解 緩衝液（２５ｍＭトリス−リン酸、ｐＨ７．８、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤ ＴＡ、１０％グリセロール、及び、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で３７ ℃で粗抽出物を使用して行い、様々な時点で、酵素のアリコートを取り出し、上 記の通りに検定した（５３０μＭ ＡＴＰを使用）。残留活性を時間経過に応じ てプロットした。 この例の二重改変である６０１Ｇ１Ｋに関するＫ_m値が、２５．２μＭ（標準 誤差１．５）であることを見い出し、この値も、対応する３５４リシン突然変異 体と野生型ルシフェラーゼのＫ_m値の１／２よりも小さかった。 連続加熱時にルシフェラーゼの活性がその初期値の５０％に減少するのに要す る時間であるｔ_1/2値が、次の値であることが判明した。 60la (組換え野生型) 7.0分後にｔ_1/2に達した。 60laGl (270 Ｋ_m改変) 1.75分後にｔ_1/2に達した。 60laK (354 熱安定性改変) 35分よりも長い時間が経過した後 にｔ_1/2に達した。 60laGlK (270＋354 改変) 10.5分後にｔ_1/2に達した。 上記データは、Ｋ_m値と共に次のリスト（他のデータに加えて）に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，Ａ Ｚ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロウ，クリストフアー・ロビン イギリス国、ケンブリツジシヤー・シー・ ビイ・２・１・キユー・テイ、ケンブリツ ジ、テニス・コート・ロード、ユニバーシ テイ・オブ・ケンブリツジ（番地なし) (72)発明者 ホワイト，ピーター・ジヨン イギリス国、ケンブリツジシヤー・シー・ ビイ・２・１・キユー・テイ、ケンブリツ ジ、テニス・コート・ロード、ユニバーシ テイ・オブ・ケンブリツジ（番地なし) (72)発明者 マリ，ジエイムズ・オーガスタス・ヘンリ ー イギリス国、ケンブリツジシヤー・シー・ ビイ・２・１・キユー・テイ、ケンブリツ ジ、テニス・コート・ロード、ユニバーシ テイ・オブ・ケンブリツジ（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基２７０、又は、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及 びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基２７２に相当する アミノ酸残基がグルタメート以外のアミノ酸であることを特徴とする、ルシフェ ラーゼ活性を有し且つＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍ ｉｎｇｒｅｌｉｃａ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ、又は、Ｌｕｃｉｏｌ ａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ からのルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して６０％を 越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質。 ２． 配列中の（１）がＤ又はＥであり、（２）がＴ又はＬであり、且つ、Ｘが グルタメート以外のアミノ酸残基である、アミノ酸配列：Ｆ（１）ＸＥ（２）Ｆ Ｌを有することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。 ３． 配列中のＸがグルタメート以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列ＴＰＸ ＧＤＤＫＰＧＡを有することを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。 ４． 前記アミノ酸残基Ｘがリシンであることをことを特徴とする請求項１、２ 又は３に記載のタンパク質。 ５． Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基２１５、又は、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａも しくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基２１７に相当 するアミノ酸残基が疎水性アミノ酸である請求項１から４のいずれか一項に記載 のタンパク質。 ６． Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基２１５、又は、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａも しくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基２１７に相当 するアミノ酸残基が、イソロイシン、ロイシン、バリン、又は、これらのいずれ かの類似体である請求項５に記載のタンパク質。 ７． Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５４、又は、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａも しくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５６に相当 するアミノ酸残基が、グルタメート以外のアミノ酸である請求項１か ら６のいずれか一項に記載のタンパク質。 ８． Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５４、又は、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ 、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａも しくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ ルシフェラーゼの残基３５６に相当 するアミノ酸残基が、リシン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジ ン、又は、これらのいずれかの類似体である請求項７に記載のタンパク質。 ９． 配列中のＸａａがリシンである、配列番号：２で記述されるアミノ酸配列 を含むタンパク質。 １０． 請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ 。 １１． 配列中の８１１から８１３までの３つの塩基Ｎがグルタメート以外のア ミノ酸をコードするコドンを形成する、配列番号：１で記述されるヌクレオチド 配列を含む請求項１０に記載のＤＮＡ。 １２． 前記コドンがリシンをコードする請求項１１に記載のＤＮＡ。 １３． 請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質を コードするｌｕｃ遺伝子を含むベクター。 １４． Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの２７０位のグルタ メート、又は、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒ ｕｃｉａｔａ あるいはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの２ ７２位のグルタメートをコードするコドンを別のアミノ酸に改変するための部位 特異的突然変異誘発によって、野生型又は組換えｌｕｃ遺伝子を含むベクターを 処理することによって得られる請求項１３に記載のベクター。 １５． 前記別のアミノ酸がリシンである請求項１４に記載のベクター。 １６． ｌｕｃ遺伝子がその中にライゲーションされているｐＫＫ２２３−３、 ｐＤＲ５４０及びｐＴ７−７から選択される請求項１３から１５のいずれか一項 に記載のベクター。 １７． 請求項１０から１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ又はベクターを含む 、請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質を発現させることが可能な 細胞。 １８． Ｅ．ｃｏｌｉ又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１７に記載の 細胞。 １９． 発光試薬中に含まれる請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク 質を含むことを特徴とするＡＴＰ測定による検定を行うためのテストキット。 ２０． ルシフェラーゼが請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質で あることを特徴とする、ＡＴＰ量にその量が関係している光を発生させるために ルシフェリンとルシフェラーゼを使用してＡＴＰを測定する検定方法。 ２１． 前記検定を３０℃から７０℃までの温度で行う請求項２０に記載の検定 方法。 ２２． 前記検定を３７℃から６０℃までの温度で行う請求項２０に記載の検定 方法。 ２３． 前記検定を４０℃から５０℃までの温度で行う請求項２０に記載の検定 方法。 ２４． 配列中のＸａａがアルギニン、グルタミン及びアラニンから選択される 配列番号：２で記述されるアミノ酸配列を含むタンパク質。