JPH10509025A - 固体表面に吸着された核酸の電気的に発生した化学ルミネッセンス性検出のためのバイオセンサーおよび方法 - Google Patents

固体表面に吸着された核酸の電気的に発生した化学ルミネッセンス性検出のためのバイオセンサーおよび方法

Info

Publication number
JPH10509025A
JPH10509025A JP8508822A JP50882296A JPH10509025A JP H10509025 A JPH10509025 A JP H10509025A JP 8508822 A JP8508822 A JP 8508822A JP 50882296 A JP50882296 A JP 50882296A JP H10509025 A JPH10509025 A JP H10509025A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
nucleic acid
film
metal
electrode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP8508822A
Other languages
English (en)
Inventor
アレン ジェイ． バード，
クシアオ−ホン ズ，
Original Assignee
アイジェン， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アイジェン， インコーポレイテッド filed Critical アイジェン， インコーポレイテッド
Publication of JPH10509025A publication Critical patent/JPH10509025A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Abstract

(57)【要約】 アルミニウムアルカンビスホスホネートフィルムで被覆された電極をss-DNA溶液に浸漬して、電極上に一本鎖DNAを固定化した。Ru(bpy)3 2+で標識された固定化ss-DNAを、トリ-n-プロピルアミンを含有する溶液中で酸化することにより生じる電気的に発生した化学ルミネッセンス(ECL)をモニターすることにより検出した。標識されていないss-DNAを固定化した後、相補的な標識されたDNA鎖をハイブリダイズさせ、表面にds-DNAを生成させた。DNAハイブリダイゼーションの程度を標識されたRu(bpy)3 2+のECLで測定した。表面に固定化したds-DNAもまた、インターカレートされたRu(phen)3 2+のECLを観察することにより検出し得た。透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、フィルムおよび固定化DNAを画像化した。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 固体表面に吸着された核酸の電気的に発生した化学ルミネッセンス性検出のため のバイオセンサーおよび方法発明の分野 本発明は、診断の分野に関し、そして特に核酸診断に関する。詳細には、本発 明は、金属中心を含有するフィルムを有するプローブまたはセンサー、１本鎖ま たは２本鎖核酸配列がフィルムに固定化されるプローブまたはセンサーの調製、 およびルミネッセンス性金属キレートで標識することによる、引き続く核酸の検 出におけるプローブまたはセンサーの使用に関する。 表面設計された修飾電気センサー（例えば、チップまたは電極）に基づく核酸 診断のための主題バイオセンサーを用いることに加えて、表面反応を介する、自 己組織化した薄いフィルム上でのDNAのような核酸の固定化およびハイブリダイ ゼーションもまた、DNAの分子認識を研究することにおいて有用である。発明の背景 核酸診断は、疾患および生物混入食物の決定ならびに法医学調査および環境調 査への応用をともなって、分子生物学およびバイオテクノロジー研究において重 要な領域になっている。新規なDNAバイオセンサーの開発は、いくつかの検出技 術の応用（例えば、光学的方法（例えば、ルミネッセンス、エリプソメトリー(e llipsometry)、および偽Brewster角反射率法（pseudo-Brewster angle reflecto metry））、圧電デバイス（例えば、SAW、QCM）、および電気化学的技術（例え ば、CVおよびSWV））を導いた。特に重要なものは、光化学的、化学的、および 電気化学的反応スキームによりルミネッセンスに行われ得る標識である。詳細に は、標識物質の存在を決定するための電気化学ルミネッセンス法は、多くの理由 から他の方法よりも好まれる。それらは、特定標識の存在の高度な診断法であり 、高感度であり、無害であり、安価であり、そして広範な種々の応用に用 いられ得る。適切な標識は、電気化学的ルミネッセンス性化合物（有機化合物お よび金属キレートを包含する）を含む。 例えば、電気化学的ルミネッセンス性のルテニウムおよびオスミウム含有標識 が、液体培地中の目的の分析物を検出および定量する方法に用いられている（米 国特許第5,310,687号；同第5,238,808号；および同第5,221,605号）。さらに、 ルテニウム含有標識とインターカレートした液相DNAの検出への電気的に発生し た（electrogenerated）化学ルミネッセンス（ECL）測定の応用が記載されてい る（Carter，M.T.ら、（1990）Bioconjugate Chem 2:257-263）。しかし、液相 で実行可能な反応スキームは、しばしば固相には適用され得ない。より重要なこ とは、DNAのような液相分析物の検出は、固体表面に吸着した分析物の検出と比 較していくつかの欠点を有する。溶液技術と対比して、固相技術を介するDNAの 検出に関する利点は：（1）より高感度である（単層量の検出）；（2）サンプル からDNAを分離し易い（干渉を避ける）；そして（3）局在化プローブによる、１ 回の分析におけるいくつかの異なるDNAの検出の可能性（例えば、配列決定研究 における）である。 これらのルミネッセンス系は、診断における重要性が増大している。例えば、 米国特許第4,372,745号では、化学ルミネッセンス性標識は、免疫化学の応用に 用いられる。この場合、標識はH2O2およびシュウ酸と反応することにより、この 標識はルミネッセンス性状態に励起される。これらの系では、H2O2は、シュウ酸 を高エネルギー誘導体に酸化的に転換し、次いでこの高エネルギー誘導体が標識 を励起する。原理的に、このH2O2およびシュウ酸の反応スキームは、アッセイの 酸化条件下で安定な任意のルミネッセンス性物質と作用するはずであり、そして 高エネルギーのシュウ酸誘導体により励起され得ると予測される。不幸なことに 、この融通性の非常な広さが、米国特許第4,372,745号の大きな欠点である：選 択性または特異性の欠失、すなわち、目的の分析物を含有する代表的な生物学的 液体はまた、高バックグラウンドレベルのルミネッセンスを引き起こし得る潜在 的なルミネッセンス性物質を多数含有する。 従って、固相系（例えば、バイオセンサー）、および（1）H2O2およびシュウ 酸反応スキームに依存する必要な特異性の非存在系を提供し；そして（2）溶液 技 術に依存しない必要な特異性の非存在系を提供する方法が必要とされる。本発明 は、先行技術の制限および欠点を克服する。発明の要旨 本発明は、バイオセンサー、ならびにルテニウムおよびオスミウム含有化学ル ミネッセンス性標識の使用を介する固体表面に吸着した核酸の電気的に発生した 化学ルミネッセンス検出のためのその使用を提供する。 本発明の目的は、アルミニウム中心に固定化された１本鎖または２本鎖DNAへ の結合のために、この金属性アルミニウム中心（すなわち、イオン性アルミニウ ムAl(III)中心）を有するアルミニウム（III）アルカンビスホスホネート層を含 有するフィルムを提供することである。アルミニウム（III）アルカンビスホス ホネートは、ss-DNAまたはds-DNAに結合する、Al2(C4BP)の被覆を有するバイオ センサーとして提供され得る。 本発明のさらなる目的は、ルミネッセンス性標識（例えば、オスミウムまたは ルテニウム成分）で標識されている吸着DNAを有するチップまたは電極の形態の バイオセンサーを提供することである。 本発明のさらなる目的は、クロム層および並置された金層を形成するシリコン ウェハーを処理し、次いで層状のウェハースと固定化剤とを接触させ；そして続 いて生成物をAl(NO3)3水溶液、ビスホスホン酸（H2O3P(CH2)4PO3H2）水溶液、お よびAl(NO3)3水溶液に浸漬することによりバイオセンサーを調製することである 。 本発明の他の目的は、ルミネッセンス性金属キレートで標識することによる核 酸の検出を包含する。 本発明のさらなる目的は、電気的に発生した化学ルミネッセンス技術を複数の （すなわち、配列された）オリゴヌクレオチドプローブに適用することである。 これらおよび他の目的は、以下の詳細な記載および図面からより明らかになる 。図面の簡単な説明 図１は、イオン性アルミニウムAl(III)部位を含有する本発明のシリコン電極 の模式図を示す。 図２は、Al2(C4BP)フィルム上のds-DNAの固定化、およびRu(phen)3 2+とds-DNA との相互作用を示す。 図3A〜3Cは、第１（A）、第２（B）、および第３（C）のスキャンを示す。0.1 3M TPrAを含有する0.19M リン酸緩衝液（pH 7）中におけるAl2(C4BP)/DNA-Ru(ph en)3 2+電極ECL発光ポテンシャルの応答（transient）。（各スキャン後、スキャ ンを停止させ、そして溶液を撹拌した。）スキャンを0Vで開始し、そしてよりポ ジティブなポテンシャルの方に向けた。スキャン速度：50mV/s。 図4A〜4Cは、Ru(bpy)3 2+を付けたss-DNAのフィルム上への固定化（図4A）；ss -DNAのフィルム上への固定化およびRu(bpy)3 2+を付けた相補鎖DNAのハイブリダ イゼーション（図4B）；ポリ（dA）のフィルム上への固定化、ポリ（dT）のハイ ブリダイゼーション、次いでds-DNA(ポリ(dA)・ポリ(dT)）（ここで・は、ECL活 性種を示す）とのRu(phen)3 2+の相互作用の模式図を示す。 図5A〜5Cは、サイクリックボルタモグラム（図5A）；0.19Mリン酸緩衝液/0.13 M TPrA（pH7）中のAl2(C4BP)/λ-１ ss-DNA-Ru(bpy)3 2+電極の発光ポテンシャル の応答（図5B）；および同じ溶液中のAl2(C4BP)/λ-１ ss-DNAの発光ポテンシャ ルの応答（図5C）を示す。図5A〜5Cに示される実験に用いられた電極を、それぞ れ、約４時間の1.38μM λ-１ ss-DNA-Ru(bpy)3 2+またはλ-１ ssDNA溶液に浸漬 して、本明細書に記載のように調製した。各々の場合において、ポテンシャルを 、v=50mV/sで0Vから1.60Vまでスキャンした。 図６は、0.19M リン酸緩衝液/0.13M TPrA(pH 7)中のAl2(C4BP)/λ-１ ss-DNA- Ru(bpy)3 2+電極に関する発光-時間応答を示す。このとき、ポテンシャルを、0V から1.5Vまで上げた。 図7Aおよび7Bは、Al2(C4BP)/λ-1c ss-DNA/λ-１ ss-DNA-Ru(bpy)3 2+電極（図 7A）およびAl2(C4BP)/λ-１ ss-DNA/λ-１ ss DNA-Ru(bpy)3 2+電極（図7B）での ECL発光ポテンシャルの応答を示す。ここで両方の電極は、0.13 M TPrAを含有す る0.19Mリン酸緩衝液（pH 7）に浸漬されており、そしてポテンシャルを、スキ ャン速度50Mv/sで0Vから1.60Vまでスキャンした。 図8Aおよび8Bは、Al2(C4BP)/ポリ(dA)/ポリ(dT)/Ru(phen)3 2+電極（図8A）お よびAl2(C4BP)/ポリ(dA)/Ru(phen)3 2+電極（図8A）でのECL発光ポテンシャルの 応答 を示す。この場合、両方の電極は、0.13M TPrAを含有する0.19Mリン酸緩衝液（p H 7）に浸漬されており、そしてポテンシャルを、スキャン速度50mV/sで0Vから1 .60 Vまでスキャンした。 図9A〜9Cは、#400 Cuグリッド上のFormvarフィルム上に被覆したAu基材のTEM 像（図9A）；Au基材上のAl2(C4BP)フィルムのTEM像（図9B）；1.65mM[NP]のds-D NA溶液中に約４時間フィルムを浸漬することにより調製された、Al2(C4BP)フィ ルム上に固定化されたウシ胸腺ds-DNA（図9C）のTEM像を示す。 図10A〜10Cは、Formvarフィルム上に被覆したAu基材上のAl2(C4BP)フィルムの TEM像（図10A）；1.65mM[NP]のds-DNA溶液中に約４時間フィルムを浸漬すること により調製された、Al2(C4BP)フィルム上に固定化したウシ胸腺ds-DNAのTEM像（ 図10B）；室温で約６時間超音波処理した、1.65mM[NP]のds-DNA溶液中に約４時 間フィルムを浸漬することにより調製された、Al2(C4BP)フィルム上に固定化し た超音波処理したウシ胸腺ds-DNA（図10C）のTEM像を示す。 図11A〜11Bは、配列ハイブリダイゼーションを介する配列決定を示す。発明の詳細な説明 本発明はセンサーおよびこのセンサーを用いる核酸の検出方法に関する。セン サーは、チップ、電極、あるいはss-DNAまたはds-DNAを吸着するために適切に修 飾された表面であり得る。本発明の方法で検出される核酸としては、DNA、cDNA 、あるいはこれらの任意の合成変異体が挙げられる。本願明細書および請求の範 囲全体で使用される核酸はDNAまたはその任意の合成変異体を意味する。 本発明の方法で検出され得るDNAの例としては、染色体DNA、プラスミドDNA、 ウイルスDNA、バクテリアDNA、および組換えDNAが挙げられる。本発明の方法で 検出され得る核酸配列の長さの範囲は、約2.7nmから約200nmである。好適な実施 態様においては、核酸配列の範囲は８塩基対(bp)ヌクレオチドから3,000塩基対 ヌクレオチドである。最も好適な実施態様においては、核酸配列の範囲は約30bp ヌクレオチドから1,500bpヌクレオチドである。 本発明において、検出される核酸配列は、精製された核酸であり得るか、また は生物学的サンプル中に存在し得る。本発明の方法を用いて検出され得る核酸が 存在する生物学的サンプルとしては、生物学的流体、例えば、血清、唾液、毛髪 、皮膚などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、核酸は当業者に 公知の方法（Current Protocols in Electrobiology(1994編。Ausubel，F.M.ら 、John Wiley & Sons，Inc))を用いて、サンプルから精製され得る。 好適に用いられるアルミニウム(III)アルカンビスホスホネート（Al2(C4BP)、 ならびに[Al2C4BP]）は、フィルム生成バイオセンサーであり、以下のように調 製され得る。シリコンウエハーをトリクロロエチレン中に30分間浸漬し、2-プロ パノールで２回すすぎ、過剰量の脱イオン水ですすぎ、次いで乾燥窒素気流で乾 燥した。清浄なシリコンウエハーを50Åのクロム層で、次いで2000Åの金の層を 被覆させることによって、下塗りした。MRCモデル8620システム中、10-2トル(to rr)で、クロムと金(99.999%)とを用いてフィルムをウエハーにスパッターした。 Au層あるいはCr層に塗布するための、例えば、化学蒸着(CVD)などの別の技法も また、用いられ得る。 シリコンウエハー上に支持される金表面を、熱クロム酸（90％H2SO4中の飽和K2 Cr2O7）で、約10秒間、清浄にし、次いで多量の水ですすいだ。このプロセスを 繰り返して、水の表面接触角が15°未満となるようにした。次いで、清浄Au表面 を直ちに固定化剤（無水アルコール中の0.5mM 4-メルカプトブチルホスホン酸(M BPA)溶液）で、約24時間浸漬した。図１を参照のこと。次いでリン酸末端表面全 体をエタノールですすぎ、N2気流で乾燥し、次いで、交互に、5mM Al(NO3)3水溶 液、5mM ビスホスホン酸(H2O3P(CH2)4PO3H2）水溶液および5mM Al(NO3)3水溶液 に、それぞれ約４時間浸漬し、それぞれの工程の間は、水で洗浄した。好適な実 施態様はAl中心の使用を意図するが、他の金属中心（例えば、ランタン(La)およ びジルコニウム(Zr)）もまた、意図される。さらに、C4種がアルカンビスホスホ ネートフィルムの生成に用いられたが、他の結合鎖、C2-C16も用いられ得、フィ ルムの表面上のアルミニウムイオンの適切なスペースを形成して、DNAバックボ ーンのホスフェートと接触させる。換言すれば、「スペーサー」は、２から16の 炭素長の範囲をとり得る。 上記センサーは以下のように用いられる： a)核酸を金属中心を含有するフィルム上に吸着させる； b)このフィルムに吸着した核酸をルミネッセンス性の金属標識と反応させる； そして、 c)工程b)で形成された核酸金属標識キレートを、このキレートの電気的に発生 した化学ルミネッセンスを介して検出する。 工程a)において、核酸が吸着したフィルムは金属イオンを含有するが、この金 属イオンは、フィルムの表面上に適切に配置され、金属と核酸配列のバックボー ンホスフェート基とが相互作用できるようになる。核酸のホスフェート基と結合 するために用いられる適切な金属中心の例は、アルミニウム、ランタニウム、お よびジルコニウムである。好適な実施態様では、フィルムはアルミニウムAl(III )金属中心を含有する。 本発明の方法の工程a）でフィルムに吸着される核酸は、二本鎖か、または一 本鎖かのどちらかであり得る。フィルムに一本鎖核酸が吸着したとき、吸着した 一本鎖核酸は、次いで相補的な一本鎖核酸配列とハイブリダイズする。フィルム に吸着した一本鎖DNAとその相補配列間の塩基対形成を促進するハイブリダイゼ ーション条件が用いられる。核酸配列間のハイブリダイゼーションに影響する因 子は当業者に公知であり、このような因子としてはハイブリダイゼーション溶液 の塩濃度、ハイブリダイゼーション温度、およびハイブリダイゼーション後の洗 浄の緊縮度が挙げられる。さらに、ハイブリダイゼーションの長さもまた、結合 を最適化するように制御され得る。ハイブリダイゼーション反応を行う十分な緩 衝液としては、50mM NaClを含む5mMトリス緩衝液(pH ７)が挙げられる。 フィルムに吸着した核酸とハイブリダイズする相補的な一本鎖核酸配列は、標 識されていないか、ルミネッセンス性金属標識で標識され得る。好適なルミネッ センス性標識としては、ルテニウム含有およびオスミウム含有標識が挙げられ、 ルテニウムまたはオスミウムは少なくとも一つの多座配位子と結合している。金 属が一つを越える多座配位子を有している場合、多座配位子は同じであるか、異 なり得る。（他の既知のECL活性標識もまた用いられ得、この標識は、異なる波 長で放射する有機ECL標識、例えば、スルホン化-9,10-ジフェニルアントラセン である）。ルテニウムあるいはオスミウムのどちらかの多座配位子としては、芳 香族リガンドおよび脂肪族リガンドが挙げられる。適切な芳香族多座配位子とし ては、芳香族複素環リガンドが挙げられる。好適な芳香族多座配位子は窒素を含 有しており、例えば、ビピリジル、ビピラジル、ター(ter)ピリジル、およびフ ェナントロリルなどである。金属キレートが一つを越える多座配位子を有する場 合、多座配位子は同じか、または異なり得る。 適切な多座配位子は、置換されていないか、または当業者に公知の多数の置換 基のいずれかで置換され得る。適切な置換基としては、例えば、アルキル、置換 アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシ ル、カルボキシアルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、 イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジニウム 、ウレイド、硫黄含有基、リン酸含有基、およびN-ヒドロキシスクシンイミドの カルボキシルエステルが挙げられる。 ルテニウムあるいはオスミウムは１またはそれ以上の単座配位子を有し得、こ の種々の幅広い配位子が当業者に知られている。適切な単座配位子は、例えば、 一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハライド、ならびに脂肪族、芳香族、お よび複素環ホスフィン、アミン、スチビン、およびアルシンである。本発明に用 いられ得るより完全なリガンドのリスト（例えば、単座配位子および多座配位子 ）は、米国特許第5,310,687号、第5,238,808号、および第5,221,605号に記載さ れており、この主要な内容は本願明細書に参考として援用される。 例えば、放射性同位元素、蛍光化合物などの付加的な化学標識、あるいは付加 ルミネッセンス性ルテニウム中心を含有するまたは付加ルミネッセンス性オスミ ウムを含有する中心に結合される１またはそれ以上の金属リガンドも、本発明の 範囲内である。 相補的な一本鎖核酸は、本発明の好適なルミネッセンス性金属標識で標識され 得るが、これは、１つまたはそれ以上のアミド結合によって、金属標識の１つま たはそれ以上の多座配位子と共有結合することによる。この結合は、核酸が直接 カルビノールに結合するか、あるいはアミド結合の窒素に直接結合するように、 配向され得る。これらの化学部位はイオン化され得る。ルミネッセンス性ルテニ ウム含有またはオスミウム含有標識を生物学的物質（核酸など）のアミノ基へ結 合する方法は、より詳細に、米国特許第5,221,605号に記載されており、本願明 細書に参考として援用される。 別の実施態様では、相補的な一本鎖核酸は標識されておらず、そして、フィル ムに吸着された一本鎖核酸へのハイブリダイゼーションの結果、標識されていな い二本鎖核酸がフィルムに吸着することになる。このように、二本鎖核酸が直接 フィルムに吸着され得るか、あるいは、まず、一本鎖核酸がフィルムに吸着し、 次いで、この吸着された核酸とその相補的な配列とをハイブリダイズさせて、二 本鎖核酸が作成され得る。どちらの場合においても、吸着した二本鎖核酸を含有 するフィルムは、次いで、ルミネッセンス性金属標識を含有する溶液か、または 金属と二本鎖核酸とのインターカレーションを促進するに適切な溶液に浸漬する 。適切な溶液の例としては、水が挙げられるが、これに限定されない。 ルミネッセンス性金属を含む標識がインターカレートして核酸--金属標識キレ ートを生じる核酸は、次いで、キレート中に存在する金属標識を誘導して電磁放 射線を発光することにより検出されるが、これは、室温で、約200nmから約900nm の波長でルミネッセンスを発する金属種の励起状態を作り出すことにより、行わ れる。ECL標識種とDNAとの間のインターカレーション（または、より一般的には 、会合）は、標識が部分的にDNAの塩基対の間に挿入される実験条件に依存して いる。これは、正に帯電した標識と負に帯電したDNA上のホスホネート基との間 の静電的相互作用による「会合」と考えられる。Ru(phen)3 2+とDNAとの相互作用 の正確な性質は不明確であるが、インターカレーションと考えられている。温度 は、ds-DNAの融点よりも低くなければならず、好適には約25〜30℃である。pHは 、典型的には、７付近であるが、約５から約８の範囲であり得る。インターカレ ーション反応または会合反応が生じるためには、十分な時間が必要である；約30 から約60分であるが、10分程度の短い時間でも働く。 本発明の一つの実施態様においては、金属標識は核酸−金属標識キレートを電 気化学的エネルギーに曝すことにより励起される。金属標識の酸化が起こる電位 は、金属標識の正確な構造、ならびに、使用する共反応物、溶液のpH、および使 用する電極の性質などのファクターに依存する。適切な共反応物の例は、電気化 学的エネルギー存在下で核酸-金属標識キレートとともにインキュベートしたと きに、核酸とインターカレートした金属標識がルミネッセンスするものであり、 適切な共反応物としては、例えば、トリプロピルアミン(TPrA)、オキサレートま たは他の有機酸（例えば、ピルベート、ラクテート、マロネート、タータレート およびシトレート）が挙げられる。この酸化は、PbO2またはCe(IV)塩などのいく つかの強力な酸化剤と化学的に行い得る。 当業者は、電気化学的ルミネッセンス系における最適な電位およびルミネッセ ンス波長をどのようにして測定するかを認識している。電気化学的ルミネッセン ス種は、適切な機構（例えば、電流の測定または発光した電磁放射線の測定）で 測定され得る。例えば、系にインプットされたエネルギーの速度によって、ルミ ネッセンス種が測定され得る。適切な測定としては、例えば、ルミネッセンス種 が電気化学的に生じたときには電流の測定、ルミネッセンス種が化学的に生じた ときには還元剤または酸化剤の使用速度、または光ルミネッセンス技法における 電磁エネルギーの吸収が挙げられる。さらに、もちろん、ルミネッセンス種は発 光した電磁放射線を測定することにより、検出され得る。これらの測定のすべて は、連続的な速度基準測定として、または長時間にわたるシグナルを蓄積する累 積方法としてのいずれかで行い得る。速度基準測定の例は、光増感チューブ、フ ォトダイオード、フォトランジスターを用いて、入射した光強度の大きさに比例 する電流を生じることによる。累積方法の例は、速度基準データの積分および累 積データを直接提供する写真フィルムの使用である。 これらのすべてのルミネッセンスを基準とする方法は、ルテニウム含有化合物 による反復ルミネッセンスを伴う。検出され得る事象の反復性は、これらの標識 と放射性同位元素または結合した化学ルミネッセンス性物質（例えば、ルミノー ル）とを区別する。後者の標識は標識の一分子（または原子）あたり、たった一 回の検出され得る事象を生成し、これによりその検出能力が制限される。 以下の実施例は、本発明の種々の局面を例示して説明するが、本発明の範囲を 制限する意図はない。本発明のフィルム、金属成分（例えば、Al）を含有するシ リコンウエハー上に支持された金表面を用いて、ECLおよび電気化学的研究のた めに設計されたプレキシガラスセル中で分析を行った。飽和塩化水銀参照電極(S CE)と白金線対向電極をすべての測定に用いた。ECL実験と組み合わせた電気化学 的測定を、Model 175 ユニバーサルプログラマー、Model 173 電位差計(potenti ostat)(Princeton Applied Research，PAR，Princeton，NJ)、およびOminigraph ic 2000 X-Y recorder(Houston Instruments，Houston，TX)を用いて行った。EC L発光は、Model C123 single-photon-counting system（Hamamatsu Corp.，Brid gewater，NJ）により検出し、Hamamatsu R928P PMTを、Model TE 308 TSRF cool er controller(Research Inc.，Danvers，MA社製)中で-20℃に冷却して用いた。 計量値をx-yレコーダーのy軸に入力し、電位差計からのシグナルをｘ軸に入力し てECl強度対バイアス電位を表示した。EClによる溶液分析は、QPCR 分析器(Perk in-Elmar，Norwalk，CT)を用いて行った。 MRC(Materials Research Corporation，Orangeburg，NY)Model 8620 スパッタ リングシシテムを、10-2トルで、150WのRFパワーおよびRFのピークからピークへ の電圧が1.8KVの条件で用いて、金(99.999%)をシリコンウエハーにスパッターし た。 ポリデオキシアデニル酸(Poly(dA))、ポリチミジル酸(Poly(dT))、ポリデオキ シシチジル酸(Poly(dc))およびウシ胸腺(CT)ss-DNAおよびds-DNAを、Sigma Chem ical Co.(St．Louis，MO)から入手し、さらに精製することなく使用した。ss-DN Aサンプル、λ-１ DNA(5’GAAAATGTGCTGACCGGACATGAAAATGAG3’)（配列番号：１ ）、Ru(bpy)3 2+で標識されたλDNA（5'Ru(bpy)3 2+- GAAAATGTGCTGACCGGACATGAAA ATGAG 3'）(配列番号：２)および相補鎖λ-1c DNA(5’CTCATTTTCATGTCCGGTCAGCA CATTTTC 3')を、Perkin Elmerから入手し、50mM NaClを含有する5mM トリス緩衝 液(pH7.0)で希釈した。ss-DNAの合成は、DNA合成機で行った（例えば、Applied Biosystems，Model 381A）。L.J．McBride および M.H．Cruthers，Tetrahedron Letters，24，245(1983)も参照のこと。 以下の実施例に用いた試薬としては、トリクロロエチレン(99.6%)、2-プロパ ノール(99.9%)、トリプロピルアミン(TPrA)(98%)、Ru(bpy)3Cl2・6H2O、Ru(phen)3 Cl2O、エチルアルコール(200proof)、Al(NO3)3・9H2O、K2Cr2O7、NaH2PO4、およ びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられ、入手したまま精製する ことなく使用した。ビスホスホン酸 H2O3P(CH2)4PO3H2(C4BPA)および4-メルカプ トブチルホスホン酸(MBPA)を、Malloukら、J.A.C.S.，115，11855(1993)に教示 されている技術に従って合成した。ECL実験に用いたアッセイ緩衝液は、0. 13M TPrAおよび0.19M リン酸緩衝液を含有しており、TPrAをNaH2PO4溶液に溶解 し、そして1M NaOHでpHを７に調整することにより調製した。 Millipore Milli-Q(18 MΩ-cm)システムからの脱イオン水を用いて、すべての 水溶液を調製し、電極表面をすすいだ。 TEMサンプル調製 減圧エバポレーター(Edwards 306)を用いて、#400 Cuグリッド上のFormvarフ ィルム上にAuをコーティングし、Al2(C4BP)フィルムを、上記の手順のあとでAu の上に組み立て、次に、Al2(C4BP)フィルム上にDNAを固定化することによりTEM サンプルを調製した。透過型電子顕微鏡(JEOL 100CX)を80KVで用いて、Au基材、 Al2(C4BP)フィルムおよび固定化DNAの画像化に用いた。 実施例１ ルテニウム標識を用いた固定化ds-DNAの電気的に発生した 化学ルミネッセンス検出 子ウシ胸腺ds-DNAを、Al2(C4BP)フィルムの表面に、DNA溶液（ヌクレオチドホ スフェート（NP）で1.9mM）中にフィルムを４時間浸漬することにより固定化し た（図１および図２）。次いで、フィルムを一回につき４mLの脱イオン水で３回 すすぎ、次いで、0.56mMのRu(phen)3Cl2水溶液または0.12mMのRu(phen)3(ClO4)2 MeCN溶液のいずれかに４時間浸漬した。Ru(phen)3 2+は、ds-DNAと会合し、その 電気的に発生した化学ルミネッセンス（ECL）により検出され得る。あるいは、 フィルムをds-DNA（1.9mM NP）およびRu(phen)3Cl2（0.12mM）の混合溶液に４時 間浸漬し、吸着層を生成し得た。 フィルム形成、DNA吸着、およびRu(phen)3 2+会合後の電極のポテンシャルを、 飽和カロメル電極（SCE）に対して０Ｖ〜1.6ＶまでスキャンすることによりECL を生成した。しかし、それは、0.13Mのトリ-n-プロピルアミン（TPrA）を含む0. 19Mのリン酸緩衝液（pH7）の溶液中に浸漬された。単光子計測装置（single-pho ton-counting apparatus）で検出される代表的なECL応答を、図3A〜図3Cに示す 。発光は、電気的に発生したRu(phen)3 3+とTPrAの酸化における中間体との間の エネ ルギー的電子移動反応から生じる。 発光強度は、第２のスキャンにおいて減少し、そして第３のスキャンでは何も見 出されず、フィルムからのRu(phen)3 3+の喪失およびバルク溶液中への拡散を示 唆した。 コントロール実験では、DNAで処理されていないAl2(C4BP)フィルムを有する電 極を、0.56mMのRu(phen)3 2+水溶液または0.12mMのRu(phen)2+MeCN溶液のいずれ かに４時間浸漬し、次いで、MeCNおよび水ですすいだ。この電極は、上記の同じ TPrA溶液中でポテンシャル範囲（potential sweep）においてECL発光を示さず、 Al2(C4BP)フィルム上でRu(phen)3 2+の吸着が起こらないことを示す。このECL実 験におけるRu(phen)3 2+を電気化学的に発生させる能力は、Al2(C4BP)フィルムお よびDNA層は、不均一な電子移動反応を妨害しないことを示す。 Al2(C4BP)フィルム形成およびDNA固定化についてのさらなる証拠を得るために 、金コート石英結晶および石英結晶微量天秤（QCM）を用いて実験を行った。金 を熱クロム酸で、くり返し処理し、次いで、表面が親水性（接触角測定により示 される）になるまで水およびEtOHですすいだ。次いで、DNA吸着後およびRu(phen )3 2+会合後、結晶周波数をAl2(C4BP)フィルム形成の異なるの段階の間、大気中 で測定した。フィルムは、各段階後、脱イオン水ですすぎ、そして周波数を測定 する前にＮ2気流により乾燥した。結果を表１に示す。 明らかに、結晶周波数は、Al2(C4BP)フィルムが形成され、そしてDNAおよびRu(p hen)3 2+が表面に吸着されるにつれて減少し、異なる段階の間に結晶の質量の増 加を示す。 質量変化（Δｍ）は、Sauerbrey式により、周波数変化（Δｆ）に関係づけられ 得る： ここで、Ｆ0は、無負荷結晶の基本周波数（６MHz）であり、Ａは電極面積（0.15 9cm2）であり、ρqは石英の密度（2.65g/cm3）であり、μqは石英の剛性率(2.95 ×1011dyne/cm2)である。これらの定数より、 このように計算された質量変化をまた、表１に示す。これらは、２の粗さファク ター（すなわち、0.6cm2の石英結晶の両側面の全表面積）を仮定することにより 、おおよその表面濃度（Γ）に変換され得る。Al2(C4BP)フィルム形成、DNA吸着 、およびRu(phen)3 2+会合のための基材として用いられ、TPrA溶液中でスキャン されるとき、ECLはまた、石英結晶の金の両面から検出され得る。 電極表面は、ディテクター分子Ru(phen)3 2+の吸着なしに、固定化DNAにより設 計され得る。表面上のds-DNAは、会合したRu(phen)3 2+の電気的に発生した化学 ルミネッセンスにより検出され得る。一本鎖DNAはまた、Al2(C4BP)フィルム表面 上に固定化され得、次いで、ECLにより生成されたds-DNAの検出を伴って、溶液 中＋で相補的DNAとハイブリダイズされ得る。 実施例２ 一本鎖DNAの固定化およびハイブリダイゼーション λ-1標識（すなわち、Ru(bpy)3 2+で標識された）ss-DNAを、本発明のアルミニ ウムホスフェートフィルム上に、フィルムをDNA溶液に浸漬することにより固定 化した（図４Ａ）。表面上の固定化DNA-Ru(bpy)3 2+の量を、溶液中でのRu(bpy)3 2+ およびTPrAとの酸化から生じたECLにより決定した。 標識されていないλ-1c ss-DNAを、本発明のアルミニウムホスフェート上に固 定化した。フィルムを含むλ-1c ss-DNAを、相補鎖λ-1標識ss-DNA溶液を60℃で ５分間インキュベートし、次いで、徐々に室温まで冷却した。この冷却の間、ss -DNAは、相補鎖DNAとハイブリダイズした（図４Ｂ）。ハイブリダイズしたDNA-R u(bpy)3 2+を、上記のようにECLにより検出した。 ポリ（dA）を、本発明のアルミニウムホスフェートフィルム上に、フィルムを ポリ（dA）溶液に浸漬することにより固定化した。固定化後、ポリ（dT）はポリ （dA）とハイブリダイズし、70℃で５分間ポリ（dT）溶液中でフィルムをインキ ュベートすることにより、表面上でポリ（dA）・ポリ（dT）ds-DNAが生成し、次 いで、徐々に室温まで冷却した（図４Ｃ）。Ru(phen)3 2+をds-DNA（ポリ（dA） ・ポリ(dT)）にインターカレートするために、Al2(C4BP)/ポリ（dA）・ポリ（dT ）フィルムを、Ru(phen)3 2+溶液で処理した。表面上のハイブリダイズしたポリ （dA）・ポリ（dT）−Ru(phen)3 2+を、溶液中のRu(phen)3 2+およびTPrAの酸化に 基づいてECLにより決定した。 実施例３ アルミニウムホスフェートフィルム上で固定化された 30bp ss-DNA の固定化および検出 上記のように調製されたアルミニウムホスフェートフィルムを、1.38μMのλ- 1 30bp（Ru(bpy)3 2+で標識した）ss-DNA溶液中に約２時間浸漬した。これを、0. 13Ｍ TPrAを含む0.19Ｍリン酸緩衝液（pH７）中のECL実験のための作用電極とし て用いた。サイクリックボルタモグラムおよび発光中間体を、飽和カロメル電極 （SCE）に対して０〜1.6Ｖの電極ポテンシャルをスキャンすることにより得た。 単一光子計測システムにより検出される代表的なボルタモグラムおよび発光を、 図５Ａ〜図５Ｂに示す。広範囲の酸化は、-1.2Ｖにおいてであり、そしてボルタ モグラム（図５Ａ）で-3.5Ｖにおいて観察される小さな還元波は、TPrA、Ru(phe n)3 2+、およびAu基材の酸化、ならびにAuの酸化物の還元から起こる。Al2(C4BP) /λ-1 ss-DNA-Ru(phen)3 2+電極（図５Ｂ）からのECL発光は、λ-1 30bp ss-DNA が フィルム上に固定化されたことを示す。時間(t)の関数としての光強度(I)の減衰 はまた、単一光子計測システムで調査される。光増幅管により検出される光強度 は、ポテンシャルが０Ｖから1.50Ｖにすると、時間と共に減少する（図６）。時 間と共に強度が減衰することは、電極表面からのss-DNA-Ru(bpy)3 2+の脱離また は発光体の不可逆的分解を示唆する。発光は、電気的に発生したRu(bpy)3 3+とTP rAとの酸化における中間体の間のエネルギー的電子移動反応から生じる； 非標識ss-DNAの溶液（1.38μM λ-1 30bp ss-DNAまたは0.37μM λ-1c 30bp ss- DNA）中にフィルムを浸漬することにより調製されるフィルムから、ECLは全く観 察されなかった（図５Ｃ）。 304nM DNA-Ru(bpy)3 2+溶液に約４時間浸漬されたアルミニウムホスフェートフ ィルムによるコントロール実験は、無視し得るECLシグナルを示す。これは、Ru( bpy)3 2+がフィルム上に吸着せず、酸化もしないことを示す。 実施例４ ルテニウム標識を用いて標識した相補的ss=DNAにハイブリダイズする30bp ss- DNAの検出 非標識λ-1c 30bp ss-DNAのAl2(C4BP)フィルム上に固定化した後、フィルムを 、1.38μMの（Ru(bpy)3 2+で標識した）相補鎖ss-LNA（λ-1 30bp ss-DNA-Ru(bpy )3 2+）溶液中に浸漬した。溶液中のフィルムを、水浴中で60℃まで徐々に加熱し 、60℃で5分間インキュベートし、次いで室温までゆっくり冷却した。その間に 、λ-1 ss-DNA-Ru(bpy)3 2+は、図４Ｂに示すように、表面上の相補鎖λ-1c ss-D NAとハイブリダイズした。ハイブリダイズしたDNAを有するフィルムを、上記の よ うに、ECLセルにおける作用電極として用いた。フィルムからのECL発光は、図７ Ａに示すように観測された。しかし、λ-1 ss-DNA（λ-1c ss-DNAではない）を フィルム上に固定化し、その後、λ-1 30bp ss-DNA-Ru(bpy)3 2+溶液中でフィル ムをインキュベートし、60℃に加熱し、次いで室温まで冷却することによる、上 記と同じハイブリダイゼーション手順を行った場合、図７Ｂに示すように、明瞭 なECL発光は明らかではなかった。このことは、図７ＡにおけるECL発光が、溶液 中で、固定化λ-1c ss-DNAのλ-1 ss-DNA-Ru(bpy)3 2+とのハイブリダイゼーショ ンから生じていることを示す。この発光はまた、式[６]〜[10]により表わされる ように、溶液中で、Ru(bpy)3 2+標識され、ハイブリダイズしたss-DNAとTPrAとの 酸化から生じる。この実験において、Al2(C4BP)／λ-1 ss-DNA電極がλ-1 ss-DN A-Ru(bpy)3 2+にさらされる前に、Al2(C4BP)フィルムを十分に長い時間（少なく とも４時間）の間λ-1 ss-DNA溶液中でインキュベートし、フィルム上のすべて の可能なAl(III)の結合部位をλ-1 ss-DNAで覆うべきである。いくらかのss-DNA -Ru(bpy)3 2+の固定化から生じるフィルム／λ-1 ss-DNA／λ-1 ss-DNA-Ru(bpy)3 2+ からの発光を避けるために、すべてのAl3+吸着部位を覆うことが好適である。 実施例５ ルテニウム標識を用いるポリ(dT)にハイブリダイズするポリ(dA)の検出 上記のように調製されたリン酸アルミニウムフィルムを、21μMポリ(dA)溶液 中に約４時間、次いで0.24mMのRu(phen)3 2+溶液に約４時間浸漬した。Al2(C4BP) ／ポリ(dA)／Ru(phen)3 2+フィルムを、0.13Ｍ TPrAを含有する0.19Ｍリン酸緩衝 液（pH７）の溶液中での作用電極として用いた場合、ECL発光は観測されなかっ た(図８Ａ)。このことは、Ru(phen)3 2+とss-DNAとの会合がないことと一致する 。しかし、ポリ(dT)のみとハイブリダイズしてds-DNAを形成するポリ(dA)のフィ ルムは、ECLをまさに生じた。ポリ(dA)溶液に中に浸漬することにより形成され たこのフィルムを、38μMポリ(dT)溶液中でインキュベートした（水浴中で70℃ まで徐々に加熱し、70℃で５分間インキュベートし、次いで室温までゆっくり冷 却した）。次いで、0.24mMのRu(phen)3 2+水溶液で処理し、そしてECL調査のため のTPrA含有リン酸緩衝液中における作用電極として用いた。ECL発光は代表的な 発光 過程（図８Ｂ）に示すように観測された。このことは、溶液中のポリ(dT)が、表 面上のポリ(dA)とハイブリダイズして、ds-DNA[ポリ(dA)・ポリ(dA)]、および図 ４Ｃに示すようなds-DNAとインターカレートしたRu(phen)3 2+が生成したことを 示す。 これらの例は、Ru(phen)3 2+が、ss-DNA(ポリ(dA))とではなく、ds-DNA[ポリ(d A)・ポリ(dT)]とのみインターカレートすることを示す。ss-DNAおよびds-DNAと のRu(bpy)3 2+のインターカレーションおよびECL発光を、43nMのRu(phen)3 2+溶液 、57μMの子ウシ胸腺ss-DNAヌクレオチドホスフェート（[NP]）を含有する43nM のRu(phen)3 2+、および33μM［NP］の子ウシ胸腺ds-DNAを含有する43nMのRu(phe n)3 2+からQPCR分析計を用いて測定した。結果を表２に示す。 この表は、ds-DNAがRu(phen)3 2+溶液に添加された後、ECL放射が減少したことを 示す。しかし、ECLシグナルにおける無視できる変化が、ss-DNAを添加した場合 に見られる。このことは、さらに、Ru(phen)3 2+が、ss-DNAとではなく、ds-DNA とのみインターカレートすることを示す。 ポリ(dA)の固定化後のフィルムをポリ(dT)の代わりに21μMのポリ(dA)または4 6μMのポリ(dC)溶液中でインキュベート（70度で５分、継いで室温まで冷却）し 、次いでRu(phen)3 2+で約2時間処置したコントロール実験は、ECL発光を生じな い。 このことは、Al2(C4BP)／ポリ(dA)電極は、ポリ(dT)DNAの相補鎖を非相補鎖から 区別し得ることを示す。 実施例６ フィルムおよび子ウシ胸腺ds-DNAのTEM像 真空エバポレーターを用いて#400 Cuグリッド上のFormvarフイルムにAuをコー トし、上記のようにこのAu上にリン酸アルミニウムフィルムを製作し、次いでAl2 (C4BP)フィルムを子ウシ胸腺ds-DNAの1.65mM[NP]に約4時間浸漬することにより DNAをAl2(C4BP)フィルム上に固定化することにより調製されたサンプルを、80KV での透過電子顕微鏡(TEM)により映像化した。図９Ａ〜９Ｃに示すように、特徴 のないAu基材(図９Ａ)は、Al2(C4BP)フィルムの結晶島（図９Ｂ）およびDNAの塊 (clump)（図９Ｃ）の形成を示す。次いで、フィルム（図10Ａ）を、1.65mM[NP] の子ウシ胸腺ds-DNA(図10Ｂ)または６時間の超音波処理に供していたds-DNAの同 一溶液(図10Ｃ)のいずれかで処理した。結果は、超音波処理後、DNAのより小さ な塊がフィルム上に吸着することを示す。 本発明のさらなる実施態様を、図11Ａおよび図11Ｂに示す。結合基を有する多 層フィルムを有するセンサー表面は、ds-DNAの吸着およびss-DNAの吸着のために 、上記の同様な技術を用いるオリゴヌクレオチドプローブの完全なセットが備え られる。図11Ａ参照。図11Ａのセンサー表面は、配列決定されるべきDNAと接触 する。次いで、上記の開示されたECL手順を用いて、相補配列を有する領域(zone )を認識する。(図11Ｂ)。 チップを使用する場合、テスト配列をなす異なるタイプのss-DNAをチップの表 面に結合させて、整列させる。次いで、チップ列を、配列決定すべきサンプル溶 液に曝し、適切な位置でds-DNAの形成をECLアプローチにより認識する。 本発明を特定の実施態様と一緒に記載してきたが、多くの変更および変化は、 前記の記載に照らして当業者には明らかであることは明白である。従って、本発 明は、添付の請求項の精神および範囲内にあるすべての変更および変化を含むこ とが意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５Ｇ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．核酸の検出方法であって、 a.金属中心を有するフィルムを含有するセンサーの表面を形成する工程； b.該金属中心上に少なくとも一つの核酸を吸着させる工程； c.該フィルムに吸着した核酸とルミネッセンス性金属標識とを反応させる工程 ；および d.工程(c)で形成した核酸金属標識キレートを、該キレートの電気的に発生し た化学ルミネッセンスを介して検出する工程、 を包含する方法。 ２．前記工程(b)の核酸が二本鎖である、請求項１に記載の方法。 ３．前記工程(b)の核酸が一本鎖である、請求項１に記載の方法。 ４．工程(c)が、さらに、前記フィルムに吸着した一本鎖の核酸を相補的な一本 鎖の核酸配列に結合させる工程を包含する、請求項３に記載の方法。 ５．前記電気的に発生した化学ルミネッセンスが、核酸-金属標識キレート中で 電気的に生成した金属標識と適切な共反応物との反応から生じる、請求項１に記 載の方法。 ６．前記電気的に発生した金属標識が、電極であるセンサーからの発光を介して 生成される、請求項５に記載の方法。 ７．核酸の検出方法であって、 a.電極上に少なくとも一つの核酸を吸着させ、電極を形成する工程； b.該電極に吸着した核酸とルミネッセンス性標識とを反応させる工程；および c.工程(b)で形成した核酸標識を、電気的に発生した化学ルミネッセンスを介 して検出する工程、 を包含する方法。 ８．前記工程(b)の核酸が二本鎖である、請求項７に記載の方法。 ９．前記工程(b)の核酸が一本鎖である、請求項７に記載の方法。 １０．工程(c)が、さらに、前記電極に吸着した一本鎖の核酸を相補的な一本鎖 の核酸配列に結合させる工程を含む、請求項８に記載の方法。 １１．前記電気的に発生した化学ルミネッセンスが、核酸-金属標識キレート中 で電気的に生成した金属標識と適切な共反応物との反応から生じる、請求項７に 記載の方法。 １２．前記電気的に発生した金属標識が、電極からの発光を介して生成される、 請求項１１に記載の方法。 １３．基材および第１の金属層；および、 Al金属中心を形成するアルミニウムアルカンビスホスホネート層を含有する、 アルミニウムアルカンビスホスホネートバイオセンサー。 １４．前記バイオセンサーが、さらに前記アルミニウム中心に固定化された一本 鎖DNAを含む、請求項１３に記載のバイオセンサー。 １５．前記DNAが、オスミウムまたはルテニウム成分で標識されている、請求項 １４に記載のバイオセンサー。 １６．前記バイオセンサーが、さらに前記アルミニウム中心に固定化された二本 鎖DNAを含む、請求項１３に記載のバイオセンサー。 １７．前記DNAがオスミウムまたはルテニウム成分で標識されている、請求項１ ６に記載のバイオセンサー。 １８．核酸のバイオセンサーを調製する方法であって、 a)シリコンウエハーを処理して、クロム層および並列するAu層を形成する工程 ； b)該層化したウエハーを固定剤と接触させる工程；および、 c)工程(b)の生成物を交互に、Al(NO3)3水溶液、ビスホスホン酸(H2O3P(CH2)4P O3H2）水溶液および Al(NO3)3水溶液に浸漬する工程、 を含む、方法。 １９．電極基材、該電極上に固定化した吸着されたss-DNAまたはds-DNA、および 該ss-DNAまたはds-DNA上の検出可能な標識を含有する、バイオセンサー。 ２０．前記DNAが、オスミウムあるいはルテニウム成分、またはルミネッセンス 性標識で標識されている、請求項１９に記載のバイオセンサー。
JP8508822A 1994-08-26 1995-08-25 固体表面に吸着された核酸の電気的に発生した化学ルミネッセンス性検出のためのバイオセンサーおよび方法 Pending JPH10509025A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29663094A 1994-08-26 1994-08-26
US08/296,630 1994-08-26
PCT/US1995/010630 WO1996006946A1 (en) 1994-08-26 1995-08-25 Biosensor for and method of electrogenerated chemiluminescent detection of nucleic acid adsorbed to a solid surface

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10509025A true JPH10509025A (ja) 1998-09-08

Family

ID=23142843

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8508822A Pending JPH10509025A (ja) 1994-08-26 1995-08-25 固体表面に吸着された核酸の電気的に発生した化学ルミネッセンス性検出のためのバイオセンサーおよび方法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0777741A4 (ja)
JP (1) JPH10509025A (ja)
AU (1) AU703344B2 (ja)
CA (1) CA2198489A1 (ja)
WO (1) WO1996006946A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006075497A1 (ja) * 2004-12-21 2006-07-20 Kyoto University プローブユニット、ヌクレオチド領域の同定装置、及びヌクレオチド領域の同定方法

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5786141A (en) * 1994-08-26 1998-07-28 Bard; Allen J. Electrogenerated chemiluminescence labels for analysis and/or referencing
US6673533B1 (en) 1995-03-10 2004-01-06 Meso Scale Technologies, Llc. Multi-array multi-specific electrochemiluminescence testing
CN1192097C (zh) * 1995-03-10 2005-03-09 梅索磅秤技术有限公司 多阵列、多特异性的电化学发光检验
US6140045A (en) * 1995-03-10 2000-10-31 Meso Scale Technologies Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6207369B1 (en) 1995-03-10 2001-03-27 Meso Scale Technologies, Llc Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6319670B1 (en) 1995-05-09 2001-11-20 Meso Scale Technology Llp Methods and apparatus for improved luminescence assays using microparticles
US7014992B1 (en) 1996-11-05 2006-03-21 Clinical Micro Sensors, Inc. Conductive oligomers attached to electrodes and nucleoside analogs
FR2762013B1 (fr) * 1997-04-09 1999-06-04 Cis Bio Int Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
US6942771B1 (en) 1999-04-21 2005-09-13 Clinical Micro Sensors, Inc. Microfluidic systems in the electrochemical detection of target analytes
US7935481B1 (en) 1999-07-26 2011-05-03 Osmetech Technology Inc. Sequence determination of nucleic acids using electronic detection
US6518024B2 (en) 1999-12-13 2003-02-11 Motorola, Inc. Electrochemical detection of single base extension
AU2907201A (en) * 1999-12-09 2001-06-18 Motorola, Inc. Methods and compositions relating to electrical detection of nucleic acid reactions
US6824669B1 (en) 2000-02-17 2004-11-30 Motorola, Inc. Protein and peptide sensors using electrical detection methods
US6706479B2 (en) * 2000-10-05 2004-03-16 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Bio-chip, photoluminescent methods for identifying biological material, and apparatuses for use with such methods and bio-chips
WO2005016115A2 (en) 2003-01-23 2005-02-24 Montana State University Biosensors utilizing dendrimer-immobilized ligands and their use thereof
WO2005005952A2 (en) 2003-05-13 2005-01-20 The Trustees Of Boston College Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection
US7741033B2 (en) * 2003-05-13 2010-06-22 Trustees Of Boston College Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection
CN102216762B (zh) 2008-09-02 2016-02-10 多伦多大学董事局 纳米结构的微电极以及集成所述微电极的生物传感器件
EP2663857B1 (en) 2011-01-11 2018-12-12 The Governing Council Of The University Of Toronto Protein detection method
WO2012122564A2 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Xagenic, Inc. Diagnostic and sample preparation devices and methods
BR112018001956A2 (pt) 2015-08-20 2018-09-11 Hoffmann La Roche ?método de medição de analitos e kit?
EP3427057A1 (en) 2016-03-07 2019-01-16 H. Hoffnabb-La Roche Ag Detection of anti-p53 antibodies
JP7068323B2 (ja) 2017-02-02 2022-05-16 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 少なくとも２種のペグ化された分析物特異的結合剤を使用する免疫アッセイ
CN111936522A (zh) 2018-04-18 2020-11-13 豪夫迈·罗氏有限公司 新型抗胸苷激酶抗体
EP3844503A1 (en) 2018-08-31 2021-07-07 F. Hoffmann-La Roche AG Thymidine kinase (tk-1) in prognostic indices for dlbcl
CN114144674A (zh) 2019-07-22 2022-03-04 豪夫迈·罗氏有限公司 P物质作为用于子宫内膜异位症的非侵入性诊断的血液生物标志物
WO2021013784A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag S100a8 as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
CN114144675A (zh) 2019-07-22 2022-03-04 豪夫迈·罗氏有限公司 S100a9作为血液生物标志物用于子宫内膜异位症的非侵入性诊断
EP4004555A1 (en) 2019-07-22 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG S100a6 as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
BR112022001140A2 (pt) 2019-07-22 2022-03-15 Hoffmann La Roche Métodos para avaliar se um paciente tem endometriose ou está em risco de desenvolver endometriose, selecionar um paciente para terapia e monitorar um paciente que sofre de endometriose ou que está sendo tratado para endometriose
WO2021094409A1 (en) 2019-11-15 2021-05-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Derivatization of beta-lactam antibiotics for massspec measurements in patient samples
CN111272742B (zh) * 2020-03-06 2022-11-08 安徽大学 基于金属有机凝胶复合材料和金属有机框架的电致化学发光传感器及其制备和检测方法
US20230406909A1 (en) 2020-11-02 2023-12-21 Roche Diagnostics Operations, Inc. Sars-cov-2 nucleocapsid antibodies
WO2022207628A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Scf as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
WO2022207685A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Psp94 as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
CN117337394A (zh) 2021-05-17 2024-01-02 豪夫迈·罗氏有限公司 sFRP4作为血液生物标志物用于子宫腺肌病的非侵入性诊断
WO2023072904A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Monoclonal antibodies specific for sars-cov-2 rbd
WO2023131594A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Derivatization of compounds in patient samples for therapeutic drug monitoring (tdm)
WO2023247752A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for diagnosing endometriosis and for classifying the stage of endometriosis
WO2024017985A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Fibroblast growth factor binding protein 1 (fgfbp1) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome
WO2024017982A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Leukotriene a4 hydrolase (lta4h) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome
WO2024017983A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Meteorin-like protein (metrnl) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome
CN115414930B (zh) * 2022-08-26 2023-10-31 重庆医科大学 Ru(bpy)32+阳极或阴极共反应物及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1258580A (ja) * 1967-12-28 1971-12-30
US5238808A (en) * 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5124022A (en) * 1989-08-23 1992-06-23 Aluminum Company Of America Electrolytic capacitor and method of making same
US5019343A (en) * 1989-12-15 1991-05-28 W. R. Grace & Co.-Conn. Control of corrosion in aqueous systems using certain phosphonomethyl amines
US5846708A (en) * 1991-11-19 1998-12-08 Massachusetts Institiute Of Technology Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006075497A1 (ja) * 2004-12-21 2006-07-20 Kyoto University プローブユニット、ヌクレオチド領域の同定装置、及びヌクレオチド領域の同定方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2198489A1 (en) 1996-03-07
AU3410395A (en) 1996-03-22
EP0777741A1 (en) 1997-06-11
EP0777741A4 (en) 1999-01-13
AU703344B2 (en) 1999-03-25
WO1996006946A1 (en) 1996-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH10509025A (ja) 固体表面に吸着された核酸の電気的に発生した化学ルミネッセンス性検出のためのバイオセンサーおよび方法
Xu et al. Immobilization and hybridization of DNA on an aluminum (III) alkanebisphosphonate thin film with electrogenerated chemiluminescent detection
US6127127A (en) Monolayer and electrode for detecting a label-bearing target and method of use thereof
US6096500A (en) Multi-label complex for enhanced sensitivity in electrochemiluminescence assay
JP4618886B2 (ja) サンプル中の標的の検出
Hendji et al. Sensitive detection of pesticides using a differential ISFET-based system with immobilized cholinesterases
Rai et al. Electrochemical nanoporous alumina membrane-based label-free DNA biosensor for the detection of Legionella sp
Dharuman et al. Label-free impedance detection of oligonucleotide hybridisation on interdigitated ultramicroelectrodes using electrochemical redox probes
IE69371B1 (en) Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets
US20090036315A1 (en) Device and methods for detecting and quantifying one or more target agents
US9068979B2 (en) Micro bio sensor and method for manufacturing the micro bio sensor
US6387625B1 (en) Monolayer and electrode for detecting a label-bearing target and method of use thereof
Rasheed et al. Quartz crystal microbalance genosensor for sequence specific detection of attomolar DNA targets
Deshmukh et al. A capacitive DNA sensor for sensitive detection of Escherichia coli O157: H7 in potable water based on the z3276 genetic marker: Fabrication and analytical performance
Rasheed et al. Femtomolar level detection of BRCA1 gene using a gold nanoparticle labeled sandwich type DNA sensor
JP2004132954A (ja) 一個または複数個の分析物を検出するための方法および装置、ならびに装置の使用
Geng et al. Sensitive impedimetric immunoassay of Japanese encephalitis virus based on enzyme biocatalyzed precipitation on a gold nanoparticle-modified screen-printed carbon electrode
Wang et al. Coupling of background reduction with rolling circle amplification for highly sensitive protein detection via terminal protection of small molecule-linked DNA
US20100279278A1 (en) Methods of detecting one or more bioterrorism target agents
Cha et al. Quantitative analysis of H5N1 DNA hybridization on nanowell array electrode
Miao et al. Fabrication of multi-functionalized gold nanoparticles and the application to electrochemical detection of nitrite
CN110849958B (zh) 一种利用ZnO纳米棒提升光寻址电位传感器检测DNA性能的装置及方法
Wei et al. Determination of surface-immobilized double-stranded DNA using a metallointercalator and catalytic voltammetry
CN109856210B (zh) 一种检测早期肺癌标记物nap-2蛋白的电化学发光生物传感器及其制备方法
Palchetti et al. Electrochemical adsorption technique for immobilization of single-stranded oligonucleotides onto carbon screen-printed electrodes